Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Роль простагладинов в развитии иммунодефицита и регуляции репарации после травмы

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ КйИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ

На правах рукописи

НАБИШИН Рустем Русланович

РОЛЬ ПРОСТАШЩИНОВ В РАЗВИТИИ ИММУНОДЕФИЦИТА И РЕГУЛЯЦИИ РЕПАРАЦИИ ПОСЛЕ ТРАВШ

14.00.36 - Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск, 1991

Работа выполнена в Институте клинической иммунологии Сибирского отделена Академии медицинских наук СССР

Научный руководитель: академик АЩ СССР, профессор В. П.Лозовой

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Д.Н.Маянский кандидат медицинских наук А.П.Колесников Ведущее учреждение: Институт иммунологии ¡¿¡шстерства здравоохранения СССР

Защита диссертации состоится " "_1991 г.

в" " часов на-заседании специализированного совета К C0I.0I.0I Института клинической иммунологии СО АМН СССР по адресу: 630091, г. Новосибирск, ул. Ядринцовск&ч, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института клинической иммунологии СО АМН СССР

Автореферат разослан и_" _1991 г.

Учений секретарь специализированного совета

кандидат биологических наук Лууцс fil ОЛ.Кудаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕШ. Травма является самой частой причиной временной утраты трудоспособности, а инвалццизация достигает 29% (Григорьев Ы.Г. с соавт.1977). Несмотря на строгое соблюдение правил асептики и антисептики, применение все более "мощных антибиотиков и других антисептических средств частота гнойных осложнений травки не уменьшается, и даже наметилась тенденция к их росту. Самым грозным осложнением является сепсис, летальность при котором составляет до ЬО/Ь Свакег о.о.,I960; Колкер И.И. и соавт.1961). Общая смертность при травме достигает 10% пострадавших. Тяжелая травма требует длительного находдения пациента в реанимационном отделении и далее в обычной палате, что обусловливает высокие экономические затраты на лечение данной категории больных. Неудивительно, что проблема борьбы с гнойными осложнениями травмы является актуальной проблемой в медицине. Актуальность эта возросла в "эру промышленных катастроф", приматами которой стали одномоментные массовые поражения населения.

В то же время, причина повышенной восприимчивости травмированных. пациентов к инфекционным агентам сегодня полносты не ясна.

Исследования, проведенные как на клиническом материале, так и на лабораторных животных показали многочисленные изменения в именной системе после травмы (Редькин Ю.В. и соавт. 1983; Faist E.,etai, 1966; Burleson D.G. et al.,I968). До настоящего времени недостаточно изучен вклад различных факторов травмы в качестве причин развития иммунодефицита,' так что ряд иммунологов считает, что "сама травма является .причиной иммуносупрессии'4 Green D.K. et al,I9B8).

Неясна и патогенетическая (а возможно, и саногенетичес-кая) роль иммуносуцрессии в травматической болезни, хотя высказано предположение, что иммуносупрессия - это реакция организма, предупреждающая массивный аутоиммунный ответ на неоантигены, появляющиеся после ПОврелщеНИЯ (Hansbrough J.F. et al 1987), которое поддерживается рядом авторов, подчеркивавших роль "аутосенсибилизацвд" в течении травмы (Долгушин И. И. и соавт. 1969J. Остается дисскусионным вопрос о взаимосвязи иммуносупрессии с хирургической инфекцией и сепсисом: ряд авторов прямо указывают на иммунодефицит в качестве причины

развития инфекционных осложнений (Munster a.m. 1976). Другие •авторы резонно считают, что клеточный иммунодефицит не может являться причиной бактериальных инфекций, так как при травме, как драЕило, гуморальные зффекторные функции сохранены ( DiPa-dova е.,et aljsfi8). Данные факты свидетельствуют о необходимости дальнейшего изучения различных факторов, определяющих течение травматической болезни.

Б настоящее время вшшую роль в регуляции иммунных реакций отводят цростагландинам (ПГ), наиболее активншш кз zîoto-рых являются ПГ группы Е. Показана способность DTEg ингибиро-вать пролиферации иымунокомпетентных клеток, подавлять синтез ÏUI-2 и эксцресси» рецептора к нему, суцрессировать многие реакции именной системы. Интенсивно изучается роль ПГ в клинике таких заболеваний как ревматоидный артрит, саркоидоз, различные опухоли ( Brunda M.J. I960; Wolinsky S., 1680; Goodwin J.s., IS63). Возможная роль ПГ в течении посттравматического периода неисследована, хотя ПГ обладает мощным супрессивным эффектом на те функции иммунной системы, которые подавляется при травме. Выяснение роли ПГ позволило бы целенаправленно регулировать его продукции и таким образом влиять на реакции имцунной системы.

Известно, что ITTEg подавляет рост фибробластов в культуре. Таким образом, возмонно его прямое или опосредованное участие в репарации после травмы.

Другим аспектом цротивоинфекционной защиты является аутодеркопластика, которая широко применяется яри обширных ояогах. Однако достаточно часто аутопластика не только не дает положительного эффекта, но и усугубляет течение посттравматического процесса из-за лизиса хояного трансплантата. Изучение эффекторных клеточных функций позволило бы своевременно диагностировать и корригаровать данное осложнение. Для этого необходима разработка новых методов оценки эффекторных функций, адаптированных для нуед практического здравоохранения.

В силу вышесказанного, мы цроводили исследования на системах, позволявших,моделировать влияние различных факторов на иммунную систему и репаративные процессы, а также их взаимодействие.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работы явилось» изучение роли ЛГ-продуцирувщих клеток в развитии посттравыа-тического иммунодефицита и регуляции репаративных процессов, обоснование и разработка ранней имыунокоррекции для профилактики гнойных осложнений и стимуляции цроцессов"репарации после травш.

