Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Роль предсердного и мозгового натрийуретических пептидов в регуляции артериального давления при вазоренальной гипертензии у крыс

На правах рукописи

□03488002

РАХЧЕЕВА МАРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

РОЛЬ 11РЕДСЕРДНОГО И МОЗГОВОГО НАТРИЙУРЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ В РЕГУЛЯЦИИ АРТЕРИАЛЬНОГО ДАВЛЕНИЯ ПРИ ВАЗОРЕНАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ У КРЫС

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 О ДЕК 2009

Москва - 2009

003488002

Работа выполнена в Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Росздрава

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор Мухина Ирина Васильевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Пшенникова Майя Григорьевна

доктор биологических наук,

профессор Торшин Владимир Иванович

Ведущая организация: ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова

Защита диссертации состоится » £-£/*<2-(уи€ 2009 г. в часов

на заседании диссертационного совета Д.001.003.01 при ГУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН» по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института. Автореферат разослан «¿Ю » 2009г.

Учёный секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Скуратовская Лариса Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение механизмов и причин заболеваний, связанных с патологией почек, остается актуальной проблемой для биологии и медицины. Известно, что ишемические повреждения почек могут приводить к развитию острой почечной недостаточности и, как правило, сопровождаться вазоренальной пшертензией (Lifton R.P. et al., 2001; Mussalo H., 2003). Причем с одной стороны отмечается существенное увеличение риска потенциально фатальных сердечно-сосудистых осложнений, обусловленных как прогрессированием ишемического процесса, так и высокой и трудноустранимой артериальной гипертензией, с другой - значительно возрастает риск необратимого ухудшения функции почек (Мухин H.A. и др., 2008). Важна своевременная дифференциация реноваскулярной гипертеизии от других заболеваний, характеризующихся стойким повышением артериального давления (АД), для диагностики и целенаправленного лечения почечной недостаточности, чтобы добиться более эффективного контроля артериальной гипертензии.

В настоящее время экспериментальные модели артериальной гипертензии широко используются для изучения механизмов развития заболевания, выяснения роли различных факторов внешней и внутренней среды в становлении патологического процесса, дают возможность подробно изучить патогенез и изыскать средства для рационального терапевтического вмешательства и профилактики (Коган А.Х., 1962; Нилова В.К., Хирманов В.Н., 1992; Харин С.Н., Крандычева В.В., 2004).

Чаще всего первопричинами вазоренальной гипертензии выступают стеноз почечной артерии и увеличенная секреция ренина (Unger Т., 1985). Многочисленные вазоактивные пептиды играют важную физиологическую роль в регуляции артериального давления, сосудистого тона, реактивности и структуры сердечно-сосудистой системы. Одним из элементов управлеши и контроля над артериальным давлением является ренин - ангиотензин -альдостероновая система, основная цель которой - поддержание системного артериального давления и достаточного кровотока в таких жизненно важных органах, как головной мозг, сердце, почки, печень (Persson Р.В., 2003; Caliere G. et al., 2007). Данной системе противостоит система сердечных натрийуретических пептидов (НП). Натрийуретические пептиды являются сердечными гормонами, регулирующими давление крови и объем жидкости тела. Они вызывают гипотензию благодаря своим диуретическому, натрийуретическому и вазодилататорному действиям. Кроме того, НП уменьшают концентрацию ренина и альдостерона в крови и обладают

1

противовоспалительным потенциалом (Мартынова М.Г. и др., 2008; Daniels L.B., Maisei A.S., 2007). Однако при различных сердечно-сосудистых заболеваниях наблюдается высокий уровень содержания в плазме пептидов, при этом артериальное давление остается также повышенным. В настоящее время до конца не известны причины неэффективности системы натрийуретических пептидов в регуляции артериального давления при сердечно - сосудистой патологии.

В сердце секретируется предсердный (ПИП) и мозговой натрийуретический пептиды (МНП). Измерение содержания в плазме этих пептидов имеет прогностическую ценность при оценке пациентов с клиническим подозрением на реноваскулярную гипертензию (Mussalo Н., 2003), хроническую сердечную недостаточность (Langub М.С. Jr. et al., 1995; Jensen J.K. et al., 2009). Раннее лечение стеноза при вазоренальной гипертензии может помочь избежать пожизненного противопшертонического лекарственного лечения и прогрессивной почечной недостаточности. В связи с этим очень важно выявить на ранних стадиях заболевания пациентов, у которых подозревают наличие вазоренальной гипертензии.

Таким образом, настоящая работа посвящена исследованию секреции предсердного и мозгового натрийуретических пептидов в условиях экспериментальной вазоренальной гипертензии, развившейся вследствие односторонней ишемии почки.

Целью исследования явилось изучение особенностей секреции предсердного и мозгового натрийуретических пептидов секреторными кардиомиоцитами правого предсердия крыс и их влияния на артериальное давление при экспериментальной вазоренальной гипертензии.

Задачи исследования

1. Провести сравнительный анализ динамики артериального давления, биохимических показателей функционального состояния почек и морфофункциональных изменений контралатеральной почки крыс после перевязки левой почечной артерии на 30 и 60 сутки.

2. Исследовать морфофункциональные изменения секреторных кардиомиоцитов правого предсердия крыс на 30 и 60 сутки после перевязки левой почечной артерии.

3. Изучить влияние секреции предсердного и мозгового натрийуретических пептидов на артериальное давление при вазоренальной гипертензии, развившейся вследствие ишемии почки в течение 30-60 суток.

Научная новизна. Впервые комплексно изучены морфофункциональные изменения секреторных кардиомиоцитов правого предсердия и

контралатеральной почки крыс в течение длительного периода (60 суток) после перевязки левой почечной артерии.

Выявлено, что к 60 суткам на фоне адаптационных процессов в канальцах контралатеральной почки - активации аппарата Гольджи, набухания митохондрий, увеличения просвета канальцев происходило увеличение деструктивных изменений в секреторных кардиомиоцитах. Данные изменения заключались в расхождении вставочных дисков, наличии миелиноподобных структур, преобладании вакуолизированных митохондрий при нарушении микроциркуляторных процессов. Наличие деструктивных изменений внутриклеточных органелл в кардиомиоцитах при сохранении синтетической и секреторной функций свидетельствовало о напряженности системы внутриклеточной регуляции в условиях адаптации к вазоренальной гипергензии.

Впервые показано, что на 60 сутки после перевязки левой почечной артерии происходило увеличение количества мезангиальных клеток клубочкового аппарата, что характеризовало усиление патологических процессов в контралатеральной почке, способное привести к фиброзу ткани и необратимому нарушению фильтрационной способности клубочков. В этих условиях сердечные натрийуретические пептиды, способствуя уменьшению сокращения мезангиальных клеток, стабилизировали процессы клубочковой фильтрации, оцениваемые по данным биохимических показателей функционального состояния почек (количество калия, мочевины и креатинина в плазме крови).

Впервые описана динамика секреции предсердного и мозгового натрийуретических пептидов клетками правого предсердия в течение 60 суток в условиях вазоренальной гипергензии при односторонней ишемии почки. Максимальный пик секреторной активности кардиомиоцитов правого предсердия соответствовал 30 суткам ишемического периода. На ультраструктурном уровне показано, что у крысы способом выведения натрийуретических пептидов из кардиомиоцитов как в условиях нормы, так и в условиях вазоренальной пшертензии являлась диффузия.

