Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунобиологическая активность нейтрофилов при травматической болезни

од

3 пив №7

На правах рукопис и

Чукичев Александр Викторович

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ ПРИ ТРАВМАТИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ (клишко-экспериментальное исследование)

14.00.36 - аллергология и иммунология

/АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Челябинск, 1996

Работа выполнена в Челябинской государственной медицинской академии МЗ России Научные консультанты:

академик МАНЭБ, доктор медицинских наук, профессор И.И. Долгушин доктор медицинских наук, профессор Л.Б. Новокрещенов

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАЕН, доктор медицинских наук, профессор А.Н. Маниский член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор В.А. Черепшев академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор A.A. Ярилнн

Ведущая организация - научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН им. И.П. Павлова

Зашита состоится "_______1997 г., в _ часов па заседапш

диссертационного совета Д. 084.04.02 при Челябинской государственной медицинской академии по адресу: 454092, г. Челябинск, ул Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан "_"_ 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

A.B. Зурочка

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Внимание многих исследователей до сих пор сконцентрировано на изучении межклеточных взаимодействий в иммунной системе, которые являются одной из актуальных проблем современной иммунологии (Медуницын Н.В. с соавт., 1980; Петров Р.В. с соавт., 1981; Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989; Ковальчук JI.B., Чередеев А.Н., 1991; Козлов И.Г. с соавт., 1995; Маянский А.Н., 1995; Фрейдлин И.С., 1984; 1995; Пальцев М.А., Иванов A.A., 1995; Хаитов P.M., Земсков В.М., 1995; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Липшиц Р.У. с соавт., 1996 и др.). Необходимость тесной кооперации различных популяций иммунокомпетентных клеток при реализации их функций в иммунном ответе стало неопровержимым фактом, доказанным многочисленными фундаментальными исследованиями (Земсков В.М., 1983; Вогралик Н.В., Ковальчук Л.В., 1986; Кульберг А.Я., 1986; Брондз Б.Д., 1987; Мазинг Ю.А., 1991; Завьялов В.П., 1993; Ляшенко В.А., 1994; Воробьев A.A., Медуницын Н.В., 1995; Стефани Д.В., Вельтищев Ю.В., 1996; Ogle James D. et al., 1992; Campebll P.A. et al., 1993 и другие). Однако, вопрос об участии нейтрофилов в регуляции иммунного и других звеньев гомеостаза только в последнее время становится предметом для пристального внимания исследователей (Бакуев М.М., 1992; Бережная Н.В., 1988; Чередеев А.Н. с соавт., 1983; 1986; Зурочка A.B., 1991; Пигаревский В.Е., 1992; Долгушин ИИ. и соавт., 1986-1996; Маянский А.Н. с соавт., 1995; Полянская Г.А., Свнрежива М.Н., 1993; Goto К. et al., 1984-1988; Ishibashi Y. et al., 1981-1989; Zeman K. et al. 1987-1993 и другие). Вместе с тем, изучение механизмов кооперации этих клеток с иммуноцитами, клетками крови, фибробластами, эндотелиоцитами, медиа-торными системами крови и соединительной ткани может иметь существенное значение в понимании патогенеза острого воспаления, вообще, и заболеваний, возникающих после повреждений тканей, в частности.

Современное понятие травматической болезни трактуется как совокупность местных и общих изменений гомеостаза, обусловленных механической травмой, определяющих жизнедеятельность и адаптивные возможности организма (Дерябин И.И., Насонкин О.С., 1987; Шапошников Ю.Г. с соавт., 1989; Краснов А.Ф. с соавт., 1996 и другие). Тяжесть общего состояния, течение посттравматического периода, возникновение гнойных осложнений, процессы тканевой репарации и окончательный исход травматической болезни во многом зависят от качества и выраженности изменений в гомеостазе, в частности, в его иммунном звене (Александров В.Н., 1989; Долгушин И.И. с соавт., 1989; Ермолович Е.Ю., 1993; Кожевников B.C., 1994; Шилова H.A., 1995; Donnelly S.C. et al., 1994; Feuerstein G.Z. et al., 1995; Kantorova I. et al., 1995 и другие).

Доказано, что в ответ на тяжелую травму развивается стойкая иммунодепрес-сия, характеризующаяся инволюцией лимфоидной ткани, выраженным Т-иммуноде-фицитом и нарушением функций макрофагов (Долгушин И.И., 1980; Вагнер Е.А. с соавт., 1992; Кожевников B.C., 1994; Шилова H.A., 1995; Хилько В.А. с соавт., 19941995; Barlow Y., 1994; Dibirdik I., 1995 и другие). Наряду с дефектами иммунных

механизмов, развивающихся при травме, в литературе широко представлены в о< новном данные о постгравматическом угнетении эффекторной функции нейтрофилс (Беловолова Т.А., 1992; Ермакова Н.Г., 1991; Котельников Г.П. с соавт., 1996; Мяд< лец О Д. с соавт., 1993; Орлов А.Б. с соавт., 1994; Chiba К. et al., 1989; Childs С. et al 1994 и другие).

Вместе с тем известно, что нейтрофилы являются не только элиминирующим] вспомогательными и эффекторными клетками, выполняющими «команды» лимфе цитов и макрофагов, но и клетками, участвующими в инициации и регуляции имм^ нологических реакций (Зурочка А.В., 1991; Бакуев М.М., 1992; Пигаревский В.Е 1992; Долгушин И.И. и соавт., 1986-1996; Маянский А.Н. с соавт., 1995; Goto К. i al., 1984-1988; Ishibashi Y. et al., 1981-1989; Zeman K. et al. 1987-1993 и другие Значение клеточной кооперации в системе «нейтрофил-иммуноциты», реализуемо посредством секреции регуляторных факторов - «нейтрофилокинов», исследован некоторыми из вышеперечисленных авторов в основном в норме и при инфекцио! ном процессе. Между тем, иммунорегуляторная роль нейтрофилов и их низкомол« кулярных продуктов секреции в процессе развития травматической болезни остаетс не-изученной.

В последние годы обнаружены медиаторы, общие для иммунной и нервно систем (Захарова Л.А., Петров Р.В., 1990; Абрамов В.В., 1991; Михайлова А.А., 199; Pousset F., 1994; Hopkins S.J., 1995 и другие). По мнению Е.М. Sternberg (1989), ря пептидных медиаторов были обозначены как моно- и лимфокины, а не как нейропег тиды, лишь потому, что сначала были открыты в иммунной, а не в нервной систем! Работами И.И. Долгушина с соавт. (1989-1996) было показано, что нейтрофилокин: также обладают выраженным нейротропным действием. Это обстоятельство опред< лило необходимость изучения при травматической болезни влияния низкомолекуля} ных продуктов нейтрофилов на нервную систему, роль которой в течении и исхол данного заболевания не вызывает сомнений.

В последнее время доказана значительная роль макрофагов в восстановлени поврежденной ткани. Эти клетки и продукты их секреции участвуют в межклеточны взаимодействиях с фибробластами и другими клетками соединительной ткани, обновлении таких важных ее компонентов, как коллаген и фибрин (Маянский А.Н 1981; Фрейдлин И.С., 1984; Маянский Д.Н. с соавт., 1996; Henson Р., 1993 и другие Основываясь на данных И.И. Долгушина с соавт. (1988) о существовании функцис нальных контактов нейтрофилов с макрофагами, можно думать об опосредова! ном участии полинуклеарных фагоцитов в регуляции восстановительных процессе поврежденной ткани. При этом, нельзя исключить и прямое влияние нейтрофилов их продуктов на механизмы заживления ран, поскольку эти клетки максимальн накапливаются в зоне тканевой деструкции уже в первые часы после травмы. Одн; ко, эти предположения требуют доказательств.

Кроме того, остается неясным, связано ли состояние секреторной функции Hei трофилов с другими звеньями гомеостаза при травматической болезни, нарушени которых определяет течение и исход данной патологии. Именно поэтому, большо практический интерес представляют исследования возможности применения нейтрс

филокинов для коррекции нарушений ряда звеньев гомеостаза организма при травматической болезни. Исследования в этом направлении не проводились.

Из вышеизложенного очевидно, что роль нейтрофилов и продуктов их секреции в патогенезе травматической болезни окончательно не определена. Вместе с тем, ее исследование при данной патологии может позволить разработать новые подходы к диагностике и лечению иммунодефицитного состояния при травматических повреждениях, а также определить возможность коррекции нарушений других звеньев гомеостаза. Эти обстоятельства и определили цель планируемого исследования.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работы является исследование при травматической болезни роли нейтрофилов и их секреторных продуктов в развитии нарушений иммунного и других звеньев гомеостаза, а также изучение возможности коррекции последнего с помощью нейтрофилокинов.

ЗАДА ЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Изучить процессы межклеточной кооперации в системе "нейтрофил-моно-цит" у детей в различные периоды травматической болезни.

2. Исследовать иммунобиологическую активность нейтрофилов и их продуктов секреции у животных с изолированной и множественной механической травмой.

3. Определить связь между состоянием секреторной функции нейтрофилов, с одной стороны, и изменениями иммунологической реактивности, состояния центральной нервной системы, репаративно-пластических процессов и устойчивостью организма к стресс-воздействию, с другой, у животных с экспериментальной травматической болезнью, и тем самым, установить роль и место этих клеток в регуляции гомеостаза при данной патологии.

4. Изучить возможности повышения иммунореактивности травмированного организма, ускорения репаративной регенерации поврежденных тканей, стимуляции двигательно-ориентировочной деятельности и усиления устойчивости животных с тяжелой механической травмой к дополнительному стресс-воздействию с помощью секреторных продуктов активированных нейтрофилов донора.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. В работе впервые установлено, что при иммунодефи-цитном состоянии, возникающем у детей с травматической болезнью, происходит нарушение межклеточного взаимодействия в системе кооперации "нейтрофил-мо-оцит", которое проявляется снижением секреции полинуклеарными фагоцитами низ-номолекулярных факторов, обладающих выраженным иммунобиостимулирующим действием. Выявлены четыре типа состояния секреторной функции нейтрофилов: нормальное, компенсированное, субкомпенсированное и декомпенсированное. Нормальный и субкомпенсированный типы межклеточного взаимодействия в системе "секреторные продукты нейтрофилов + моноциты" in vitro характеризуются стимулирующим, а суб- и декомпенсированный - супрессорным действием супернатантов активированных нейтрофилов детей с травмой на клетки-мишени. Последние два типа состояния иммунорегуляторной функции нейтрофилов наиболее часто встречаются при множественной, сочетанной и осложненной гнойной инфекцией травме, а также в ранние периоды травматической болезни. Введение супернатантов нейтрофилов, полученных у детей в острый период и в катаболическую фазу периода развернутой

клинической картины травматической болезни, вызывает у интактных животных нарушения иммунореактивности, поведенческих реакций и снижение репаративной регенерации, подобные тем, которые отмечаются у мышей с тяжелой механической травмой.

Множественные переломы костей скелета у животных приводят не только к резкому снижению иммунной защиты, психомоторной активности, репарационно-пластических процессов, устойчивости к дополнительному стресс-воздействию, но и к подавлению способности нейтрофилов секретировать иммуностимулирующие пеп-тидсодержащие продукты. При этом, между нарушением секреторной активности нейтрофилов и изменениями вышеуказанных звеньев структурного гомеостаза определяется тесная взаимосвязь, свидетельствующая о важной роли данного функционального дефекта нейтрофилов в развитии расстройства постоянства внутренней среды организма при травматической болезни.

Впервые показано, что введение супернатантов активированных латексом нейтрофилов доноров восстанавливает иммунологическую реактивность у мышей с тяжелой экспериментальной травмой, ускоряет репарацию поврежденной ткани и оказывает стимулирующее действие на нервную систему.

Из супернатантов активированных нейтрофилов здоровых людей было получено и очищено ранее неизвестное вещество пептидной природы с ЫНг-концевой аминокислотой - лейцином, М.М. около 1500 Д, которое обладало выраженным иммуностимулирующим, нейротропным, репарантным и протекторным действием. Новизна этого вещества была подтверждена авторскими свидетельствами (A.c. № № 1536977, 2008006, 2008683).

Введение вышеуказанного вещества животным с множественными переломами костей позволяет восстановить их иммунологическую реактивность, ускорить процессы заживления ран и костной консолидации, повысить двигательно-ориентиро-вочные реакции, устойчивость организма к дополнительному стрессу и почти в 2 раза снизить летальность. Полученные данные открывают перспективу для создания нового лекарственного препарата, обладающего широким спектром биорегуляторного действия.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Результатами настоящего исследования показано, что нейтрофилы занимают важное место в системе регуляции межсистемных взаимодействий, обеспечивающих сохранность постоянства внутренней среды организма в экстремальных условиях. Регуляторную функцию нейтрофилы могут осуществлять посредством секреции низкомолекулярных (менее 10 кД) пептидсодержащих факторов, которые оказывают модулирующее влияние на систему иммунокомпетентных клеток и органов, центральную нервную систему, процессы репарационной регенерации и устойчивость организма к стрессу. Нарушение секреции данных факторов (нейтрофилокинов) является одной из причин вторичного посттравматического иммунодефицита. Экспериментально доказано, что коррекция нарушения данной функции нейтрофилов путем восполнения дефицита секре-тируемых ими иммунобиостимулирующих факторов веществом, полученным из А5-

пептидсодержащей фракции супернатантов активированных нейтрофилов доноров, существенно улучшает исход посттравматического процесса.

Все это расширяет представление о нейтрофилах, как об одной из центральных клеточных популяций, участвующих в поддержании гомеостаза организма при травматической болезни.

Исследование секреторной функции нейтрофилов и воспринимающей способности моноцитов к нейтрофилокинам у детей с травматической болезнью в комплексе с другими методами оценки иммунного статуса позволяет диагностировать развитие у них иммунодефицитного состояния. Разработанные методические подходы к оценке процессов кооперации "нейтрофил-иммуноциты" подробно изложены в методических рекомендациях "Изучение кооперации нейтрофилов с клетками иммунной системы в норме и патологии", опубликованных на всероссийском уровне, и используются для диагностики не только хирургической, но инфекционной и аллергологической патологии. Челябинским медицинским институтом принято и внедрено в практику рационализаторское предложение № 2 от 19 января 1989 года "Способ исследования секреторной функции нейтрофилов".

На базе кафедры детской хирургии Челябинской государственной медицинской академии создана лаборатория по исследованию регуляторной функции нейтрофилов, в которой обследуются дети с различной хирургической патологией (травма, хирургическая инфекция), и в настоящее время на основе полученных результатов разрабатываются методы прогнозирования течения посттравматического и послеоперационного периода у детей.

Метод исследования иммунорегулирующей функции нейтрофилов внедрен не только в Челябинской государственной медицинской академии, детских хирургических отделениях Челябинской областной клинической больницы, но и в Челябинской дорожной больнице, Челябинском областном кожно-венерологйческом диспансере, а также в клинико-иммунологическом центре Тюменской медицинской академии.

Для сокращения времени и трудоемкости исследования секреторной функции нейтрофилов был разработан способ определения иммуномодулирующей активности нейтрофилов, основанный на определении цветности супернатантов данных клеток. Данный способ был защищен авторским свидетельством № 1287006.

Разработана технология получения из супернатантов нейтрофилов вещества с выраженными биорегуляторными свойствами, которая защищена авторским свидетельством № 1536977 "Способ получения иммуностимулирующих нейтрофилоки-нов". На вещество, выделенное этим способом, получены два патента на изобретение: № 2008006 "Средство, обладающее репаративной активностью" и № 2008683 "Психотропное средство".

И, наконец, результаты исследований используются при преподавании патогенеза травматической болезни как в лекционном материале, так и на практических занятиях со студентами Челябинской государственной медицинской академии.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научной конференции "Актуальные вопросы иммунологии, аллергологии и молекулярной биологии" (Краснодар, 1983); Всесоюзном симпо-

зиуме "Фагоцитоз и иммунитет" (Москва, 1983); Всесоюзных конференциях "Про филактика, диагностика и лечение аутоиммунных заболеваний и вторичных иммуно дефицитов" (Новосибирск, 1985); "Актуальные вопросы клинической микробиологи! в неинфекционной клинике" (Москва, 1988); "Стресс и иммунитет" (Ростов-на-Дону Ленинград, 1989); 1 конгрессе иммунологов Эстонии (Тарту, 1989); 1 Всесоюзно» иммунологическом съезде (Москва-Дагомыс, 1989); 7 Международном конгрессе п< иммунологии (Западный Берлин, 1989); 5 Всесоюзном симпозиуме "Взаимодействи нервной и иммунной систем" (Оренбург, 1990); Всесоюзной конференции "Экологи ческие аспекты иммунопатологических состояний" (Алма-Ата, 1990); на Междуна родном симпозиуме "Мононуклеарная фагоцитирующая система в норме и патоло гии" (Новосибирск, 1990); I Республиканском съезде детских хирургов Башкири: (Уфа, 1992); I Международном конгрессе по иммунореабилитации (Москва-Дагомыс 1994); зональных конференциях "Факторы гуморального и клеточного иммунитет; при различных физиологических и патологических состояниях" (Челябинск, 1990 1992, 1994); I Российском конгрессе по патофизиологии (1996), на совместных сове щаниях кафедр микробиологии, иммунологии и детской хирургии Челябинской госу дарственной медицинской академии, а также на заседании Челябинского городской научно-практического общества ортопедов-травматологов.