В ходе работы решались с л едущие задачи:

1. Исследовать динамику ^-продуцирующих супрессороь пролиферации при осложненном и неосложненном течении посттравматического периода.

2. Изучить роль 11Г во взаимодействии иммунокоыпэтентных клеток с фибробластами в культуре.

3. Оценить активность аспирина и тактивина в отношении репаративных процессов в посттравматическом периоде и в моделях взаимодействия имцунокомпетентных клеток с фибробластами ин витро.

4. Разработать метод ранней иммунокоррекцик-с целью профилактики гнойно-септических осложнений травш и стимуляции репаративных цроцессов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ НОВИЗНА. Впервые показана различная динамика ПГ-синтезирувщих супрессорных клеток при вариантах течения травмы: при осложненном течении травматической болезни отмечается активация супрессоров в первые 2-3 недели посттравматического периода. При неослокненном -снижение активности в те же сроки. Обратная динамика получена для активности надосадочной жидкости культур мононуклеарных клеток в отношении роста фкбробластов: при осложненном течении ингибиция, а при неосложненном - стимуляция пролиферации фкбробластов. Предварительная обработка. ШК аспирином не влияла на стимулирующую активность, но изменяла ингибирувщую на стилфлируюцую.

Впервые показано, что малые дозы аспирина (как блокатора циклсоксигеназного пути метаболизма врахвдоновой кислоты) обладают стимулирущим эффектом на процессы репарации к иммунную систему.

Показано, что препарат тимуса тактйвин и аспирин обладают синергическим эффектом на пролиферацию фибробластов.

Продемонстрирована клиническая эффективность применения этих препаратов. Выявлена действенность тактивина в модуляции функции.

ЯРАЮ'ИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Разработан и апробирован метод оценки активности эффекторов ПЗТ, адаптированный к применению в условиях практического здравоохранения, не требующий специального оборудования. Метод прошел проверку в КузШШРе г. Прокопьевска, ОВГ 333 г. Новосибирска и ряде цругих клиник при использовании в клинических исследованиях различных иммунопатологических состояний. Способ может быть использован практически во всех учреждениях здравоохранения для оценки клеточного иммунного ответа у больных с иммунопатологическим компонентом (травма, ожог, гнойная и инфекционная патология и т.д.).

Показано иммуномодулирукцее действие тактивина на функции ГЗТ у больных остеомиелитом и посттравматическим остеоартритом: повышение функциональной активности клеток ГЗТ в ответ на неспецифическую (®ГА) и снижение - в ответ на специфическую активацию "фибробластическим антигеном" (водно-солевой экстракт фиб-робластов эмбриона человека).

В результате исследований различных сочетаний препаратов разработана, апробирована и внедрена схема иммунокоррекции, включающая аспирин, преднизолон и тактивин, црименение которых с первых дней после травмы в 1,6 раз снижает сроки эпителиза-ции ожоговой поверхности.

Данная схема используется в отделении реанимации I ГКБ г. Новосибирска, а также в работе отряда экстренной иммунологической помощи, работавшим в местах массовых термических поражений (взрывы в гг. Алма-Ата, Уфе-Челябинске).

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИШЕ НА ЗАЩИТУ;

1. В раннем периоде травматической болезни активация процессов репарации при благоцриятном течении посттравматического периода соцровоздается снижением активности ДГ-продуцирующих суцреосоров и угнетением активности ГЗТ-эффекторов, специфич-гак к антигенам соединительной ткани, что необходимо для активации репаративных процессов.

2. Осложненное течение травматической болезни сопровождается повышением активности ЯГ-продуцирующих супрессоров в раннем периоде, активацией ГЗТ-эффекторов, специфичных к антигенам соединительной ткани в период осложнений (при остеомие-

лиге).

3. Сочетанное применение аспирина и тактивина являег-я эффективным методом иммунокоррекции для профилактики'гнойных осложнений транш и сокращения сроков эпителизации раневой поверхности.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, изложенных в В главах, заключения и выводов. Диссертация иллюстрирована 5 таблицами и 25 рисунками. Список литературы состоит из 167 источников, из них 29 работ отечественных авторов.

АПРОБАЦИЯ РАБОШ И ПУБЛИКАЦИИ. Полученные результаты доложены на конференции "Экспериментальная и клиническая иммунология на Востоке страны", 1968, Красноярск; Всесоюзной конференции "Система мононуклеарных фагоцитов в норме и патологии", 1990, Новосибирск; Всероссийской конференции "Актуальные вопросы медицины катастроф", 1990, Уфа.

Апробация работы состоялась на расширенном семинаре Института клинической иммунологии 15 декабря 1990 года.

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, получено авторское свидетельство на изобретение:

материалы и ызтода ИССЛЕДОВАНИЯ

Обследовано 104 пациента с открытыми и закрытыми переломами длинных трубчатых костей и с термическими ожогами различной степени в динамже после травмы. В качестве группы сравнения обследовано 32 здоровых донора. Обследование и лечение больных проводилось на базе I П{Е г.Новосибирска и Кузбасского НИ' травматологии и ортопедии г. Прокопьевска.