Впервые выявлено, что постепенное повышение артериального давления со второй недели после перевязки левой почечной артерии вызывало увеличение секреции сердечных натрийуретических пептидов на 30 сутки ишемического периода при вазоренальной гипертензии. Причем выявленное увеличение секреции в данное время не сопровождалось восстановлением артериального давления. Вероятно, отсутствие регулирующего действия пептидов на артериальное давление было обусловлено снижением плотности

рецепторов к сердечным натрийуретическим пептидам на фоне структурных нарушений клубочкового и канальцевого аппаратов почки. Однако, повышенная секреция предсердного и мозгового натрийуретических пептидов способствовала последующей нормализации артериального давления к 60 суткам и наблюдалась на фоне восстановления содержания исследуемых пептидов в секреторных кардиомиоцитах правого предсердия.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные экспериментальные данные расширяют современные представления о системе натрийуретических пептидов, подчеркивая снижение влияния предсердного и мозгового натрийуретических пептидов на артериальное давление при развитии вазоренальной гипертензии. Проведенная в работе сравнительная оценка динамики артериального давления, морфофункционального состояния контралатеральной почки и секреторных кардиомиоцитов правого предсердия создает теоретические предпосылки для разработки патогенетических методов коррекции артериального давления при нарушении эффективности регуляторного действия системы сердечных натрийуретических пептидов при вазоренальной гипертензии.

Положения, выносимые иа защиту.

1. Окклюзия левой почечной артерии вызывает к 30 суткам изменение активности секреторных кардиомиоцитов, проявляющееся в уменьшении общего количества гранул и увеличении В - гранул, что свидетельствует об активном выбросе натрийуретических пептидов в кровь. На 60 сутки общее количество гранул и соотношение их типов достоверно не различимы от исходных значений.

2. На 30 сутки развития вазоренальной гипертензии происходит снижение влияния натрийуретических пептидов на артериальное давление, о чем свидетельствуют высокий уровень давления и выброс пептидов из предсердных кардиомиоцитов. На 60 сутки после перевязки левой почечной артерии наблюдается нормализация артериального давления за счет предшествующей увеличенной секреции предсердного и мозгового натрийуретических пептидов, наблюдаемой на 30 сутки эксперимента.

3. Повышение уровня секреции натрийуретических пептидов в отдаленном периоде на 30 сутки после односторонней ишемии почки необходимо для развития адаптационных процессов, обеспечивающих нормализацию артериального давления к 60 суткам. Однако, в секреторных кардиомиоцитах правого предсердия наблюдаются деструктивные изменения, проявляющиеся в нарушении структуры сократительного и энергетического аппарата клеток.

Апробация работы. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ BIIO Нижегородской государственной медицинской академией Росздрава и апробирована на расширенном заседании ЦНИИ НижГМА (Н. Новгород, 2009). Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Десятой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2007); Юбилейной научно-практической конференции, поев. 90-летшо чл.-кор. АМН СССР, проф. Н.Ю. Беленкову (Нижний Новгород, 2007); VIII сессии молодых ученых «Решение актуальных вопросов современной медицины» (Нижний Новгород, 2009); Десятой Международной конференции «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2009); Тринадцатой международной Пущинской школе - конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2009).

Публикации по теме диссертации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 3 в издании, рекомендованном ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация общим объемом в 118 страниц машинописного текста состоит из введения, четырех глав: обзора литературы, описания материалов и методов, двух глав собственных исследований; заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 23 рисунками и 7 таблицами. Список литературы включает 206 источников, в том числе 57 отечественных и 149 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Настоящая работа выполнена на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Росздрава.

Эксперименты были проведены с учётом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» на 74 белых лабораторных нелинейных крысах-самцах массой 180-220 г. Распределение по сериям представлено в таблице (Табл. 1).

Модель вазоренальной гипертензии по Когану (Коган, 1962) создавали полной перевязкой левой почечной артерии. В эксперимент были взяты животные, у которых развилась вазоренальная гипертензия (57%).

Как на этапах эксперимента, так и в интактной группе соответственно временным интервалам измеряли артериальное давление в хвостовой артерии, определяли содержание калия, мочевины, креатинина в плазме крови, иссекали ткани правой почки и правого предсердия для морфологических исследований,

проводили иммуноцитохимическую реакцию для определения предсердного и мозгового натрийуретических пептидов.

Таблица 1

Общее количество объектов исследования и их распределение по сериям _экспериментов_

Серии экспериментов Количество крыс

Интактные животные 31

Перевязка левой почечной артерии 30 суток после перевязки левой почечной артерии 28

60 суток после перевязки левой почечной артерии 15

Измерение артериального давления осуществляли инвазивным методом через хвостовую артерию по Guo и Zhou (Guo Z.K., Zhou L., 2003). Запись артериального давления осуществляли с помощью датчика давления MPX5050D (Motorola).

Определение содержания мочевины и креатинина в плазме крови проводили с помощью Биохимического анализатора АБ-02 Уральского оптико-механического завода. Для определения использовали: набор реагентов фирмы DiaSys Диакон для определения концентрации мочевины в сыворотке, плазме или моче уреазным-глутаматдегидрогеназным ферментативным УФ методом (Германия); набор реагентов фирмы DiaSys Диакон для определения креатинина кинетическим тестом без депротеинизации, в соответствии с методом Яффе (Германия). Содержание калия в плазме крови определяли с помощью унифицированного колориметрического метода на колориметре КФК-2. Для определения концентрации калия в плазме крови использовался набор реагентов фирмы Vital Diagnostics SPb для определения концентрации калия в сыворотке и плазме крови турбидиметрическим методом без депротеинизации (Россия). Концентрации мочевины и калия выражали в ммоль/л. Концентрацию креатинина выражали в мкмоль/л.

Для электронно-микроскопического анализа контралатеральной почки и правого предсердия крыс взятие материала осуществляли у интактных животных, на 30 и 60 сутки эксперимента. Кусочки ткани фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида на кокадилатном буфере (рН=7,4) и в 1% растворе четырехокиси осмия. Материал обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заключали в смесь ЭПОН-АРАЛДИТ (Микроскопическая техника..., 1996).

Полутонкие и ультратонкие срезы готовили на ультратоме ULTRACUT (Reichert-yung). Полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим и фуксином. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по методу Reynolds и просматривали в электронном микроскопе Morgagni 268D фирмы FEI с использованием программы AnalySIS.

Производили наблюдение и описание элементов правого предсердия и правой почки. Для секреторных кардиомиоцитов применяли морфометрический метод подсчёта Л - и В - типов гранул в полях зрения, причём учитывали только те поля, в которых обнаруживали гранулы (п=261). Морфометрический метод был также применён для подсчёта морфологических разновидностей митохондрий в полях зрения (п=100). За поле зрения принимали клетку никелевой сетки (37x37 мкм2), на которой помещался ультратонкий срез.

Подтверждение наличия предсердного и мозгового натрийуретических пептидов, содержащихся в секреторных гранулах кардиомиоцитов правого предсердия, проводили па ультратонких срезах материала, заключенного в эпоксидные смолы. Иммуноцитохимические реакции осуществляли для каждого антитела отдельно. Срезы, помещенные на никелевые сеточки, обрабатывали 3%-ной перекисью водорода в течение 20 мин для разрыхления смолы и повышения иммунореактивности ткани. Затем срезы инкубировали в растворе поликлональных антител к J1H11 (Rabbit anti-Atrial Natriuretic Factor (1-28) (rat), Peninsula Laboratories, LLC, Bachem) и МНП (Rabbit anti-Brain Natriuretic Peptide-32 (Rat) Serum, Peninsula Lab. Inc., Bachem) с рабочим разведением 1:2000 в течение 1 сут при 4°С. В качестве вторых антител использовали белок А, конъюгированный с коллоидным золотом (15 нм) (Protein-A/Gold, 15 nm, EM Grade, Electron Microscopy Sciences), с рабочим разведением 1:20 (Мартынова М.Г. и др., 2008).