По теме диссертации опубликованы 54 научных работы, получены 4 авторски: свидетельства, оформлено и внедрено рационализаторское предложение и изданы ме тодические рекомендации.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 325 стра ницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методоЕ четырех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и библио графического указателя, включающего 187 работ отечественных и 201 работу иност ранных авторов. Работа иллюстрирована 45 таблицами, 42 рисунками и 5 фотогра фиями.

ПОЛОЖЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

• У детей при травматической болезни развивается иммунодефицитное состоя ние, характеризующееся не только снижением гуморального и клеточного звена им мунитета, но и нарушением межклеточного взаимодействия на уровне "нейтрофил моноцит".

• Нарушения регуляторной функции нейтрофилов наблюдаются чаще у детей ранние периоды травматической болезни и, особенно, при множественных, сочетай ных и осложненных инфекцией повреждениях.

• У животных с экспериментальной травматической болезнью характер нар> шений межклеточной кооперации в системе "нейтрофил-иммуноциты" зависит от т^ жести механической травмы.

• Нарушение взаимодействия нейтрофилов с клетками иммунной системы травмированных животных сопровождается снижением иммунологической реактиЕ

ности, замедлением регенераторно-пластических процессов, угнетением поведенческих реакций и уменьшением устойчивости к дополнительному стресс-воздействию.

• Восполнение дефицита стимулирующих секреторных факторов нейтрофилов в организме животных с множественной травмой веществом, выделенным из А5-фрак-ции супернатантов активированных нейтрофилов донора, позволяет не только восстановить иммунологическую реактивность, но и ускорить процессы заживления ран и костной консолидации, а также повысить двигательно-ориентировочные реакции, устойчивость организма к стрессу и снизить летальность травмированных животных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В соответствии с поставленной целью нами были обследованы 95 детей с травматическими повреждениями, находившихся на лечении в детском ортопедо-трав-матологическом отделении Челябинской областной клинической больницы. Средний возраст детей составил 9,33±1,33 лет. Среди пострадавших преимущественно были мальчики (70,53%). В первые 24 часа после травмы поступили 39 (41%) детей, на 2-3 сутки - 27 (28,42%) и позже четвертых суток - 29 (30,58%) пострадавших. Основной причиной травматической болезни у детей являлось механическое воздействие. 60 (63,16%) обследованных нами детей имели изолированные, 26 (27,37%) - множественные и 9 (9,47%) - сочетанные повреждения. В 92,5% случаев пострадавшие поступали в клинику с переломами трубчатых костей. Из 133 переломов костей, выявленных у пациентов, 86 (64,66%) приходились на кости верхней конечности. Переломы костей нижней конечности диагностированы у 27 (28,42%) детей. Реже наблюдались переломы костей таза - у 3 (3,16%), черепа - у 2 (2,10%), кисти - у 2 (2,10%), стопы - у I (1,05%) и позвоночника - у I (1,05%) детей. Переломы, связанные с нарушением целостности хрящевых зон роста и отрывом ядер окостенения эпифизов и апофизов, диагностированы у 35 (36,84%) детей. Метафизарные и диафизарные переломы наблюдались соответственно у 21 (16,93%) и 68 (54,84%) детей. У 91 (95,79%) пострадавшего перелом костей сопровождался грубым смещением отломков, требующим повторной закрытой ручной репозиции или хирургического лечения. У 9 (9,47%) детей травма опорно-двигательного аппарата сочеталась с нарушением целостности других анатомических областей. Из них у 6 пострадавших была диагностирована закрытая черепно- и спинномозговая травма, а у 4 детей выявлены повреждения органов брюшной полости и забрюшинного пространства. Эти повреждения требовали проведения неотложных лечебных мероприятий. Лечение детей с травматическими повреждениями было комплексным и включало консервативные и хирургические методы, направленные на восстановление анатомической целостности поврежденных областей и нарушенных функций систем гомеостаза организма. Ранние и поздние осложнения наблюдались у 15 (15,8%) пострадавших.

Комплексное клинико-иммунологическое обследование пострадавших детей, включающее сбор анамнеза, осмотр и физикальное обследование, вспомогательные лабораторные, биохимические и специальные методы исследования, а также оценка

иммунного статуса, были проведены в различные периоды травматической болезни (острый период, период развернутой клинической картины - катаболическая и анаболическая фазы, реабилитационный период).

Контрольную группу составили 53 здоровых ребенка школьного возраста.

О развитии острофазовой реакции постгравматического воспаления судили пс уровню схрантитрипсина, гаптоглобина, трасферрина, осг-макроглобулина и С-реак-тивного белка, определяемых турбодиметрическим методом на аппарате "ARRAY' фирмы "Beckman" (USA).

Состояние иммунной системы у детей с травматической болезнью оценивали пс содержанию СЗ- и С4-фрагментов комплементарной системы и уровню сывороточных иммуноглобулинов классов A, G и М, изучаемых с помощью иммунонефеломет-рического метода на аппарате "ARRAY" фирмы "Beckman" (USA). Функциональное состояние фагоцитирующих клеток определяли по их способности к поглощеник частиц полистирольного монодисперсного латекса, лизосомапьной активности (Л.Б Хейфец, В.А. Абалакин, 1973; И.С. Фрейдлин и соавт., 1976; Л.Я. Эберт и соавт. 1977; Wong, 1976) и восстановлению нитросинего тетразолия в диформазан (А.Н Маянский, М.Е. Виксман, 1979; A.W. Segal, 1974).

Способность нейтрофилов периферической крови к секреции пептидсодержа-щих продуктов с молекулярной массой от 0,5 до 10 кД, обладающих иммунотропны-ми свойствами (нейтрофилокины), и воспринимающую чувствительность моноцито! к последним изучали, используя для этого методы, разработанные нами совместно < И.И. Долгушиными A.B. Зурочкой (1984-1994).

С целью получения продуктов секреции нейтрофилов доноров и детей с травмой использовали 15-20 мл гепаринизированной периферической венозной крови которую с целью осаждения эритроцитов отстаивали в силиконизированной пробир ке с добавлением 6% раствора декстрана Т-500 (Pharmacia, Sweden) в соотношенш 10:1 при 37° С в течение 30 минут. Выделение нейтрофилов осуществляли на двой ном градиенте плотности фиколла-верографина (Pharmacia, Sweden; Spofa, CSSR) пс методу Wong L. et al. (1975). В интерфазе между двумя слоями градиентов содержа ние гранулоцитов равнялось 98-100%.

Секреторную функцию нейтрофилов (СФН) оценивали по схеме, представлен ной в рис. 1. Клетки, полученные от донора или больного, доводили до концентрацш 5x10б клеток/мл и делили на две части. Одну порцию нейтрофилов инкубировали i среде 199 без добавления активатора, а другую - в присутствии частиц полистироль ного латекса (d=l,7 мкм) (соотношение нейтрофилов и частиц латекса - 1:50). Посл< одночасовой инкубации при 37°С суспензию клеток центрифугировали при 300( об/мин в течение 15 мин, надосадочную жидкость дополнительно центрифугировал1 в течение 5 минут при 8000 об/мин и фильтровали через мембранные фильтры с диа метром 0,24 мкм (Millipore, USA) с целью удаления неосевших частиц латекса Полученные супернатанты неактивированных (СНН) и активированных нейтрофило] (САН) отдельно фасовали в стерильные флаконы и использовали для исследовани) их иммунобиологической активности в норме и при патологии.

латекс

/

среда 199,37 С, I час

Супернатант

неактивированных

нейтрофилов

I i

фильтрация

Супернатант

активированных

нейтрофилов

тестирование иммунотропной активности супернатантов

in vitro (инкубирование моноцитов в супернатантах нейтрофилов в течение

1 часа при 37°С)

1. Содержание лизосом в моноцитах донора или больного

2. Активность и интенсивность фагоцитоза моноцитов донора или больного

3. Способность моноцитов донора или больного к редукции HCT

Вычисление индекса стимуляции или супрессии: функциональная активность клеток-мишеней в супернатанте

ИС=-

функциональная активность клеток-мишеней в среде 199

in VIVO

1. Иммунный ответ мышей на эритроциты барана

2. Активность спленоцитов мышей в локальной реакции трансплантат против хозяина (РТПХ)

3. Антигенпредставляющая функция макрофагов (АГПФМ)

4. Содержание лизосом в цитоплазме макрофагов

5. Способность макрофагов к редукции НСТ

6. Активность и интенсивность фагоцитоза макрофагов

Рис. 1. Схема исследования секреторной функции нейтрофилов

Пептидсодержащие фракции секреторных продуктов нейтрофилов выделяли и суммарных супернатантов, полученных от 25 доноров. Для этого продукты секреци нейтрофилов подвергали последовательной ультрафильтрации через фильтры УШУ ns 6000 (Владипор, СССР), задерживающие вещества с М.М. выше 10 кД, и У AM 50, пропускающие химические соединения с М.М. менее 500 Д. Полученный бессс левой концентрат ультрафильтрата с М.М. от 0,5 до 10 кД наносили на колонку дие метром 15x50 см с мелкопористым сефадексом G-15 (Pharmacia, Sweden). Элюцш проводили деионизированной водой. Регистрацию выходящих вслед за свободны] объемом пиков (фракций) осуществляли при помощи аппарата Uvicord (LKE Sweden). Выходящие фракции, полученные из СНН условно обозначали Hl, Н2 ... Н; а выделенные из САН - Al, А2 ... А„. В каждой фракции определяли количество качество выходящих продуктов, подвергая их в последующем лиофилизации.

А5-фракцию, обладающую наибольшей иммунотропной активностью, подвер гапи обращенно-фазовой хроматографии высокого давления при помощи жидкостнс го хроматографа фирмы Gilson (France) на колонках диаметром 4x250 мм с модифицированными селикогелями марки Whatman Partisil 5 ODS-3 в градиенте ацетон m рила (CH3CN) (Merk, Fluca, Swithzerland-Germany) с добавлением 0,1% раствор трифторуксусной кислоты. Фракцию, выходящую за свободным объемом, с максим; льным по величине пиком собирали, лиофизировали и определяли в ней концентре цию вещества. Для определения природы полученное вещество исследовали даг сильным методом Эдмана.

При тестировании иммунотропных свойств супернатантов нейтрофилов доне ров или детей с травматической болезнью in vitro в качестве клеток-мишеней испол! зовали моноциты донора. Моноцитстимулирующее или моноцитсупрессорное дейст вие секреторных продуктов нейтрофилов оценивали по их влиянию на фагоцитарнук лизосомальную и НСТ-активность клеток-мишеней.

Воспринимающую способность моноцитов (ВСМ) детей с травмой определял по изменению их функциональной активности после одночасовой инкубации в сред суммарных супернатантов активированных нейтрофилов, полученных от 10-15 доне ров. Контролем служили клетки, инкубированные в течение 1 часа в среде 199. BCÍ оценивали по индексу стимуляции или супрессии, выраженного отношением функци моноцитов больного после инкубации в супернатанте и в среде 199.

Изучение иммунобиологической активности секреторных продуктов нейтрофр лов доноров и детей с травматической болезнью осуществляли также in vivo. Экспериментальный раздел исследования выполнен на 3240 мышах линий СВ/ С3НА, гибридах Fi(CBAxC57Bl), беспородных белых мышах весом от 18 до 25 г. Ж* вотные были получены из питомников АН СССР "Столбовая", "Светлые горы", "Par полово" и г. Снежинска Челябинской области.

Экспериментальную модель травматической болезни воспроизводили путем з; крытого перелома средней трети костей одной или обеих голеней между браншам пинцетов. В качестве критериев, отражающих тяжесть течения посттравматическог процесса, у животных в динамике (на 3, 7, 14 и 21 сутки после повреждения) исследс вали показатели температурной реакции, функции нервной системы, иммунореактш

ности, репаративно-пластических процессов, устойчивости к дополнительным стресс-воздействиям и летальность. Контролем служили группы интактных мышей.

Ректальную температуру определяли с помощью электротермометра. Состояние нервной системы оценивали по двигательно-ориентировочным реакциям мышей в "открытом поле" по методу M.L. Weisher (1976). О репарационно-пластических процессах у животных судили по весу мышей, относительной массе ряда органов (тимус, селезенка, печень), содержанию в них тканевого белка, уровню белка в крови (И.А. Волчегорский, 1993), скорости заживления стандартных ожоговых ран (И.И. Долгушин, 1980), формированию костной мозоли и ее прочности при растяжении. Устойчивость животных к дополнительному стресс-воздействию определяли по продолжительности принудительного плавания (Окишор А., 1992). Иммунореактивность организма изучали по способности мышей к иммунному ответу на эритроциты барана (Jerne N.K., Nordin A.A., 1976), по уровню активности спленоцитов в локальной реакции трансплантат против хозяина при полусингенном переносе клеток селезенки в генетической комбинации СВА -» гибриды F^CBAxCstBI) (R. Röbler et al., 1975), ан-тигенпредставляюшей функции макрофагов (Галактионов В.Г., Анфалова Т.В., 1974), способности последних и нейтрофилов поглощать частицы латекса (Фрейдлин И.С. и соавт., 1976) и восстанавливать нитросиний тетразолий в диформазан (Маянский А Н., Виксман М.К., 1979; Segal A.W., 1974).

Иммунобиорегуляторную функцию нейтрофилов животных опытных групп исследовали по влиянию их продуктов секреции на ряд из вышеперечисленных показателей у интактных мышей в динамике.

В качестве источника секреторных продуктов использовали нейтрофилы пери-тонеального экссудата животных (ПЭ), выделяемые через 6 часов после внутрибрю-шинного введения 4 мл 1,2% раствора казеина. Таким способом удавалось получить у мышей линии СзНА клеточную взвесь, содержащую до 95-97%, а у других линий животных - до 90-95% нейтрофилов. Супернатанты этих клеток получали таким же образом, что и у детей.

Тестирование биологической активности нейтрофилокинов человека и мышей, полученных в норме и после травмы, проводили на группах интактных животных. Супернатанты нейтрофилов и вещество, выделенное из А5-пептидсодержащей фракцией (последняя была получена из САН доноров), вводили в брюшную полость с первого дня после перелома костей трехкратно через каждые 48 часа соответственно в дозах 50 мкл/мышь и 10'7 мкг/мышь, которые, по данным A.B. Зурочки (1991), обладали наиболее выраженным иммунотропным эффектом. Схема введения и доза секреторных продуктов нейтрофилов у интактных животных были сходными. В контрольную группу входили интактные мыши, которым вводили физиологический раствор по той же схеме.

При изучении иммунобиокорригирующих свойств секреторных продуктов нейтрофилов (САН и вещество, выделенное из А5-пептидсодержащей фракцией) использовали аналогичную схему введения. Изучаемые клинико-иммунологические критерии оценивали на 3, 7, 14 и 21 сутки после начала введения или травмы.

Полученные результаты обрабатывали методами вариационной статистик (Венчиков А.И., Венчиков В.А., 1974, Мерков A.M., Поляков JI.E., 1974). Статистич< екая обработка полученных данных проведена на персональном компьютере ЮМ Р Pentium 120/16 с использованием программы "Statistica for Windows 5,00".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для решения поставленной цели, в первую очередь, мы провели исследован* динамических изменений количественного и качественного состава форменных эл! ментов крови, а также функционального состояния фагоцитарного звена естественнс резистентности, акцентировав в дальнейшем свое внимание на изучении секреторнс функции нейтрофилов и воспринимающей способности моноцитов, как основно объекте наших исследований у детей с травматической болезнью.

В результате проведенных исследований нами было выявлено, что развитие ос poro периода травматической болезни у детей сопровождалось лейкоцитозом, koti рый сохранялся в течение всех последующих периодов, но имел явную тенденцию снижению. Истинный лейкоцитоз в остром периоде наблюдался только у 48 (50,5?-детей, в то время как у 43 (45,3%) - общее количество лейкоцитов оставалось в пред лах нормы, а у 4 (4,2%) пострадавших развивалась лейкопения. В период развернуто клинической картины количество детей с истинным лейкоцитозом увеличивала незначительно и достигало 57,2%. Повышение общего количества лейкоцитов у дете было обусловлено, в основном, нейтрофильным сдвигом. Абсолютное количестг палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов увеличивалось в период разверн; той клинической картины почти в 2 раза. В реабилитационный период на фоне сохр няющегося, но имеющего тенденцию к снижению умеренного нейтрофилеза, у дете наблюдалась нормализация относительного количества нейтрофилов.

