Автореферат и диссертация по медицине (14.00.10) на тему:Состояние стромальных клеток костного мозга у больных вирусными гепатитами В, С и ВИЧ-инфекцией и их значение в развитии заболевания

На правах рукописи

РГ5 ОД

2 2 ДПР 2СС2

КУЗНЕЦОВ Николай Ильич

СОСТОЯНИЕ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА У БОЛЬНЫХ ВИРУСНЫМИ ГЕПАТИТАМИ В, С и ВИЧ-ИНФЕКЦИЕЙ И ИХ ЗНАЧЕНИЕ В РАЗВИТИИ ЗАБОЛЕВАНИЯ

14. 00. 10- инфекционные болезни

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Санкт-Петербург 2002

Работа выполнена в Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования и в Российском научно-исследовательском институте гематологии и трансфузиологии.

Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор А.Г.Рахманова доктор медицинских наук В.И. Ругаль

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Н.М.Калинина доктор медицинских наук, профессор О.И.Кошиль доктор медицинских наук, профессор A.A. Яковлев

Ведущая организация: Санкт-Петербургский Государственный медицинский университет им.акад. И.П. Павлова

Защита состоится « 5 » апреля 2002г. в_час.

на заседании диссертационного совета Д 208.089. 04 в Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования (193015, Санкт-Петербург, ул. Кирочная, д 41)

С диссертацией можно ознакомится в фундаментальной библиотеке СПб МАПО (Санкт-Петербург, Заневский пр. 1/82)

Автореферат разослан «_»_2002г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, с.н.с.

А.В.Соболев

; • о

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Вирусные гепатиты В и С в силу своей социально-экономической значимости занимают одно из ведущих мест в инфекционной патологии в связи с высоким уровнем инфицированное™ населения всех стран мира (более 500 млн. человек в мире являются носителями этих вирусов). По данным ВОЗ около двух миллионов человек в мире ежегодно умирает от патологии, связанной с вирусами гепатитов В и С. Из них более половины умирают от цирроза или карциномы печени (Покровский В.И., 1996, Ющук Н.Д., 2000, Sherlock Sh., 1995, Atkinson W., 2000). В настоящее время наибольшую социально-экономическую значимость из-за отсутствия специфической профилактики приобретает вирусный гепатит С, что определяется его распространенностью (Онищенко Г.Г., 2001), и теми тяжелыми последствиями, к которым он приводит, а именно развитию цирроза печени и гепатокарциномы, являющимися основными причинами летальности при этой инфекции (Виноградова E.H., 1997, Ивашкин В.Т., 1997, Шувалова Е.П., 1997, Brerchort С., 1998, Chi-sari F.V, 2000).

Несмотря на большой и постоянно расширяющийся объем знаний в области этиологии вирусных гепатитов, многие вопросы, касающиеся механизмов их возникновения и прогрессирования, остаются открытыми. (Яковлев A.A., 1992 Рахманова А.Г. с. соавт., 1995, Антонова Т.В., 1996, Апросина З.Г., 1996, Лоб-зин Ю.В. с соавт. 1999, Ющук Н.Д. с соавт., 2000 , Жданов К. В. с соавт.,2001, Журкин А.Т. с соавт., 2001, Михайлов М.И., 2001, Ghendoti V.Z., 1993, Капе М., 1993, Sherlock Sh., 1995). Одной из причин пристального внимания к проблеме вирусных гепатитов В и С является их частое сочетание с ВИЧ инфекцией, что связано с идентичными путями передачи (Онищенко Г.Г.,2000, Покровский В.В., 1996-2001, Hollinger F.B., 1996).

Достижения вирусологии и молекулярной биологии позволили разработать новые подходы к изучению патогенеза и диагностики вирусных гепатитов. Несомненным достижением последних лет явились полученные данные о воз-

можной внепеченочной репликации вирусов гепатита В и С. (Апросина З.Г., 1981- 1999, Серов В.Ф., 1989-1997, Юшук Н.Д. с соавт, 2000, Baischer W. et al., 1995, Galli M, 1995, Cohen P., 1999). Возможность репликации вирусов В, С и ВИЧ в клетках предшественниках гемопоэза является установленным фактом, однако остаются неизученными вопросы взаимодействия вирусов с элементами кроветворного микроокружения костного мозга, которые, как известно, оказывают сложное регуляторное влияние на гемо - и лимфопоэз, включая продукцию различных цитокинов (Clark B.K. et al., 1992, Koziel M.J. et al., 1995, Raza A. et al., 1996).

Изменение баланса провоспалительных и противовоспалительных цитокинов играет существенную роль в патогенезе хронических вирусных гепатитов (Буеверов А.О., 1998, Маммаев С.Н., 2001, Nelson D.R. et al., 1997). Мало изученными аспектами остаются вопросы влияния кроветворного микроокружения костного мозга на развитие цитокинового дисбаланса у больных различными формами вирусных гепатитов. Возрастающие возможности диагностики различных проявлений вирусных гепатитов В и С, и несовершенство терапии побуждают к дальнейшим исследованиям способов влияния на различные звенья патогенеза заболевания, в том числе, медикаментозными и немедикаментозными средствами (Малеев В.В.2000).

Таким образом, все выше изложенное свидетельствует об актуальности проблемы изучения различных аспектов патогенеза гепатитов В, С и ВИЧ- инфекции, и, в частности, влияния состояния стромальных клеток кроветворного микроокружения на развитие заболевания и определение способов воздействия на них иммунокоррегирующими средствами с целью восстановления их функции.

Цель исследования. Изучить состояние стромальных клеток кроветворного микрокружения костного мозга у больных вирусными гепатитами В, С и ВИЧ -инфекцией и определить значение их изменений для прогноза заболевания и оценки способов терапии.

Задачи исследования:

1 .Исследовать состояние стромальных клеток кроветворного микрокружения костного мозга у больных острым вирусным гепатитом В, хроническим вирусным гепатитом С, хроническим вирусным гепатитом смешанной В, С этиологии и ВИЧ - инфекцией.

2.Изучить возможность персистирования вирусов гепатитов В и С в стромальных клетках кроветворного микроокружения у больных острым гепатитом В, хроническим гепатитом С и при смешанной форме хронического гепатита В и С.

3.Исследовать клинико-биохимические и иммунологические показатели у больных острым гепатитом В, хроническим гепатитом С и хроническим гепатитом смешанной В и С этиологии.

4.Оценить влияние состояния стромальных клеток кроветворного микроокружения костного мозга на показатели иммунного статуса при острых и хронических формах гепатитов В и С, и ВИЧ - инфекции.

5.На основании комплексного клинико-иммунологического, биохимического и морфологического исследования определить эффективность воздействия низкоинтенсивного лазерного излучения на состояние стромальных клеток кроветворного микроокружения и течение заболевания у больных острым гепатитом В и хроническим гепатитом С.

6.Изучить влияние отечественного рекомбинантного ИЛ-1Р (беталейкина) на состояние стромальных клеток кроветворного микроокружения и иммунную систему у больных хроническим гепатитом С в зависимости от длительности заболевания.

Научная новизна

Впервые изучено состояние стромальных клеток кроветворного микроокружения костного мозга у больных острым вирусным гепатитом В и хроническим

вирусным гепатитом С и ВИЧ- инфекцией с различными сроками заболевания. Установлено значение поражения стромальных клеток костного мозга в формировании иммунного ответа у больных вирусными гепатитами В и С, и ВИЧ-инфекцией. Изучено состояние Т - клеточного звена иммунитета и цитокиново-го статуса с учетом изменений стромальных клеток костного мозга и сроков инфицирования.

Впервые показана возможность персистирования вируса гепатита С в эндо-телиоцитах и ретикулярных стромальных клетках кроветворного микроокружения. Доказано приоритетное значение персистирования вируса гепатита С в стромальных клетках костного мозга при хронических гепатитах смешанной В и С этиологии. Установлено отсутствие инфицирования стромальных клеток костного мозга вирусом гепатита В при острой форме заболевания.

Впервые изучена in vitro пролиферативная активность стромальных клеток кроветворного микроокружения больных хроническим гепатитом С и проведена оценка продукции ими цитокинов.

Впервые осуществлен сравнительный анализ нарушений состояния стромальных клеток кроветворного микроокружения костного мозга у больных ВИЧ - инфекцией и хроническим гепатитом С и показано их сходство.

На основании клинических, молекулярно-биологических и гистоморфологи-ческих исследований получены новые данные о патогенезе хронического гепатита С, показана возможность формирования очагов сохранения HBV и HCV инфекций в стромальных клетках костного мозга. Выявление HCV РНК у больных хроническим гепатитом С в стромальных клетках костного мозга при отсутствии их в крови позволяет выделить этих пациентов как группу риска про-грессирования заболевания.

Впервые дана оценка влияния низкоинтенсивного лазерного излучения на состояние стормальных клеток костного мозга у больных острым вирусным гепатитом В.

Впервые изучено воздействие ИЛ-1Р ( беталейкина ) на стромальные клетки кроветворного микроокружения костного мозга у больных хроническим вирусным гепатитом С и дана комплексная оценка состояния иммунного статуса больных на фоне использования беталейкина в зависимости от длительности инфицирования.

Положения, выносимые на защиту.

Персистирование НСУ и НВУ у больных хроническим гепатитом в стро-мапьных клетках кроветворного микрокружения костного мозга вызывает их морфо-функциональные нарушения и ведет к формированию очагов медленной инфекции, что способствует прогрессированию заболевания. Изменения стро-мальных клеток кроветворного микроокружения костного мозга, вызванное вирусом гепатита С имеют сходную картину с таковым у ВИЧ - инфицированных. Вместе с тем при ВИЧ - инфекции, в отличие от гепатита С, отмечаются более выраженные поражения не только стромальных клеток костного мозга, но и всех его элементов кроветворения.

При остром вирусном гепатите В выявляется гиперфункциональное состояние стромальных клеток костного мозга при отсутствии их инфицирования вирусом гепатита В.

У больных хроническим гепатитом С с длительностью заболевания более трех лет персистирование НСУ в стромальных клетках костного мозга приводит к снижению их пролиферативной активности и возникновению цитокино-вого дисбаланса, что способствует развитию нарушения Т - клеточного звена иммунитета и прогрессированию заболевания. При хроническом вирусном гепатите С с длительностью заболевания более трех лет отмечается корреляция между морфологическими изменениями в печени и состоянием стромальных клеток костного мозга.