Монон/клеарные клетки (МНК) выделяли из венозной крови обследуемых лкц традиционным методом на градиенте плотности фкколл-верографин. Моноциты частично удаляли прилипанием к пластиковой поверхности с последующим осаждением фагоцитов в магнитном поле с помощью карбонильного железа. МНК разносили в лунки по 10° клеток в среде йРЫ-1640, дополненной 10% инактн-вкрованной АВ сывороткой, 2 мМ глютамина, 40 мкг/мл гентаымцинв

ь

(в дальнейшем - "полная среда").

Б контрольные культуры добавляли $ГА Р ("ДШТО", США) в конечном разведении 1:25000, в опытные - ФГА + индометацин (1икг/т) и ФГА + аспирин (2мкг/мл). За 4 часа до окончания 72-часового культивирования в увлажненной среде с 5?о при 37°С в каждую лунку вносили 0,04 МБК ^Н-тимидина, клетки переносили на фильтры с помощью харвестра и определяли радиоактивность в бетта-счетчике. Влияние индометацина и аспирина выражали как индекс влияния (ИВ), равный частному от деления радиоактивности опытной и контрольной культур.

Фибробласты эмбриона человека (ФЭЧ) выделяли стандартным методом (ВеЬивЪго, 1962). Суспензию ШК пациента делили на 2 части - опыт и контроль. Контрольные клетки обрабатывали аспирином (2мкг/мл) I час при 37°С, необратимо ингибируя синтез ПГ, затем троекратно отмывали. Контрольные и опытные клетки разносили по лункам и культивировали как описано выше. Через 72 часа надосадочные жидкости собирали и добавляли в культуру ФЭЧ (10^ клеток в полной среде). За 4 часа до окончания 3 -суточного культивирования в лунки вносили 0,04 4БК Н-тими-дина. Ивдекс влияния высчитывали по формуле:

пролиферация в опыте(имп/мин-пролиферация в конт.(имц/ыин)

ИВ=---

пролиферация в контроле (имц/мин)

Определение активности КЛ-1 в супернатантах культур моноцитов крови оценивали стандартным методом по пролиферации ти-моцитов мышей (Satsangy а. et а1. Д967). Суспензию моноцитов крови получали при адгезии прилипающих клеток МНК к обработанному 0,1% раствором желатина пластику. МНК в концентрации 5x10^ клеток (10% АВ сыворотки) инкубировали 60 мин в ^-инкубаторе при 37°С. Чашки с прилипшими клетками помещали в холодильную камеру (4°С) в среде 199 на 25 мин, затем клетки собирали, смывая с поверхности чашки холодным забуференным С,ё6:й раствором хлористого натрия и центрифугировали 5 мин при 1000 об/мин при 4°С. Обогащенную суспензию моноцитов инкубировали в полной среде 24 часа в СО^-инкубаторе. В параллельных исследованиях к культурам добавляли I мкг/мл индометацин ("МЕВК", ФРГ). Супернатанты собирали, центрифугировали и хранили при -70°С.

Ткмоциты мышей ВА В/С в возрасте 2-х месяцев в концент-

С.

рации 0,5x10 клеток культивировали в полной среде с добавлением 0,05 мл супернатанта культур моноцитов (опыт). Тимоциты культивировали 72 часа в СО^-инкубаторе. За 18 часов до конца инкубации вносили I мкКю %-тимидина. Затем клетки собирали на фильтры, радиоактивность оценивали в бетта-счетчике. Для учета эффекта воздействия супернатантов, отражающих активность продуффуемого Ий-1, использовался индекс влияния (ИВ): число имп/мин в опыте число имп/мин в контроле

Данный раздел исследований проведен совместно со старшим научным сотрудником ИКИ СО АМН СССР Т.В. Шхеенко.

Активность ИЯ-2 в надосадочных жидкостях определяли им-муноферменткым методом. Исследовались супернатанты как ин-тактных 3-суточных культур МНК, так и культуры, предварительно обработанные I час аспирином и дважды отмытые.

На первом этапе стандартный образец рШ-2 и исследуемые супернатанты раститровывали по лункам планшета, делая двоичные разведения. После внесения образцов планшет инкубировали во влажной камере при 3?°С в течение 30 минут, лри этом Ш-2 в образцах связывался с моноклоналышми антителами к Ш-2, фиксированными н лункам. После инкубации и стандартных процедур отмывки в планшет вносились биотилированные' антитела к ИЛ-2. После инкубации и внесения коныогата стрептавидина с пероксидазой хрена, производили отмывку и вносили стандартный субстрат пероксидазы О-фенилендиамин (0$Д). Учет результатов проводили на спектрофотометре "УБИСК/Ш"- 2. Абсолютное содержание ИЛ-2 в исследуемых сулернатантах высчитывались соответственно калибровочной кривой. Результаты выражались

в нанограммах/мЛ'

Определение функциональной активности клеток эффекторов гиперчувствительности замедленного типа (ГЗГ) проводилось в разработанной наш системе (A.C.I5757II, В.С.Кожевников, Р.Р.Набиуллин, С.В.Богидаев, В.П.Лозовой, 1987). Клетки, полученные из лейковзвеси пациентов, 2-кратно отмывали средой 199 и вносили 50 мкл суспензии в концентрации ^ млн/мл (10% сыворотки крупного рогатого скота, 40 мкг/мл гонтамицина) в круглодонные лунки планшета (г.Ленинград).