Функциональная активность нейтрофилов была изучена у 41 ребенка в острь период после травмы и у 54 и 20 детей соответственно в катаболическую и анабол] ческую фазы периода развернутой клинической картины. Контролем служили ¿ здоровых детей в возрасте от 6 до 14 лет. При этом было установлено, что у детей острый период и катаболическую фазу развернутой клиники травматической болезг развивалось достоверное угнетение поглотительной способности и лизосомальнс активности нейтрофилов. В анаболической фазе способность нейтрофилов к захва' частиц латекса нормализовалась, однако интенсивность фагоцитоза оставалась ей сниженной, хотя и имела тенденцию к восстановлению. Лизосомальная активное нейтрофилов в конце периода развернутой клинической картины полностью восст навливалась. Активность нейтрофилов в спонтанной реакции НСТ в первые две ст дии травматической болезни была существенно выше, чем у доноров. По мере стих ния посттравматического воспаления кислородзависимый метаболизм исследуемь клеток нормализовался.

Исходя из полученных данных очевидно, что в ранние периоды травматическс болезни у детей на фоне увеличения количества нейтрофилов изменялась их эффе торная функция, которая характеризовалась активацией кислородзависимого метаб лизма клеток, понижением их поглотительной и переваривающей способности.

Важные результаты были получены при изучении секреторной функции ней-трофилов с помощью разработанного нами метода, основанного на определении цветности среды 199, в которой культивировались нейтрофилы больного в присутствии и без добавления частиц латекса. Установлено, что секретируемые продукты нейтрофи-лов доноров, иммунотропные свойства которых зависят от активации клеток латексом, по-разному меняли цветность среды культивирования. Индекс экстинции супер-натантов активированных клеток, обладающих выраженным иммуностимулирующим действием, не превышал 1,41 усл.ед., тогда как его уровень у супернатантов неактивированных нейтрофилов, оказывающих иммуносупрессорное влияние, был выше 1,43 усл. ед. В ранние периоды травматической болезни индекс экстинции супернатантов как неактивированных, так и активированных латексом нейтрофилов у детей, был значительно ниже пороговой величины и равнялся соответственно 1,31 ±0,03 и 1,35±0,04 усл. ед. В анаболическую фазу оптическая плотность супернатантов неактивированных клеток возрастала, а индекс экстинции достигал 1,47±0,04 усл. ед. В то время как индекс экстинции супернатантов активированных нейтрофилов оставался практически на прежнем уровне и равнялся 1,40±0,02 усл. ед..

Это обстоятельство позволило предположить, что травма сама по себе является пусковым фактором в индукции секреции нейтрофилами продуктов с иммунотроп-ными свойствами. Для подтверждения этого предположения нами было проведено исследование иммунотропного действия супернатантов нейтрофилов на донорские клетки-мишени как in vitro, так и in vivo.

Нами было установлено, что in vitro нейтрофилы доноров, активированные частицами полистирольного латекса, секретируют в среду культивирования продукты, оказывающие иммуностимулирующее действие. Под воздействием САН мононукпе-арные фагоциты доноров in vitro более интенсивно захватывали объекты фагоцитоза, повышался их кислородзависимый метаболизм, и увеличивалось содержание лизосом в цитоплазме клеток. Неактивированные нейтрофилы доноров, секретировали продукты, которые, напротив, вызывали снижение числа лизосом в цитоплазме моноцитов, незначительно угнетали фагоцитоз клеток и усиливали их активность в спонтанной НСТ-реакции. Такое реагирование донорских моноцитов на супернатанты нейтрофилов доноров мы назвали «нормальным».

Анализируя изменения фагоцитарной и лизосомальной активности моноцитов доноров, развивающиеся под влиянием супернатантов активированных и неактивированных нейтрофилов, выделенных у детей в различные периоды травматической болезни, нами было обнаружено 4 типа ответного реагирования клеток-мишеней: нормальный - САН активируют клеточные реакции моноцитов доноров, а СЫН угнетают их; стимулирующий - САН и СНН усиливают исследуемые функции донорских моноцитов; супрессорный I - САН снижают, а СНН, наоборот, стимулируют реактивность клеток, и супрессорный II - САН и СНН понижают функциональную активность клеток-мишеней.

В процессе развития травматической болезни у детей частота встречаемости вышеперечисленных типов реагирования клеток-мишеней в ответ на действие супер-

натантов активированных и неактивированных нейтрофилов пострадавших имелг свою динамическую закономерность.

Фагоцитарная реакция моноцитов доноров

60 ■

Острый период

Катаболичесхая фаза

Анаболическая фаза

□ Нормальный

■ Стимулирующий

□ Супрессорный I

□ Супрессорный II

Лизосомальная активность моноцитов доноров

Острый период

Катаболичесхая фаза

Анаболическая фаза

□ Нормальный

■ Стимулирующей

□ Супрессорный I

□ Супрессорный II

Рис. 2. Распределение детей с травматической болезнью (в %) по типам ответного реагирования фагоцитарной и лизосомальной активности моноцитов донора на СНН и САН больных, полученных в различные периоды после травмы

Нормальное реагирование клеток-мишеней при оценки их фагоцитарной способности и лизосомальной активности наблюдалось соответственно только ) 24,4±2,78 и 20,0±0,89% детей (см. рис. 2). В катаболическую фазу процент детей с сохраненной секреторной активностью нейтрофилов еще несколько снижался и, соответственно, был равен 14,5±2,47 и 17,9±2,89%. В анаболическую фазу количество детей, у которых активированные нейтрофилы продуцировали моноцитстимулирую-, щие, а неакгивированные - моноцитсупрессорные факторы, достоверно повышало« по данным показателям соответственно до 55,0±2,28 и 42,1±2,21 %.

У 34,1±3,07% детей САН и СНН, полученные в острый период после травмы вызывали повышение поглотительной способности моноцитов доноров. В последующие периоды развития травматической болезни количество детей, у которых суперна-танты нейтрофилов обладали только стимулирующим действием на фагоцитоз клеток-мишеней, снижалось до 25,0±1,98%. Идентичное действие супернатантов нейтрофилов наблюдалось при изучении их влияния на лизосомальную активность моноцитов доноров.

50

Первый супрессорный тип реагирования, при котором САН и СНН приобретали противоположные норме иммунотропные свойства (тестируемые на модели фагоцитарной реакции и лизосомальной активности моноцитов доноров), наблюдался, соответственно, у 14,7±2,29% и 6,7±1,69% детей в острый период после травмы, а также у 16,8±2,61% и 10,7±2,33% пострадавших в катаболическую фазу периода развернутой клинической картины травматической болезни. В анаболическую фазу у 5,3±0,23% обследованных данная реакция отмечалась только со стороны лизосомальной активности клеток-мишеней.

В процессе развития ранних периодов травматической болезни у детей наиболее часто встречалась супрессорное реагирование моноцитов II типа, когда САН и СНН угнетали поглотительную способность клеток-мишеней и снижали содержание лизосом в их цитоплазме. В острый период подавление фагоцитоза донорских моноцитов и снижение их лизосомальной активности супернатантами нейтрофилоп пострадавших детей было выявлено, соответственно, в 26,8±2,87% и 40,0±1,32% наблюдений. Подавление фагоцитоза и суммарного свечения лизосом донорских моноцитов мосле инкубации с САН и СНН было, соответственно, выявлено у 38,8+3,45% и 32,1±3,71% детей, обследованных в катаболическую фазу второго периода травматической болезни. В анаболическую фазу посттравматического процесса количество детей, у которых супернатанты нейтрофилов угнетали исследуемые функции моноцитов доноров, достоверно уменьшалось по сравнении с острым периодом или катабо-лической фазой и достигало 20,0±1,83% и 31,5±2,08%.

При сравнительном анализе между уровнем оптической плотности супернатан-тов активированных и неактивированных клеток, с одной стороны, и выраженностью их моноцитстимулирующего или моноцитсупрессорного действия на лизосомальную активность моноцитов донора in vitro, с другой стороны, была выявлена прямая корреляционная связь (г=0,69 при р<0,05). Несовпадение характера изменения оптической плотности супернатантов и их иммунотропных эффектов, определенных нами с учетом типов ответного реагирования клеток-мишеней и по различным показателям (фагоцитоз, лизосомальная активность), наблюдался соответственно только у 11,72 и 8,25% обследованных детей. Последнее свидетельствует о достаточно высокой точности метода оценки секреторной функции нейтрофилов по уровню оптической плотности их супернатантов и позволяет говорить о возможности широкого использования данного метода для экспресс-диагностики нарушений секреторной функции нейтрофилов человека.

Исходя из полученных данных, можно заключить, что в процессе развития травматической болезни нейтрофилы продуцируют факторы с разнонаправленным моноциттропным действием. Последнее подтверждалось обнаружением четырех типов реагирования клеток-мишеней в ответ на действие секреторных продуктов нейтрофилов. Стимулирующий или супрессорный характер воздействия супернатантов во многом зависел от стадии патологического процесса и определял состояние секреторной функции системы нейтрофилов в целом. На основании выявленных нами типов реагирования клеток-мишеней на супернатанты нейтрофилов детей с травмой были определены четыре состояния секреторной функции нейтрофилов: нормальное,

компенсированное, субкомпенсированное и декомпенсированное. У наиболее многс численной группы детей с травматической болезнью секреторная функция нейтроф* лов изменялась до такой степени, что продукция ими стимулирующих факторов даж при дополнительной стимуляции полностью прекращалась. Этот факт свидетельстве вал о развитии «субкомпенсированного» и «декомпенсированного» состояний данно функции этих клеток. Важно подчеркнуть, что декомпенсация секреторной активне сти нейтрофилов носила транзиторный характер и при благоприятном течении траг матической болезни имела тенденцию к обратимости. В то же время, при ее длител! ном сохранении она могла способствовать развитию осложнений. Это подтвержд; лось тем фактом, что первый и второй супрессорные типы реагирования клето! мишеней на продукты секреции нейтрофилов были отмечены у 3 и 9 детей из 1 больных, имеющих те или иные гнойные осложнения

Рассматривая динамику секреторной функции нейтрофилов у детей в процесс развития травматической болезни, можно было отметить, что для ее ранних периоде наиболее характерно, так называемое, субкомпенсированное и декомпенсированнс состояние данной функции. Для анаболической фазы было свойственно превалиров; ние компенсаторной и нормальной секреторной активности нейтрофилов. Последне указывало на общую тенденцию к восстановлению секреторной функции нейтрофг лов по мере развития репарационных процессов в зоне повреждения.

Представленные выше данные позволили нам определить направленность и: менений секреторной функции нейтрофилов в процессе развития травматической бс лезни у детей. Между тем, необходимо было выяснить насколько выражена степей им-мунотропного воздействия супернатантов нейтрофилов на функциональную а! тивность клеток-мишеней в зависимости от их типов реагирования и стадий развита посттравматического процесса.

Установлено, что супернатанты нейтрофилов с иммуностимулирующим дейс вием независимо от типов реагирования моноцитов доноров обладали более сильны воздействием (р<0,05-0,001) на функцию клеток-мишеней по сравнению с САН дс норов. Выраженность сдвига отдельных функций моноцитов донора, особенно их ф; гоцитоза, была во многом связана с периодами течения травматической болезни и п мере развития восстановительных процессов у большинства больных уменьшалась достигала нормального уровня (р>0,05).

У детей с адекватным типом реагирования клеток-мишеней на секреторны продукты нейтрофилов фагоцитарная емкость моноцитов доноров в целом мака мально увеличивалась (почти в 3 раза) после инкубации данных клеток с САН, выд< ленных у детей в острый период и в анаболическую фазу периода развернутой юп ники травматической болезни, и, значительно в меньшей степени, - в катаболиче( кую фазу. Между тем, степень стимулирующего действия САН на лизосомальну] активность клеток-мишеней была существенно ниже, чем на их фагоцитарную спс собность. «Неактивированные» нейтрофилы у данной группы детей продуцировал супрессорные факторы, которые вызывали приблизительно идентичное норме сниж< ние показателей фагоцитарной и лизосомальной активности донорских моноцитов ка по величине, так и по характеру.

Наиболее значительным моноцитстимулирующим действием обладали супер-натанты нейтрофилов детей с, так называемым, компенсаторным состоянием секреторной функции данных клеток, то есть когда «неактивированные» нейтрофилы вырабатывали стимулирующие факторы и при дополнительной активации латексом сохраняли эту способность. Величина сдвигов большинства исследуемых показателей фагоцитарной реакции моноцитов доноров под их влиянием достигала 2 и более усл. ед.

У группы детей с "субкомпенсированным" состоянием секреторной функции нейтрофилов выраженность иммунотропной активности как САН, так СНН была умеренной по силе и отличалась по направленности в различные периоды травматической болезни.

Особый интерес представляли сведения, полученные при изучении силы су-прессорного действия САН и СНН у травматологических больных с "декомпенсацией" секреторной функции полиморфоядерных фагоцитов. Супрессорный эффект СНН и САН имел своеобразный перекрестный характер, который заключался в следующем. Снижение фагоцитарной и лизосомальной активности моноцитов доноров, индуцируемое СНН, получаемыми в различные периоды после травмы, имело тенденцию к нарастанию по мере развития травматической болезни у детей данной группы, тогда как супрессорное действие САН на данные функции клеток-мишеней уменьшалось.

Таким образом, развитие травматической болезни у детей сопровождалось изменением моноцитрегулирующей функции нейтрофилов. Эта активность секреторных продуктов нейтрофилов у детей зависела от периода течения травматической болезни и отличалась не только по направленности, но и по силе действия.

Вместе с тем, важно было выяснить не только, как менялась СФН, но и способны ли моноциты больного воспринимать "сигналы" от нормальных нейтрофилов, то есть, каким образом будет изменяться функция мононуклеарных фагоцитов при воздействии на них САН доноров, обладающих выраженным иммуностимулирующим действием.

Нами было установлено, что у моноцитов детей с травматической болезнью активность и интенсивность фагоцитоза, также как и их общий фагоцитарный потенциал практически не изменялись в первые дни после травмы. Выраженное угнетение фагоцитарной реакции моноцитов наблюдалось в катаболическую фазу периода развернутой клинической картины. В анаболическую фазу практически все показатели, отражающие фагоцитарную функцию моноцитов детей с травмой, нормализовались, а их фагоцитарный потенциал в целом даже достоверно превышал нормальный уровень.

В отличие от фагоцитарной реакции моноцитов, их лизосомальная активность в острый период травматической болезни у детей достоверно снижалась, что, вероятно, было связано с активацией секреторной дегрануляции, вызываемой тканевой деструкцией (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989). В последующие периоды посттравматического процесса по мере стабилизации клеточных мембран содержание лизосом в цитоплазме исследуемых клеток увеличивалось и в анаболическую фазу второго периода - нормализовалось.

Способность моноцитов детей восстанавливать нитросиний тетразолий в ди-формазан в острый период после травмы, напротив, достоверно возрастала, а в последующем уменьшалась и в анаболическую фазу даже существенно снижалась.

На фоне изменений эффекторных функций моноцитов, характер которых во многом зависел от периодов течения травматической болезни у детей, нами были обнаружены также дефекты их воспринимающей способности моноцитов (ВСМ) к нейтрофилокинам донорских нейтрофилов. Для тестирования ВСМ мы инкубировали эти клетки в течение часа в среде стандартизованных САН, представляющие собой смесь супернатантов активированных нейтрофилов, полученных от 10-15 здоровых детей.

Нами было установлено, что ВСМ нарушалась не у всех детей с травматической болезнью, и частота ее встречаемости зависела от стадий постгравматического процесса. В острый период суммарные САН доноров угнетали фагоцитарную реакцию и лизосомальную активность моноцитов соответственно у 42,5+3,16 и 34,9+3,07 % детей с травмой. В катаболическую фазу периода развернутой клинической картины травматической болезни количество детей, имеющих нарушенную ВСМ к суммарным донорским САН достоверно увеличивалось и достигало в соответствии с изучаемыми показателями данных клеточных функций 61,4±3,30 и 51,0±3,60 %. Нарушение ВСМ сохранялось в анаболическую фазу, хотя и отмечалась тенденция к ее нормализации по сравнению с предыдущей стадией. Число детей с дефектами данной функции снижалось в эту фазу постгравматического процесса. Фагоцитарная способность моноцитов доноров под влиянием САН понижалась у 47,6±2,34%, а лизосомальная активность - у 38,5±1,82% детей с травмой.