Низкоинтенсивное лазерное излучение не оказывает отрицательного воздействия на стромальные клетки костного мозга. Более выраженная эффективность воздействия этого метода лечения отмечена у больных острым гепатитом В.

Интерлейкин -10 способствует нормализации иммунного статуса у больных хроническим гепатитом С с длительностью заболевания не более трех лет. Препарат оказывает положительное влияние на состояние стромальных клеток кроветворного микроокружения костного мозга.

Практическая значимость работы. Внедрение метода трепанобиопсии при обследовании больных хроническим гепатитом С позволило уточнить характер выраженности патологического процесса, а при обследовании больных с неве-рифицированным хроническим гепатитом в ряде случаев установить этиологию заболевания. Выявление внепеченочной репликации вируса позволяет более обоснованно прогнозировать характер течения болезни и оценить эффективность проводимой терапии.

Данные о различиях в иммунном ответе при хроническом гепатите С, в зависимости от сроков заболевания, способствуют более рациональному подходу к их терапии. Установлена зависимость терапевтической эффективности бета-лейкина от длительности хронического гепатита С. Более целесообразно применение данного препарата у больных с длительностью инфицирования менее трех лет.

При морфологическом исследовании состояния стромальных клеток кроветворного микроокружения костного мозга ВИЧ- инфицированных установлено, что изменения в костном мозге значительно опережают изменения в периферической крови. Данное положение указывает на необходимость внедрение этого метода при обследовании ВИЧ-инфицированных на ранних стадиях заболевания.

Апробация результатов работы и внедрение в практику

Материалы диссертации доложены на IV Международном конгрессе, посвященном 10-летию Московского областного центра лазерной хирургии, Москва - Видное, 1997год; IV Международном конгрессе по СПИДу стран Азии, Манила, 1997.; на XIV Международной крнференции по гематологии, Стокгольм, Швеция, ЗОУШ - 41Х 1997г.; на V Гематологической конференции НАТО, Лис-

собон, Португалия, 25-27 мая 1998г.; на Научно-практической конференции с международным участием «Гепатит В, С и Д - проблемы диагностики, лечения и профилактики», Москва, 1999г; на II съезде иммунологов России, Сочи, 1999г.; на Международном конгрессе «Лазеры и здоровье» - 1999, Москва 1999г.; на III Международной конференции по терапии вирусных гепатитов, Маями, США, 12-16 декабря 1999г.; на X Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным болезням, Стокгольм, Швеция, 28-31 мая 2000г.

По материалам диссертации опубликованы 43 научные работы.

Результаты исследования внедрены в практику Республиканской клинической инфекционной больницы МЗ РФ, Санкт- Петербургской городской инфекционной больницы №30 им. С.П. Боткина, в учебный процесс кафедры инфекционных болезней с курсом лабораторной диагностики СПИД СПб МАПО. На основании полученных результатов были составлены методические рекомента-ции для студентов и клинических ординаторов «Применение низкоинтенсивной лазерной терапии в лечении вирусных гепатитов» - УМО-114 от 10.04.2001. Рекомендации утвержденны Учебно-методическим объединением медицинских и фармацевтических вузов при Министерстве образования и Миниситерстве здравоохранения РФ.

Объем и струюура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Общая характеристика больных и методов исследования», четырех глав собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 373 литературных источников - 134 отечественных и 239 иностранных авторов. Работа изложена на 217 страницах, иллюстрирована 43 таблицами, клиническими примерами, 14 рисунками и схемой.

Содержание работы Общая характеристика обследованных больных и методов исследования

Работа проводилась в 1997-2001 гг на базе Городской инфекционной больницы №30 имени С.П. Боткина, Городского диагностического центра (вирусологического) при Комитете здравоохранения Администрации Санкт-Петербурга , Российского НИИ гематологии и трансфузиологии и ГосНИИ особо чистых биопрепаратов города Санкт-Петербурга.

Под наблюдением находилось 309 больных с вирусными гепатитами. Из них 124 больных хроническим гепатитом С (ХГС): 100 больных с низкой клинической и гистологической активностью (2-6 баллов по Кпос1е1 и 0-1 балл степень фиброза -группа А) и 24 с умеренной клинической и гистологической активностью (9-12 баллов по Кпос1е1 и Збалла степень фибраза- группа Б); 120 больных острой формой вирусного гепатита В и 65 больных хроническим вирусным гепатитом смешанной С и В этиологии (ХГС+ХГВ) со слабо выраженными клиническими и гистологическими изменениями (2-6 баллов по Кпос1е1 и 0-1 балл степень фиброза). Обследуемые больные разделялись методом случайной выборки на основную группу -205 человек (из них с ХГС 85 человек , с ХГС+ХГВ - 40 и 80- ОВГВ), получавших иммуномодулирующую терапию и контрольную группу - 104 человек (39 с ХГС , 25 с ХГС+ХГВ и 40 с ОВГВ), которым проводилась только базисная терапия.

Наряду с больными вирусными гепатитами в группу обследованных вошли 15 больных ВИЧ-инфекцией.

В качестве контрольной группы при морфологическом исследовании было обследовано 30 здоровых доноров.

Средний возраст больных составил 26,2±3,2 лет. Из числа обследованных больных женщин было 126, мужчин - 183. Диагноз устанавливался с учетом международной классификации хронических гепатитов 1994 года (Оеэтеп! V. ег а!., 1995) на основании общепринятых клинических, эпидемиологических и

биохимических данных и подтверждался обнаружением маркеров вирусных гепатитов, при ВИЧ- инфекции с применением иммунноблота.

У наблюдаемых больных, страдающих вирусными гепатитами, проводилось биохимическое обследование, включающее определение билирубина сыворотки крови, активности аланинаминотрасферазы (Алт).

Диагноз вирусных гепатитов В и С подтверждался серологическим методом путем определения маркеров.

Помимо серологических исследований подтверждение гепатитов В и С проводилось с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) путем обнаружения нуклеиновых кислот гепатитов В или С в сыворотке крови. Наряду с биохимическим обследованием определяли состояние иммунного статуса у больных хроническими вирусными гепатитами С и В до и после лечения. Иммунологическое исследование включало в себя оценку состояния клеточного звена иммунитета и активности цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-8, ИЛ-4, ИЛ-6, ФНОа и уровня ИФНа.

Выбор определения данных цитокинов обосновывался тем, что ИЛ-1 и ИЛ-8 являются провоспалительными цитокинами, которые синтезируются однотипными группами клеток, в том числе и клетками кроветворного микроокружения (КетлинскийС.А., 1995). Кроме того, ИЛ-1 и ФНО обладают широким спектром свойств, что делает их одними из основных цитокинов иммунного ответа (Пальцев М.А., 1996), а ИЛ-2 и ИФН являются ключевыми медиаторами Т клеточного звена иммунитета. Определение ИЛ-4 обусловлено тем, что он является цитоки-ном Th2 типа иммунного ответа, ИЛ-6 - ингибитором ИЛ-1 и ФНО, а также индикатором воспалительного процесса в печени. Определение цитокинов и интерферона осуществляли методом твердофазного ИФА, используя полистироловые планшеты фирмы Costar. Определение популяций лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих поверхностные антигенные маркеры CD 3 -, CD 4 -, CD 8 -, CD 16 -, CD 20 - и CD 25 - клеток и другие, проводили с использованием проточного цитофлюориметра EPICS XL (Coulter Corporation, USA).

Морфологические методы включали в себя гистологическое и морфометри-ческое исследование трепанобиоптатов подвздошной кости с использованием световой и электронной микроскопии. Трепанобиопсия производилась с помощью иглы типа Gamshidi.

Трепанобиопсия была выполнена как больным вирусными гепатитами, так и всем наблюдаемым больным с ВИЧ-инфекцией.

Кроме вышеописанных исследований больным также проводилась чрез-кожная пункционная биопсия печени с помощью иглы Менчини. Основными критериями оценки являлись показатели воспаления, наличие фиброза.

Кроме гистологического исследования в полученных образцах костного мозга проводилось определение методом амплификации ДНК вируса гепатита В и РНК вируса гепатита С.

Модельные опыты и создание пробной панели образцов проводили с использованием тест-систем для ПЦР ГВ и ГС "Amplicor" фирмы "Hoffman La-ЯосЬе'ХШвейцария). Полученные образцы гомогенизировали и обрабатывали согласно инструкции фирмы производителя. При проведении исследования тотальный препарат нуклеиновых кислот выделяли методом фенол-хлороформенной экстракции с последующим осаждением нуклеиновых кислот изопропиловым спиртом. ПЦР проводили с использованием коммерческих наборов "Гепатит С ампли-тест"("Ниармедик" Россия) по методике фирмы производителя с незначительными модификациями.

В трепанобиптатах, полученных от больных вирусными гепатитами, определялась способность стромальных клеток кроветворного микроокружения секретировать цитокины in vitro. Материалом для иммунологического исследования служили супернатанты органных культур, полученные через сутки и 2 недели от начала культивирования. Определение ИЛ-1, ИЛ-4 в супернатантах проводили методом твердофазного ИФА аналогичным определению цитокинов в сыворотке крови. ИЛ-6 определяли стандартным тестом, основанном на поддержании пролиферации ИЛ-6 зависимой гибридомы мыши В9.

У 120 больных острым вирусным гепатитом В и 32 больных хроническим гепа-тим С проводили определение интенсивности свободно-радикального окисления липидов методом индуцированной хемилюминесценции. Объем проведенных исследований представлен в таблице 1.

Таблица 1

Объем проведенных исследований

Вид исследования Количество анализов

Серологические исследования 1854

Биохимические исследования 2009

Иммунологические исследования 4179

Исследования параметров свободно-

радикального окисления 672

Молекулярно-биологические исследо-

вания 543

Биопсия печени 188

Трепанобиопсия 264

Исследование культуры клеток 60

Исследование цитокинов в суперна-

тантах культуры клеток 240

Всего: 9 видов исследований 10009

В качестве медикаментозного иммуномодулирующего средства использовался рекомбинантный интерлейкин-1[3 человека (беталейкин), синтезированый в Государственном НИИ особо чистых биопрепаратов Санкт-Петербурга. Препарат вводился в дозе 7-8 нг/кг, продолжительность лечения'составляла до 20 дней (10 внутривенных капельных вливаний через день).

В качестве немедикаментозного метода воздействия использовалось низко интенсивное лазерное излучение, которое проводилось полупроводниковым лазером (АГЛ) типа "Узор -2К" с матричной головкой, излучающей инфракрасный цвет длиной волны 890нм. Прибор работал в импульсно-периодическом режиме, со средней мощностью излучения от 30 до 60 мВт, с частотой повторения импульсов-ЗОООГц.