В лунки I и 2, где исследовалась спонтанная активность клеток ■эффекторов добавляли 50 мкл среды 199 (контроль), в лунки 3, 4-50 мкл среды с 5ГА-Р СДИФКО", США) в разведении I:25CG (стимулирующая доза), в лунки 5, б - 50 мкл среды с ФГА-Р в разведении 1:500 (кнгибирующая доза). Планшет инкубировали 18 часов при 37°С в увлажненной атмосфере с 5"о COg, далее 10 минут при комнатной температуре в наклонном положении (60-80°), после чего неприлишие клетки удалялись многоканальной пипеткой, а б лунки вносили ЮС мкл раствора Версена. После 30 минутной инкубации число клеток просчитывали в камере Горяева. Интегральный показатель эффекторных функций ГЗТ на данный стимул (П34) рассчитывали по формуле:

индекс миграции

ЛЭФя-

индекс ингибиции миграции

где, иццекс миграции (ИМ) - частное от деления количества клеток в опыте с стимулирующей миграцию дозой STA или антигена на количество клеток в контроле, а индекс ингибиции .миграции (ШМ) - частное от деления количества клеток е опыте с ингибирующей дозой ЗГА или антигена на таковое в контроле.

Дозы и время обработки культур клеток тактивином, индо-метацином и аспирином указаны в соответствующих раздела;«.

■ Математическая обработка данных производилась на ЭВМ ДВН-3. Проверка нулевой гипотезы о соответствии эмпирических данных нормальному распределению не подтвердилась, поэтому при статистической обработке использовались непараметрические критерии "U" Вилкоксона-л'анна-Уктни, ранговый коэффициент Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБОдЦьН^Е

Активность простагландин - синтезирующих суппессорных клеток в динамике после травмы.

Супрессорную активность моноцитов/макрофагов оценивали с использованием ицдометацина или аспирина, вносимых в культуры МНК, стимулированных йГА. В данной модели моноциты/макрофаги оцениваются как простаглаццин-синтезиру&цие супрес-соры пролиферации лимфоцитов ( uoodwin л.а.и соавт. 1976,

1985). Ингибйция простагландин-синтетазы индометацином приводит к отмене судрессорного эффекта, что выражается в усилении включения Н-тимидина по сравнению с культурами без • ивдометацина. В этой же системе мы использовали необратимый ингибитор 11Г-синтетазы аспирин (Варфоламеев С.Д., 1985). Установлено, что низкие дозы аспирина (1-5 мкг/мл) стимулируют пролиферацию МНК в ответ на ФГА, наибольший прирост пролиферации отмечается при дозе 2 мкг/мл - ИВ« 1,9 £ 0,26 (р<0,05). Эта доза, вызывающая максимальный стимулирующий эффект с наименьшей ошибкой величин у доноров и была использована в дальнейшем, фи сравнении влияния ивдометацина (I мкг/мл) и аспирина (2 мкг/мл) на пролиферацию МНК 32 здоровых доноров в ответ на различные дозы ФГА установлено, что хотя наиболее выраженный прирост пролиферации в абсолютных величинах срм наблвдается при оптимальной дозе.ФГА (1:1000), относительный прирост, выраженный как ИВ был максимален в ответ на низкую субоптимальную дозу ФГА (1:25000).. В то же время, обращает на себя внимание тот факт, что аспирин обладает аналогичным индометацину эффектом.

• Следующим этапом работы было изучение в вышеописанной системе ответа МНК пациентов с травмой. Обследовано 23 пациента с термическим поражением различной степени тяжести и 81 - с открытыми и закрытыми переломами длинных трубчатых костей. Пострадавшие поступали в клинику в течение первых суток после травма. В зависимости от течения посттравматического периода всех больных ретроспективно разделили на 2 группы. Группа А состояла из пациентов с благоприятным течением заболевания (п=40). Группу Б составляли больные (п=64), у которых впоследствие развились гнойно-септические осложнения (остеомиелит, сепсис, обширные нагноения мягких тканей и т.д.). На рис.1 представлены ИВ аспирина и индометацина в группах А и Б в зависимости от срока после травмы. В группе с благоприятным течением посттравматического периода на 7 - 14 сутки заболевания резко угнетается функция НГ-синтезирующих супрессоров, что выражается в снижении ИВ индометацина и аспирина до по сравнению с донорской группой (р<0,01). К исходу 3-4 недели после травмы супрессорная функция нор-

мализуется, что выражается в увеличении ИВ до нормы. В группе с развившимися в дальнейшем хирургическими осложнениями наряду с незначительным угнетением в ранние сроки, в период развития гнойно-септических осложнений супрессорная функция значительно возрастает - ИВ индометацина до 1,79 £ 0,56; ИВ аспирина до 1,8 £ 0,33 (р<0,05), превышая нормальный уровень.

В позднем периоде после травмы у пациентов с развившимся остеомиелитом наблвдается снижение функции ПГ-супрессоров, что по-видимому, отражает более глубокие нарушения функций иммунной системы.

При удалении прилипающих к пластику и фагоцитирующих карбонильное железо клеток в магнитном поле индекс влияния аспирина и индометацина резко снижается - с 1,94 £ 0,21 до 1,0^0,08 (р<0,01). Одновременно наблвдается достоверное снижение спонтанной пролиферации - соответственно, 5966 £ 23Е8 и 3105 £ 1755 (р<0,05); и стиадлированной ФГА пролиферации - 33066 £ 8747 и 15287 £ 3344 (р<0,05). Данный факт, видимо, можно объяснить тем, что моноциты/макрофаги данных пациентов наряду с гиперпродукцией ЛГ, продуцируют повышенное количество стимулирующих рост клеток монокинов, в частности Ш-1. Удаление же макрофагов из культуры ведет к снижению спонтанной и стимулированной пролиферации клеток.