Математическая обработка результатов исследования. Полученные данные были обработаны с помощью пакета прикладных программ Microsoft Excel и Statistica 6.0. Результаты представлялись в виде M и SD, где M - среднее значение, SD - стандартное отклонение. Парные межгрупповые сравнения средних определяли по критерию Манна-Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Функциональные, метаболические и морфофункциональные изменения на 30 сутки после перевязки левой почечной артерии у крыс

Проведенные исследования показали, что на 30 сутки после перевязки левой почечной артерии у животных артериальное давление достоверно

увеличилось на 28% от исходного уровня (табл. 2). Увеличение среднего АД с 87 мм рт. ст. до 112 мм рт. ст. позволяло авторам (Харин С.Н., Крандычева В.В., 2004) делать вывод о развитии вазоренальной гипертензии. Причем развитие артериальной гипертензии в наших экспериментах приводило к атрофии левой почки и гипертрофии правой: уменьшение массы левой почки сопровождалось компенсаторным увеличением массы правой (рис. 1).

Таблица 2

Изменение среднего артериального давления на 2 неделю, 30 и 60 сутки после перевязки левой почечной артерии у крыс, мм рт. ст. (М, БР)

Серии Среднее артериальное давление, мм рт. ст. (М) Стандартное отклонение (ББ)

Интактные (п=28) 85,62 14,60

2 недели после перевязки (п=28) 93,82 10,26

30 суток после перевязки (п=16) 109,69 р=0,000134 12,31

60 суток после перевязки (п=12) 94,28 12,72

Примечание: р - различия значений достоверны относительно интактных животных (по тесту Манна-Уитни).

Интактные 30 суток

□ Масса левой почки, мг □ Масса правой почки, мг

Рис. 1. Морфометрические изменения почек на 30 сутки после перевязки левой почечной артерии (* - различия значений достоверны относительно интактных животных (р<0,05), по тесту Манна-Уитни).

Электронно-микроскопический анализ контралатеральной почки у животных с развившейся вазоренальной гипертензией показал, что на 30 сутки эксперимента в ней наблюдались изменения многих структурных компонентов. Встречались участки с незначительным утолщением базальной мембраны. Для подоцитов характерны изменения, носящие различный характер: в одних отмечалось сохранение всех органелл (с ядрами, митохондрии с крнстами, развитым аппаратом Гольджи), в других - ядра были набухшие, митохондрии без крист, цистерны аппарата Гольджи расширены, а в некоторых происходило разрушение органелл и образование миелиноподобных структур. Капиллярная сеть также подверглась изменениям: большинство капилляров находилось в дилатированном состоянии, без эритроцитов, с темной плазмой. Подобные изменения свидетельствовали о нарушениях фильтрационного барьера почки, что проявлялось в достоверном увеличении концентрации мочевины в два раза и креатинина в 1,5 раза в плазме крови и достоверном уменьшении содержания калия в два раза в исследуемый период (табл. 3).

Таблица 3

Биохимические показатели функционального состояния почек крыс

(в плазме крови) (М, БР)

Серии Калий, ммоль/л Мочевина, ммоль/л Креатинин, мкмоль/л

Интактные (п=28) М 8,13 3,47 66,92

0,57 0,61 3,96

30 суток после перевязки (п=16) М 3,88 р=0,000034 6,97 р=0,000092 81,13 р=0,001591

БО 0,81 2,00 4,42

60 суток после перевязки (п=9) М 3,32 р=0,000007 7,18 р=0,055914 87,23 р=0,000011

1,27 5,84 9,65

Примечание: р - различия значений достоверны относительно интактны.х животных (по тесту Манна-Уитни).

Эпителий многих проксимальных канальцев практически полностью перекрывал просвет, и его микроворсинки образовывали компактные скопления в центральной части канальцев. Некоторые микроворсинки имели расширения на своих концах у просвета канальца. Часть клеток отличалась сильной деструкцией многих цитоплазматических органелл: наблюдалась гиперплазш и гипертрофия митохондрий, заполняющих весь эпителиоцит; ядра имели

9

инвагинации кариолеммы с преобладанием гетерохроматина; в некоторых отмечалось образование вакуолей и миелиноподобных структур. Выявленные изменения отражали нарушение реабсорбционной способности и секреции, также проявляющейся в снижении концентрации калия и увеличения концентрации мочевины в плазме крови (табл. 3).

Однако следует отметить, что наряду с патологическими измененными канальцами встречались и канальцы с незначительно измененной ультраструктурой эпителия. Даже рядом расположенные клетки нередко существенно отличались по сохранности ультраструктурных компонентов.

В миокарде, правого предсердия на 30 сутки развития вазоренальной гипертензии обнаружены слабо выраженные деструктивные процессы, проявляющиеся в изменениях микроциркуляторного русла: наблюдалось увеличение капилляров с узким просветом и преобладанием в них грубодисперсного осмиофильного аморфного материала. Наряду с деструктивными процессами отмечались морфологические признаки активации биосинтетических процессов, происходящих в секреторных кардиомиоцитах правого предсердия: преобладание в ядрах эухроматина, наличие ядрышек, расширение пластинчатого комплекса и саркоплазматического ретикулума.

Известно, что набухание митохондрий является реакцией на различные патологические состояния организма (Структурные..., 1987). Проведенные исследования показали неоднородность изменений структуры митохондрий: 14% из них были набухшие с просветленным матриксом и разрушающимися кристами; 25% митохондрий наряду с нормальными кристами имели структуры, напоминающие миелиноподобные тела (рис. 2). Однако основную часть (61%) представляли митохондрии с плотным матриксом и сохраненньми кристами (рис. 2), по-видимому, они достаточно обеспечивали клетки энергией, необходимой для их жизнедеятельности в условиях вазоренальной гипертензии при ишемии почки.

В предсердных миоцитах крысы наблюдались секреторные гранулы А - и В - типов. Гранулы А - типа, запасающие НП, имели гомогенную электронно-плотную сердцевину и окружены хорошо различимой мембраной, под которой иногда просматривался тонкий светлый ободок (рис. За). Их размер в среднем составлял 0,28 мкм. Гранулы В - типа, выделившие НП, содержали более светлую сердцевину. Их мембрана часто плохо различима на электроннограммах, так как ее контуры выглядели размытыми (рис. За). Размер гранул В - типа составлял около 0,17 мкм. Причем, размер гранул обоих типов у интактных животных и у животных на 30 сутки развития вазоренальной гипертензии достоверно не различался.

Интактные 30 суток

Я нормальные МХ □ набухшие □ вакуолизированные

Рис. 2. Изменение процентного содержания морфологических разновидностей митохондрий на 30 сутки после перевязки левой почечной артерии.

Электронно-микроскопическая иммуноцитохимия подтвердила, что секреторные гранулы правого предсердия являются формой хранения предсердного и мозгового натрийуретического пептидов одновременно, то есть являются гранулами второго типа по содержанию натрийуретических пептидов (МИше е1 а1., 1991). Следует отметить, что все гранулы были помечены обоими антителами, то есть содержали и ПНП, и МНП. Причем визуально интенсивность мечения антителами А - и В - типов гранул была примерно одинаковой (рис. 3). Выявленная положительная МНП - иммунореактивность опровергает факт, что МНП вырабатывается только в желудочках.

В отличие от авторов, утверждающих, что синтез НП осуществляется только при патологии (Кпохукв е1 а!., 2001), нами обнаружены секреторные гранулы, содержащие ПНП и МНП, не только у экспериментальных животных с развившейся гипертензией, но и у интактных животных (рис. За, б).