Лазерное воздействие осуществлялось чрескожно контактным методом, что исключало инфицирование в момент проведения сеансов. Один сеанс включал облучение двух областей тела: проекция печени и область локтевых вен или проекция печени и область крыла подвздошной кости с двух сторон. Доза облучения на одну область равнялась 5-10 Дж. Длительность облучения одной области составляла 4 минуты, весь сеанс длился до 12 минут. Продолжительность курса составляла 7 сеансов.

У ВИЧ-инфицированных больных методы иммунномодулирующего воздействия не применялись.

Статистическая обработка полученных данных произведена с помощью пакета StatView и STATISTICA. Оценивались основные статистические показатели (среднее, ошибка среднего). Для выявления различий между группами использовали непараметрические методы статистической обработки (Wilcoxon Signed Rank, Mann-Whitney).

Результаты исследований и их обсуждение

Проведенное до начала лечения гистологическое исследование трепаноби-оптатов подвздошной кости больных ОГВ не выявило у них значимых морфологических нарушений структуры костного мозга. У всех больных определялся нормоклеточный костный мозг без топографических нарушений взаимоотношения кроветворных и стромальных клеток. При сопоставлении морфометри-ческих показателей клеточного состава стромы костного мозга больных ОГВ с таковыми здоровых доноров крови в группе больных было обнаружено статистически достоверное (р< 0,05) повышение количества интрамедулярных ретикулярных и эндостальных клеток.(Таблица 2)

Таблица 2

Морфометрические показатели клеточного состава стромы костного мозга больных ОГВ

Клеточные элементы Здоровые лица Больные ОГВ

Синусоидальные сосуды (% площади в гистологическом препарате) 5,0±1,0% 5,15±0,25%

Интрамедулярные ретикулярные клетки (кол-во в одном поле зрения) 2,9±1,4 4,0±1,0

Жировая ткань (% площади в гистологическом препарате) 29,2 ±4,1% 23,7± 5,2%

Эндостальные клетки с темными уплощенными ядрами (кол-во в одном поле зрения - 1см2) 1,3± 0,26 1,5±0,3

Эндостальные клетки с просветленными ядрами (кол-во в одном поле зрения -1см2) 0,09±0,02 1,8 ±0,25*

*р< 0,05 в сравнении с группой здоровых лиц Увеличение количества происходило за счет молодых функционально активных клеток. Следует также отметить, что при ультраструктурном изучении гистологических препаратов подвздошной кости больных ОГВ не было выявлено клеток с патологическими включениями, характерными для их вирусного поражения.

Полученные результаты позволили сделать вывод о том, что стромальные клетки кроветворного микроокружения находятся у больных ОГВ в период разгара заболевания в гиперфункциональном состоянии. Однако отсутствие патологических включений, характерных для вирусного поражения, в клетках кроветворного микроокружения костного мозга свидетельствует о том, что при острой форме гепатита В их вирусное поражение не наблюдается. Можно предположить, что гиперфукциональное состояние стромальных клеток кроветворного микроокружения способствует развитию полноценного иммунного ответа и является адекватной реакцией на вирусное воздействие.

Исследование влияния воздействия НИЛИ на состояние иммуной системы и клеток кроветворного микроокружения было изучено у 120 больных ОГВ и 32 ХГС.

При повторном гистологическом иследовании трепанобиоптатов, выпо-ненном после окончания курса воздействия НИЛИ, каких-либо изменений в состоянии стромальных клеток кроветворного микрокружения обнаружено не было, что позволяет сделать вывод о том, что используемая методика приме-ниния НИЛИ при остром вирусном гепатите В не оказывает отрицательного воздействия на их состояние.

Имеющиеся литературные данные, посвященные изучению влияния лазерного излучения на клетки костного мозга как in vivo, так и in vitro, касаются, в основном, только состояния гемопоэза (Колесникова А.И., 1991, Байбеков И.М. с соавт 1993) Как известно, жизненный цикл кроветворных клеток короток. Возможно, это обстоятельство и позволило обнаружить результаты воздействия НИЛИ на эти клеточные популяции. Стромальные клетки костного мозга относятся к медленнопролиферирующей долгоживущей клеточной популяции, что может объяснить отсутствие влияния НИЛИ на их состояние.

Учитывая тесную взаимосвязь ПОЛ и иммунной системы в патогенезе острого вирусного гепатита В (Журкин А.Т. с соавт.,1989, Афонина З.Г. с соавт., 1999) и практически отсутствие таких данных при ХГС, представлялось интересным изучение этого аспекта у больных обеих групп. Выраженность и продолжительность процессов ПОЛ в организме во многом определяет клиническую тяжесть, продолжительность и исходы вирусных гепатитов. (Шувалова Е.П. с соавт., 1997) У больных острым гепатитом В обнаружена прямая зависимость между содержанием продуктов липопероксидации в сыворотке крови и тяжестью течения заболевания. Максимальный уровень содержания МДА, диеновых конъюгатов в сыворотке крови регистрируется в разгар заболевания (Bernard D., 1997). Исходя из этого, сроки первичного обследования больных приходились на 4,36±0,40 день пребывания больного в стационаре. Исходные

биохимические показатели активности AJTAT и содержания билирубина, до начала курса НИЛИ в основной группе практически не отличались от таковых в сравнительной группе. Так, билирубин сыворотки крови у больных основной группы составил 243,9±10,0 мкмоль/л, а у больных сравнительной группы -239,0±10,0 мкмоль/л (р>0,05),показатели активности АЛАТ соответственно равнялись - 1256,4±0,76 е/л и 1285±1,5 е/ (р>0,05). Клиническими проявлениями интоксикации были преимущественно симптомы диспептического и астено-вегетативного характера. При изучении иммунологического статуса основная и сравнительная группы разделились на две подгруппы в зависимости от исходного иммунологического уровня: I подгруппа - 45 больных с изначально низкими показателями клеточного иммунитета, а именно CD3 - 43±5,4% в основной группе и CD3- 41,5±6,1% в сравнительной, CD4 - 23±5,1% и 22±5,7% соответственно и CD8 - 20,1 ±2,7% в основной группе и 19,5±2% в сравнительной группе. В группах с исходно повышенными цифрами Т лимфоцитов- 75 больных, различий между основной и сравнительной подгруппами также не было. Соответственно: CD3- 65±1,5% и CD3- 62,4± 2,6%, CD4- 38± 2,3% и CD4-36±2,7%, CD832±1% и CD8-29,7±1%.

Как показал анализ литературы, выявленные нарушения Т- клеточного зве-t

на иммунитета являются характерными для больных острым гепатитом В. При определении продукции ИЛ-1р у больных ОГВ различий в группах в зависимости от исходного уровня Т - лимфоцитов обнаружено не было, но отмечалось повышение спонтанной и индуцированной продукции по сравнению с нормой.

В начале заболевания у больных основной и сравнительной групп первичные показатели ПОЛ и АОС были идентичны. МДА в основной группе -15,65±0,63 мкмоль/л, в сравнительной группе - 15,75±0,9 мкмоль/л (р>0,05), SH в основной группе - 22,87±0,95 мкмоль/л, в сравнительной группе - 23,1±0,6 (р>0,05). Показатель АОС - 6,23±0,1 отн. ед. и 6,71±0,21. После окончания курса НИЛИ в основной группе и параллельно в те же сроки в сравнительной группе проводилось повторное исследование всех показателей. Под влиянием

лазеротерапии в основной группе отмечалось уменьшение сроков интоксикации. Так, общая слабость в основной группе исчезла на 9,7±0,83 день, а в сравнительной группе на 12,5±1,6 день (р<0,05), а снижение аппетита - 9,3±0,58; 12,7±0,8 (р<0,05), соответственно.

Средние сроки исчезновения желтухи у больных основной группы -28,8±2,5 дня оказались меньшими, чем у больных, получавших только базисную терапию - 35±1,9.

При повторном биохимическом исследовании отмечалась положительная динамика снижения содержания билирубина в сыворотке крови к моменту выписки в основной группе до 17,2±0,66 по сравнению со сравнительной группой - до 24,1±2,4.

Повторное иммунологическое исследование состояния Т- клеточного звена иммунитета выявило положительную динамику иммунологических показателей в обеих группах. Было установлено, что в основной подгруппе I по сравнению с исходным уровнем показатели приблизились к норме, а именно: CD3 -60,2±0,5%, CD4 -32,8±1,8%, CD8-32,6±1,0% в сравнительной подгруппе I оставались значительно снижены: CD3 - 47±5%, CD4 - 24,9±1,6%, CD8 -25,4±1,6%.

После проведения курса лазеротерапии у больных основной подгруппы II была выявлена тенденция к уменьшению всех показателей. Число CD3 снизилось до 50,8±1,0% , CD4 до 33,3±1,8%, CD8 было снижено до 26,3±1,45 в сравнительной подгруппе II больных, не получавших НИЛИ, иммунологические показатели по сравнению с исходным уровнем практически не изменились, а именно: CD3 - 63,4±15, CD4 - 33,9±1,9%, CD8 - 29,7±1,05. В то же время, при иммунологическом исследовании у больных основной подгруппы II в периоде ранней реконвалесценции наблюдалось повышение уровня всех иммунологических показателей до нормы: CD 3- 62±1,0%, CD4 - 32,9±1,6% и CD8-30,2±2,8%

При проведенном контрольном исследовании синтеза ИЛ-ip после окончания курса НИЛИ отмечалось повышение его спонтанной и индуцированной

продукции в обеих группах. В основной группе эти показатели были достоверно выше, чем в сравнительной и равнялись - 500±50 пг/мл при спонтанной продукции и 3400±200 при индуцированной, а в сравнительной группе I - 350±40 пг/мл и 1700±400 пг/мл (р<0,05).

В группе больных острым вирусным гепатитом В отмечалось также положительное влияние НИЛИ на ПОЛ и АОС. Выявлено снижение показателя МДА в 1,8 раз в основной группе (с 15,65±0,63 мкмоль/л до 8,08±0,7; р<0,05) и в 1,3 раза в сравнительной группе (с 15,75±0,9 мкмоль/л до 12,08±0,3; р<0,05). Содержание глутатиона в эритроцитах увеличилось в 1,6 раза в основной группе (с 22,87±0,95 мкмоль/л до 3.5,2±0,8; р<0,05), а в сравнительной группе больных, получавших только базисную терапию, в 1,02 раза (с 23,1±0,6 до 30,12±0,9; р<0,05). Оценивая состояние свободнорадикального окисления при применении НИЛИ, можно отметить, что АОС повысилось в основной группе в 1,5 раза по сравнению с исходным уровнем (6,23±0,1 отн. ед.) - 9,23±0,6 отн. ед.. (р<0,05), а в сравнительной группе - практически не изменилось - 7,2±0,46 (6,71±0,21) (р>0,05).