Так как аспирин является необратимым ингибитором ДГ-син-тетазы, то для того, чтобы исключить другие возможные механизмы действия аспирина мы сравнили пролиферацию обработанных в течение I часа аспирином, а затем отмытых МВД и пролиферацию культуры, содержавшей в течение всего периода инкубации аспирин. Эффект аспирина наблюдался и в этой системе, причем ИВ аспирина был деже выше (I,88 £ 0,3 и 1,43 - 0,21 соответственно).

Влияние моконуклеарннх клеток больных на пролиферацию фибробластов в культуре.

Макрофаги и лимфоциты продуцируют ряд факторов, .в том числе Ш-1, факторы некроза опухоли альфа и батта, которые стимулируют пролиферацию ^ибр^бласюв, а также Ш^, который является основным ингибитором пролиферации фибробластов.

В напей модели гл>; использовали 3-х суточные нестимули-

2 _ ив

I .

0-1

О,0 -

соответственно аспирин и иццо-метацин цри неос-ложненном течении (п = 40) А - то же цри осложненном течении (п « 64)

(недели после травмы)

4 Остеомиелит

Рис. I. Влияние аспирина и мндометацина на ФГА-индуцирован-ную пролиферацию ШК в динамике после травмы. 4г - р < 0,05 (с донорами) -£#-р<0,01 (с донорами) х - р<0,СЬ (мету гр. А и Б)

ИВ

I -

О J

Рис.

О

- гр. А 43 (п=10)

гр. Б (п=14)

(недели после травмы)

—I--—

3 4

2. Влияние надосадочной жидкости культур ШК на пролиферацию 2>ЬЧ в динамике посттравматического периода.

рованные культуры МНК доноров и пациентов в качестве источника надосадочной жидкости (НЖ), которую добавляли (1:1) в культуру фибробласгов эмбриона человека (£34). На рис.2 представлены данные исследования влияния НЖ на культуру ФЭЧ, которые демонстрируют активацию пролиферации ФЭЧ под влиянием НЖ здоровых доноров и пациентов группы А (неослож-ненное течение) и ингибицию пролиферации ФЭЧ под влиянием Щ МНК пациентов группы Б (осложненное течение), причем наиболее выраженная стимуляция роста ФЗЧ отмечается при использовании НЖ МНК группы А от МНК, полученных на 2 - 3 неделе посттравматического периода.

Предварительная обработка МНК аспирином (10 мкг/мл при 37°С, 2 отмывки) практически не влияла на активность НЖ МНК здоровых доноров и больных группы А в отношении роста ФЭЧ, тогда как НЖ МНК больных группкБ изменяла свою активность с ингибирующей на стимулирующую (рис.3). Эти данные свидетельствуют о том, что МНК пациентов группы Б продуцируют не только стимулирующие пролиферацию ФЭЧ факторы, но и ингиби-рующие, влияние которых не цроявляется после предварительной обработки МКК аспирином, что позволяет сделать вывод о повышенной по сравнению со здоровыми и пациентами группы А продукции ДГ, которые и обеспечивают ингибици» пролиферации 2ЭЧ.

Влияние аспирина и тактивина на культуры МНК и фибро-бластов.

Опосредованное через продукцию цитокинов и 1ТГ влияние МНК на пролиферацию фибробластов может отражать воздействие иммунной системы на репаративные процессы ин виво, В этой связи нами изучалось влияние на рост ФЗЧ самих иммуноактив-ных препаратов - аспирина и тактивина, предполагаемых для использования в качестве иммуномодуляторов.

Аспирин дозозависимо усиливал пролиферацию &»Ч, действуя аналогично известному эффекту иядометацина (ие«Ьоп Е.Б.,1587), а также пролиферацию смешанной культуры ¿34 и ЛИК (рис.4).

Известно, что препараты тимуса увеличивают продукцию ЙЛ-2 В культуре ФГА-СТИМуЛкрОВаННЫХ МНК (ВисЬаЬеаи J., et а1.1985). Нам показалось интересным определить не являются ли и ингиби-

2 _ ИВ

I -

О

2

- группа А (п=Ю)

- группа Б (п=14)

Рис.

3 4 (недели после травмы)

3. Влияние предварительной инкубации ШК с аспирином на активность их Щ в отношении Ф&Ч.-X - р<0,СЬ (с донорами) XX- р< 0,01 (с донорами)

О

и мп/ мин/1 в4* 2 н

Т х.

12 3 4 .'ис. 4. Влияние аспирина на пролиферации сметанной куль

турн МНК и «ЗЛ»Ч •

I

АС/1 . С - ЛПА,

- + МНК, 4 - то же + аспирин) ов:й с 3)

торы циклооксигеназы, в частности аспирин, стимуляторами цро-дукции ИЛ-2 в культуре. Ш сравнили методом ИФА продукцию Ий-2 интактными ШК доноров с продукцией И2-2 теш же МНК, обработанными I час аспирином (1С мкг/мл) и дважды отмытыми.

Аспирин увеличивает продукцию ИЯ-2 с I,Ü8 - 0,73 нг/мл до 4,36 - 1,43 нг/мл (р<0,05; п=7). Этот факт заслуживает внимания, т.к. одним из основных механизмов имкуносупрессии после травш является подавление синтеза ИЬ-2 и экспрессии TAC - антигена ( Teodorozylcvinjeyan J.A. et al. J9S9), a ПГ могут являться одним из медиаторов данного механизма имыуно-супрессик.

Наши данные также подтверждают литературные сведения о снижении продукции ИЯ-2 в группе больных с гнойно-воспалительными ослоанениями по сравнению с группой с благоприятным течением траЕКЫ (2,02 Í 0,85 и 3,3 ± 1,15).