Таким образом, в процессе развития травматической болезни более чем у половины детей (1 группа), особенно в катаболическую фазу, моноциты утрачивали способность отвечать изменением функциональной активности на стимулирующие сигналы нейтрофилов доноров. Между тем, у другой части больных (2 группа) ВСМ была сохранена. В этой связи представляло интерес определить, насколько изменялся уровень эффекггорной функция моноцитов у тех и других детей после инкубации этих клеток с суммарными донорскими САН.

Фагоцитарная реакция моноцитов, за исключением фагоцитарного индекса, у детей с нормальной ВСМ под влиянием САН доноров в острый период травматической болезни достоверно возрастала в 1,5-2 раза по сравнению с исходными значениями. В то время как у группы больных с дефектной ВСМ величина показателей фагоцитоза моноцитов снижалась в среднем 18-45%. В катаболическую фазу у детей

1 группы стимуляция фагоцитарной способности исследуемых клеток хотя и сохранялась, но была менее выражена. Аналогичная картина наблюдалась в эту стадию и у

2 группы детей. В анаболическую фазу индекс сдвига показателей фагоцитоза моноцитов у группы детей с неизмененной ВСМ опять несколько увеличивался, тогда как у больных противоположной группы, супрессия фагоцитарной функции моноцитов, вызываемая САН доноров, практически была не выражена и достигала в среднем 10%.

При анализе изменения лизосомалыюй активности моноцитов у травмированных детей с нормальной ВСМ наибольшее увеличение содержания лизосом в цитоплазме этих клеток после инкубации их с донорскими САН выявлено в острый период травматической болезни. В последующие исследуемые периоды посттравматического процесса величина лизосомальной активности, стимулированной суммарными САН доноров, постепенно снижалась. У детей с нарушенной ВСМ, супрессия лизосомальной активности моноцитов детей во все периоды травматической болезни не превышала 40%, и то это было характерно для катаболической фазы периода развернутой клинической картины.

Итак, развитие посттравматического процесса у ряда детей сопровождалось не только нарушением секреторной функции нейтрофилов, но и возникновением дефекта воспринимающей способности мононуклеарных фагоцитов к активирующим сигналам донорских нейтрофилов. В этой связи представляло особый интерес выяснить, в какой степени нарушения этой функции моноцитов совпадают с изменениями состояния секреторной активности нейтрофилов в зависимости от ее видов у детей с травмой.

Фагоцитарная Лизосомальная

реакция активность

Рис. 3. Соотношение детей с нарушением ВСМ (в %) к САН доноров в различные периоды травматической болезни.

Установлено, что в острый период травматической болезни дефект ВСМ наиболее часто наблюдался у детей с «суб- и декомпенсированным» состоянием секреторной функции моноцитов (см. рис. 3). Понижение фагоцитарной способности, лизосомальной активности моноцитов после инкубации с донорскими САН отмечалось соответственно у 50,0±1,34 и 33,3±1,41% больных с «субкомпенсированным» состоянием. Аналогично изменялись данные показатели соответственно у 50,0+1,67 и 50,0±2,18 % детей с «декомпенсированным» состоянием секреции нейтрофилов при травме. У больных с неизмененной секреторной активностью нейтрофилов нарушение ВСМ отмечалось значительно реже и встречалось по всем изучаемым показателям эффекторной функции моноцитов в среднем у 23,9% детей, обследованных в острый период травматической болезни. В то же время, в среднем у 34,7% травмиро-

ванных пациентов, имеющих дефект ВСМ, состояние секреторной функции нейтро-филов было «компенсированным».

В катаболическую фазу травматической болезни, процент детей, имевших нарушение ВСМ был наиболее высоким. При этом важно отметить, что в эту стадию количество детей с дефектом ВСМ возрастало, в основном, за счет групп пациентов с «нормальным» и, особенно, с «компенсированным» состоянием секреторной функции нейтрофилов. В группах же детей с «суб- и декомпенсированной» секреторной акгив-ностью нейтрофилов частота нарушения ВСМ увеличивалась незначительно.

В анаболическую фазу постгравматического процесса прослеживалась явная тенденция к нормализации ВСМ практически у всех групп пострадавших. Исключение составили только дети с «декомпенсированным» состоянием секреторной функции нейтрофилов, у которых снижение фагоцитоза и лизосомальной активности моноцитов под влиянием донорских САН наблюдалось соответственно в 75,0±1,00 и 66,0±1,22 % наблюдений. Последнее, вероятнее всего, было связано с тем, что большинство детей данной группы имели сочетанную тяжелую или осложненную травму.

Таким образом, в ответ на травматическое повреждение в организме ребенка возникало не только снижение эффекторного потенциала фагоцитирующих клеток, по и изменялась регуляторная функция нейтрофилов, которая проявлялась секрецией моноцитгропных факторов с разнонаправленными иммунотропиыми свойствами, а также нарушалась воспринимающая способность моноцитов к стимулирующим «сигналам» донорских нейтрофилов. Секреторная функция нейтрофилов не страдала только у 21,3% обследованных больных. Субкомпенсированное и декомиенсироваи-ное состояния секреторной активности нейтрофилов развивались у детей уже в острый период травматической болезни и наиболее часто отмечались в ее катаболическую фазу. При этом, они, в основном, регистрировались у пострадавших с множественной (18 из 26 детей) и сочетанной (7 из 9 детей) травмой. Эти состояния секреторной функции нейтрофилов в сочетании с нарушениями ВСМ являются прогностически неблагоприятными, так как они отмечались у 12 из 15 детей с гнойными осложнениями. В то же время, наличие декомпенсированного состояния секреторной активности нейтрофилов, как и дефектов ВСМ не являлось стопроцентным гарантом неблагоприятного исхода травмы, ибо они имели обратимый характер и при адекватном лечении постепенно восстанавливались. Подтверждением это являлся тот факт, что из всех детей, у которых были исследованы данные показатели функционального состояния этих фагоцитов, ни один из них не погиб, даже ссли у них развилось осложнение. Правда неизвестно, какой бы степени достигали изменения СФН и ВСМ, и каков бы был исход, если бы пострадавшему не оказывалась медицинская помощь. Ответить на такой вопрос возможно было только в ходе экспериментальных исследований. Кроме того, необходимость проведения эксперимента была обусловлена еще и тем, что данные об изменениях регуляторной функции нейтрофилов и воспринимающей способности моноцитов к их «сигналам» были получены в условиях in vitro и демонстрировали лишь узколокальное моноцитотропное действие продукгов секреции нейтрофилов. Между тем, важно было выяснить, какое иммунобиорегуляторное действие могут оказывать секреторные продукты нейтрофилов, полученные в различные

периоды травматической болезни, на живой организм, в частности, на факторы неспецифической резистентности, иммунный ответ, его нервную систему и репарационные процессы.

С этой целью было проведен эксперимент на мышах-гибридах Fi (CBAXC57BI), которые были разделены на 4 группы: 1 группя - интактные животные, получавшие среду 199 (контроль 1); 2 группа - мыши с переломами костей голени с обеих сторон, которым вводили среду 199 (контроль 2); 3 группа - животные, получавшие СНН детей с травматической болезнью; 4 группа - мыши, которым вводили САН детей с травматической болезнью. В эксперименте были использованы супернатанты ней-трофилов 15 детей с декомпенсированным состоянием секреторной функции данных клеток, полученные в изучаемые периоды травматической болезнью. Секреторные продукты нейтрофилов суммировали соответственно видам клеток (неактивированные и активированные) и периодам их получения. Супернатанты вводили внутри-брюшинно в дозе, обладающей наибольшей иммунотропной активностью, а именно 50 мкл/мышь (Власов A.B., 1989), трехкратно через сутки в утренние часы. На 10-е сутки мышей выводили из опыта под эфирным наркозом методом трансцервикалыюй дислокации и выделяли перитонеальные макрофаги из брюшной полости. Оценивали фагоцитарную способность данных клеток и их кислородзависимый метаболизм, а также антителообразующую функцию селезенки животных.

Нами было выявлено, что выраженность влияния супернатантов нейтрофилов во многом зависит от периодов травматической болезни, в которые они были получены. Снижение функциональной активности макрофагов перитонеального экссудата здоровых животных вызывалось в большей степени секреторными продуктами нейтрофилов, полученных в острый период после травмы, и в меньшей - супернатанта-ми, выделенными в катаболическую и анаболическую фазы периода развернутой клинической картины травматической болезни. Однако, уровень угнетения почти всех изучаемых функций макрофагов не достигал величины такового, определяемого у травмированных животных. СНН, выделенные в острый период после травмы, оказывали достоверное супрессорное действие также и на продукцию АОК после иммунизации интактных животных ЭБ. Такой эффект был характерен и для супернатантов, полученных в катаболическую и анаболическую фазы травматической болезни у детей, хотя количество АОК-ЭБ и повышалось после введения их, но не достигало нормы. Уровень иммунного ответа практически не изменялся под влиянием продуктов, секретируемых активированными нейтрофилами детей в острый период и катаболическую фазу после травмы. Однако, САН, полученные у детей в анаболической фазу, достоверно угнетали синтез АОК-ЭБ интактных мышей.

Таким образом, продукты секреции нейтрофилов детей с травмой, оказывают иммуносупрессорное действие не только на антигенпредставляющие клетки интактных животных, но и на иммунную реакцию организма - антителопродукцию, вызывая этим нарушения иммунореактивности организма, подобные тем, которые отмечались у животных с экспериментальной травматической болезнью.

К настоящему времени накоплены знания о цитокинах как медиаторах нейро-иммунного взаимодействия. Это обстоятельство, а также и тот факт, что изменения со

стороны нервной системы играют важную роль в патогенезе травматической болезни послужили мотивацией для исследования влияния секреторных продуктов нейтрофи лов детей с травмой на двигательно-ориентировочные реакции интактных животных.

Нейтрофилы здорового человека в условиях активации частицами латекса сек ретировали вещества, которые оказывают стимулирующее нейротропное действие н интактных животных, тем самым подтверждая свое участие в нейроиммунном взаи модействии. Введение секреторных продуктов нейтрофилов, полученных у детей травматической болезнью, вызывало сильное угнетение моторной активности у здо ровых животных и их способности ориентироваться на местности. Депрессивно действие супернатантов в большей степени отражалось на стойках мышей и выгля дываниях их в окна актографа, то есть тех показателях, которые характеризуют ис следовательскую реакцшо животного. В ранние периоды эти клетки продуцировал] факторы с выраженным нейросупрессорным эффектом, которые вызывали депрессш нервной системы у интактных животных, превосходящую таковую у мышей с экспе риментальной травмой.

Полученные данные свидетельствовали не только о выраженном иммунно-, н и о нейросупрессорном действии секреторных продуктов нейтрофилов детей с трав матической болезнью. Более яркие подтверждения нейросупрессорного действия сек реторных продуктов нейтрофилов при патологии были получены Б.Г. Яровинскш (1996), которым было показано, что САН больных с атопическим дерматитом не тс лько угнетали психо-моторную активность интактных мышей, но и вызывали у них головном мозге очаги глиоза и некроза.

Нервная система играет решающую роль в обеспечении адаптации организма внешним воздействием, и ее состояние в целом отражает уровень защитных реакции в том числе и репарационных процессов, значение которых для исхода травматиче ской болезни трудно переоценить..

Учитывая, что в обеспечении последних немаловажная роль принадлежит : иммунной системе (Бабаева А.Г., 1985-1987), а также тот факт, что исследуемы нами продукты секреции нейтрофилов оказывали существенное влияние на разны звенья иммунной защиты и обладали нейротропным действием, логично было пред положить, что нейтрофильные факторы детей с травмой могут влиять и на процесс! репарации. Поэтому мы провели исследование влияния секреторных продуктов ней трофилов доноров и детей с травматической болезнью на течение заживления стан дартных точечных ожоговых ран у здоровых животных.

В результате проведенных исследований установлено, что только донорски САН способны достоверно ускорять отторжение струпа и эпителизацию ожоговы ран. При введении САН, выделенных у детей в острый период травматической болез ни, время заживления ожоговой раны увеличивалось благодаря более замедленно: эпителизации раневой поверхности как по сравнению с первой, так и со второй груп пой. СНН, полученные у детей в острый период травматической болезни, не влиял: на репарацию точечных ран после ожога здоровых мышей. Сходные изменения с стороны тканевой репарации наблюдались у групп интактных животных, которьп вводили секреторные продукты нейтрофилов, выделенные у детей в катаболическуъ

и анаболическую фазы периода развернутой клинической картины травматической болезни.

Таким образом, моноцитсупрессорное действие секреторных продуктов ней-трофилов у травмированных детей с «декомпенсированным» состоянием СФН, наблюдаемое нами in vitro, находит подтверждение и in vivo. Отрицательное влияние супернатантов нейтрофилов больных распространялось на эффекторную функцию перитонеальных макрофагов интактных мышей и на формирование иммунного ответа организма животных при иммунизации их эритроцитами барана. Секреторные продукты нейтрофилов детей с травматической болезнью обладали нейросупрессорным действием и оказывали негативное действие на процессы репарации интактных мышей.

Исходя из полученных данных, нарушение секреторной функции нейтрофилов, развивающееся у детей в процессе прогрессирования травматической болезни и характеризующееся угнетением секреции этими клетками иммунобиостимулирую-щих факторов, вероятно, может послужить причиной возникновения посттравматического иммунодефицита и оказывать в целом отрицательное влияние на течение патологического процесса, вызываемого травмой.

Ориентируясь на предварительные результаты, свидетельствующие о иммуно-биорегуляторной активности нейтрофилов, можно было предположить, что применение нативных продуктов секреции донорских активированных нейтрофилов и их производных может быть эффективно при коррекции патологических процессов, развивающихся после травмы.

Однако, прежде чем ответить на этот вопрос, необходимо было выяснить, во-первых, развиваются ли у животных с травмой подобные нарушения секреторной функции нейтрофилов, и как они меняются в течении постгравматического периода, а, во-вторых, насколько эффективны нейтрофилокины доноров для коррекции нарушений гомеостаза при травматических повреждениях.

При создании экспериментальной модели травматической болезни перед нами стояла задача выяснить, какой степени механическое повреждение, наносимое животному, может вызвать угнетение секреторной активности нейтрофилов. Решение этой задачи позволяло оценить не только состояние СФН у животных с экспериментальной травмой в зависимости от выраженности повреждения, но и ответить на вопрос о наличии межвидового сходства нарушений данной функции клеток, развивающихся при травме у человека и животного.

Для этого нами было изучено действие секреторных продуктов мышей-доноров на иммунологическую реактивность интактных животных. В качестве критериев, характеризующих последнюю, мы изучали фагоцитарную способность и спонтанную НСТ-реакцию перитонеальных макрофагов (ПМ) и уровень иммунного ответа при иммунизации ЭБ мышей-реципиентов СЫН и САН интактных животных, а также на их двигательно-ориентировочные реакции.

Исследования выполнены на мышах-гибридах F] (CBAXC57BI), которые, были разделены на несколько групп: 1 группа - интактные мыши - доноры нейтрофилов, используемых для получения секреторных продуктов (супернатантов); 2 и 3 группы -

интактные животные, которым соответственно вводили САН и СНН интактных мышей; 4 группа - интактные животные (контрольная), которым вводили среду 199. Секреторные продукты нейтрофилов ПЭ, полученные из очага асептического воспаления, индуцированного 1,2% раствором казеина, от 10 мышей-доноров объединялись и вводились интакгшым животным внутрибрюшинно трижды через каждые 48 часов в дозе 50 мкл/мышь.

Установлено, что САН интактных животных достоверно повышали интенсивность фагоцитарной реакции ПМ за счет поглощения большего количества частиц латекса каждой клеткой. В то же время число фагоцитирующих макрофагов после введения САН у опытных мышей оставалось на прежнем уровне по сравнению с контрольной группой животных. Введение СНН интактных мышей несколько усиливало активность и интенсивность фагоцитоза ПМ, но при этом почти не влияло на величину фагоцитарного индекса. Кислородзависимый метаболизм данных клеток у интактных животных-реципиентов увеличивался как после введения САН, так и СНН. Только, если в первом случае повышение активности и интенсивности спонтанной НСТ-реакции ПМ у опытных мышей имело достоверное значение, то, во втором -отмечалась лишь тенденция к усилению кислородзависимого метаболизма этих клеток.

Изменения со стороны иммунного ответа на ЭБ у животных опытных групп, вызываемые секреторными продуктами перитонеальных нейтрофилов здоровых животных, имели стимулирующий характер. Введение супернатантов увеличивало анти-телообразование у мышей-реципиентов независимо от стимуляции ПМЯЛ латексом. Однако, важно отметить, что САН, в отличии от СНН, достоверно повышали число АОК-ЭБ в селезенке опытных животных, увеличивая количество этих клеток в 1,5 раза

САН мышиных нейтрофилов, таюке как и человеческие, достоверно стимулировали двигательную активность и ориентировочные реакции здоровых животных-реципиентов. В то же время, СНН перитонеальных нейтрофилов мышей-доноров, не оказывали существенного влияния на моторную активность опытных животных, однако, в отличии от человеческих супернатантов неактивированных нейтрофилов, почти в 2 раза увеличивали их ориентировочную деятельность.