Изучение воздействия НИЛИ на течение ХГС изучено у 32 больных, 12 из них составили контрольную группу. По характеру течения заболевания и клиническим симптомам обе группы больных были однородными. Изменения биохимических показателей в этой группе больных были слабо выражены и не имели существенного значения в оценке эффективности воздействия НИЛИ на течение заболевания. Наиболее интересным предсталялось изучение состояния ПОЛ и АОС у больных хроническим гепатитом С. В доступной литературе сведения по данному вопросу практически отсутстствуют.

Показатели ПОЛ у больных ХГС до курса НИЛИ находились на контрольном уровне, как в основной, так и в сравнительной группе. Активность МДА у больных основной группы равнялась - 5,3±0,1 мкмоль/л„ а у больных сравнительной группы - 5,64±0,4 мкмоль/л. Показатели АОС у больных обеих групп приближались к норме: в основной группе - 7,35±0,17 отн. ед., в

сравнительной группе - 7,4±0,3 отн. ед. Показатели восстановленного глута-тиона в обеих группах практически не отличались от нормального значения и равнялись соответственно 25,3±0,2 мкмоль/л и 26,04±0,4. При исследовании показателей иммунитета до начала курса НИЛИ отмечалось некоторое снижение CD3 лимфоцитов в основной и сравнительной группах и равнялось соответственно 45,6±6% и 45,3±4,5%. Количество CD4 и CD8 также было ниже нормы соответствующей субпопуляции лимфоцитов. Так, CD4 в основной группе - 27,5±2,8%, в сравнительной группе -26,3±3,1%, a CD8 - до лечения -15,4±2,6%, в сравнительной группе - 16,1±1,8%

После проведенного курса НИЛИ отмечалось незначительное уменьшение содержания глутатиона по сравнению с исходными показателями, в основной группе - 22,13±0,6 (25,3±0,2) , в сравнительной группе - 24,9±0,4 (26,04±0,4) (р>0,05). Показатели АОС и МДА, как в основной группе, так и в сравнительной группе практически не изменились. Так, МДА в основной группе - 5,7±0,24 мкмоль/л (р>0,05), в сравнительной группе - 5,2±0,8 мкмоль/л (р>0,05).

Выраженной динамики изменений показателей Т- клеточного звена иммунитета у больных ХГС также не наблюдалось.

Таким образом, оценивая полученные результаты, можно сделать вывод, что НИЛИ не оказывает влияния на Т клеточное звено иммунитета и другие показатели активности инфекционого процесса при отсутствии выраженных отклонений в них.

Сопоставляя полученные результаты изучения влияния НИЛИ на течение острого гепатита В и хронического гепатита С, можно сделать вывод, что в основе положительного воздействия НИЛИ лежит нормализация процессов ПОЛ, а основной точкой приложения является клеточная мембрана. Через нормализацию нарушенной функции клеточных мембран макрофагов и моноцитов НИЛИ оказывает регуляторное воздействие на продукцию ИЛ-1 и пролиферацию Т- лимфоцитов. Вероятно, увеличение количества Т-лимфоцитов происходит за счет активации их пролиферации в лимфотических узлах.

Эффективность воздействия НИЛИ на тот или иной процесс зависит от его исходного состояния. НИЛИ оказывает положительное влияние на патологически изменные процессы, способствуя их нормализации. Учитывая полученные результаты изучения влияния НИЛИ на течение вирусных гепатитов, можно говорить о целесобразности его использования в качестве компонента комплексной терапии при острых формах вирусных гепатитов и хронических формах данного заболевания при наличии выраженных клинических и биохимических изменений.

При гистологическом исследовании трепанобиопсий подвдошной кости больных хроническим гепатитом С с низкой клинической и минимальной гистологической (2-6 балла по Кноделю без учета фиброза - группа А) активностью отмечались признаки дисмиелопоэза. В костномозговых лакунах определялись эритроидные клетки без структурной организации островков, которые характерны для нормального кроветворения. Гранулоцитарный росток характеризовался уменьшением количества зрелых гранулоцитов. У 20% больных в гистологических препаратах костного мозга в части лакун отмечались очаги отека. При анализе количественного состава клеток костного мозга выраженных структурных изменений, по сравнению с гистологическими препаратами подвздошной кости здоровых лиц, обнаружено не было. Выявленные изменения носили, в основном, качествееный характер. Так, при исследовании синусоидальных сосудов обращало на себя внимание появление эндотелиальных клеток с крупными просветленными ядрами, содержащими малое количество органоидов. Появление таких клеток можно расценивать, как снижение функциональной активности синусоидов. О снижении функциональной активности эндотелия синусоидальных сосудов свидетельствовало также уменьшение клеток с признаками пино-и экзоцитоза. Проведенное ультраструктурное изучение трегганобиоптатов позволило уточнить характер морфофункциональных изменений стромальных клеток костного мозга у обследуемых больных.

При обзорном электронном икроскопическом просмотре кусочков костного мозга больных ХГС выявлялись ретикулярные клетки всех типов. Однако у больных ХГС преобладали ретикулярные клетки с узким ободком цитоплазмы, имевшие темные ядра с грубой структурой хроматина. В цитоплазме некоторых из них обнаруживались признаки вакуолизации. У здоровых же лиц преобладали ретикулярные клетки с крупным просветленным ядром с расположенными в них ядрышками. В интрамедуллярном пространстве обнаруживались стро-мальные ретикулярные клетки и эндотелиоциты, содержащие патологические внутриядерные включения. Указанные структурные перестройки ядер являются достоверным признаком вирусного поражения клеток. Наряду со структурными изменениями эндотелиоцитов отмечалось их достоверное снижение и изменялось соотношение между двумя популяциями эндотелиоцитов. У больных ХГС (группа А) значительно реже, по сравнению со здоровыми лицами, наблюдались участки, в которых выявлялись скопления эндостальных клеток с крупными просветленными ядрами. Соотношение клеточных элементов эндоста с темными и просветленными ядрами составило соответственно 0,9± 0,02 (здоровые лица 1,3±0,1) и 0,06±0,01 (здоровые лица 0,09±0,02).

Среди клеток жировой ткани у больных ХГС встречались мононуклеарные и макрофагальные клеточные элементы. Обращало на себя внимание изменение структуры жировых клеток. Часть клеток имела полигональную форму с уплощенным ядром. Также обнаруживалось большое количество жировых клеток с темными пикнотичными ядрами. Подобные изменения характерны для клеток с низкой функциональной активностью. При исследовании трепанобиоптатов больных смешенной формой хронического С и В гепатита выявлены аналогичные изменения.

Следует отметить, что изменений в периферической крови у данной группы больных не было. В отличие от больных ХГС группы А, у больных группы Б с умеренными морфологическими изменениями в печени (9-12 баллов по Кноде-лю без учета фиброза) в периферической крови наблюдались клинические при-

знаки цитопении, а именно у больных отмечалось снижение гемоглобина до 90±15 г/л, а количество тромбоцитов составляло 100±25-10*9/л. При исследовании трепанобиоптатов повздошной кости у всех пациентов этой группы, в отличие от больных группы А, было выявлено выраженное снижение клеточно-сти костного мозга. Основную массу ткани костного мозга составляла жировая ткань, (табл. 3)

Таблица 3

Гнстоморфометрические данные костного мозга больных ХГС с умеренной гистологической активностью (9 —12 баллов по Кпос1е1) в печени

Вид ткани Объем площади в препарате.

Жировая ткань 45,2±1,25%

Трабекулы губчатой кости 22,2± 0,25%

Синусоидальные сосуды 5,75± 0,5%

Кроветворная ткань 23,85±1%

У всех больных этой группы также были выявлены признаки дисмиелопо-эза.

Эритроцитарный росток характеризовался нарушением структуры эритро-идных островков, нарастанием числа макрофагов среди эритрокариоцитов и появлением мегабластов. В гранулоцитарном ростке отмечалось снижение количества зрелых гранулоцитов и нарушение локализации молодых клеток, которые располагались в центральных отделах лакун внеэндостально. Дисмегака-риоцитопоэз проявлялся также увеличением среди мегакариоцитов клеточных форм с уменьшенным объемом цитоплазмы. На этом фоне наблюдалось увеличение лимфоцитов, плазмоцитов, гистиоцитарных элементов.

Изменения кроветворного микроокружения у больных группы Б имели как количественный, так и качественный характер. Характер перестроек, указывающий на изменения функционального состояния клеток, отчетливо выявлялся при электронномикроскопическом исследовании и свидетельствовал о снижении их активности. Наиболее выраженные изменения касались ретикулярных клеток и эндотелиоцитов. Количество ретикулярных клеток, выявленное в

гистологических препаратах подвздошной кости больных ХГС (группа Б), равнялось 5,3± 0,75 клеток, и было выше по сравнению с группой здоровых лиц (2,9±1,4) в поле зрения препарата. Наибольший процент (65%) составляли ретикулярные клетки с низкой функциональной активностью, которые характеризовались наличием темного ядра и узким ободком цитоплазмы.

У больных группы Б наиболее выраженные нарушения были выявлены при ультраструктурном анализе состояния эндостальных клеток. Практически все эндостальные клетки были уплощенной формы с электронноплотной, бедной органоидами цитоплазмой. Некоторые из них имели короткие цитоплазматиче-ские отростки. Эндостальные клетки с просветленными ядрами составляли меньший процент по сравнению со здоровыми лицами (0,045±0,02 и 0,09±0,02).

Таблица 4

Морфометрическая характеристика эндостальных клеток костного мозга

больных ХГС (группа Б)

Эндостальные клетки костного мозга Обследуемые группы

Здоровые Больные ХГС

С темными уплощенными ядрами 1,3±0,26 0,6±0,01*

С просветленными ядрами 0,09±0,02 0,045±0,02*

Р < 0,05

В цитоплазме этих клеток выявлялись хорошо развитые органоидные включения. Также, как и у больных группы А, в трепанобиоптатах больных этой группы были выявлены стромальные ретикулярные клетки и эндотелиоциты, содержащие патологические внутриядерные включения, характерные для вирусного поражения клеток.