В литературе имеются противоречивые данные о способе выведения ПНП и МНП из клетки (Акрамова Д.К., Чернова И.А., 1989; Коростышевская И.Н., Максимов В.Ф., 1989). В ходе нашего эксперимента признаков экзоцитоза, таких как слияние мембраны гранулы с сарколеммой миоцита, наличие гранул в интерстициальном пространстве, не было выявлено. Нами показано, что у крыс способом выведения предсердного и мозгового натрийуретических пептидов из кардиомиоцитов является диффузия.

Рис. 3. Иммуноцитохимическое выявление ПНП и МНП в секреторных гранулах (стрелки) кардиомиоцитов правого предсердия (А - гранулы типа А, 1 В - гранулы типа В): а - кардиомиоцит правого предсердия интактной крысы с секреторными гранулами, содержащими ПНП. X 28000: б - кардиомиоцит интактной крысы с секреторными гранулами, содержащими МНП. X 28000: в - секреторные гранулы с ПНП на 30 сутки развития вазоренальной ' гипертензии, X 28000: г - секреторные гранулы с МНП на 30 сутки развития I вазоренальной гипертензии. X 36000.

Морфометрические исследования показали, что у интактных животных преобладали гранулы А - типа, которые составили 63% от общего количества | гранул. В кардиомиоцитах на 30 сутки развития вазоренальной гипертензии наблюдалось изменение соотношения типов секреторных гранул относительно соотношения типов гранул в миоцитах интактных животных: общее количество их достоверно снизилось на 18%. при этом доля гранул А - типа достоверно уменьшилась на 57%. тогда как доля В - типа достоверно увеличилась на 73% (рис. 4). Выявленное на 30 сутки после перевязки почечной артерии увеличение количества в предсердных миоцитах гранул В - типа и снижение количества

гранул А - типа свидетельствовало о быстром выведении сердечных натрийуретических пептидов. Эта гиперактивность эндокринной функции предсердных кардиомиоцитов являлась, по-видимому, компенсаторной реакцией на развившуюся гипертензию.

37%

63%

64%

36%

□ А-гранулы

□ В-гранулы

Б

Рис. 4. Изменение процентного соотношения типов секреторных гранул на 30 сутки после перевязки левой почечной артерии: А - интактные животные, Б - 30 сутки после перевязки левой почечной артерии.

Известно, что повышение артериального давления вызывает выброс предсердного и мозгового натрийуретических пептидов в кровь (Скворцов A.A. и др., 2003; Daniels L.B. et al., 2007). Нами показано, что постепенное повышение артериального давления со второй недели после перевязки почечной артерии приводило к выбросу сердечных натрийуретических пептидов из кардиомиоцитов на 30 сутки эксперимента. Однако, несмотря на активное выделение данных пептидов, участвующих в регуляции артериального давления и способствующие его снижению, на 30 сутки эксперимента происходило увеличение артериального давления. Одно из основных воздействий НП, направленных на снижение АД, осуществляется посредством экспрессии рецепторов на клубочках нефронов, что приводит к ингибированию выработки ренина, и впоследствии альдостерона (Lee С.Y., Burnett J.C. Jr., 2007). В

литературе существуют данные о снижении плотности рецепторов к ПНП и МНП, локализованных на клубочках нефрона, при вазоренальной гипертензии, развившейся вследствие перевязки или сужении одной или двух почечных артерий (Figueroa C.D. et al., 1990; Puyo A.M. et al, 1998). В наших экспериментах, по-видимому, наблюдаемые морфофункциональные изменения в контралатеральной почке вызывали сокращение количества рецепторов к НП, располагающихся на мембранах клубочков. Это приводило к ослаблению антагонистического действия ПНП и МНП на ренин - ангиотензин -альдостероновую систему и поддержанию высокого уровня артериального давления.

Функциональные, метаболические и морфофункциональные изменения на 60 сутки после перевязки левой почечной артерии у крыс

К 60 суткам эксперимента наблюдалось возвращение среднего артериального давления к исходным показателям (табл. 2). У животных через 30 суток после моделирования односторонней тотальной ишемии почки происходило достоверное увеличение среднего АД, на 60 сутки среднее значение АД не отличалось от исходного.

На 60 сутки эксперимента мы не наблюдали изменений биохимических показателей функционального состояния почек у крыс относительно 30 суток (табл. 3). По-видимому, у животных происходила адаптация организма к новым условиям, вызванных гиперфункцией контралатеральной почки и атрофией левой после перевязки левой почечной артерии.

Морфофункциональные изменения контралатеральной почки, отмеченные на 30 сутки, сохранялись к 60 суткам. В клубочках наблюдалось утолщение базальной мембраны, обедненные органеллами подоциты, плазматические капилляры. Для 60 суток, в отличие от 30, характерно разрастание мезангия. В проксимальных канальцах преобладали клетки с сохраненными ультраструктурными компонентами. За счет этого не происходило процессов нарушения реабсорбции, выявленных на 30 сутки, в результате чего содержание калия, мочевины и креатинина достоверно не отличались от показателей, полученных на 30 сутки. По-видимому, изменений артериального давления, биохимических показателей функционального состояния почек и морфофункциональных изменений правой почки следует ожидать в более отдаленные сроки.

На 60 сутки в секреторных кардиомиоцитах правого предсердия наблюдались изменения в микроциркуляторном русле: капилляры имели узкие просветы, отмечалось образование сладжей эритроцитами. Эндотелиальная

стенка была набухшая, некоторые эндотелиальные клетки содержали миелиноподобные структуры. Ядра кардиомиоцитов имели ядрышки, преобладал эухроматин, но в ряде миоцитов выявлены ядра с инвагинациями и характерным перинуклеарным отеком. Обнаружено существенное расхождение вставочных дисков и образование миелиноподобных структур (рис. 5). Комплекс Гольджи хорошо развит, наблюдалась гиперплазия и гипертрофия его компонентов, которые располагались не только около ядра, но и на периферии предсердных миоцитов. Как и на 30 сутки, отмечалась мозаичность изменений митохондрий; 44% митохондрий имела нормальные кристы, 38% содержали внутримитохондриальные вакуоли (рис. 6).

Рис. 5. Ультраструктура секреторных кардиомиоцитов правого предсердия на 60 сутки после перевязки левой почечной артерии: а - расхождение вставочных дисков (стрелки), X 14000; б - вакуолизированная митохондрия с образованием миелиноподобных структур (стрелка), X 14000.

Выявленные изменения в секреторных кардиомиоцитах правого предсердия свидетельствовали о преобладании нарушающих адаптацию изменений при хроническом действии односторонней ишемии почки. Причем наличие деструктивных изменений внутриклеточных органелл кардиомиоцитов при сохранении синтетической активности являлось показателем напряженности системы внутриклеточной регуляции в условиях адаптации к вазоренальной гипертензии.

Таким образом, обнаруженные изменения ультраструктуры миокарда правого предсердия на 60 сутки постишемического периода были более выраженными, чем на 30 сутки. По-видимому, дальнейшие патологические изменения в кардиомиоцитах будут происходить в более отдаленные сроки.

Интактные 60 сут

Ш нормальные MX □ набухшие □ вакуолизированные

Рис. 6. Изменение процентного содержания морфологических разновидностей митохондрий на 60 сутки после перевязки левой почечной артерии.

Как и на 30 сутки, на 60 сутки в правом предсердии мы обнаружили с помощью электронно - микроскопической иммуноцитохимии второй тип гранул, содержащих предсердный и мозговой натрийуретические пептиды одновременно, с одинаковой степенью мечения антителами гранул А - и В - типов.

В связи с тем, что к 60 суткам ядра и аппарат Гольджи секреторных кардиомиоцитов не подверглись сильным изменениям, восстановление общего количества секреторных гранул и преобладание А - типа гранул над В - типом (табл. 4) свидетельствовало о накоплении предсердного и мозгового ! натрийуретических пептидов.