Таким образом, секреторные продукты, выделяемые так называемыми «неактивированными» перитонеальными нейтрофилами в процессе индукции асептического воспаления в брюшной полости раствором казеина, в отличии от интактных нейтрофилов человека, выделяемых из периферической крови, не оказывают иммуносупрес-сорного действия. Развитие асептического воспаления в течение первых шести часов, сопровождающееся максимальным накоплением нейтрофилов в воспалительном экссудате, приводит к тому, что эти клетки начинают секретировать продукты с умеренным иммуностимулирующим действием. Дополнительная стимуляция нейтрофилов ПЭ интактных животных частицами полистирольного латекса, вызывает выброс в среду инкубации факторов с еще более выраженными иммуностимулирующими свойствами. Во многом аналогичная картина наблюдается и при изучении нейротроп-ного действия секреторных продуктов нейтрофилов ПЭ на двигательно-ориентиро-вочную деятельность интактных мышей-реципиентов.

Данный факт приобретает особое значение, поскольку, уже на этом этапе исследований, позволяет предположить одну из причин так называемого «компенсированного» состояния секреторной функции нейтрофилов, наблюдаемого нами чаще у детей с благоприятным течением травматической болезни и в ее анаболическую фазу. По нашему мнению, выраженность нарушения секреторной функции нейтрофилов (вплоть до ее угнетения) может быть во многом обусловлена обширностью повреждения, которая в значительной степени влияет на тяжесть течения воспалительного процесса.

При вскрытии брюшной полости у мышей после введения 1,2% раствора казеина мы не наблюдали каких-либо выраженных признаков перитонита, а животные выживали в 100% случаев. Это свидетельствует о том, что развивающаяся воспалительная реакция, вероятней всего, имеет адекватный защитный характер. На основании этого можно было полагать, что продукция «неактивированными» и рестимули-рованными нейтрофилами факторов с иммуностимулирующими свойствами при такой модели воспаления является положительным биологическим явлением, отражающим нормальное течение воспалительного процесса и свидетельствующим о компенсированном состоянии защитных клеточных реакций, в том числе и секреторной функции нейтрофилов.

Между воспалительной реакцией, вызываемой казеином, и воспалением, развивающимся при закрытом переломе, с патогенетической точки зрения имеется определенное сходство - асептический характер, фазы развития и другие (В.В. Серов, B.C. Пауков, 1995). Различия же между ними заключаются в анатомическом расположении, характере провоцирующего фактора и, что особенно важно, на наш взгляд, в силе и обширности воздействия последнего. Исходя из этого, можно было предположить, что моделируя механические повреждения костей скелета у животных, состояние СФН будет зависеть от распространенности тканевой деструкции и динамики течения травмы.

Поэтому был проведен следующий эксперимент, целью которого являлось определение влияния секреторных продуктов нейтрофилов ПЭ животных с переломом костей голени одной конечности (изолированная травма) и двух конечностей (множественная травма) на иммунную защиту организма интактных мышей. Следуя поставленной задаче животные были разделены на несколько групп: 1 группа - мыши, у которых воспроизводился перелом костей одной голени (изолированная травма); 2 группа - животные, у которых воспроизводился перелом костей двух голеней (множественная травма); 3 и 4 группы - интактные животные, которым соответственно вводили САН и СНН мышей с изолированной травмой; 5 и 6 группы - интактные животные, которым соответственно вводили САН и СНН мышей с множественной травмой; 7 группа - интактные животные, которым вводили среду 199 (контрольная).

В результате эксперимента установлено, что характер и выраженность изменений эффекторной функции нейтрофилов ПЭ, используемых в дальнейшем для получения супернатантов, зависели от объема тканевой деструкции.

СНН и САН животных с изолированной травмой достоверно увеличивали фагоцитарную реакцию ГТМ здоровых мышей-реципиентов независимо от сроков их получения после травмы. При этом, отмечалось две особенности: во-первых, на 3 сутки

постгравматического периода СНН обладали достоверно выраженным фагоцитозсти-мулирующим действием по сравнению с САН, а, во-вторых, стимулирующее воздействие СНН на фагоцитарную реакцию макрофагов здоровых мышей в динамике посттравматического процесса имеет четкую тенденцию к снижению. Секреторные продукты «неактивированных» нейтрофилов, выделенных у животных на 14 сутки после травмы, не вызывали достоверного повышения процента фагоцитирующих макрофагов. Интенсивность поглотительной способности этих клеток оставалась на высоких цифрах. Выраженность стимулирующего влияния САН на уровень фагоцитоза макрофагов ПЭ интактных мышей к 7 и 14 суткам сохранялась приблизительно на одном уровне.

Иная картина прослеживалась при изучении действия супернатантов нейтрофилов животных с множественной травмой на фагоцитарную способность макрофагов здоровых мышей. Секреторные продукты «неактивированных» нейтрофилов, выделенных на 3 сутки после травмы, умеренно снижали фагоцитарную реакцию моно-нуклеарных фагоцитов в целом. Достоверное уменьшение в сравнении с нормой наблюдалось только со стороны интенсивности фагоцитоза этих клеток. Дополнительная активация нейтрофилов, полученных в этот период, латексом приводила к тому, что супернатанты этих клеток еще сильнее подавляли фагоцитоз макрофагов, преимущественно, действуя на его активность и интенсивность. Супернатанты нейтрофилов ПЭ, полученные у животных на 7 сутки после перелома костей двух конечностей, независимо от дополнительной латексной стимуляции достоверно снижали фагоцитарную способность макрофагов мышей-реципиентов. К 14 суткам после множественной травмы отмечалась тенденция к снижению отрицательного влияния секреторных продуктов «неактивированных» и активированных перитонеальных нейтрофилов на фагоцитоз макрофагов мышей-реципиентов.

Секреторные продукты нейтрофилов ПЭ у животных с изолированной травмой и у мышей с множественной травмой оказывали диаметрально противоположное действие на способность перитонеальных макрофагов интактных животных восстанавливать нитросиний тетразолий в диформазан. Если у мышей при повреждении одного сегмента конечности СНН и САН, в основном, усиливали кислородзависимый метаболизм мононуклеарных фагоцитов, то у животных с переломами костей голени обеих конечностей эти супернатанты, наоборот, - снижали. Оба вида супернатантов перитонеальных нейтрофилов, полученные у мышей на 7 сутки после изолированной травмы не оказывали какого-либо достоверного стимулирующего действия на спонтанную НСТ-реакцию макрофагов ПЭ интактных животных. СНН и САН, получаемые у мышей после множественных повреждений в этот же период, максимально снижали уровень кислородзависимого метаболизма.

Как видно, характер изменений эффекторной функции макрофагов, вызываемых введением секреторных продуктов нейтрофилов ПЭ мышей с экспериментальной травмой, зависит от обширности травматического повреждения и динамики его течения. Учитывая, что оценка эффекторной функции мононуклеарных фагоцитов не может полностью отражать развитие иммунного ответа, в частности, его заключительной фазы - антителообразования, было изучено влияние супернатантов нейтрофи-1

лов ПЭ травмированных животных на развитие иммунного ответа у мышей, иммунизированных ЭБ.

САН, полученные на 3 сутки у животных с изолированной травмой, вызывали достоверное уменьшение числа АОК-ЭБ в селезенке иммунизированных интактных мышей, тогда как при введении СНН снижение количества этих клеток было незначительным и не имело достоверного различия в сравнении с иммунным ответом на ЭБ у животных контрольной группы. На 7 и 14 сутки после травмы картина резко менялась. Супернатанты нейтрофилов ПЭ независимо от дополнительной стимуляции их латексом усиливали продукцию АОК-ЭБ в селезенке интактных мышей-реципиентов почти в 2,5-3 раза. Иммуностимулирующая активность у СНН, выделенных на 7 сутки после травмы, была опять несколько выше, чем у САН. К 14 суткам усиление иммунного ответа у здоровых мышей, вызываемое введением САН, наоборот, незначительно превалировало над таковым у животных, которым вводили СНН мышей с изолированной травмой.

Супернатанты нейтрофилов ПЭ животных с множественной травмой на протяжении всех исследуемых сроков посттравматического периода снижали иммунный ответ интактных мышей-реципиентов на ЭБ. При этом, достоверное уменьшение количества АОК-ЭБ в селезенке здоровых мышей-реципиентов было отмечено после введения супернатантов, полученных только на 3 и 7 сутки после тяжелой травмы. К 14 суткам секреторные продукты нейтрофилов не оказывали достоверного действия на иммунный ответ здоровых мышей.

Учитывая, что продукты секреции нейтрофилов детей с травматической болезнью, полученные в ее ранние периоды, обладали выраженным нейросупрессориым эффектом, нами было изучено влияние супернатантов нейтрофилов ПЭ травмированных животных на поведенческие реакции мышей-реципиентов.

СНН и САН ПЭ животных с изолированной травмой достоверно усиливали двигательную активность здоровых мышей-реципиентов. Наблюдаемое стимулирующее действие секреторных продуктов этих клеток сохранялось во все исследуемые сроки посттравматического процесса. В динамике отмечалась тенденция к уменьшению активизирующего влияния продуктов секреции нейтрофилов ПЭ на моторику интактных животных опытных групп.

СНН, полученные у мышей с множественной травмой на 3 и 7 сутки, достоверно увеличивали количество пересечений секторов и стоек, совершаемых мышами-реципиентами. Однако, данные продукты секреции нейтрофилов не вызывали достоверного повышения числа выглядываний животных в окна актографа. К 14 суткам СНН были способны достоверно повышать только число стоек и незначительно увеличивать моторную активность здоровых животных и их способность выглядывать в окна актографа.

САН, выделенные на 3 и 7 сутки после травмы, практически не влияли на моторную активность мышей-реципиентов. Только САН, полученные на 14 сутки посттравматического периода, достоверно увеличивали количество пересечений секторов опытными животными, не оказывая стимулирующего действия на ориентировочные реакции мышей-реципиентов.

Таким образом, «неактивированные» и дополнительно активированные in vitro латексом нейтрофилы животных, также как и человеческие нейтрофилы, обладают иммуно- и нейромодулирующим действием, направленность которого тесно связано с состоянием организма.

Развитие экспериментальных воспалительных процессов различного генеза (введение раствора казеина, травматические повреждения костей скелета) сопровождается изменением секреторной функции нейтрофилов, характер которой зависит от степени выраженности повреждения.

Введение 1,2% раствора казеина вызывало асептическое воспаление в брюшной полости, при котором нейтрофилы ПЭ выделяли в среду инкубирования независимо от дополнительной стимуляции клеток латексом факторы, которые усиливали функцию изучаемых нами звеньев иммунной и нервной систем, играющих чрезвычайно важную роль в адаптации организма к экстремальным условиям. Важно отметить, что реактивированные нейтрофилы экссудата воспаления, индуцированного казеином, были способны продуцировать факторы с еще более выраженным стимулирующим действием, что в определенной степени свидетельствовало о сохранении высокого функционального резерва этих клеток при данной воспалительной реакции.

При воспалительном процессе, развивающимся у животных после изолированного повреждения костей скелета, иммуно- и нейротропная активность продуктов секреции как «неактивированных», так и активированных нейтрофилов во многом была идентична по направленности той, которая наблюдалась при воспалении, вызываемым казеином. При данном посттравматическом воспалении резервный потенциал способности нейтрофилов продуцировать в условиях реактивации стимулирующие факторы начинал снижаться, так как САН по своей стимулирующей активности уступали СНН. При экспериментальной множественной травме развивалось воспаление, которое сопровождалось угнетением продукции стимулирующих веществ как «неактивированными», так и активированными нейтрофилами. Супернатанты данных клеток оказывали супрессорное действие на изучаемые показатели резистентности организма.

Изменения данной функции этих клеток имели динамическую зависимость. По мере стихания воспаления и превалирования репаративных процессов нейтрофилы начинали постепенно восстанавливать способность продуцировать стимулирующие факторы, особенно у животных с изолированной травмой. Угнетение продукции нейтрофилами стимулирующих веществ при тяжелой травме было более стойким, хотя также имело тенденцию к снижению.

Супернатанты нейтрофилов животных с тяжелой травмой, как и продукты этих клеток у части детей с травматической болезнью, обладали достаточно выраженным иммуно- и нейросупрессорным влиянием, а также снижали репарацию поврежденных тканей. Исходя из этого, возникал вопрос, чем обусловлено такое действие супер-натантов нейтрофилов. Можно было предположить, что изменение биопотенции-рующих свойств секреторных факторов нейтрофилов происходит не только за счет уменьшения в них стимулирующих продуктов, но и за счет сохранения или нарастания исходного (базального) уровня супрессорных веществ, продуцируемых данными клетками в условиях относительного «покоя». Последнее подтверждается данными

A.B. Зурочки (1991), который на модели инфекционного воспаления показал, что угнетающее действие САН инфицированных животных связано с сохраняющимся в них уровнем супрессорных и отсутствием секреции нейтрофилами стимулирующих факторов.

Учитывая это, можно было предположить, что восполнение недостатка стимулирующих факторов, продуцируемых нейтрофилами, развивающееся при тяжелой механической травме, секреторными продуктами активированных клеток донора может существенно повлиять на ее течение и исход. Однако, прежде чем доказать это, необходимо было ответить на два вопроса. Первый, насколько велико значение дефекта СФН в развитии данной патологии. Второй, как и чем можно восполнить недостаток стимулирующих факторов, секретируемых активированными нейтрофилами.

Для ответа на первый вопрос, мы провели исследование клинико-иммуноло-гических особенностей течения экспериментальной травматической болезни у животных, развивающейся после множественных повреждений костей скелета и характеризующейся нарушением способности нейтрофилов секретировать биостимулирующие факгоры.

Объектом изучения были беспородные и линейные мыши [СВА, Fi (CBAXC57BI)] с множественными переломами костей скелета. Исследования проводились в динамике на 3, 7, 14 и 21 сутки после травмы. В результате было установлено, что после множественных переломов костей скелета в организме животного развивалось нарушение постоянства внутренней среды. Последнее характеризовалось не только стойким снижением эффекторной и секреторной функции нейтрофилов, но и развитием в ранний посттравматический период гипотермии, угнетением двигатель-но-ориентировочной деятельности животных, задержкой роста массы тела, весовой инволюцией иммунокомпетентных органов (тимус, селезенка, печень), сочетающейся со снижением уровня ЯСК и тканевого белка в этих органах, понижением пластических процессов, нейтрофилезом и лимфопенией, а также вторичным постгравматиче-ским иммунодефицитом: уменьшением антигенпредставляющей функции макрофагов, снижением иммунного ответа и РТПХ. Все это в целом сопровождалось значительным понижением общей резистентности травмированных животных и гибелью части из них.

Исходя из этого, можно было предположить, что угнетение секреции нейтрофилами биостимулирующих факторов, наблюдаемое в клинике и эксперименте при травматической болезни, играет важную роль в ее развитии и исходе. Для подтверждения данного предположения нами было проведен корреляционный анализ взаимосвязи между степенью (индексом сдвига) влияния секреторных продуктов нейтрофилов травмированных животных на иммунный ответ здоровых мышей и уровнем вышеуказанных клинико-иммунологических показателей у мышей с множественной 1равмой. В результате чего, было установлено, что между нарушением способности нейтрофилов секретировать иммуностимулирующие факторы и изменениями многих из изучаемых нами показателей существует тесная связь. Секреторная функция нейтрофилов была достоверно связана с показателями, отражающими нейро-моторную

деятельность, пластические процессы (вес животных, распределение тканевого белка заживление ран), тимико-лимфатическую инволюцию, иммунологическую реактивность (иммунный ответ, РТГГХ, эффекторная функция макрофагов) и несколько г меньшей степени - с устойчивостью животных с множественной травмой к острой физической нагрузке и с их летальностью.

Учитывая наличие данной корреляционной зависимости, можно было думать что восстановление секреторной способности нейтрофилов травмированных животных будет сказываться на состоянии нервной и иммунной систем, процессах репарации, в частности, и на адаптации организма к травме, в целом. Именно поэтому, поиск путей коррекции дефицита стимулирующих веществ, секретируемых нейтро-филами, стал для нас одной из главных задач в настоящем исследовании.

Как было показано, активированные нейтрофилы донора секретируют продукты с выраженными биостимулирующими свойствами, в связи с эти нами был проведен эксперимент, целью которого являлось определение влияния САН здоровых мышей на течение посттравматического процесса у животных с множественными повреждениями скелета.