Тактивик дозозависимо с пиком активности на 0,1 мкг/мл усливал пролиферацию ФЭЧ, а также культур, состоящих из смеси ФЭЧ к ШК (см. таблицу I).

Таблица I

Влияние тактивина на пролиферацию культур ШК и ФЭЧ

Культура Дозы тактивина (мкг/мл)

О С,001 0,01 0,1

£ЭЧ 430 + £2 435 + 41 580 X 57 770 + XX 55

ШК 1270 + 30 1422 + 332 1512 264 1898 542

®эч 4- ынк 1414 + 337 1293 + 180 1360 t 173 2079 + 270

примечание: Сравнение проводилось по критерию "U" Вилкоксона-Ианна-Уитни; х - р<0,05; хх - р<.0,01

Интересен тот факт, что фибробласты, предварительно обработанные асгофином (10 мкг/мл, I час при 37°С, 2 отмывки), отвечают значительно большим усилением пролиферации под действием тактивина, чем под действием только асгщрина(рис.Ь), что дает возможность предподойсить синергизм аспирина ¡; такти-

имп/мин/10" 3

-г-

XX

"Г

I 2 3 4

Рис. 5. Влияние тактивина на пролиферацию ФЭЧ, предварительно обработанных аспирином (I - 234, преобра-ботанше аспирином, 2 -, 3 -, 4 - то же +■ соответственно 0,001; 0,01 и 0,1 мкг/мл тактивина). х - р < 0,05 хх - р < 0,01

О - (£ГА О - ¿АГ

х

xx

(недели после траЕ.чы)

и 1 к. й 4 остеомиелит Рис. 6. Динамика оф&охториих функций ГЗТ теле травма (п-30) О - зд^рог-ке доноры (п=<7) х - р<С,С'5 XX - р< 0,01

вина в активации репаративных процессов при их применении ин виво.

Активность синтеза Ш1-1 моноцитами/макрофагами пациентов.

В ходе исследования нами не было обнаружено достоверного различия спонтанного и индуцированного ЛИС синтеза ИЛ-1 в обеих труппах. Соответственно, для групп А и Б: спонтанная -1,65 ± 0,29 у.е. и 1,47 ± 0,05 у.е.; ивдуцированная - 1,65*0,33 и 1,42 £ 0,09 у.е. (р>0,05). В то же время, у подавляющего большинства пациентов ингибитор ЛГ-синтетазы индометацин повышает синтез Ш-1: до 1,78*0,38 в группе А и 1,62 £ 0,16 у.е. в группе Б.

Полученные данные свидетельствуют о перспективности исследований сочетанного применения аспирина и тактивина в им-мунокоррекции с целью активации репаративных процессов при посттравматическом иммунодефиците, что и было продемонстрировано нами в дальнейшем.

Оценка клеточных эффекторных функций в динамике после травмы.

Ряд авторов придают большое значение феноменам "аутосен-сибилизации", развивающимися вследствие термической и механической травмы, в патогенезе травматической болезни (Долгушин И.И. с соавт. 1989). Действительно, такие осложнения, как длительно незаживающие раны, трофические язвы, лизис аутодер-мотраневлантата, которые сопровождаются не только угнетением репаративных процессов, но и активным отторжением собственной кожи при аутодермопластике, могут свидетельствовать о роли иммунной системы в качестве активного участника патогенеза данных осложнений травмы.

В связи с этим часть работы была посвящена разработке методов оценки эффекторных функций ГЗ'Г, пригодных для обследования больших групп больных.

Принцип разработанного метода заключается в следующем. На первом этапе лейкоциты оседают на дно круглодонных лунок планшета (при 4°С), где создается их большая концентрация, побуждающая к миграции вверх по стенкам лунки (второй этап -при 37°С). Внесение митогена или антигена приводит к продукции клетками факторов торможения миграции и ингибиции рас-

пластывания, в результате чего уменьшается зона мигрировавших клеток (при оптимальных дозах митогена или антигена). Субоптимальные дозы митогена или антигена вызывают усиление распластывания п миграции лейкоцитов в результате прямого воздействия на мигрирующие клетки, что позволяет оценить их миграционную способность в качестве одной из функциональных характеристик (выполнение метода описано в разделе "Материалы и методы").

Исследование эффекторкых функций ГЗТ в ответ на поликло-нальную М'ГА) и "специфическую" (ФАГ - водно-солевой экстракт флбробласгов эмбриона человека) стимуляцию показало их снижение начиная с I - 2 недель после травмы, причем не было выявлено достоверных различий между группами больных с осложненным я неосложненным течением посттравматического периода (рис. 6).

Изучение 20 пациентов с остеомиелитом и остеоартритом показало, что по сравнению со здоровыми донорами, ответ эф-фчкторов ГЗТ на НА резко снижен (см. таблицу 2), тогда как огрет на 1АГ - лосьпен (рис.6), что, вероятно, свидетельствуй? о развитии особого патогенетического типа иммунодефици-

Таблица 2

показатели эффекторных функций ГЗТ (иЗЮ в отевт на поликло-нальную стимуляцию (ФГА).

Группа обследо-панных

Здоровые донорк Ожоги переломи Ос то о же л ит

11Сж

Достоверностипо сравнения с донорами)

Количество наблюдений

27 13 17 20

о ,с ¡с ,5 с, 36 I

^ 1,0 ± с,39

+ о,г?