По литературным данным известно, что предсердный и мозговой i натрийуретические пептиды обладают релаксирующим действием на мезангиальные клетки (Scherman J., Briggs J.P., 1987). На 60 сутки после перевязки левой почечной артерии в контралатеральной почке нами обнаружено увеличение количества мезангиальных клеток, по сравнению с интактной серией и 30 сутками после перевязки, что свидетельствовало об увеличении патологических процессов в гломерулярном аппарате контралатеральной почки. Однако в этих условиях сердечные натрийуретические пептиды, способствуя уменьшению сокращения мезангиальных клеток, увеличивали площадь Г клубочковой поверхности, тем самым, стабилизируя процессы клубочковой фильтрации. Как следствие такого воздействия пептида не происходили

изменения биохимических показателей функционального состояния почек (количество калия, мочевины и креатинина в плазме крови оставались на том же уровне, что и на 30 сутки). Сниженная концентрация калия в данный период способствовала уменьшенной выработке альдостерона. Таким опосредованным способом предсердный и мозговой натрийуретические пептиды вызывали ингибирование ренин - ангиотензин - альдостероновой системы и наблюдаемое снижение артериального давления в исследуемый период. Также нормализация артериального давления на 60 сутки после перевязки левой почечной артерии происходила за счет увеличенной секреции ПИП и МНП, наблюдаемой на 30 сутки эксперимента.

Таблица 4

Изменение соотношения типов гранул в предсердных кардиомиоцитах крыс, _количество гранул в поле зрения (М, БР)_

Серии А - гранулы В - гранулы Общее кол-во гранул

Интактные (п=3) М 111,37 66,05 177,42

43,27 26,49 51,31

30 суток после перевязки (п=6) М 52,44 р,=0,00000 93,56 Р1=0,000004 146 р,=0,001428

34,35 40,82 59,63

60 суток после перевязки (п=6) М 113,82 р2=0,000000 58,03 р2=0,000000 171,85 р2=0,012309

56,63 32,47 57,66

Примечание: Р) - различия значений достоверны относительно интактных животных; р2 - различия значений достоверны относительно 30 суток (по тесту Манна-Уитни).

Таким образом, на 30 сутки после перевязки левой почечной артерии происходило развитие вазоренальной гипертензии, о чем свидетельствовало увеличение артериального давления, повышение концентрации мочевины и креатинина в плазме крови и уменьшение уровня калия в плазме крови. Изменение биохимических показателей крови было обусловлено нарушением процессов клубочковой фильтрации, канальцевой реабсорбции вследствие морфофункциональных изменений в контралатеральной почке. В этот лее

период наблюдались изменения ультраструктуры секреторных кардиомиоцитов правого предсердия, имеющие компенсаторно-приспособительный характер. Выявлено, что постепенное повышение артериального давления со второй недели после перевязки левой почечной артерии вызывает выброс сердечных натрийуретических пептидов из кардиомиоцитов на 30 сутки. Однако, несмотря на выделение предсердного и мозгового натрийуретических пептидов из кардиомиоцитов правого предсердия, артериальное давление не снижалось. Возможной причиной нарушения регуляции явились гиперактивация ренин -ангиотензин - альдостероновой системы, вызванная перевязкой левой почечной артерии, и сокращение плотности рецепторов к сердечным натрийуретическим пептидам в почках. На 60 сутки после перевязки левой почечной артерии у животных происходила адаптация к хроническому действию односторонней ишемии левой почки. Так значения артериального давления возвращались к исходным показателям; содержание калия, мочевины, креатинина в плазме крови достоверно не отличались от показателей на 30 сутки эксперимента. Морфофункциональные изменения контралатералыюй почки, отмеченные на 30 сутки после перевязки, сохранялись к 60 суткам. В исследуемый период изменения в секреторных кардиомиоцитах правого предсердия были более выраженными, чем на 30 сутки эксперимента, что свидетельствовало о преобладании нарушающих адаптацию изменений при хроническом действии односторонней ишемии почки. Наблюдалось восстановление общего количества секреторных гранул, содержащих предсердный и мозговой натрийуретические пептиды, с преобладанием А - типа гранул над В - типом. Наблюдаемая нормализация артериального давления происходила за счет опосредованного действия ПНП и МНП на мезангиоциты и увеличенной секреции данных пептидов на 30 сутки эксперимента.

ВЫВОДЫ

1. Развитие вазореналыюй гипертензии после перевязки левой почечной артерии у крыс на 30 сутки сопровождается увеличением артериального давления на 28%, концентрации мочевины в плазме крови в два раза, креатинина на 21% и уменьшением содержания калия на 48% от исходного уровня, что обусловлено нарушением процессов клубочковой фильтрации, канальцевой реабсорбции вследствие морфофункциональных изменений в контралатеральной почке, имеющих обратимый характер.

2. На 60 сутки у животных происходит адаптация к хроническому действию односторонней ишемии левой почки: значения артериального давления

возвращаются к исходным показателям; содержание калия, мочевины, креатинина в плазме крови достоверно не отличаются от показателей на 30 сутки, что связано со стабилизацией процессов клубочковой фильтрации и канальцевой реабсорбции в контралатеральной почке.

3. Изменения ультраструктуры секреторных кардиомиоцитов правого предсердия на 30 сутки после перевязки левой почечной артерии носят компенсаторно-приспособительный характер: незначительное расширение саркоплазматического ретикулума и пластинчатого комплекса, преобладание ортодоксальных форм митохондрий (61%).

4. Повышенный уровень секреции пептидов на 30 сутки в ответ на развитие вазоренальной гипертензии при односторонней ишемии почки сопровождается появлением миелиноподобных структур, увеличением конденсированных и вакуолизированных форм митохондрий до 18,5% и 37% соответственно, расхождением вставочных дисков в кардиомицитах к 60 суткам ишемического периода.

5. Иммуноцитохимически в кардиомиоцитах правого предсердия обнаружены секреторные гранулы второго типа, содержащие предсердный и мозговой натрийуретические пептиды, с одинаковой степенью мечения антителами А - и В - типов гранул. Показано, что у крыс способом выведения сердечных натрийуретических пептидов из клетки является диффузия.

6. После перевязки левой почечной артерии на 30 сутки эксперимента выявлено увеличение выделения сердечных натрийуретических пептидов на 72% от исходного уровня на фоне повышенного артериального давления. Восстановление артериального давления не происходило, вероятно, вследствие снижения плотности рецепторов к пептидам на фоне структурных нарушений клубочкового и канальцевого аппаратов почки.

7. На 60 сутки ишемического периода значение артериального давления возвращается к исходным показателям на фоне нормализации общего количества гранул и восстановления соотношения типов гранул, содержащих предсердный и мозговой натрийуретические пептиды, за счет их увеличенной секреции, наблюдаемой на 30 сутки эксперимента.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Рахчеева М.В., Мухина И.В., Бугрова М.Л. Натрийуретические пептиды в регуляции сердечно-сосудистой системы // Нижегородский медицинский журнал. - 2006. - №5. - С. 96-102.

2. Бугрова M.JI., Рахчеева M.B. Морфофункциональные изменения секреторных кардиомиоцитов правого предсердия крыс в раннем постреперфузионном периоде // Тезисы Десятой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье». - Санкт-Петербург. - 2007. - С. 53-54.

3. Бугрова M.JL, Рахчеева М.В. Морфофункциональные изменения секреторных кардиомиоцитов правого предсердия крыс в раннем и отдаленном постреанимационном периоде Н Нижегородский медицинский журнал. - 2008. -Вып. 1,№2.-С. 137-139.