Донорами нейтрофилов служили мыши линии СзНА. Множественную травму воспроизводили у мышей-гибридов Р| (СВАхС57В1). Супернатанты, полученные от 10 животных, суммировали и вводили в дозе 50 мкл/мышь внутрибрюшинно мышам с множественными переломами трижды с интервалом 48 часов после нанесения повреждения. Первую инъекцию производили через час после травмы. Контролем служила группа интактных (контроль 1 - до травмы) и травмированных животных, которым аналогичным образом вводили 0,05 мл среды 199 (контроль 2). Иммунологическую реактивность оценивалась по уровню иммунного ответа на ЭБ и ряда показателей эффекторной функции перитонеальных макрофагов. Для изучения иммунного ответа на 3, 7, 14 и 21 сутки мышей внутрибрюшинно иммунизировали 2х108 ЭБ/мышь, а через пять дней у контрольных и опытных животных определяли способность к формированию АОК-ЭБ в селезенке. В эти же сроки у другой группы опытных животных, которые получали донорские САН, исследовали фагоцитарную функцию перитонеальных макрофагов и их кислородзависимый метаболизм. Контролем также служили интактные и травмированные мыши, которым вводили среду 199.

В результате проведенных исследований было установлено, что уже на 3 сутки после травмы введение САН приводило к повышению числа АОК-ЭБ в селезенке мышей. На 7 сутки после травмы уровень АОК-ЭБ в селезенках травмированных мышей достигал максимального значения и достоверно превышал их содержание как у интактных, так и у контрольных травмированных животных. Введение САН интактных мышей травмированным животным повышало поглотительную способность и кислородзависимый метаболизм ПМ. Иммуностимулирующие супернатанты вызывали стойкое достоверное повышение числа фагоцитирующих клеток, увеличивая их способность захватывать частицы латекса. Активность и интенсивность спонтанной НСТ-реакции мононуклеарных фагоцитов у мышей с множественной травмой под влиянием вводимых САН достоверно увеличивались по сравнению с интактными животными. Наиболее выраженное стимулирующее действие на способность этих кле-

гок восстанавливать нитросиний тетразолий в диформазан отмечено после окончания введения САН, то есть на 7 сутки после травмы, а также в последний срок исследования.

Важно было отметить и то, что САН интактных мышей оказывали стимулирующее влияние не только на иммунную систему травмированных животных, но и на динамику прироста веса их тела. На 14 сутки после травмы прирост веса животных после введения САН был более значимым, чем- у мышей с травмой, которым вводили среду 199 (р<0,05).

На фоне изменений массы тела животных, наблюдаемых после введения секреторных продуктов активированных донорских нейтрофилов, отмечалась активация их двигательно-ориентировочных реакций. На 3 сутки после травмы и первого введения САН травмированные мыши пересекали значительно большее количество секторов акгографа, чем животные второй контрольной группы, а частота пересечений достигала нормального уровня. Они достоверно чаще делали стойки и выглядывали в окна актографа, чем животные с травмой, которым вводили просто среду 199. Однако, уровень их ориентировочных реакций в этот период был еще крайне далек от нормального. К 7 суткам нейро-моторная активность мышей-реципиентов САН доноров, как и в последующие периоды продолжала возрастать и ее уровень до 21 суток был по ряду показателей достоверно выше, чем у второй контрольной группы, и мало чем отличался по сравнению с интактными животными.

Таким образом, полученные результаты свидетельствовали о том, что восполняя наблюдаемый у животных с множественной травмой недостаток стимулирующих факторов, секретируемых нейтрофилами в норме, можно восстановить не только иммунологическую реактивность и пластические процессы организма, но и его нейро-моторную активность. Данный эффект достигался даже при введении просто суммарных продуктов секреции активированных нейтрофилов здоровых животных. С эдной стороны, этот факт подтверждал наши предположения о возможности коррекции САН доноров нарушений СФН, а с другой - ставил перед нами другую проблему - определить какие же вещества или вещество, входящие в состав этих супернатантов являются основой для вышеописанных эффектов. Для того, чтобы осуществить исследование в данном направлении, необходимо было получить достаточно большое количество супернатанта с целью его фракционирования и очистки. Такое реально эыло сделать только при работе с нейтрофилами периферической крови человека или крупных животных. Мы остановились на донорской человеческой крови.

При хроматографии нативных суммарных супернатантов активированных ней-фофилов здоровых людей на сефадексе 0-15 была получена А з -пептидсодержащая фракция с выраженными иммуностимулирующими свойствами. Используя метод зысокоэффективной жидкостной хроматографии из этой фракции на модифицированных силикогелях в градиенте ацетонитрила было выделено вещество, называемое 1ами "Аз-вещество", имеющее ЫИг-концевую аминокислоту - лейцин и М.М. около I 500 Д.

После получения вещества было изучено его влияние на состояние некоторых теньев гомеостаза животных в норме и при множественных повреждениях костей

скелета. Исследование было выполнено на мышах-гибридах Р, (СВАХС57В1), которые были разделены на 4 группы: 1 группа - интактные животные, которым вводили физиологический раствор; 2 группа - интактные мыши, которым вводили Аз-вещество; 3 группа - животные с множественными переломами костей скелета (переломы костей голени с обеих сторон), которым вводили физиологический раствор; 4 группа - мыши с множественными переломами костей скелета (переломы костей голени с обеих сторон), которым вводили Аз-вещество.

Через час после нанесения повреждения животным внутрибрюшинно вводили вещество А5-пептидсодержащей фракции в количестве 10~7 мг/мышь, разведенном в 0,1 мл физиологического раствора, обладающего максимальным иммуностимулирующим действием. Инъекцию вещества повторяли на 3 и 5 сутки после травмы. Схема введения вещества из А5-пептидсодержащей фракции в группе интактных мышей была идентичной.

В первой серии опытов на 3, 7, 14 и 21 сутки после начала эксперимента у мышей измерялись вес и ректальная температура, а также исследовалась их двигатель-но-ориентировочная активность в «открытом» поле. В соответствии с вышеуказанными сроками у животных изучались: реакция системы крови по процентному соотношению и абсолютному количеству нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов; вес им-мунокомпетентных органов (тимус, селезенка, печень) и количество ЯСК в мг ткани тимуса и селезенки для определения тимико-лимфатической инволюции; содержание белка в ткани тимуса, селезенки, печени и периферической крови с целью оценки состояния пластических процессов.

Во второй серии экспериментов было изучено влияние вещества А5-пептидсо-держащей фракции на иммунный ответ изучаемых групп животных, иммунизированных ЭБ. У аналогичных групп мышей изучались эффекгорная и антигенпредстав-ляющая функции макрофагов и активность клеток селезенки в локальной РГ11Х при полусингенном переносе в генетической комбинации СВА -» гибриды И) (СВАхС57В1).

В третьей серии опытов исследовалось состояние тканевой репарации у обследуемых групп мышей, которое оценивалось по времени заживления стандартных ожоговых ран, а также по динамике формирования костной мозоли и ее прочности.

Четвертая серия экспериментов была посвящена изучению влияния А5- вещества на устойчивость испытуемых животных к дополнительным стресс-воздействиям (принудительное плавание и заражение стафилококком) и их летальности при множественных повреждениях скелета и тяжелой ожоговой травме.

Введение Аз-вещества животным с множественной травмой уже в первые часы приводило к усилению наблюдаемой у них посттравматической гипотермии. Отмечаемое усиление гипотермии в ранний период посттравматического процесса можно с определенной вероятностью расценивать как положительное явление, ибо из данных литературы известно, что умеренное снижение температуры является одним из факторов, сдерживающих распад тканей, а искусственная гипотермия широко используется как метод защиты ряда органов при продолжительных хирургических вмешательствах (Захаров В.Е., 1983; Зотов С.П., 1988). Кроме того, исследованиями И.И.

Волчегорского (1985) было показано, что снижение температуры тела ниже 34° является критическим для животных с обширными термическими повреждениями и приводит их к гибели. В наших же наблюдениях индуцируемая А5-веществом гипотермия у травмированных мышей оказалась ниже критического уровня только у одного животного, которое погибло на вторые сутки после травмы.

После введения А5-вещества у животных с множественной травмой вес тела на 3 сутки после нанесения повреждения сохранялся на прежнем уровне, а в дальнейшем имел положительную динамику. У травмированных мышей, которым вводили физиологический раствор, отрицательный баланс веса наблюдался до 14 суток и только к последнему сроку исследования масса тела животных этой группы начинала увеличиваться, при этом не достигая нормальной величины. Введение А5-вещества интакт-ным животным не вызывало достоверного изменения веса тела.

На фоне наблюдаемого изменения со стороны веса животных с множественными переломами костей скелета после введения А5-вещества относительная масса таких иммунокомпетентных органов, как тимус и селезенка, менялась незначительно.

Диаметрально противоположные изменения были выявлены при изучении содержания ЯСК в тимусе травмированных животных, которым вводили А5-вещество. Во все исследуемые сроки посттравматического периода количество ЯСК в тимусе мышей данной группы было достоверно выше, чем у интактных животных и мышей с множественной травмой, получавших физиологический раствор. Введение А5-вещес-тва интактным животным первоначально приводило к снижению числа ЯСК в тимусе и лишь к 21 сутками вызывало достоверное увеличение данных клеток по сравнению с нормой.

У здоровых мышей и животных с множественной травмой введение вещества А5-фракции вызывало изменение содержания селезеночных ЯСК только на 7 сутки. В этот период наблюдалось достоверное повышение данных клеток в селезенке мышей этих групп. После чего, на 14 сутки отмечалось статистически значимое снижение уровня ЯСК в селезенке, которое сменялось к 21 суткам значительным увеличением количества этих клеток.

Таким образом, А5-вещество при введении его животным с травмой предотвращало развитие отрицательной динамики их веса, но при этом не оказывало существенного влияния на возникающую при травме весовую инволюцию такого органа как тимус. Между тем, при снижении веса последнего количество ЯСК в нем под влиянием А5-вещества не только не падало, а, наоборот, увеличивалось. Этот факт, в какой-то мере, свидетельствовал о нивелировании развития истинной посттравматической акцидентальной инволюции тимуса и увеличении клеточной плотности этого органа. Последнее в определенной степени подтверждалось данными, полученными при исследовании содержания белка в сырой ткани вилочковой железы.

Количество белка, приходящееся в перерасчете на 1 г сырой ткани тимуса травмированных животных-реципиентов А5-вещества, было на 3 сутки после перелома костей достоверно выше уровня тканевого белка в данном органе у интактных мышей и животных с множественной травмой, которым вводили физиологический раствор. В дальнейшем, несмотря на снижение тканевого белка в тимусе, уровень

его на 7, 14 и 21 сутки оставался в пределах нормы. У травмированных животных контрольной группы содержание белка в ткани тимуса нормализовалось только к 14 суткам посттравматического периода. Необходимо отметить, что динамика изменения тканевого содержания белка в тимусе у здоровых мышей, получавших А5-вещество, была сходной с таковой у травмированных животных-реципиентов данного препарата.

В селезенке мышей с травмой, которым вводили А5-вещество, количество белка в ткани достоверно снижалось и достигало минимального значения на 7 сутки постгравматического периода, тогда как у травмированных животных контрольной группы уровень этого показателя в данный срок соответствовал норме, а у интактных животных после его введения - превышал норму почти в 2 раза. В последующие периоды исследования содержание тканевого белка в селезенке был приблизительно одинаковым у всех групп животных и несколько превышало нормальный уровень.

Введение А5-вещества вызывало у животных также изменение содержания белка в печени. У интактных мышей-реципиентов данного вещества на 3 сутки отмечалось достоверное повышение уровня тканевого белка печени. Аналогичное повышение, но менее выраженное, наблюдалось у животных с множественной травмой на 7 день после нанесения повреждения. В то же время у контрольной группы травмированных животных содержание белка в ткани печени было снижено во все сроки постгравматического периода.

Изложенные выше материалы свидетельствуют о развитии нарушений белкового обмена у животных с множественными переломами, которые проявляются в наших наблюдениях снижением содержания белка в тканях. Введение вещества, полученного из А5-пептидсодержащей фракции САН доноров, позволило не только сохранить содержание белка в тканях травмированного животного на нормальном уровне, но в ряде органов, в частности в тимусе и печени, повысить его количество. Последнее, вероятно, может быть обусловлено усилением клеточной пролиферации, которая сопровождалась повышением ЯСК в тимусе как интактных, так и травмированных животных, являющихся реципиентами А5-вещества.

Существенное позитивное влияние исследуемого А5-вещества на белковый обмен животных во многом положительно сказалось на репарации зон тканевой деструкции. А5-вещество способно ускорять заживление стандартных точечных ожоговых ран не только у здоровых мышей, но у животных с множественной травмой. Введение данного вещества интактным мышам приводило к достоверному сокращению времени отторжения струпа и эпителизации раневой поверхности. Аналогичная картина наблюдалась и у травмированных животных, являющихся реципиентами А5-вещес-тва. При этом, у последней группы мышей время отторжения струпа и эпителизации ожоговых ран было достоверно меньше не только в сравнении с животными с травмой контрольной группы, но и с интактными мышами.

Как известно, восстановительные процессы при благоприятном течении травматической болезни протекают значительно быстрее в мягких тканях, чем в кости. Именно поэтому, поиск методов и средств, позволяющих ускорить процесс срастания костных отломков, всегда являлся для исследователей и практических врачей актуальной проблемой. Исходя из того, что введение А5-вещества травмированным жи-

вотным сопровождалось ощутимым сокращением времени восстановления термически поврежденных мягких тканей, нельзя было не предположить, что это вещество может влиять и на сроки костной консолидации.

Для подтверждения этого предположения был проведен эксперимент, целью которого являлось изучение динамики формирования костной мозоли и определение ее прочности после введения травмированным животным А5-вещества. Исследования были проведены на двух группах мышей линии СВА, у которых моделировались закрытые переломы костей голени обеих задних конечностей. После этого, одной из групп животных в той же дозе и по аналогичной схеме внутрибрюшинно вводилось А5-вещество. Мышам другой группы вводили физиологический раствор. О течении костной репарации судили по данным рентгенологического исследования, макроскопической оценки и измерению веса травмированных костей голени, а также по средним значениям длины и толщины костной мозоли. Для исключения искажения результатов, связанного с влиянием смещения отломков на объем костной мозоли, производились измерения угла смещения отломков, относительной длины поврежденного сегмента и абсолютной длины костных отломков, величины которых использовались в предложенной нами формуле для расчета индекса роста костной мозоли. По окончании всех измерений проводилось исследование прочности костной мозоли на растяжение.

У животных после перелома отмечалась патологическая подвижность в поврежденном сегменте. В контрольной группе этот симптом полностью исчезал только к 21 суткам. Патологическая подвижность у травмированных мышей-реципиентов А5-вещества уменьшалась уже на 7 сутки после травмы и исчезала у большинства животных к 14 дню. В контрольной группе травмированных мышей на 7 сутки после перелома появление костной мозоли отмечалось в 10 из 18 выделенных сегментов (одна мышь погибла на 2 сутки). У травмированных мышей-реципиентов А5-вещества хорошо сформировавшаяся наружная костная мозоль в этот срок наблюдалась на всех выделенных костях голени. Важно отметить, что, относительный вес поврежденных костей голени у мышей-реципиентов А5-вещества был достоверно выше, чем у травмированных животных, которым вводили физиологический раствор. Среднее значение протяженности и толщины костной мозоли у мышей-реципиентов А5-веще-ства было достоверно выше на 7 сутки после травмы. Данные показатели у травмированных животных контрольной группы достигали максимальных значений несколько позже - на 14 сутки. В целом же, максимальный рост костной мозоли после введения А5-вещества наблюдался на 7 сутки после перелома. Величина индекса роста костной мозоли в этот период была выше в 2 раза, чем у контрольных мышей. К этому времени у животных данной группы костная мозоль становилась рентгенокон-трастной, тогда как у мышей, которым вводили физиологический раствор, такая рентгенологическая картина не наблюдалось, даже при условии относительно благополучного стояния отломков.

По мере формирования костной мозоли увеличивалась ее устойчивость к растяжению. Под влиянием А5-вещества прочность сращения отломков костей голени у травмированных животных на 7 сутки после перелома достоверно возрастала по сравнению с группой контрольных мышей. Величина усилия, необходимого для разрыва

срастающихся отломков, у мышей-реципиентов А5-вещества увеличивалась почти в раза. При перестройке костной мозоли ее прочность при растяжении возрастала 1 обеих группах обследуемых животных, но и в этом случае величина силы разрыв; костных отломков у опытных мышей было достоверно выше, чем у контрольных.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствовали о высокой био логической активности изучаемого А5-вещества в отношении к процессов репарацш кожи и костей у животных с множественной травмой.

Восстановительная способность является универсальным свойством всего жи вого. В ее регуляции значительная роль принадлежит гуморальным и клеточньи звеньям иммунной системы. Поэтому важно было проследить, как будет изменятьа иммунологическая реактивность травмированных животных под влиянием А5-вещес тва.