£ 0,19

р <0,01 р< С,01 Р<0,С1

та - сьиу.енне способности л пслнклональному ответу, но с акти-

вацией эффекторов ГЗТ к антигенам соединительной ткани, подобно той, что отмечается при аутоиммунных заболеваниях, фи этом клинически наблвдается подавление репаративных процессов, что выражается в длительно незаживающих ранах, свищах. Курс лечения тактивином изменяет показатели функций ГЗТ - эффекторов, причем ответ на ФГА увеличивается до нормальных значений, что свидетельствует о коррекции клеточного иммунодефицита, тогда как ответ на "фибробластический антиген" (ФАГ) снижается, свидетельствуя о снижении "аутосенси-бшшэации" у данных пациентов. Эти данные позволяют также сделать вывод о имцуномодулирующей в отношении клеточных эффекторных функций активности тактивина, заключающейся в усилении способности имоднной системы развивать ГЗТ - ответ (ФГА) при снижении специфической сенсибилизации (ФАГ).

Разработка и апробация метода ранней кммунокоррекции после травмы.

проведенные исследования позволили сформулировать принципы иммунокоррекции, позволяющей активировать процессы репарации. В качестве препарата было решено использовать аспирин в низких терапевтических дозах, которые в культурах клеток оказывают стимулирующее действие на пролиферацию ЫНК, 434 и их смеси, то есть 2-5 мг/кг веса. Во-вторых, это стимуляция дифференцировки ^-лимфоцитов и модуляция клеточных эффекторных функций. В качестве препарата, отвечающего этим требованиям было решено использовать тактивин, тем более, что аспирин и тактивин обладают синергичным действием в стимуляции пролиферации ФЭЧ, АШ и их смеси в обычно используемых терапевтических дозах.

Сочетанное применение аспирина и тактивина для воздействия на репаративные процессы было проведено в комплексе с общецринятой терапией больных с ожогами, поскольку срок полной эпителизации ожоговой поверхности является объективным критерием эффективности проводимого лечения. Аспирин назначали в первые сутки в виде 0,33}¿ раствора внутривенно ка-пельно, суточную дозу вводили б 2 приема - утром и вечером в течение 7-10 дней. Тактивин применяли с 3 - 5 суток (после окончания курса глюкокортикоидов), ежедневно, в вечер-

ние часы в течение 5 дней.

При учете результатов лечения больных разделили на 2 группы: группа I - лечение общепринятым способом; группа 2 -лечение общепринятым способом с иммунокоррекцией по вышеописанной схеме. Кроме того, в каждой группе было выделено по 2 подгруппы в зависимости от тяжести ожога: подгруппа А - ожог средней тяжести, подгруппа Б - критический ожог (для новорожденных - 5%; для детей до I года - 1(3%; до 3 лет - К>7°; до 6 лет - 2С№; старше 6 лет - 307» и более поверхности тела). Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3

Характеристика пациентов с пжогами и эффективность иммуно-коррекции

Группа Количество Средняя Средний Сроки

пациентов пациентов площадь возраст эпителизации

ожога(%) (лет) (дни)

1А 23 10*0,7 2,4*0,36 14*1,2

1Б 20 22*2,3 1,7*0,25 18*1,6

2А 5 11*1,5 2,4+1,31 8+0,2

2Б 25 24*1,8 1,8?0,23 12*0,6

Достоверность различий: 1А - 2А р >0,05 р >0,05 р <0,01

1Б - 2Б р >0,05 р >0,05 р<0,01

Таблица 3 демонстрирует однородность групп пациентов по площади ожога и возрасту, тогда как по срокам эпителизги ции ожоговой поверхности для ожогов средней тяжести отмечается достоверное (в 1,7 раза) сокращение, так же как и для критических (в 1,6 раза) ожогов. Полученные результаты свидетельствуют об эффективности данной схемы иммунокоррек-ции по отношению к процесса1/, репарации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Я ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

Как благоприятное, так и осложненное течение травмы сопровождается вторичным иммунодефицитом, длительность и исход

которого зависят от различных факторов, определяющих развитие определенного патогенетического типа иммунодефицита.

Неослолшенное течение травмы сопровождается снижением функции ДГ-синтезирующих суцрессоров, в то время кш£ для осложненного течения характерно усиление активности ПГ-продуци-руюпдех клеток, приводящее к подавлению пролиферации Т-лимфо-цитов, главным образом за счет ингибиции простагландином EU продукции и рецепции ИЯ-2.

Кроме того, ДГ содержащиеся в супернатактах ШК больных с осложненным течением посттравматического периода, подавляет пролиферацию £>34 в культуре, что отражает подавление репаративных процессов у данных больных. Ингибирующая активность б отношении ®5Ч отменяется предварительной обработкой ШК аспирином. Аспиркн в малых дозировках также восстанавливает црслиферативную активность лимфоцитов, стимулщюванных ФГА к культуры фибробластов, стицулирует продукцию KJI-2 ин витро.

В дальнейших исследованиях наш показано подавление функции эффекторов ГЗТ при осложненном и иеосложненном течении травмы,"наиболее выраженное на 2 - 3 неделе заболевания, с дальнейшей тенденцией к нормализации. У пациентов с развившимся остеомиелитом и посттравматическим остеоартритоы на фоне сниженной или нормальной функции ГЗГ эффекторов на поли-клональнук стимуляцию STA обнаружена активация реакций ГЗТ на фибробластический антиген, что свидетельствует о сенсибилизации у данных больных к собственной соединительной ткани. Тактивик модулировал данные изменения с одновременной стагфляцией репаративных процессов б ране.