4. Бугрова М.Л., Рахчеева М.В., Яковлева Е.И., Снопова Л.Б. Изменения миокарда левого желудочка и правого предсердия крыс в раннем постреперфузионном периоде // Материалы международного симпозиума «Адаптационная физиология и качество жизни: проблемы традиционной и инновационной медицины», поев. 80-летию акад. РАМН H.A. Агаджаняна. -Москва: РУДН. - 2008. - С. 68-69.

5. Рахчеева М.В., Бугрова М.Л., Яковлева Е.И. Влияние мексидола на ультраструктуру секреторных кардиомиоцитов правого предсердия крыс в раннем постреперфузионном периоде // Научные труды II съезда физиологов СНГ (Кишинев, Молдова, 29-31 октября 2008 г.). - Москва - Кишинев: Медицина - Здоровье. - 2008. - С. 178-179.

6. Рахчеева М.В., Бугрова М.Л., Мухина И.В., Жаберева A.C. Роль предсердного натрийуретического пептида в регуляции артериального давления при односторонней ишемии почки у крыс // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. - 2009. - № 6. - С. 107-111.

7. Рахчеева М.В., Бугрова МЛ. Иммуноцитохимическое определение предсердного натрийуретического пептида при экспериментальной вазоренальной гипертензии у крыс // Современные технологии в медицине: Материалы 8-ой научной сессии «Современное решение актуальных научных проблем в медицине». - 2009. - № 1. - С. 114-115.

8. Рахчеева М.В., Бугрова М.Л. Роль предсердного натрийуретического пептида в регуляции артериального давления при экспериментальной вазоренальной гипертензии у крыс // Труды 10-ой международной конференции «Актуальные проблемы современной науки». Часть 24. Секция: медицинские науки СГОУ(Н)~ Самара. - 2009. - С. 5-8.

9. Рахчеева М.В., Бугрова М.Л. Влияние секреции ANP на артериальное давление при вазоренальной гипертензии у крыс // Сборник тезисов 13 международной Пущинской школы конференции молодых ученых «Биология- наука XXI века». -Пущино. - 2009. -С. 117-118.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АД - артериальное давление

МНП - мозговой натрийуретический пептид

НП - натрийуретический пептид

ПНП - предсерднмй натрийуретический пептид

Rakhcheeva Maria Vladimirovna The role of atrial and brain natriuretic peptides in the regulation of the arterial pressure in vasorenal hypertension in rats

The problem of the cardiorenal interactions is the main problem in cardiology and nephrology. It is known, that ischemic damages of kidneys can lead to the development of vasorenal hypertension. The cardiorenal interactions are mainly realised through activation of the renin - angiotensin - aldosteron system. Effects of this system are inhibited by the cardiac natriuretic peptides.

The present work is devoted to the study of the secretion of atrial and brain natriuretic peptides (ANP and BNP) in experimental vasorenal hypertension developed due to a two kidney one renal artery ligation in rats.

The dynamics of the secretion of ANP and BNP during 60 days in vasorenal hypertension have been revealed. The arterial pressure increases on the 30th day in spite of the secretion of those peptides in blood. It has been supposed that the physiological effects of ANP and BNP are weakened due to the reduction of the density of the natriuretic peptide receptors on the 30th day of the experiment. The restoration of a total amount of the secretory granules on the 60th day it has been detected. As a result the arterial pressure has returned to the initial values. It has been established that ANP and BNP are kept in the granules of the secretory cardiomyocytes by EM immunocytochemistry. Also experimentally it has been shown that the cardyomyocytes release natriuretic peptides by means of diffusion.

This study makes the theoretical preconditions for working out of the pathogenetic methods of the correction of the arterial pressure in damages of the

efficiency of the natriuretic peptide system in vasorenal hypertension.

21

Заказ № 7562 Подписано в печать 13.11.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1 ООО «Центр оперативной печати А52», тел. (831)278-50-50; (831)419-68-83 www.a52.ru; e-mail: salon@a52.ru

Актуальность проблемы

Изучение механизмов и причин заболеваний, связанных с патологией почек, остается актуальной проблемой-для биологии' и медицины. Известно, что ишемические повреждения почек могут приводить к» развитию^ острой почечной недостаточности и, как правило, сопровождаться вазоренальной гипертензией [130, 148]. Причем с одной стороны отмечается существенное увеличение риска потенциально фатальных сердечно-сосудистых осложнений, обусловленных как прогрессированием» ишемического процесса, так и высокой и трудноустранимой артериальной гипертензией, с другой - значительно возрастает риск, необратимого ухудшения функции почек [33]. Важна своевременная дифференциация- реноваскулярной гипертензии от других заболеваний, характеризующихся стойким повышением артериального давления (АД); для- диагностики и целенаправленного лечения, почечной недостаточности, чтобы добиться? более эффективного контроля артериальной гипертензии.

В настоящее время экспериментальные модели артериальной гипертензии широко используются для изучения механизмов' развития^ заболевания, выяснения роли различных факторов внешней и внутренней среды в становлении патологического процесса, дают возможность подробно изучить патогенез и изыскать средства1 дляфационального терапевтического вмешательства и профилактики [20, 36, 52].

Чаще всего первопричинами вазоренальной' артериальной гипертензии выступают стеноз почечной артерии и увеличенная секреция ренина [190]. Многочисленные вазоактивные пептиды играют важную физиологическую роль в регуляции артериального давления, сосудистого тона, реактивности и структуры сердечно-сосудистой системы. Одним из элементов управления и контроля над артериальным давлением является ренин - ангиотензин — альдостероновая система, основная цель которой — поддержание системного артериального давления и достаточного кровотока в таких жизненно важных органах, как головной мозг, сердце, почки, печень [76, 158]. Данной системе противостоит система натрийуретических пептидов (НП). Натрийуретические пептиды являются сердечными гормонами, регулирующими давление крови и объем жидкости тела. Они вызывают гипотензию благодаря своим диуретическому, натрийуретическому и вазодилататорному действиям. Кроме того, НП уменьшают концентрацию ренина и альдостерона в крови и обладают противовоспалительным потенциалом [27, 88]. Однако при различных сердечно-сосудистых заболеваниях наблюдается высокий уровень содержания в плазме пептидов, при этом артериальное давление остается также повышенным. В настоящее время до конца не известны причины неэффективности системы натрийуретических пептидов в регуляции артериального давления при сердечно — сосудистой патологии.

В сердце секретируются предсердный (ПНП) и мозговой натрийуретический пептиды (МНП). Измерение содержания в плазме этих пептидов имеет прогностическую ценность при оценке пациентов с клиническим подозрением на реноваскулярную гипертензию [148], хроническую сердечную недостаточность^ 11, 114]. Раннее лечение стеноза при реноваскулярной гипертензии может помочь избежать пожизненного противогипертонического лекарственного лечения и прогрессивной почечной недостаточности. В связи с этим очень важно выявить на ранних стадиях заболевания пациентов, у которых подозревают наличие вазоренальной гипертензии.

Таким образом, настоящая работа посвящена исследованию секреции предсердного и мозгового натрийуретических пептидов в условиях экспериментальной вазоренальной гипертензии, развившейся вследствие односторонней ишемии почки.

Цель исследования

Изучить особенности секреции предсердного и мозгового натрийуретических пептидов секреторными кардиомиоцитами правого предсердия крыс и их влияния на артериальное давление при экспериментальной вазоренальной гипертензии.

Задачи исследования

1. Провести сравнительный анализ динамики артериального давления, биохимических показателей функционального состояния почек и морфофункциональных изменений контралатеральной почки крыс после перевязки левой почечной артерии на 30 и 60 сутки.