Состояние иммунной системы у подопытных мышей оценивали по абсолютно му количеству и процентному соотношению лейкоцитов крови, уровню функцио нальной активности макрофагов, интенсивности иммунного ответа организма на ЭБ,; также по РТПХ.

При исследовании содержания лейкоцитов в периферической крови у травми рованных мышей под влиянием А5-вещества в первые сутки после перелома не раз вивались нейтрофилез и лимфопения, которые были характерны для контрольно} группы животных с травмой. На 7 сутки процентное содержание ПМЯЛ у мышей реципиентов А5-вещества несколько снижалось, а лимфоцитов - повышалоа (р>0,05). В дальнейшем уровень данных клеток в процентном отношении выравни вался во всех группах опытных мышей и достигал нормальных цифр.

Таким образом, введение А5-вещества на ранних сроках развития травматиче ской болезни у животных с множественными переломами костей скелета в опреде ленной степени сдерживает развитие стрессорной реакции системы крови, которая характеризуется, согласно данных П.Д. Горизонтова (1981), нейтрофилезом и лимфо пений.

Поскольку макрофаги играют важную роль в регуляции процессов восстановления поврежденных тканей и принимают активное участие в поддержании иммунногс гомеостаза, необходимо было выяснить влияние А5-вещества на функциональную активность этих клеток у мышей с множественной травмой.

Исследование показало, что на 3 сутки после травмы и начала введения вещества уровень фагоцитарной реакции ПМ у травмированных животных достовернс возрастал как по сравнению с группой интактных мышей, так и в сравнении с животными с травмой, которым вводили физиологический раствор. Повышение числа фагоцитирующих клеток и активация их поглотительной способности продолжали отмечаться и на 7 сутки после травмы. К 14 и 21 суткам активность и интенсивносп фагоцитоза нормализовались. Введение А5-вещества здоровым мышам приводилс также к длительному подъему фагоцитарной способности ПМ.

Усиление фагоцитарной реакции ПМ у животных, индуцируемое А5-вещест-вом, сопровождалось активацией кислородзависимого метаболизма этих клеток. Нг протяжении, всего изучаемого постгравматического периода у мышей-реципиентоЕ данного вещества достоверно повышался процент НСТ-положительных макрофаго!

по отношению к норме. Вместе с тем, необходимо отметить, что на 3 сутки после травмы интенсивность восстановления нитросинего тетразолия в диформазан в этих клетках мышей-реципиентов А5-вещества была снижена по сравнению с контролем. Увеличение интенсивности спонтанной НСТ-реакции ПМ отмечалась несколько позже (на 14 сутки после травмы). К 21 суткам данный показатель нормализовался у обеих групп мышей с травмой. У здоровых животных максимальное увеличение НСТ-положительных ПМ наблюдалось на 3 сутки после введения А5-вещества. После чего их количество нормализовалось к 14 суткам и в дальнейшем опять достоверно повышалось. Интенсивность же спонтанной НСТ-реакции ПМ первоначально достоверно снижалась, но на 7, 14 и 21 сутки после введения исследуемого вещества возрастала и по величине статистически значимо превышала нормальный уровень.

На фоне изменения фагоцитарной активности и их кислородзависимого метаболизма усиливалась также АГПФ ПМ у животных, которым вводили А5-вещество. Ее уровень после введения вещества у травмированных животных, в отличии от таковой у группы сравнения, на 3 день после травмы был нормальным, но несколько снижался к 7 суткам. В дальнейшем отмечалось достоверное повышение данной функции ПМ как по сравнению с интактными животными, так и по отношению к группе травмированных мышей, которым вводили физиологический раствор.

Наблюдаемое усиление АГПФМ у опытных животных, вызываемое А5-ве-ществом, сопровождалось повышением уровня иммунного ответа на вводимые ЭБ и активности клеток селезенки в локальной РТПХ. У травмированных животных-реципиентов А5-вещества процесс нормализации образования АОК-ЭБ происходил значительно быстрее и отмечался уже на 7 сутки после перелома костей. К 14 суткам уровень этих клеток достигал достоверного различия в сравнении не только с контрольной группой травмированных мышей, но и с нормой. В дальнейшем количество АОК-ЭБ у этих групп животных в одинаковой степени нормализовался. Аналогичное повышение содержания этих клеток наблюдалось и у здоровых мышей-реципиентов А5-вещества. У них максимальный иммунный ответ отмечался на 14 сутки после введения вещества.

Во многом сходные изменения были зарегистрированы и со стороны РТПХ. Отличие заключалось только во времени максимального подъема активности спленоци-тов в данной реакции, который был отмечен на 7 день как у интактных, так и у травмированных мышей-реципиентов А5-вещества.

Таким образом, вещество, выделенное нами из А5-пептидсодержаший фракции активированных нейгрофилов донора, оказывало существенное стимулирующее влияние на все исследуемые звенья иммунной системы не только здоровых животных, но и мышей с множественными переломами. При этом, введения А5-вещества сдерживало развитие иммунодефицитного состояния у мышей с экспериментальной травмой.

Поскольку иммунная и нервная системы неразрывно связаны между собой и играют важную роль в системе адаптации организма к экстремальным условиям, представлялось важным определить влияние А5-вещества на двигательно-ориенти-ровочную деятельность животных с множественной травмой. Двигательно-ориенти-ровочные реакции у подопытных животных изучали в "открытом" поле. Если в первые дни после перелома костей наблюдалось резкое угнетение ориентировочной

способности у мышей в актографе, то у реципиентов А5-вещества на 3 сутки количе ство стоек оставалось в пределах нормы, а число выглядываний было почти в 2 раз выше. В дальнейшем уровень ориентировочной активности животных с множествен ной травмой постепенно повышался. Однако, если у мышей-реципиентов А5-вещес тва все показатели ориентировочной деятельности нормализовались к 21 суткам пос ле травмы, то у травмированных животных контрольной группы число выглядывани в окна актографа к этому сроку оставалось достоверно сниженным по сравнению нормой. В меньшей степени изменялась под влиянием А5-ве-щества моторная актив ность мышей с переломами костей. Однако, надо отметить, что на 7 сутки количест во пересечений секторов, совершаемых мышами-реципиентами А5-вещества, был достоверно выше чем, у травмированных животных, которым вводили физиологиче ский раствор. К 21 суткам моторная активность обеих групп мышей с множественно: травмой восстанавливалась и по уровню мало чем отличалась.

Кратко подводя итог проведенным исследованиям, можно отметить, что А5 вещество оказывает достоверное стимулирующее действие не только на пластически процессы и тканевую репарацию, но и иммунологическую реактивность и нервнук систему животных с экспериментальной травмой. При этом, максимальное воздейст вие А5-вещества отмечалось именно в ранние периоды травматической болезни, ког да наиболее выражены были изменения со стороны вышеперечисленных звеньев го меостаза организма.

Исходя из этого, для нас представлялось важным ответить на вопрос, можно л: А5-веществом увеличить резервные возможности травмированных животных и тег самым снизить их летальность при травме, в том числе и при тяжелом ожоге.

Для ответа на этот вопрос нами было проведено исследование устойчивост] травмированных животных к острой физической нагрузке, моделируемой путем при нудительного плавания. Кроме этого, продолжительность плавания была изучена ; групп мышей с травмой, которых дополнительно инфицировали золотистым стафи лококком.

В условиях принудительного плавания интактные мыши удерживались на по верхности воды в течение 292,0±40,1 минут. После нанесения травмы продолжитель ность плавания достоверно снижалась только на 3 сутки. К 7 суткам она нормализо валась, а на 14 день даже несколько превышала норму. Травмированные животные которым вводили А5-вещество, уже на 3 сутки плавали несколько дольше, чем мыш) с травмой, получавшие физиологический раствор. На 7 и 14 сутки время плавани мышей-реципиентов изучаемого вещества возрастало почти в 2 раза. Инфицировани мышей с множественной травмой приводило к резкому сокращению длительности и: плавания, которое равнялось в среднем 8,47±0,38 мин. Введение А5-вещества живот ным с травмой, отягощенной инфекцией, достоверно увеличивало продолжитель ность их плавания до 11,83+0,44 мин.

И, наконец, нами было проведено изучение влияния А5-вещества на летальност животных после множественной травмы, а также на выживаемость мышей при нане сении им сублетального термического ожога.

Таблица

Регуляторные эффекты вещества, выделенного из Аб-пептидсодержащей фракции нейтрофилов донора, наблюдаемые после его введения травмированным

животным

Исходный уровень Характер действия Аз-

изучаемых показате- вещества на ранних сроках

Показатели лей у животных с посттравматического пе-

травмой риода

Температурная реакция Сниженный Понижает

Вес животных Сниженный Увеличивает

Двигательная активность Сильно сниженный Увеличивает

Ориентировочная деятельность Сильно сниженный Увеличивает

Относительный вес тимуса Сниженный Не влияет

Относительный вес селезенки Нормальный Увеличивает

Относительный вес печени Сниженный Не влияет

Содержание ЯСК тимуса Сниженный Увеличивает

Содержание ЯСК селезенки Сниженный Понижает

Количество белка в г тимуса Сниженный Увеличивает

Количество белка в г селезенки Сниженный Понижает

Количество белка в г печени Сниженный Нормализует

Количество белка в крови Нормальный Не влияет

Соотношение форм лейкоцитов Нейтрофилез и лим- Нормализует

крови фопения

Фагоцитоз макрофагов Сниженный Усиливает

Кислородзависимый метаболизм Повышенный Усиливает

макрофагов

АГПФМ Сниженный Усиливает

Иммунный ответ ЭБ Сниженный Усиливает

РТПХ Сниженный Усиливает

Время заживления ран Сниженный Ускоряет

Костная консолидация - Ускоряет

Устойчивость к острой физиче- Сниженный Повышает

ской нагрузке

Летальность Высокий Снижает

В результате проведенных исследований было установлено, что после множественных переломов костей скелета погибает 17% животных. В группе травмированных животных, которым вводили Аз-вещество, летальность равнялась 9%. При термическом ожоге 35-40% поверхности тела Шб-степени в контрольной группе выживало только 15% мышей, тогда как в опытной - 43% животных (х2>3,841, р<0,05).

Таким образом, полученные данные еще раз свидетельствуют о том, что ней-трофил с функциональной точки зрения является уникальной и высокоуниверсальной клеткой, занимающей одно из центральных мест в системе обеспечения восстановительной способности любого живого организма. Ее по праву можно назвать «одноклеточной секреторной железой». Свое участие в поддержании внутреннего постоянства среды организма она реализует как за счет мощного эффекторного потенциала, так и посредством продукции и выделения многочисленных высоко-, средне- и низкомолекулярных регуляторных факторов пептидной природы, в том числе и тех, которые были обнаружены и изучены нами. Благодаря секреции этих продуктов ней-трофилы принимают не только активное участие в каскадной сети регуляции иммуногенеза, но существенно влияют на функцию центральной нервной системы, процессы репарационной регенерации и механизмы устойчивости организма к экстремальным условиям в норме и при патологии. Об этом свидетельствуют обобщенные данные, полученные при исследовании иммунобиологической активности вещества, выделенного из А5-пептидсодержащей фракции супернатантов активированных латексом нейтрофилов, на модели травматической болезни, которые представлены в таблице.

Нарушение способности нейтрофилов секретировать стимулирующие низкомолекулярные пептидсодержащие факторы при развитии посттравматического состояния во многом определяют течение и исход травматической болезни, ибо оно является одной из причин вторичного иммунодефицита, дисфункции нервной системы, ре-парационно-пластических процессов и снижения устойчивости организма к дополнительным стресс-воздействиям. С одной стороны, это было наглядно подтверждено не только серией экспериментов, показавших, что нанесение травмы ведет к угнетению секреторной функции нейтрофилов (СФН), но и исследованиями данной способности клеток в клинике у детей с травматической болезнью, выявившими различные типы состояния СФН, развитие которых зависело от тяжести повреждения. С другой стороны, введение стимулирующих секреторных продуктов нейтрофилов доноров значительно способствовало восстановлению иммунореактивности, двигательно-ориенти-ровочных реакций, заживлению поврежденных тканей, устойчивости к дополнительному стрессу, как в частности, так и снижению летальности животных с тяжелой экспериментальной травмой, в целом. Последнее подтверждает не только чрезвычайное важное значение исследуемой функции нейтрофилов в обеспечении выживаемости организма в экстремальных условиях, но открывает перспективы для создания нового лекарственного препарата, обладающего широким спектром биорегуляторного действия.

Оценивая полученные нами результаты исследования иммунобиологической активности нейтрофилов и их низкомолекулярных продуктов секреции, мы считаем, что сделан еще один шаг на пути к познанию общебиологического значения данных клеток в организме как в норме, так и при патологии.

ВЫВОДЫ

1. В процессе развития травматической болезни у детей формируется иммуно-дефицитное состояние, характеризующееся не только изменением гуморального и

клеточного звеньев иммунной системы, но и нарушением межклеточного взаимодействия в системе кооперации "нейтрофил-моноцит".

2. У детей с травматической болезнью отмечаются четыре типа кооперативных связей между поли- и мононуклеарными фагоцитами in vitro: нормальный, компенсированный, субкомпенсированный и декомпенсированный. При нормальном типе межклеточного взаимодействия в системе "гранулоциты-моноциты доноров" секреторные продукты неактивированных нейтрофилов больных снижают, а активированных - усиливают эффекторную функцию клеток-мишеней. Компенсированный тип характеризуется тем, что продукты секреции неактивированных и активированных нейтрофилов детей с травмой активируют фагоцитарную и лизосомальную активность донорских моноцитов. Для субкомпенсированного типа свойственно моноцит-стимулирующее действие секреторных продуктов неактивированных нейтрофилов и моноцитсупрессорное - активированных клеток. При декомпенсированном типе продукты секреции нейтрофилов больного независимо от их активации латексом оказывают только супрессорное действие на эффекторную функцию моноцитов доноров.

Нарушения моноцитрегулируюшей функции нейтрофилов после травмы более, чем у половины детей с травматической болезнью, сочетается с дефектом воспринимающей способности моноцитов к донорским нейтрофилокинам.

4. Суб- и декомпенсированное состояние регуляторной функции нейтрофилов в сочетании со снижением воспринимающей способности моноцитов к донорским нейтрофилокинам чаще встречается у детей при множественных и сочетанных механических повреждениях, в острый период и катаболическую фазу стадии развернутой клинической картины травматической болезни и нередко сопровождается развитием гнойно-воспалительных осложнений.

5. Секреторные продукты нейтрофилов, полученные у детей в ранние периоды травматической болезни, вызывают у интактных животных развитие иммунодефи-цитного состояния, нарушение репарационно-пластических процессов и угнетение деятельности ЦНС, аналогичные тем, которые отмечаются у мышей с экспериментальной множественной травмой.

6. У мышей с экспериментальной травматической болезнью на фоне нарушения изучаемых звеньев гомеостаза наблюдается дефект межклеточного взаимодействия в системе "нейтрофил-иммуноциты", проявляющийся тем, что при изолированной травме секреторные продукты нейтрофилов обладают, преимущественно, иммунобио-стимулирующим, а при множественных повреждениях - иммунобиосупрессорным действием

7. Изменения иммунобиологических свойств продуктов секреции нейтрофилов у животных с переломами костей и у детей с травматической болезнью имеют однонаправленный характер, который зависит от тяжести повреждений, что указывает на общебиологическую закономерность регуляторной функции этих клеток при посттравматическом процессе.

8 У животных с множественной травмой между нарушением секреторной функции нейтрофилов, с одной стороны, и угнетением иммунологической реактивности и пластических процессов, а также изменением состояния нервной системы, устойчивости организма к дополнительному стресс-воздействию и летальностью, с

другой, имеются тесные корреляционные связи, что свидетельствует о взаимодейсп вии нейтрофилов с различными звеньями гомеостаза при травматической болезни.

9. Введение нейтрофилокинов доноров восстанавливает у животных с тяжело травмой иммунологическую реактивность, ускоряет течение репарационно-пласти ческих процессов, улучшает функцию центральной нервной системы, повышае устойчивость организма к дополнительному стрессу и снижает почти в 2 раза их ле тальность, что открывает перспективы для создания нового лекарственного препарг та, обладающего широким спектром биорегуляторного действия.

10. Нейтрофилы являются одними из ключевых клеток в регуляции различны звеньев гомеостаза (иммунной и нервной систем, репарационной регенерации) орг;: низма при травматической болезни, течение и исход которой во многом зависят о способности данных клеток секретировать иммунобиостимулирующие факторы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 .Модификация метода изучения функциональной активности моноцитов пе риферической крови, культивируемых in vitro // Лабораторное дело. - 1983. - № 2. - С 26-29 (соавт. Л.Я. Эберт, С.И. Марачев, Л.Б. Новокрещенов).