Таким образом, проведенные гистологические исследования трепанобиоп-сий подвздошной кости больных ХГС с различной степенью морфологических изменений печени позволяют сделать вывод о наличии морфофункциональных изменений состояния стромальных клеток кроветворного микроокружения ко-

стного мозга. Причем у больных ХГС с более выражеными морфологическими изменениями печени помимо качественных нарушений состояния стромальных клеток костного мозга выявлялась отчеливая гипоплазия клеток костного мозга, близкая к аплазии. Как компенсаторный механизм поддержания функции костного мозга в данном случае можно рассматривать увеличение объема жировой ткани и появление ретикулярных клеток с фагоцитарными свойствами. На основании наличия патологических включений, характерных для вирусного поражения клеток, обнаруженных при ультраструктурном исследовании в ретикулярных и эндостальных стромальных клетках, можно сделать вывод об их вирусном поражении.

Проведенное молекулярно-биологическое исследование цельных фрагментов подвздошной кости методом ПЦР на РНК вируса гепатита С и на ДНК вируса гепатита В позволило подтвердить данное положение. Всего было выполнено 90 исследований, результаты которых представлены в таблице 5.

Таблица 5

Результаты определения нуклеиновых кислот вирусов В и С в трепаноби-оптатах подвздошной косгн больных ХГС и ХГС+ХГВ (во всех группах)

Показатели сыво- Результаты определения ПЦР в трепанобиоптатах

ротки крови РНК НСУ+ РНК НСУ + ДНК НВУ + ДНК НВУ+

ХГС РНК НСУ+ 45 (75%) 0 0

N=60

ХГС+ХГВ 4 6 0

РНК НСУ+,

ДНК НВУ+

N=10

ХГС+ХГВ 9 0 0

РНК НСУ+

ДНКНВУ-

13

ХГС+ХГВ 0 5 2

РНК НСУ-

ДНК НВУ+

N=7

В группе больных ХГС (группа А) определение РНК НСУ в трепанобиоптатах было выполнено у 36 больных, а в группе Б у 24 человек. Частота выявления РНК НСУ соответственно составила 69,4% в первой группе и 83,3% во второй. В группе больных ХГС смешанной этиологии были получены следующие результаты. Из 10 больных с положительной реакцией ПЦР в сыворотке крови на РНК НСУ и ДНК НВУ двойная реакция ПЦР в трепанобиоптате была положительной у 6 больных, и у 4 пациентов на один вирус (РНК НСУ). Реакция ПЦР только на ДНК НВУ была отрицательной. В группе больных из 13 человек с преобладанием репликативной активности НСУ (реакция ПЦР в сыворотке положительная на РНК НСУ и отрицательная на ДНК НВУ при наличии в крови маркеров- НВзА§ НЬсог^М) при исследовании трепанобиоптата у 9 человек была положительная реакция ПЦР только на РНК НСУ. В группе же из 7 больных с положительной реакцией ПЦР в сыворотке крови только на ДНК НВУ и наличием анти НСУ у 5 больных при исследовании трепанобиоптатов была выявлена смешанная вирусная активность и у 2-х - положительная реакция ПЦР на ДНК НВУ.

Таким образом, полученные результаты молекулярно-биологического исследования подтверждают данные о вирусном поражении стромальных клепок костного мозга, и позволяют сделать вывод о преобладающей роли НСУ в их поражении по сравнению с НВУ. Аналогичные данные были получены при исследовании больных с заболеваниями крови. Так, по данным Е.А.Лукиной с со-авт. (2000), преобладание хронической НСУ инфекции клеток крови и костного мозга по сравнению с НВУ инфекцией наблюдалось у больных со сложными гематологическими синдромами.

Для более точной оценки нарушения функциональной способности стромальных клеток костного мозга был использован метод монослойного культивирования с последующей оценкой пролиферативной активности стромы и оп-ределеним концентрации цитокинов в супернатантах органных культур стромы костного мозга. Было проведено определение концентрации: ФНО-а, ИЛ-

1р, ИЛ-4, ИЛ-6. Определение концентрации цитокинов в супернатантах проводилось через сутки культивирования и через 14 дней. В препаратах, полученных при культивировании стромапьных клеток костного мозга, преобладали, в основном, ретикулярные клетки. Результаты проведенного исследования показали, что у 34 больных ХГС (группа А) из 40 обследованных имелся нормопла-стический тип пролиферативной активности и у 6 больных из этой группы ги-попластический тип. В группе же больных ХГС с умеренными морфологическими изменениями в печени (группа Б) преобладал гипопластический тип пролиферации (18 больных). У двух больных был апластический тип пролиферации, (табл.6)

Таблица 6

Пролиферативная активность стромальных клеток костного мозга у больных ХГС

Группы больных Тип пролиферативной активности

Апластический Гипопласти -ческий Нормопласти-ческий Гиперпластический

ХГС (группа А) (п = 40) 0 6 34 0

ХГС (группа Б) (п = 20) 2 18 0 0

Результаты проведенного исследования пролиферативной активности стромальных клеток костного мозга у больных ХГС полностью коррелировали с морфологическими нарушениями, выявленными в гистологических препаратах костного мозга, и выраженностью морфологических изменений в печени.

Проведенная оценка функциональных свойств стромальных клеток костного мозга по их способности вырабатывать цитокины in vitro, оказывающих

влияние на лимфо и гемопоэз, показала наличие более существенных функциональных нарушений во второй группе больных. При определении концентрации цитокинов после суточной инкубации клеток и через 14 дней инкубации были получены следующие результаты. При определении исходного уровня цитокинов в первой группе больных нулевые значения были выявлены у 4 пациентов с нормопластическим типом пролиферации, во второй группе у 7 больных с гипопластическим и у 2 больных с апластическим типом пролиферации. Через 14 дней после культивирования цитокины определялись у всех больных первой группы, но во второй группе нулевое значение концентрации сохранялось у 2-х пациентов с апластическим типом пролиферации. Следует отметить, что у первой группы больных определялись более высокие значения ФНО-а и HJI-ip, как исходные: 30±0,25пг/мл, 45,5±0,4пг/мл, и соответственно: 26±0,75 пг/мл, 15,5± 0,25, так и конечные - 245±1 пг/мл.., 100±0,7 и соответст-вено- 148,2±0,4пг/мл и 78±1,5пг/мл (р< 0,05) Продукция же ИЛ-6 была выше у больных второй группы: исходные показатели 41±0,25пг/мл в 1й группе и 130±0,35 пг/мл - во 2й группе и соответствено конечные 1450±25 пг/мл и 2050±15 пг/мл. (р<0,05).

Тот факт, что у больных ХГС в группе А выявлен нормопластический тип пролиферации позволяет сделать вывод о незначительном нарушении функциональной активности стромальных клеток костного мозга и о их сохранившейся возможности к продукции провоспалительных цитокинов, обладающих противовирусной активностью, к которым относятся ФНОа и ИЛ-ip. Это объясняет их повышенное содержание в супернатантах у больных 1-й группы по сравнению со 2-й. Однако концентрация их у больных ХГС недостаточна для элиминации вируса, что, возможно, связано с повышенной продукцией их ингибиторов, и в частности, ИЛ-6 (Фрейдлин И.С., 2000), способствующего тем самым длительной персистенции вирусов.

Полученные результаты исследования продукции цитокинов стромальными клетками кроветворного микроокружения in vitro указывают на наличие выра-

женного цитокинового дисбаланса, обусловленного нарушением функциональной активности клеток кроветворного микроокружения. Наличие положительного результата при постановке ПЦР на присутствие нуклеиновых кислот вируса гепатита В и С в трепанобиоптатах у 71 больного (78,8%) из 90 обследованных подтверждает вирусную природу данного нарушения.

В качестве медикаментозного иммунномодулирующего средства был выбран отечественный рекомбинантный цитокин ИЛ-1 р (беталейкин), являющийся аналогом человеческого ИЛ-1 р.

При изучениии действия ИЛ-ip на течение инфекционного процесса у больных ХГС с различной длительностью заболевания наибольшая информация была получена при анализе изменения состояния стромальных клеток кроветворного микроокружения костного мозга, иммуннологических показателей и оценки репликативной активности HBV и HCV.

ИЛ-ip (беталейкин) в качестве иммунномодулятора был применен у 92 больных ХГС и у 65 больных хроническим гепатитом смешанной В, С этиологии. Клинические симптомы заболевания у больных ХГС ввиду их минимальной выраженности не имели определяющего значения для оценки эффективности исследуемого препарата. Проведенные иммунологические исследования показали, что'использование ИЛ-ip способствует нормализации специфического противовирусного иммунного ответа. Так, в группе больных ХГС с длительностью заболевания менее 3-х лет отчетливо определилось повышение CD8- с 16±1% до 25,5±2%, CD16- 12±1,7% и 20±2%, CD25- 7±1% -19±1% лимфоцитов, а также клеток, несущих HLA-II-11±0,5% и 26±0,75. Увеличение количества этих лимфоцитов и, в частности, CD 16, CD25 и клеток с HLA-II рецепторами указывает на активацию процессов, направленных на элиминацию вирусной инфекции. Оценивая влияние ИЛ-ip на Т-лимфоциты с маркерами CD95, можно предположить, что он участвует в регуляции апоптоза. Подтверждением активации противовирусного иммунитета являлось изменение баланса цитокинов в сторону Thl типа. Если до использования ИЛ-ip у больных выявлялось пре-

обладание цитокинов, характерных для иммунного ответа по ТИ2 типу, а именно повышение спонтанной продукции ИЛ-6, высокое содержание ИЛ-4 в сыворотке крови-240±12 пг/мл и отсутствие продукции ИЛ-2 и ИФН-а, то после окончания курса ИЛ-1Р отмечалось снижение спонтанной продукции ИЛ-6 практически до нормальных показателей с 1840± 250 пг/мл до 50±15 пг/мл. Концентрация ИЛ-4 в сыворотке крови также снизилась до нормальных цифр 50± 0,5 пг/мл. Одновременно с этим у больных определялось повышение индуцированной продукции ИЛ-2 (0 и 19,5±2,4 пг/мл), спонтанной продукции ИФН-а (0 и 10±0,5 пг/мл) и нарастание концентрации ИФНа в сыворотке крови до 10±0,5 пг/мл, то есть цитокинов ТЫтипа. При анализе изменений показателей иммунитета у больных ХГС с умеренным морфологическим поражением печени было выявлено, что ИЛ-1(3 у больных этой группы также способствует нормализации противовирусного иммунного ответа, но эффект положительного воздействия имеет кратковременный характер с последующим возвратом к исходным показателям через 6 месяцев.