2. Исследовать морфофункциональные изменения секреторных кардиомиоцитов правого предсердия крыс на 30 и 60 сутки после перевязки левой почечной артерии. t *

3. Изучить влияние секреции предсердного и мозгового натрийуретических пептидов на артериальное давление при вазоренальной гипертензии, развившейся вследствие ишемии почки в течение 30-60 суток.

Научная новизна

Впервые комплексно изучены морфофункциональные изменения секреторных кардиомиоцитов правого предсердия и контралатеральной почки крыс в течение длительного периода (60^ суток) после перевязки левой' почечной артерии.

Выявлено, что к 60 суткам на фоне адаптационных процессов в канальцах контралатеральной почки - активации аппарата Гольджи, набухания митохондрий, увеличения просвета канальцев происходило увеличение деструктивных изменений в секреторных кардиомиоцитах. Данные изменения заключались в расхождении вставочных дисков, наличии миелиноподобных структур, преобладании вакуолизированных митохондрий при нарушении микроциркуляторных процессов. Наличие деструктивных изменений внутриклеточных органелл в кардиомиоцитах при сохранении 'синтетической и секреторной функций свидетельствовало о напряженности системы внутриклеточной регуляции в условиях адаптации к вазоренальной гипертензии. j

Впервые показано, что на 60 'сутки после перевязки левой почечной артерии происходило увеличение количества мезангиальных клеток клубочкового аппарата, что характеризовало усиление патологических процессов в контралатеральной почке, способное привести к фиброзу ткани и необратимому нарушению фильтрационной способности клубочков. В этих условиях сердечные натрийуретические пептиды, способствуя уменьшению сокращения мезангиальных клеток, стабилизировали процессы клубочковой фильтрации, оцениваемые по данным -биохимических показателей функционального состояния почек (количество калия, мочевины и креатинина в плазме крови).

Впервые описана динамика секреции предсердного и мозгового натрийуретических пептидов клетками правого предсердия в течение 60 суток в условиях вазоренальной гипертензии при односторонней ишемии почки. Максимальный пик секреторной активности кардиомиоцитов правого предсердия соответствовал 30 суткам ишемического периода. На ультраструктурном уровне показано, что у крысы способом выведения натрийуретических пептидов из кардиомиоцитов как в условиях нормы, так и в условиях вазоренальной гипертензии являлась диффузия.

Впервые выявлено, что постепенное повышение артериального давления со второй недели после перевязки левой почечной артерии вызывало увеличение секреции сердечных натрийуретических пептидов на 30 сутки ишемического периода при вазоренальной гипертензии. Причем выявленное увеличение секреции в данное время не сопровождалось восстановлением артериального давления. Вероятно, отсутствие регулирующего действия пептидов на артериальное давление было обусловлено снижением плотности рецепторов к сердечным натрийуретическим пептидам на фоне структурных нарушений клубочкового и канальцевого аппаратов почки. Однако, повышенная секреция предсердного и мозгового натрийуретических пептидов способствовала последующей нормализации артериального давления к 60 суткам и наблюдалась на фоне восстановления содержания исследуемых пептидов в секреторных кардиомиоцитах правого предсердия.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные экспериментальные данные расширяют современные представления о системе натрийуретических пептидов, подчеркивая снижение влияния предсердного и мозгового натрийуретических пептидов на артериальное давление при развитии вазоренальной гипертензии.

Проведенная в работе сравнительная оценка динамики артериального давления, морфофункционального состояния контралатеральной почки и секреторных кардиомиоцитов правого предсердия создает теоретические предпосылки для разработки патогенетических методов коррекции артериального давления при нарушении эффективности регуляторного действия системы сердечных натрийуретических пептидов при вазоренальной гипертензии.

Положения, выносимые на защиту

1. Окклюзия левой почечной артерии вызывает к 30 суткам изменение активности секреторных кардиомиоцитов, проявляющееся в уменьшении общего количества гранул и увеличении В - гранул, что свидетельствует об активном выбросе натрийуретических пептидов. На 60 сутки общее количество гранул и соотношение их типов достоверно не различимы от исходных значений.

2. На 30 сутки развития вазоренальной гипертензии происходит снижение влияния натрийуретических пептидов на артериальное давление, о чем свидетельствуют высокий уровень давления и выброс пептидов из предсердных кардиомиоцитов. На 60 сутки после перевязки левой почечной артерии наблюдается нормализация артериального давления за счет предшествующей увеличенной секреции предсердного и мозгового натрийуретических пептидов, наблюдаемой на 30 сутки эксперимента.

3. Повышение уровня секреции натрийуретических пептидов в отдаленном периоде на 30 сутки после односторонней ишемии почки необходимо для развития адаптационных процессов, обеспечивающих нормализацию артериального давления к 60 суткам. Однако, в секреторных кардиомиоцитах правого предсердия наблюдаются деструктивные изменения, проявляющиеся в нарушении структуры сократительного и энергетического аппарата клеток.

Апробация работы

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО Нижегородской государственной медицинской академией Росздрава и апробирована на расширенном заседании ЦНИЛ НижГМА (Н. Новгород, -2009). Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Десятой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2007); Юбилейной научно-практической конференции, поев. 90-летию чл.-кор. АМН СССР, проф. Н.Ю. Беленкову (Нижний Новгород, 2007); VIII сессии молодых ученых «Решение актуальных вопросов современной медицины» (Нижний Новгород, 2009); Десятой Международной конференции «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2009); Тринадцатой международной Пущинской школе — конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2009).

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 3 в издании, рекомендованном ВАК.

Объем и структура работы

Диссертация общим объемом в 118 страниц машинописного текста состоит из введения, четырех глав: обзора литературы, описания материалов и методов, двух глав собственных исследований; заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 23 рисунками и 7 таблицами. Список литературы включает 206 источников, в том числе 57 отечественных и 149 иностранных авторов.

ВЫВОДЫ

1. Развитие вазоренальной гипертензии после перевязки левой почечной артерии у крыс на 30 сутки сопровождается увеличением артериального давления на 28%, концентрации мочевины в плазме крови в два раза, креатинина на 21% и уменьшением содержания калия на 48% от исходного уровня, что обусловлено нарушением процессов клубочковой фильтрации, канальцевой реабсорбции вследствие морфофункциональных изменений в контралатеральной почке, имеющих обратимый характер.

2. На 60 сутки эксперимента у животных происходит адаптация к хроническому действию односторонней ишемии левой почки: значения артериального давления возвращаются к исходным показателям; содержание калия, мочевины, креатинина в плазме крови достоверно не отличаются от показателей на 30 сутки, что связано со стабилизацией процессов клубочковой фильтрации и канальцевой реабсорбции в контралатеральной почке.

3. Изменения ультраструктуры секреторных кардиомиоцитов правого предсердия на 30 сутки после перевязки левой - почечной артерии носят компенсаторно-приспособительный характер: незначительное - расширение саркоплазматического ретикулума и пластинчатого комплекса, преобладание ортодоксальных форм митохондрий (61%).

4. Повышенный уровень секреции пептидов на 30 сутки в ответ на развитие вазоренальной гипертензии при односторонней ишемии почки сопровождается появлением миелиноподобных структур, увеличением конденсированных и вакуолизированных форм митохондрий до 18,5% и 37% соответственно, расхождением вставочных дисков в кардиомицитах к 60 суткам ишемического периода.

5. Иммуноцитохимически в кардиомиоцитах правого предсердия обнаружены секреторные гранулы второго типа, содержащие предсердный и мозговой натрийуретические пептиды, с одинаковой степенью мечения антителами А- и В-типов гранул. Показано, что у крыс способом выведения сердечных натрийуретических пептидов из клетки является диффузия.