2.Диагностическое и прогностическое значение исследования активности фаго цитов при различных патологических состояниях // Фагоцитоз и иммунитет: Тез докл. Всесоюзного симпозиума, посвященного 100-летию создания фагоцитарно! теории иммунитета. - М., 1983. - С. 249-250 (соавт. Л.Я. Эберт, С.И. Марачев, А.В Зурочка, Б.Г. Девятьяров).

3.Оценка некоторых тестов, используемых для изучения функции нейтрофило у человека // Тез. докладов Всесоюзной конференции. - Новосибирск, 1985. - С. 134 135 (соавт. И.И. Долгушин, A.B. Зурочка, Е.А. Крашенинникова, И.М. Беляков).

4.Психотропные свойства секреторных продуктов нейтрофилов // Роль молоды: ученых и специалистов-медиков в совершенствовании медицинской помощи населе нию. - Челябинск, 1989. - С. 5-5 (соавт. A.B. Зурочка, С.И. Марачев, A.B. Власов).

5.Психотропное влияние нейтрофилокинов на животных с травматическт стрессом // Стресс и иммунитет (психонейроиммунология): Тез. докл. Всесоюз Конференции. - Ростов-на-Дону - Ленинград, 1989. - С. 116-116 (И.И. Долгушин, А.В Зурочка, С.М. Марачев, И.Е. Третьякова, В.А. Гудков).

6.Влияние нейтрофилокинов на реакцию фагоцитов // Моделирование и клини ческая характеристика фагоцитарных реакций: Республиканский сб. науч. тр. - По, ред. проф. А.Н. Маянского. - Горький, 1989. - С. 81-85 (A.B. Зурочка, С.И. Марачев A.B. Власов).

7.Недостаточность секреторной функции нейтрофилов как фактор постинфек ционной иммунодепрессии // Тез. докл. 1-го конгресса иммунологов Эстонии. - Тарту 1989. - С. 24-24 (соавт. И.И. Долгушин, A.B. Зурочка, С.И. Марачев, A.B. Власов).

8.Роль нейтрофилов и их секреторных продуктов в течении инфекционноп процесса // Тез. докл. на VII областном съезде организаторов здравоохранения, ги гиенистов, санитарных врачей, эпидемиологов, микробиологов, инфекционистов >

профпатологов. - Челябинск, 1989. - С. 291-292 (соавт. И.И. Долгушин, A.B. Зурочка, С.И. Марачев, И.Е. Третьяков, A.B. Власов).

9.Иммунорегулирующие эффекты нейтрофилокинов // Тез. докладов I Всесоюзного иммунологического съезда. - М., 1989. - Т. 1. - С. 302. (И.И. Долгушин, A.B. Зурочка, A.B. Власов, И.Е. Третьякова, С.И. Марачев).

lO.Immunoregulative peptides of neutrophils // Abst. 7th Inter. Congr. of Immunol. -Berlin West, 1989. - 77. - 6. - p. 468 (I.I. Dolgushin, A.V. Zurochka, S.I. Marachev).

11 .Effect of immunoregulative neutrophilokines on inflammatory reactions in injured skin // International dermatology symposium: Interferons and related lymphokines. - Berlin West, 1989. - p. 496 (1.1. Dolgushin, A.V. Zurochka, S.I. Marachev, A.L. Kshivo).

12.Влияние пептидных фракций нейтрофилокинов на иммунный ответ мышей, зараженных Staphyloccocus aureus//Ж. микробиологии, эпидемиологии иммунологии.

- 1990. - № 5. - С. 69-71 (соавт. И.И. Долгушин, A.B. Зурочка, С.И. Марачев, A.B. Власов).

13. Нейтрофилокины - новые биологически активные продукты // Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях: Тез. докл. к XII межинститутской научной конференции. - Челябинск, 1990. - С. 56-56 (соавт. И.И. Долгушин, A.B. Зурочка, С.И. Марачев, В.А. Майоров, A.B. Власов, А.Ю. Холодов, A.B. Волков).

14. Механизм действия нейтрофилокинов на нейтрофилы // Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях: Тез. докл. к XII межинститутской научной конференции. - Челябинск, 1990. - С. 56-56 (соавт. ,.А.В. Зурочка, С.И. Марачев, A.JI. Хшиво).

15. Нейроиммунорегуляторные продукты секреции нейтрофилов при изолированной механической травме // Взаимодействие нервной и иммунной системы: Тез. докл. Всесоюз. Симпозиума. - Ленинград - Ростов-на-Дону, 1990. - С. 112-112 (соавт. И.И. Долгушин, A.B. Зурочка, С.И. Марачев, A.B. Власов).

16.Нейрорегуляторные свойства пептидных продуктов нейтрофилов // Взаимодействие нервной и иммунной системы: Тез. докл. Всесоюз. Симпозиума. - Ленинград

- Ростов-на-Дону, 1990. - С. 8-9 (соавт. И.И. Долгушин, A.B. Зурочка, С.И. Марачев, A.B. Власов).

17. Оценка секреторной функции нейтрофилов как надежный метод контроля за иммунореабилитацией больных // Реабилитация иммунной системы: Тез. докл. 2-го Международного симпозиума. - Цхалтуба, 1990. - С. 46-46 (соавт. И.И. Долгушин, A.B. Зурочка, A.B. Власов, С.И. Марачев, Э.М. Ахкямов).

18.Сравнительные аспекты латекс-индуцированной хемилюминесценции нейтрофилов и клеток системы мононуклеарных фагоцитов // Рукопись депонирована ВИНИТИ, 6. - № 3081-В от 06.06.90 (соавт. И.И. Долгушин, A.B. Зурочка, С.И. Марачев).

19.Применение биологически активных пептидов нейтрофилов для иммунодиагностики и иммунореабилитации // Реабилитация иммунной системы: Тез. докл. 2-го Международного симпозиума. - Цхалтуба, 1990. - С. 18-18 (соавт. И.И. Долгушин, A.B. Зурочка, A.B. Власов, С.И. Марачев, И.Е. Третьякова, В.А. Майоров).

20.Functional activity of the macrophages in the system of the neutrophils normall) and pathology // Abstr. mononuclear phagocytes system in normal and pathol. stater. ■ Novosibirsk, 1990. - p. 28-29 (I.I. Dolgushin, A.V. Zurochka, S.I. Marachev, A.V. Vlasov).

21.Нарушение процессов кооперации в системе "нейтрофил-иммуноциты" в ди агностике иммунодефицитов человека // Экологические аспекты иммунологически? состояний: Тез. докл. Всесоюз. конф. - М. - Алма-Ата, 1990. - Т. 2. - С. 26-26 (соавт И.И. Долгушин, A.B. Зурочка, A.B. Власов, С.И. Марачев, И.Е. Третьякова, Э.М. Ах кямов).

22.Новые подходы к оценке иммунного статуса человека, основанные на изуче нии кооперации в системе "нейтрофил-иммуноциты" // Экологические аспекть иммунологических состояний: Тез. докл. Всесоюз. конф. - М. - Алма-Ата, 1990. - Т. 2 - С. 43-43 (соавт. И.И. Долгушин, A.B. Зурочка, A.B. Власов, С.И. Марачев, И.Е Третьякова).

23.0сновные направления изучения свойств секреторных продуктов нейтрофи лов // Материалы конф. института по итогам научных исследований в XII пятилетке. Челябинск, 1990. - С. 96-98 (соавт. И.И. Долгушин, A.B. Зурочка, A.B. Власов).

24 .Влияние нейтрофилов на иммунный ответ животных с множественной меха нической травмой // Системные и клеточные механизмы адаптации организма i действию повреждающих факторов: Тез. докл. конф. патфизиологов Урала. - Челя бинск, 1991. - С. 115-116 (соавт. И.И. Долгушин, A.B. Зурочка, A.B. Власов, С.И Марачев, И.Е. Третьякова).

25.Нейтрофилокины в иммунном ответе // Системные и клеточные механизмь адаптации организма к действию повреждающих факторов: Тез. докл. конф. патфи зиологов Урала. - Челябинск, 1991. - С. 115-116 (соавт. И.И. Долгушин, A.B. Зурочка A.B. Власов, С.И. Марачев, И.Е. Третьякова).

26.Регуляция нейтрофилами иммунного ответа // Иммунологические реакции i диагностике, профилактике и эпидемиологическом надзоре за инфекционными за болеваниями: Сб. науч. тр. - Пермь, 1991. - С. 15-15 (соавт. И.И. Долгушин, С.И Марачев, A.B. Зурочка, A.B. Власов, И.Е. Третьяков).

27.Способ получения иммуностимулирующих нейтрофилокинов // A.c. X 1776139 (СССР). - 1991. - (соавт. И.И. Долгушин, A.B. Зурочка, С.И. Марачев).

28.Способ определения иммуномодулирующей активности нейтрофилов (А.с № 1716447 СССР // Бюл. откр. и изобр. - 1992. - № 8. - С. 32 (соавт. И.И. Долгушин A.B. Зурочка, И.А. Волчегорский, С.И. Марачев).

29. Изучение кооперации нейтрофилов с клетками иммунной системы в норме i патологии: Метод, рекомендации МЗ России. - 1992. - 19 с. (И.И. Долгушин, А.В Зурочка, С.И. Марачев, Л.Я. Эберт, A.B. Власов, В.Ф. Долгушина).

30. Сравнительное изучение иммунотропной активности пептидов нейтрофи лов и ИЛ-1 // Тез. 1-го съезда иммунологов России. - Новосибирск, 1992. - С. 177-17 (соавт. И.И. Долгушин, A.B. Зурочка, A.B. Власов, С.И. Марачев, Э.М. Ахкямов).

31. Иммунологические аспекты лечения хирургической инфекции у детей i Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических i патологических состояниях: Тез. докл. к XIII межинститутской научной конференции -Челябинск, 1992.-С. 2-2.

32.Роль нейтрофилокинов в противоинфекционной ззащите при эксперимен-альной инфекции // Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях: Тез. докл. к Х1П межинститутской шумной конференции. - Челябинск, 1992. - С. 65-65.

33 .Реакции системы крови и тимуса при травматическом стрессе, индуцирование нейтрофилокинами // Факторы клеточного и гуморального иммунитета при >азличных физиологических и патологических состояниях: Тез. докл. к XIII межин-титутской научной конференции. - Челябинск, 1992. - С. 114-114 (соавт. A.B. Зуроч-:а, A.B. Власов, С.И. Марачев, Э.М. Ахкямов, O.JI. Колесников).

34.К вопросу о протективных свойствах пептидного моновещества А5-фракции екреторных продуктов активированных нейтрофилов доноров // Факторы клеточного i гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических остояниях: Тез. докл. к Х1П межинститутской научной конференции. - Челябинск, 992. - С. 115-115 (соавт. A.B. Зурочка, A.B. Власов, С.И. Марачев, Э.М. Ахкямов).

35.Влияние нейтрофилокинов на систему мононуклеарных фагоцитов у детей с 1ереломами трубчатых костей // Актуальные вопросы теоретической и практической 1едицины. - Челябинск, 1993. - С. 107-108 (соавт. Н.М. Ростовцев, М.П. Кононенко, ".А. Селиванова, Е.А. Костенко).

36.Биологические эффекты секреторных продуктов нейтрофилов (нейтро-шлокинов) // Актуальные вопросы теоретической и практической медицины. - Челя->инск, 1994. - С. 50-54 (соавт. И.И. Долгушин, A.B. Зурочка, С.И. Марачев, O.JI. Солесников, Э.М. Ахкямов).

37.Повышение эффективности профилактики, диагностики и лечения неспеци-жческой хирургической инфекции и воспалительных осложнений травматической юлезни у детей // Актуальные вопросы теоретической и практической медицины. -1елябинск, 1994. - С. 50-54 (соавт. Л.Б. Новокрещенов, И.А. Абушкин, А.Н. Котля-юв, Л.В. Загородникова, Е.А. Неизвестных, В.А. Яковенко, Н.М. Ростовцев).

38.Психотропное средство // Описание к патенту (19) RU (11) 2008683 С1 (51) 5 Ю1 № 33/53 / Бюл. откр. и изобр. - 1994. - № 4 (соавт. И.И. Долгушин, A.B. Зурочка, 1И, Марачев, И.А. Волчегорский, A.B. Окишор).

39.Средство, обладающее репаративной активностью // Описание к патенту (19) UJ (11) 2008003 С1 (51) 5 А61 К № 37/02 / Бюл. откр. и изобр. - 1994. - № 4 (соавт. 1.И. Долгушин, A.B. Зурочка, С.И. Марачев, Э.М. Ахкямов).

40.Investigation method of "neutrophil-monocyte" cooperation and its clinical estima-lon // International journal of immunorehabilitation. - 1994. - № 1. - p. 95 (I.I. Dolgushin, V.V. Zurochka, S.I. Marachev).

41 .Neutrophilokines is a new family of the regulating cytokynes // International journal if immunorehabilitation. - 1994. - № 1. - p. 399-400 (, A.V. Zurochka, I.I. Dolgushin, S.I. Marachev, V.A. Majorov).

42.Определение секреторной активности нейтрофилов как метод диагностики иммунодефицита при различных патологических состояниях // Иммунодиагностика и 1ммунотерапия: Тр. I Международной конференции. - Витебск, 1995. - С. 32-33. (И.И. 1олгушин, A.B. Зурочка, О.Л. Колесников, С.И. Марачев, A.B. Власов, И.Ю. Зурочка, I.B. Кривохижина, Д.В. Попов).

43.Диагностическое значение кинетической функции фагоцитов // Имм} нодиагностика и иммунотерапия: Тр. I Международной конференции. - Витебс! 1995. - С. 167-168. (А.В. Зурочка, И.Г. Яковенко).

44.Низкомолекулярные пептиды нейтрофилов // Актуальные вопросы практиче ской и теоретической медицины. - Челябинск, 1995. - С. 56. (И.И. Долгушин, A.I Зурочка С.И. Марачев, Э.М. Ахкямов, И.Ю. Зурочка, Д.В. Попов).

45.Регуляторные пептиды нейтрофилов (нейтрофилокины) // Иммунология. 1995. - № 4. - С. 40-44. (соавт. И.И. Долгушин, А.В. Зурочка).

46.Психотропные эффекты нейтрофилокинов в норме и патологии // Фактор клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патолоп ческих состояниях: Тез. докл. к XII Российской научной конференции. - Челябинс 1995. - С. 48-48 (соавт. И.Ю. Зурочка, Д.В. Попов).

47.Прогнозирование течения воспалительного процесса у детей // Факторы ют точного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологич-ских состояниях: Тез. докл. к XII Российской научной конференции. - Челябинс 1995. - С. 88-88. (соавт. Л.Б. Новокрещенов, И.А. Абушкин, Л.В. Загородникова, Л.у Силкина).

48.Изучение актопротекторных свойств секреторных продуктов нейтрофилов Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических патологических состояниях: Тез. докл. к XII Российской научной конференции. Челябинск, 1995. - С. 116-116 (соавт. И.Ю. Зурочка, Д.В. Попов).

49.Роль дефектов секреторной активности нейтрофилов в развитии гнойных о ложнений тяжелой механической травмы у детей // Факторы клеточного и гуморал ного иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях: Те докл. к XII Российской научной конференции. - Челябинск, 1995. - С. 48-48 (соав Н.М. Ростовцев, Т.А. Селиванова, В.А. Яковенко).

50.Репарационные свойства низкомолекулярных пептидов нейтрофилов // Poj иммунобиологических препаратов в современной медицине: Материалы междун родного симпозиума, посвященного 150-летию со дня рождения И.И. Мечникова 90-летию Уфимского НИИВС им. И.И. Мечникова НПО "Иммунопрепарат". - Уф 1995.-Часть 2.-С. 49-51.

51 .Peptid substance application received from supernatants of neutrophils for purule complications prognosis in children with mechanical trauma // Proceedings of the- laborato medicine '95 11 th IECC European Congress of Clinical Chemistry. - Tampere, Finlan

1995. - P. 404.

52. Нейротропные эффекты секреторных продуктов нейтрофилов в норме, nj инфекции и травме // Первый Российский конгресс по патофизиологии. - Моей

1996. - С.149-150 (соавт. И.Ю. Зурочка, С.И. Марачев, И.И. Долгушин).

53.Decrease of neutrophil secretoiy activity as a factor of purulent complications case of severe mechanical traiuna in children / 4 th Scientific Meeting Athens, Greece 1996. - p. 45. (I.I. Dolgushin, A.V. Zurochka, S.I. Marachev).

54.Increasing of the immunogenesis of the neutrophil peptide products - neutrop lockynes / 4 th Scientific Meeting Athens, Greece. - 1996. - p. 78. (I.I. Dolgushin, A. Zurochka, S.I. Marachev).