Полученные данные позволяют предположить, что снижение функции ЙГ-супреесороЕ является реакцией организма на повреждение тканей и наряду с подавлением клеточных эффектор-ных функций, подавлением активности КК клеток имеет саноге-HeTKtfecKoe сучение и служит ослаблению функции иммунологического надзора за пролиферацией собственной ткани с целью скорейшей репарации после травмы и защиты от бактериальной инфекции за счет сохраненных (или стимулированных) гуморальных эффекторпых функций.

Активация клеточных эффехторных функций, примером кото-

рой служит повышение активности эффекторов ГЗТ против собственной ткани, является проявлением другого патогенетического иммунодефицита, определяющего не только развитие инфекции,' но и такие осложнения как лизис аутодермотрансплантата, незаживающие раны, ¡«консолидирующие переломы и т.д. Для профилактики гнойно-септических осложнений и стимуляции релара-тиеных процессов в раннем периоде травмы путем ингибиции супрессорных клеток, прямым или опосредованным влиянием на иммунокомпетентные клетки и фибробласты эффективно совместное использование тактивина и ингибитора циклооксигеназы -•аспирина.

ВЫВОДЫ

1. Снижение активности ДГ-продуцирующих супрессоров характеризует неосложненное течение посттравматического периода и является одним из факторов травмы, имеющих значение в стимуляции репаративных процессов.

2. Повышение активности ЯГ-продуцирующих супрессоров предшествует развитию гнойно-септических осложнений травмы и играет роль в угнетении процессов репарации.

3. Аспирин является препаратом, угнетающим активность ЛГ-синтезирующих супрессоров, стимулирующим продукцию ИЛ-2, а также активирующим пролиферацию фибробластов прямым и опосредованным (через подавление продукции 11Г моноцитами) способом.

4. Тактивин эффективен в модуляции функции ГЗТ-эффек-торов и стимуляции репаратиЕНКх процессов при осложнениях травмы, а также в стимуляции роста фибробластов в культуре. Тактивин и аспирин синергично стимулируют пролиферацию фибробластов.

5. Сочетанное применение аспирина и тактивина является эффективным методом иммунокоррекции для профилактики гнойных осложнений и стимуляции репаративных процессов в раннем посттравматическом периоде.

CiiHCOK РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕЛЕ ДИССЕРТАЦИИ I. Лозовой B.il., Кожевников З.С., Набиуллин P.P. Патогенез некоторых форм имьунодефицитов: проблемы диагноза и тера-

пии // Иммунодефицит и аллергия: Тез. докладов Всесоюзной конференции. - Москва, - 1966. - С. I59-I6C1.

2. Набиуллин P.P., Кожевников B.C. Роль макрофагоЕ - супрес-соров в патогенезе гнойной хирургической инфекции // Актуальные вопросы реконструктивной и восстановительной хирургии: Тез. докладов 5 итоговой научной сессии. - Иркутск,-1987. - С. 226.

3. Набиуллин P.P., Кожевников B.C., Лозовой В.П. Патогенетическая роль макрофагов - продуцентов iff в развитии хирургических осложнений // Экспериментальная и клиническая иммунология на Востоке страны: Тез. доклад, научно-практ. конф. - Красноярск, - I9S8. - т. 1. - С. 17.

4. Набиуллин P.P., Богидаев C.B., Кожевников B.C. Иммунная система и механизмы регенерации цри травме // Механизмы повреждения и регуляции восстановительных процессов: Тез. докладов конф. молодых ученых. - Новосибирск, - 1938. - С.119.

5. Кожевников B.C., Набиуллин P.P., Богидаев C.B., Лозовой В.П. Способ оценки клеточных иммунных реакций ин витро // A.C. I5757II. - 1968.

6. Набиуллин P.P., Кожевников B.C. Роль клеток - продуцентов HIEg в развитии вторичного ДЦ после травмы // Тез. докл.

1 Всесоюзного съезда иммунологов. - Сочи. - 1939. - С. 247.

7. Лозовой В.П., Кожевников B.C., Набиуллин P.P. Иммунологическое обеспечение массовых поражений // Актуальные вопросы медицины катастроф: Тез. докл. Всероссийской конференции. -Уфа. - 1990. - т.2. - С. 97-9».

8. Набиуллин P.P., Опарина С.И., Трянкина С.А., Кожевников B.C. Опыт работы иммунологической лаборатории при массовой термической травме // Мэлодые ученые-медики - науке и практическому здравоохранению: Со. тр. - Новосибирск. - 1990. -

С. 143-150.

g. Kabiullin P..P.., Jioziievnikov V.S., Lozovoy V.P. Participaticn of PGE in posttraumatic immunosuppression and reparation processes // Mononuclear phagocyte systea in normal and patologics.1 states: Abstracts of All Union Symposium. -Novosibirsk. - 1990. - P. 182-184.

10. Набиуллин P.P., Кожевников B.C. Изменения функции прос-таглаццин-продуцирующих клеток в посттравматическом периоде // Клеточно-тканевые механизмы адаптации к действию повреждающих факторов: Сб. тр. - Омск, ISSQ. - С.44-47 XI. Кожевников З.С., Набиуллин P.P., Лозовой В.П. Причины возникновения и роль иммунодефицита при травме // Вестник АМН СССР. - 1991. - принята в печать. 12. Набиуллин P.P., Кожевников B.C., Агаджанян В.В. Иммунокор-регирующая терапия гнойных осложнений травмы // Тез. докл. I республиканский съезд иммунологов и аллергологов. -Душанбе. - IS9I. - С. 122-123.

Загс.318.ТярЛ00.П.ч.л. 1,0. Бумага писчая 60x84/16

Тип.СО А!Ш СССР. 1991