Критерием оценки эффективности проводимой противовирусной или/и им-муномодулирующей терапии по мнению многих авторов считается определение нуклеиновых кислот вирусов гепатитов В и С (Виноградова Е.Н., 1997, Михайлов М.И.,2001, ВгесЬоП С., 1993). Однако выявление ДНК НВУ и/или РНК НСУ только в сыворотке крови не может служить надежным диагностическим критерием и контролем эффективности проводимой терапии (Лакина Е И. С соавт,1999).

Оценка влияния ИЛ-1Р на репликативную активность НСУ, проведенная методом ПЦР в сыворотке крови и в трепанобиоптатах больных ХГС, дала различные результаты эффективности воздействия ИЛ-1Р на репликативную активность вирусов. Контрольные исследования ПЦР в сыворотке крови во всех группах больных проводились сразу же после окончания применения беталей-кина, через месяц, 6 месяцев и через год. Определение ПЦР в трепанобиоптатах проводилось через 6 месяцев. После окончания курса беталейкина соотношение

результатов ПЦР на РНК ПСУ в сыворотке крови у больных основной группы, получавших ИЛ-1(3 было следующим. У 33 больных (66%) результат был отрицательным, у 17(34%) больных РНК НСУ в сыворотке крови сохранилось. В сравнительной группе у 6 (33%) больных реакция ПЦР в сыворотке крови была отрицательной и у 12 (67%) больных репликативная активность вируса сохранялась (группа А). Однако у 3 больных из 33-х, ответивших на терапию ИЛ-1Р, сохранялась репликативная активность НСУ в трепанобиоптате. Через 18 месяцев наблюдения отсутствие репликативной активности НСУ определялось только у 30 больных, так как у трех больных с положительной реакцией ПЦР на НСУ в трепанобиоптате вновь выявлялась РНК НСУ в сыворотке крови. В группе больных с двойной репликативной активностью отрицательная реакция ПЦР по двум вирусам в сыворотке крови после окончания курса беталейкина отмечалась у всех 11 больных основной группы. Эти результаты сохранялась в течение 3-х месяцев наблюдения. Однако через 6 месяцев у 4 больных определялась положительная реакция ПЦР РНК НСУ в сыворотке крови.

В группе больных хроническим гепатитом смешанной этиологии с преобладающей репликативной активностью НСУ и наличием маркеров гепатита В-HbsAg и антиНВсог^М после проведенного курса беталейкином положительная реакция ПЦР на РНК НСУ сохранялась в течение года у 8 больных основной группы (из 20 человек) и 8 больных сравнительной группы (из 10 человек). В третьей группе больных с положительной реакцией ПЦР только на ДНК НВУ и наличием анти НСУ после проведения курса ИЛ-1(3 при исследовании через месяц она сохранялась у 10 больных, а через 6 месяцев только у 4 больных. В отличие от больных ХГС группы А, у больных ХГС с длительностью заболевания более трех лет и умеренными морфологическими изменениями печени эффективность влияния ИЛ-1Р на репликативную активность НСУ по результатам определения ПЦР в сыворотке крови РНК вируса через месяц после окончания терапии составила 54,15%. В течение года процент ответивших на терапию ИЛ-1Р в этой группе больных уменьшился до 37,5%. Такой низкий результат поло-

жительного воздействия препарата у больных ХГС с длительностью заболевания более трех лет и умеренными изменениями в печени, вероятно, объясняется высоким процентом (82,5%) внепеченочной репликации НСУ в стромальных клетках кроветворного микроокружения костного мозга.

Контрольное определение РНК вируса в трепанобиоптатах методом ПЦР, проведенное через 6 месяцев после окончания курса ИЛ-1 р, показало, что препарат способствовал подавлению репликативной активности НСУ в стромальных клетках кроветворного микроокружения костного мозга только у 5 пациентов из 20 обследованных. На основании проведенных молекулярно-биологических исследований можно сделать вывод, что ИЛ-1р (беталейкин) способствует в большей степени подавлению репликативной активности НСУ и НВУ у больных на начальных этапах развития заболевания. Одним из возможных механизмов противовирусного эффекта беталейкина у больных хроническим вирусным гепатитом является регулирование цитокинового баланса в сторону ответа по ТЫтипу.

Одним из наиболее важных показателей оценки эффективности используемого препарата являлось изменение состояния стромальных клеток кроветворного микроокружения костного мозга после окончания курса лечения. Повторное морфометрическое и гистологическое изучение состояния стромальных клеток кроветворного микроокружения было проведено в обеих группах больных ХГС через 6 месяцев после окончания использования препарата. Сопоставление изменений в гистологических препаратах подвздошной кости больных ХГС с различной длительностью заболевания и выраженностью мор-фологисческих проявлений патологии печени подтвердили тот факт, что ИЛ-1р оказывает положительное воздействие на различные аспекты патологического процесса на начальных этапах его развития. Положительное воздействие ИЛ-1 р, в основном, отразилось на состоянии эндостальных стромальных клеток кроветворного микроокружения, и было выявлено при ультраструктурном исследовании препаратов. Отмечалось увеличение числа и размеров эндосталь-

ных клеток крупных размеров с большими светлыми ядрами округлой или овальной формы, содержащими ядрышки. Характер выявленных изменений эндостальных клеток кроветворного микроокружения костного мозга у больных ХГС с минимальными морфологическими изменениями печени после использования ИЛ-10 свидетельствовал о появлении молодых функционально активных клеток. Причем изменения имели как качественный, так и количественный характер. Число эндостальных клеток практически соответствовало нормальным показателям и равнялось 0,06± 0,01 до терапии и 0,09±0,02 после. Это обстоятельство свидетельствует о том, что у больных ХГС с нормопласти-ческим вариантом пролиферативной активности стромальных клеток костного мозга возможно восстановление их количественного и качественного состава. В группе сравнения и у больных ХГС с длительностью заболевания более 3-х лет подобные изменения были статистически недостоверными. Однако у них отмечалась тенденция к переходу от аплазии к гипоплазии и уменьшению признаков дисмиелопоэза. Качественные изменения состояния стромальных клеток у этих больных также выявлялись преимущественно при ультраструктурном исследовании. В гистологических препаратах подвздошной кости этих больных выявлялись единичные эндостальные клетки с признаками пиноцитоза, определялись эндостальные клетки с просветленными ядрами. Все эти изменения также указывали на улучшение функции клеток, но количество функционально активных клеток было незначительное и статистически недостоверное.

При сравнительном анализе морфологических нарушений костного мозга и, в частности, кроветворного микроокружения было выявлено сходство морфологических изменений при ВИЧ - инфекции и ХГС. У всех ВИЧ - инфицированных, также как и у больных ХГС, выявлялись признаки дисмиелопоэза, которые у ВИЧ - инфицированных были более выраженными. На этом фоне отмечалось увеличение в костном мозге количества лимфоцитов, плазмоцитов и гистиоцитарных элементов. Структурная перестройка кроветворного микроокружения имела сходство с таковой при длительности ХГС более 3-х лет.

В основном, стромальные клетки костного мозга у ВИЧ - инфицированных были представлены клеточными элементами, морфологическая характеристика которых указывала на значительные нарушения функции клетки. Так, при ультраструктурном исследовании интрамедуллярных стромальных клеток определялись клетки с вакуолизированной цитоплазмой, имевшей большое количество различных патологических включений. Эндотелиальные клетки костного мозга у ВИЧ-инфицированных имели вид набухших клеток с единичными патологическими включениями в ядрах. Все эти изменения указывали на возможность их вирусного поражения. Представленные данные свидетельствуют, что при ВИЧ- инфекции структурная перестройка костного мозга затрагивает все его клеточные элементы. Нарушение функции гемопоэтической ткани может быть обусловлено рядом причин, среди которых, также как и при ХГС, важное место занимает перестройка кроветворного микроокружения, вызванная вирусным поражением. Костный мозг - это единственное место, в котором мие-ло-, эритро- и лимфопоэз осуществляются одновременно.

Одним из ключевых факторов, способствующих прогрессированию ВИЧ-инфекции, является нарушение функции костного мозга. Спектр этих изменен-ний довольно многообразен и касается всех звеньев гемопоэза. Генез этих нарушений окончательно не установлен, а имеющиеся в литературе сведения указывают на нарушение регуляторной роли стромальных клеток костного мозга (Canque В et al.,1995, Fauci A.S., et al., 1996).

Результаты проведенного исследования показали, что структурные изменения костного мозга у обследованных ВИЧ - инфицированных затрагивают как гемопоэтическую ткань, так и стромальные элементы костного мозга. Как известно, нарушения пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток при ВИЧ - инфекции связаны с непосредственным вирусным поражением клеток - предшественников гемопоэза. (Delacretaz F., et al 1987, Mir N., et al 1989) Кроме того, одним из факторов, способствующих дисфункции, может быть вирусное инфицирование клеток кроветворного микроокружения с последующим

изменением их функциональных свойств. В результате прямого воздействия HIV на стромальные клетки происходит нарушение их функциональной активности (Sun N.C. ., et al., 1989). Обнаруженные нами при ультраструктурном исследовании стромы костного мозга больных ВИЧ- инфекцией стромальные клетки с признаками фагоцитарной активности и патологическими внутриядерными включениями подтверждают их вирусное поражение. Изменение функциональной активности стромальных клеток способствует нарушению выработки ими цитокинов, влияющих на пролиферацию и дифференцировку клеток-предшественников не только миелоидного ряда, но и лимфоидных предшественников (Ferrari G., et al., 1995 Schwartz G.M., et al., 1995). Нарушения морфо-функциональной активности стромальных клеток костного мозга выявляются на любой стадии ВИЧ- инфекции (Re М.С.,1991, Nea! T.F.,1995). При исследовании состояния костного мозга у пациентов, находящихся на разных стадиях ВИЧ - инфекции, были получены аналогичные результаты. Причем степень изменений в костном мозге была значительно выше и опережала их проявления в периферической крови. Прогрессированию поражения могут спосбство-вать различные факторы: алкоголь, наркотики и дополнительная вирусная инфекция. Интенсивной репликации HIV в инфицированных стромальных фиб-робластах костного мозга не происходит (NeaL T.F.95), а наблюдается длительная персистенция вируса и создание резервуара долговечных инфицированных клеток.

По аналогии с ВИЧ-1 персистенция HCV в клетках, участвующих в регуляции кроветворения, а именно моноцитах / макрофагах, может сопровождаться развитием дисбаланса цитокинов в результате нарушения их функций (Koziel M.J., 1989). Точка зрения о персистенции вирусов гепатита В и С в моноцитатах/ макрофагах кроветворного микроокружения является наиболее распространенной (Лукина Е.А. с соавт,2000, Luppi M., 1997). При этом авторы не исключают возможность вовлечения в патологический процесс других клеток кроветворного микроокружения.

Главным компонентом етромы костного мозга являются ретикулярные клетки (Tavassoli М., 1989), одна из их основных функций - регуляция миграции зрелых клеток крови из костного мозга в кровеносное русло (Shaklai М., 1989). Наличие вирусоподобных частиц и перестройка гетеро-аухроматина в эндоте-лиоцитах и ретикулярных клетках костного мозга у больных ХГС и положительные результаты молекулярно-биологичеких анализов на наличие РНК HCV в трепанобиоптатах подвздошной кости, указывают на возможность персистен-ции вирусов гепатита С в ретикулярных клетках костного мозга.

Проведенные исследования культуры ретикулярных клеток костного мозга подтвердили нарушения их функциональной активности, обусловленной пер-систенцией вируса. Многочисленные исследования показали, что патогенетические механизмы, лежащие в основе нарушений дифференцировки гемопоэти-ческих клеток-предшественников и изменений характеристик лимфоидных клеток обусловлены нарушением морфофункциональных свойств элементов кроветворного микроокружения (Лукина Е.А. с соавт., 2000 , AllenT.D., 1984, Davis В et al., 1990). В проведенном исследовании выявлена прямая взаимосвязь между степенью нарушений в структуре стромальных клеток, состоянием Т- лимфоцитов и продукцией цитокинов. Так, в группе больных ХГС с проли-феративной активностью стромальных клеток по гипопластическому типу отмечалось отчетливое снижение Т- лимфоцитов и более выраженный цитокино-вый дисбаланс. Изменение структуры стромальных клеток ведет к нарушению процессов регуляции апоптоза. В настоящее время доказана роль стромальных клеток костного мозга в регуляции апоптоза гемопоэтических клеток-предшественников (Juneja H.S.,1994). Отражением этого, по мнению А.О.Буеверова с соавт (2000г), является усиление апоптоза клеток периферической крови у больных хроническим вирусным гепатитом. Авторы также не исключают как возможность повреждающего действия гепатотропных вирусов на лейкоциты, так и влияние системного действия провосполительных цитокинов, и, в частности, ФНОа.- наиболее мощного цитокина с проапоптогенным эффек-

том. Повышение ФНОа в сыворотке крови отмечалось и у обследованных нами больных ХГС с выраженными структурными изменениями стромальных клеток костного мозга, что также подтверждает нарушение клетками продукции цитокинов в результате их вирусного поражения.

Полученные данные позволяют сделать вывод об общности патогенеза дис-регуляции кроветворения у больных ВИЧ - инфекцией и гепатитом С. Механизм этих нарушений может быть представлен следующим образом (схема). Вирусное поражение организма и, как следствие этого, инфицирование стромальных клеток костного мозга, ведущее к нарушению их функций, развитие дисбаланса цитокинов и нарушение регуляторного влияния стромальных клеток на стволовые кроветворные клетки. Результатом всех этих перестроек является неэффективной гемопоэз с количественными и функциональными изменениями клеток гемолимфопоэза, клиническое проявление которого выражается в развитии неполноценного иммунного ответа, способствующего хронизации инфекционного процесса.

Возможность длительной персистенции НСУ в стромальных клетках костного мозга (что доказано положительными результатами ПЦР на РНК НСУ в трепанобиоптатах подвздошной кости и наличием вирусных включений в эндо-телиоцитах и ретикулярных клетках костного мозга) может способствовать формированию резервуара вируса по аналогии с ВИЧ. Наличие таких очагов создает условия для генерации инфицированных клеток, способных к миграции в периферическую циркуляцию и диссеминации инфекции. Первыми клиническими проявлениями диссеминации инфекции, вероятно, можно считать положительные результаты реакции ПЦР на РНК НСУ в сыворотке крови, что наблюдалось у обследованных больных.

ТакидГ образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют об участии стромальных клеток кроветворного микроокружения костного мозга в патогенезе развития неполноценного иммунного ответа, способствующего про-грессированию хронического вирусного гепатита и ВИЧ - инфекции. Получен-

ные данные указывают на возможность инфицирования НСУ эндотелиоцитов и ретикулярных клеток кроветворного микроокружения костного мозга, что необходимо учитывать при обследовании больных и проведении противовирусной терапии.

СХЕМА

РОЛЬ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА В РАЗВИТИИ ИНФЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА ПРИ НСУ ИНФЕКЦИИ

выводы

1. На основании комплексного морфологического и молекулярно-биологи-ческого исследования, проведенного у больных хроническим гепатитом С и ВИЧ-инфекцией, установлено значение поражения стромальных клеток кроветворного микроокружения костного мозга в развитии и прогрессировании заболевания, а также общность в патогенезе дисрегуляции гемолимфопоэза, ведущего к развитию иммунодефицитного состояния. При ВИЧ-инфекции изменения стромальных клеток костного мозга на ранних стадиях заболевания значительно опережают изменения в периферической крови.

2. Показана возможность персистирования вирусов гепатитов С и В в эндоте-лиоцитах и ретикулярных клетках кроветворного микроокружения костного мозга и установлено приоритетное значение HCV в их инфицировании у больных хроническим гепатитом смешанной В и С этиологии. У 71% больных выявлялись положительные результаты ПЦР на РНК HCV в трепанобиптатах, в то же время реакция на ДНК HBV была отрицательной.

3. Установлено, что при остром вирусном гепатите не наблюдается персистиро-вание HBV в стромальных клетках костного мозга, отмечено лишь их гиперфункциональное состояние по результатам ультраструктурного исследования.

4. При проведении комплексного морфофункционального исследования состояния стромальных клеток кроветворного микроокружения костного мозга и изучения их пролиферативной активности in vitro было установлено, что наряду с развитием гипоплазии костного мозга у больных со сроком инфицирования более трех лет отмечается гипопластический тип пролиферативной активности стромальных клеток, сопровождающийся изменением продукции цитокинов.

5. Выявлены различия в изменениях Т-лимфоцитарного звена иммунитета и цитокинового статуса у больных хроническим гепатитом С с учетом длительности заболевания и поражения стромальных клеток костного мозга. Так, у больных с длительностью заболевания более трех лет и гипопластическим типом полиферативной активности определялось более выраженное снижение

СБ 16, СБ25 Т-лимфоцитов и повышенное содержание в сыворотке крови ФНОа.

6. При проведении комплексного изучения влияния низкоинтенсивного лазерного излучения на течение острого вирусного гепатита В и хронического гепатита С показано, что в основе его положительного влияния на течение заболевания лежит нормализация процессов перекисного окисления липидов. Установлено отсутствие отрицательного воздействия этого метода лечения на состояние стромальных клеток кроветворного микроокружения костного мозга.

7. Выявлены отличия в эффективности воздействия рекомбинантного ИЛ-1Р (бетапейкина) на состояние Т-лимфоцитов, цитокиновый статус и активность репликации НСУ у больных хроническим гепатитом С с различными сроками заболевания. По результатам ультраструктурного изучения трепанобиоптатов установлен положительный эффект воздействия ИЛ-1Р (бетапейкина) на состояние эндотелиоцитов костного мозга у больных с длительностью заболевания менее трех лет, выражавшийся в появлении молодых эндотелиоцитарных клеток кроветворного микроокружения костного мозга.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для объективной оценки выраженности инфекционного процесса при хроническом вирусном гепатите С целесообразно проведение исследования состояния костного мозга методом трепанобиопсии с использованием реакции ПЦР на наличие РНК НСУ в сыворотке крови и трепанобиоптатах. Проведение данного исследования позволит дать более объективный прогноз развития заболевания и эффективности планируемой терапии.

2. Применение низкоинтенсивного лазерного излучения в качестве дополнительного компонента комплексной терапии целесообразно при остром вирусном гепатите В или при других формах вирусных гепатитов с выраженной клинической симптоматикой. Лазерное воздействие проводится на область печени, локтевые вены и подвздошные кости с обеих сторон. Длительность облучения

одной области составляет 4 минуты, доза облучения 5-10 Дж. Продолжительность курса не более 10 сеансов.

3. Отечественный рекомбинантный ИЛ-1р (беталейкин) целесообразно использовать в качестве иммунорегулирущего средства у больных хроническим вирусным гепатитом С с длительностью заболевания до трех лет. Учитывая результаты проведенного исследования, целесообразно проведение повторных курсов терапии беталейкином с интервалом 2 месяца в течение полугода. Препарат следует применять в дозе 7 нг/кг в сутки внутривенно капельно в разведении в 400 мл 5% раствора глюкозы. Курс лечения составляет 10 инфузий, которые проводятся с интервалом в один день.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Н.И. Кузнецов, Е.В.Степанова, Е.И.Романова. Опыт использования лазерной акупунктуры при лечении больных вирусным гепатитом В // Тезисы докладов конференц. Актуальные вопросы инфекционной патологии - СПб., 1993-С.94.

2.Е.И.Степанова, Е.И. Романова, Н.И.Кузнецов. Состояние гемостаза у больных вирусным гепатитом и ВИЧ инфицированных // Тезисы докладов конференц. Актуальные вопросы инфекционной патологии - СПб., 1993- С.176.

3. А.Г.Рахманова, Е.Н.Виноградова, Т.П.Демиденко, Н.И.Кузнецов. Диагностика острого вирусного гепатита С с использованием полимеразной цепной реакции // Сбор.тезисов докл. междунар. симп. «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» - СПб., 1995-С.98.

4. V Ovsiannikov, N. Kuznetsov, I. Petrov, et al. Lazer Therapy of Hepatitis // Lazer Therapy An international journal Lazer Therapy and Photobiactivation- 1996-V.8, N 1- P.27-28

5. V Ovsiannikov, N Kuznetsov, N Pustashova et al. Lazer therapy of viral hepatitis // Lazer & technology clnical and experimental- 1996- V.6, No3 September-Descember- P. 115-119.

6.А.Г.Рахманова, Н.И.Кузнецов, В.И.Ругаль, М.И.Гурули. Гемопоэз и кроветворное микроокружение при ВИЧ- инфекции // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы-СПб., 1997-Т.1,№1-С.201-202.

7.Н.И.Кузнецов, О.А.Мастерова, Г.Г. Родионов Влияние солкосерила на состояние свободнорадикального окисления системы крови у больных вирусным гепатитом В // «Инфекционные болезни: современные концепции терапии» Тезисы докл.- СПб., 1997-25-30 мая-С.31

8.А.Г.Рахманова, Н.И.Кузнецов, В.И.Ругаль и др. Взаимоотношения между ге-мопоэтической и иммунной системой у ВИЧ-инфицированных наркоманов // «Инфекционные болезни: современные концепции терапии» Тезисы докл.-СПб., 1997-25-30 мая-С.41

9. Н.И.Кузнецов, О.А.Мастерова, В.А.Овсянников Сравнительный анализ лазерного облучения различных зон организма больных вирусными гепатитами В и С // Матер. 4 Междунар. конфер. « Проблемы лазерной медицины», посвя-щеной 10 летию Московского областного центра лазерной хирургии - Москва-Видное, 1997-С.192.

10.В.А.Овсянников, И.Б.Петров, Н.И.Кузнецов, Н.В.Сизова О возможном механизме и особенностях лазерной терапии инфекционных заболеваний // Матер. 4 Междунар. конфер. « Проблемы лазерной медицины», посвященой 10 летию Московского областного центра лазерной хирургии- Москва - Видное, 1997-С.284.

11. Н.И. Кузнецов, О.А.Мастерова, Г.Г.Родионов. Использование солкосерила в комплексной терапии вирусного гепатита // Сборник науно-практических работ « Солкосерил: итоги и перспективы» - СПб, 1997- из-во СПбГТУ - С.24-25.

12. В.И.Ругаль, Н.И.Кузнецов Структура костного мозга при ВИЧ-инфекции // Морфология- 1997-№6-С.58-59.

13. Т.П.Демиденко, Н.И.Кузнецов, О.А.Мастерова. Неовир в терапии вирусного гепатита В // Росс, журнал гастроэнтер., гепатол., колопроктол,- 1997-Т.7, №5- Прилож. №4-С.143.

14.Н.И.Кузнецов, В.И.Ругаль, М.Ш.Гурули и др. Морфофункциональные изменения костного мозга у больных вирусным гепатитом В // // Росс, журнал гастроэнтер., гепатол., колопроктол.- 1997-Т.7, №5- Прилож. № 4- С.ЗОЗ.

15. N. Kuznetsov, A.Rachmanova, V.Rugal. Morphometric studies of medulla in HIV / AIDS patients // 4th International Congress on AIDS in Asia and the Pacific. -Manila, 1997- Poster Abstracts - P.228.

16. В.А.Овсянников, Н.И.Кузнецов, И.Б.Петров и др. Лазерная терапия инфекционных заболеваний: гепатит, ВИЧ/ СПИД // Тезис, докл. науч. конфер. Медицинская физика 97- Новые технологии в радиоционной онкологии- 1997, 8-12 декабря-С.75.

17. V.Rugal, N. Kuznetsov, V Ponamorenko. Hemopoiesis and hemopoietic microenvironment in HIV patients (Report 1) // XIV th meeting of Int Soc. Haema-tol.Stocholm, Sweden- 1997, 30VIII -4IX-Posters Abstracts - P.125.

18. Т.П. Демиденко, Н.И.Кузнецов, O.A. Мастерова и др. Использование Неовира в лечении вирусного гепатита В // Вирусные гепатиты и другие актуальные инфекции - СПб, 1997- из-во «ССЗ»- Т.2 - С.7 -10.

19 Н.И.Кузнецов, О.А. Мастерова, В.А.Овсянников Использование полупроводникового лазера при лечении вирусных гепатитов В и С // Вирусные гепатиты и другие актуальные инфекции - СПб, 1997- из-во «ССЗ»- Т.2 - С.39-42.

20.Н.И. Кузнецов, М.Ш.Гурули, О.А. Мастерова и др. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на пигментный обмен и свободнорадикалькое окисление у больных вирусным гепатитом В // // Росс, журнал гастроэнтер., гепатол., колопроктол,- 1997-Т.7, №5 - Прилож. № 4 - С.302.

21.А.Г.Рахманова, Т.П.Демиденко, Н.И. Кузнецов и др. Варианты HBV в сопоставлении с клиническим течением вирусного гепатита // Актуальные вопросы ВИЧ- инфекции - СПб, 1997- Сборник науч. практ. работ - С.65-66.

22. А.Г. Рахманова, Н.И.Кузнецов, Н.В.Сизова Возможность использования низкоинтенсивного лазерного излучения при лечении ВИЧ - инфицированных больных // Актуальные вопросы ВИЧ- инфекции - СПб.,1997 - Сборник науч. практ. работ - С.70-71.

23.Н.И.Кузнецов, В.И.Ругаль, Ю.Л.Терехин Динамическое наблюдение состояния клеток костного мозга при ВИЧ-инфекции // Актуальные вопросы ВИЧ-инфекции - СПб.,1997 - Сборник науч. практ. работ - С.91-92.

24.Н.И.Кузнецов, A.C. Симбирцев, М.Ш.Гурули и др. Первый опыт использования беталейкина при лечении вирусных гепатитов В и С // Актуальные вопросы ВИЧ- инфекции - СПб., 1997- Сборник науч. практ. работ,- С.89-90.

25. Н.И.Кузнецов, O.A. Мастерова Состояние свободнорадикального окисления крови, клеточного метабализма печени у больных с острым течением гепатита В при применении Солкосерила // «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» -СПб., 1998- Матер, конфер,- С.89

26. Н.И. Кузнецов, Е.С. Романова Беталейкин в лечении вирусных гепатитов В и С // «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» - СПб, 1998- Матер, конфер.-С.91.

27. V.Rugal, N. Kuznetsov, V Ponamorenko et al. Mixed HCV and HBV infection of bone marrow // 5th Nato BloodConference 98 Lisbon Portugal, 25/27May - Posters Abstracts - P. 505.

28. V.Rugal, N. Kuznetsov, V Kravets Hemopoietic microenvironment in HIV patients // Brit J. Haematology - 1998 - V.102, N1- P.164-165.

29.A.Г.Рахманова, Т.П.Демиденко, Н.И. Кузнецов, E.B. Степанова. Этиопатоге-нетическая терапия вирусных гепатитов В и С (учебное пособие)- СПб, 1998 -Из-во СПбГТУ - 42 с.

30. Е.С.Романова, Н.И. Кузнецов, Л.Н.Крыга и др. Профилактическое значение выявления и лечения больных вирусным гепатитом С // СПб, 1999 - из-во «ССЗ»- Медико-организационные проблемы актуальных болезней - С.38-40.

31. Е.С.Романова, Н.И. Кузнецов, А.С. Симбирцев Рекомбинантный интерлей-кин 1 р в терапии больных вирусным гепатитом С // Тезисы докл II съезд иммунологов России - Сочи, 1999 - С.25.

32. Е.С.Романова, Н.И. Кузнецов Беталейкин в лечении вирусных гепатитов В и С // Тезисы докл.- Ш-я Российская научно - практическая конференция с международным участием «Гепатит В, С и Д проблемы диагностики, лечения и профилактики»- 1999 - С. 120-121.

33.Н.И.Кузнецов, В.И.Ругаль Изменения структуры костного мозга у больных гепатитом С в сочетании с ВИЧ- инфекцией // Тезисы докл.- Ш-я Российская научно - практическая конференция с международным участием «Гепатит В, С и Д проблемы диагностики, лечения и профилактики» - 1999 - С. 121-122.

34. V.Ovsiannikov, N. Kuznetsov, O.Masterova et al. Mechanism of laser therapy for viral hepatitis // Third International Conference Therapies for Viral HepatitisUSA, Maui, December 12-16, 1999 - Program, Abstracts- P.41, Ab-106.

35. А.Г.Рахманова, А.С. Симбирцев, Е.С.Романова, Н.И. Кузнецов и др. Результаты применения рекомбинантного интерлейкин ip (Беталейкина) в комплексной терапии вирусных гепатитов В и С // Эпитемиология и инфекционные болезни - 2000-№ 3 - С.28-30

36. Е.С.Романова, А.С. Симбирцев, Н.И. Кузнецов Новый отечественный препарат Беталейкин в комплексной терапии больных хроническими вирусными гепатитами «С» и «В» // Аллергология и иммунология - 2000 - Т. 1, № 2- С.23.

37. N. Kuznetsov, V.Rugal Hepatitis С is a general disease of human // 10th ECCMID, Stockholm, Sweden, May 28-31,2000- Abstracts book, P.86.

38. V.Ovsiannikov, N. Kuznetsov, T Sologub et al. Laser therapy of infections diseases results and mechanism of theatment // 3 rd international Meeting Hands on Courses 15 International Congress Laser Medicine ICLM 2000 - Florence, October 18-21, 2000 - Abstracts book- P. 16.

39. Н.И.Кузнецов, В.И.Ругаль, А.Г.Рахманова ВИЧ-инфекция и система кроветворения // ВИЧ- инфекция (клиника и лечение)- под редакц. А.Г.Рахмановой, СПб., 2000 - из-во «ССЗ» - С.34-43.

40. Е.С.Романова, Н.И.Кузнецов, В.И. Кабанова и др. Воздействие рекомби-нантного интерлейкин 10 человека на некоторые иммунологические показатели у больных хроническим вирусным гепатитом С // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы - СПб., 2001-Т.5, №1-С.59.

41.В.Г. Конусова, Е.С. Романова, Н.И. Кузнецов и др. Влияние интерлейкин 1р на свободнорадикальные процессы у больных гепатитом С // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы - СПб., 2001-Т.5, №1-С.62.

42. . Е.С.Романова, В.И. Кабанова, Н.И.Кузнецов, и др. Рекомбинантный интерлейкин 1 р человека в лечении хронического вирусного гепатита С // «Актуальные инфекции начала XXI века »- СПб, 2001-из-во «ССЗ»- С. 112-116.

43. А.Г.Рахманова, В.А.Неверов, Г.И. Кирпичникова, Н.И.Кузнецов и др. Вирусные гепатиты (этиопатогенез, эпидемиология, клиника, диагностика и терапия)- Кольцово, 2001-57с.