6. После перевязки левой почечной артерии на 30 сутки эксперимента выявлено увеличение выделения сердечных натрийуретических пептидов на 72% от исходного уровня на фоне повышенного артериального давления. Восстановление артериального давления не происходило, вероятно, вследствие снижения плотности рецепторов к пептидам на фоне структурных нарушений клубочкового и канальцевого аппаратов почки.

7. На 60 сутки ишемического периода значение артериального давления возвращается к исходным показателям на фоне нормализации общего количества гранул и восстановления соотношения типов гранул, содержащих предсердный и мозговой натрийуретические пептиды, за счет их увеличенной секреции, наблюдаемой на 30 сутки эксперимента.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ишемические повреждения почек могут приводить к развитию острой почечной недостаточности и, как правило, сопровождаться вазоренальной гипертензией [32]. Причем с одной стороны, отмечается существенное увеличение риска сердечно-сосудистых осложнений, с другой — значительно возрастает риск необратимого ухудшения функции почек, иногда очень быстрого [33]. В связи с этим, важно своевременное обнаружение вазоренальной гипертензии, которое позволит стабилизировать почечную недостаточность и добиться более эффективного контроля артериального давления.

В настоящее время особенности функционирования контралатеральной почки в состоянии усиленного кровоснабжения, вызванного пережатием противоположной почечной артерии, исследованы недостаточно. Согласно литературным данным при сужении одной из артерий почек контралатеральная (неповрежденная) почка должна отвечать усилением диуреза, являющегося адаптивной реакцией, который направлен на снижение артериального давления [193]. Однако полученные результаты исследования показали, что на 30 сутки после перевязки левой почечной артерии у крыс развилась реноваскулярная гипертензия, сопровождавшаяся также соответствующими морфометрическими изменениями: атрофией почки с перевязанной почечной артерией, компенсаторной гипертрофией контралатеральной почки.

Сравнительной оценки артериального^ давления, биохимических показателей функционального состояния почек и морфофункциональных изменений так называемой интактной почки после перевязки левой почечной артерии в литературе не встречалось.

На 30 сутки эксперимента с помощью электронно-микроскопического анализа выявлено, что в контралатеральной почке наблюдались изменения многих структурных компонентов. Встречались участки с незначительным утолщением базальной мембраны. Для подоцитов характерны изменения, носящие различный характер: в одних отмечалось сохранение всех органелл, в других — ядра были набухшие, митохондрии без крист, цистерны АпГ расширены, а в некоторых происходило разрушение органелл и образование миелиноподобных структур. Капиллярная сеть также подверглась изменениям: большинство капилляров находилось в дилатированном состоянии, без эритроцитов, с темной плазмой. Подобные изменения свидетельствовали о нарушениях фильтрационного барьера, что проявлялось в достоверном увеличении концентрации мочевины в два раза и креатинина в 1,5 раза в плазме крови и достоверном уменьшении содержания калия в два раза в исследуемый период.

Эпителий большинства проксимальных канальцев практически полностью перекрывал просвет или его м^икроворсинки образовывали компактные скопления в центральной части канальцев. Некоторые микроворсинки имели расширения на своих концах у просвета канальца. Часть клеток отличалась сильной деструкцией многих цитоплазматических органелл: наблюдалась гиперплазия и гипертрофия митохондрий, заполняющих весь эпителиоцит; ядра имели инвагинации кариолеммы с преобладанием гетерохроматина; в некоторых отмечалось образование вакуолей и миелиноподобных структур. Выявленные изменения отражали нарушение реабсорбционной способности, также проявляющейся в снижении концентрации калия и увеличении концентрации мочевины в плазме крови. Однако следует отметить, что наряду с патологическими измененными канальцами встречались и канальцы с незначительно измененной ультраструктурой эпителия.

У животных при развитии артериальной гипертензии параллельно в жизненно важных органах, в том числе и сердце, происходят специфические морфофункциональные изменения [24]. Однако работ,, посвященных морфологическим исследованиям ультраструктуры секреторных кардиомиоцитов правого предсердия при перевязке левой почечной артерии, не встречалось.

В миокарде правого предсердия на 30 сутки постишемического периода обнаружены слабо выраженные деструктивные процессы, проявляющиеся в изменениях микроциркуляторного русла: наблюдалось увеличение капилляров с узким просветом и преобладанием в них грубодисперсного осмиофильного аморфного материала. Наряду с деструктивными процессами отмечались морфологические признаки активации биосинтетических процессов, происходящих в секреторных кардиомиоцитах правого предсердия: преобладание в ядрах эухроматина, наличие ядрышек, расширение пластинчатого комплекса и саркоплазматического ретикулума. Известно, что набухание митохондрий является реакцией на различные патологические состояния организма [47]. Проведенные исследования показали неоднородность изменений структуры митохондрий: 14% из них были набухшие с просветленным матриксом и разрушающимися кристами; 25% митохондрий наряду с нормальными кристами имели структуры, напоминающие миелиноподобные тела. Однако основную часть (61%) представляли митохондрии с плотным матриксом и сохраненными кристами. По-видимому, они достаточно обеспечивали клетки энергией, необходимой для их жизнедеятельности в условиях вазоренальной гипертензии при ишемии почки.

С помощью первичных поликлональных антител к ПНП (Rabbit anti-Atrial Natriuretic Factor (1-28) (rat), Peninsula Laboratories, LLC, Bachem) и МНП (Rabbit anti-Brain Natriuretic Peptide-32 (Rat) Serum, Peninsula Lab. Inc., Bachem) и вторых антител белка А, конъюгированного с коллоидным золотом (15 нм) (Protein-A/Gold, 15 nm, ЕМ Grade, Electron Microscopy Sciences), нами установлено, что секреторные гранулы правого предсердия являются формой хранения предсердного и мозгового натрийуретических пептидов одновременно, то есть являются гранулами второго типа. Следует отметить, что интенсивность мечения антителами А — и В — типов гранул примерно одинакова. Выявленная положительная

МНП - иммунореактивность опровергает факт, что МНП вырабатывается только в желудочках.

В отличие от авторов [121], утверждающих, что синтез НП осуществляется только при патологии, нами обнаружены секреторные гранулы не только в условиях патологии, но и у интактных животных.

В литературе имеются противоречивые данные о способе выведения ПНП и МНП из клетки [1, 21]. Нами показано, что у крыс способом выведения предсердного и мозгового натрийуретических пептидов из кардиомиоцитов является диффузия. В ходе эксперимента явление экзоцитоза не было обнаружено.

На 30 сутки развития вазоренальной гипертензии наблюдалось изменение популяций секреторных гранул: общее количество их достоверно снизилось на 18%, и среди них доля гранул А - типа, запасающих ПНП и МНП, достоверно уменьшилась на 57%, а В — типа, выделившего НП, достоверно увеличилась на 73%. Преобладание В — гранул в этот период свидетельствовало об усиленном выделении сердечных натрийуретических пептидов. Эта гиперактивность эндокринной функции предсердных кардиомиоцитов являлась компенсаторной реакцией, направленной на сдерживание гипертензии в этот период. Наши данные совпадают с наблюдениями исследователей, которые продемонстрировали снижение грануляции секреторных кардиомиоцитов левого предсердия через 6 недель у крыс с адреналрегенераторной гипертензией [36]. Однако мы не наблюдали полного исчезновения секреторных гранул, выявленное авторами [86] через 48-72 часа после сужения обеих почечных артерии и сохраняющееся до 6 недели.

На 30 сутки мы не наблюдали разрастания соединительной ткани в миокарде правого предсердия, что объясняется исследователями ингибирующим действием предсердного натрийуретического пептида на гипертрофию кардиомиоцитов,и развития фиброза [118].

Известно, что повышение артериального давления вызывает выброс предсердного и мозгового натрийуретических пептидов в кровь [45, 88, 123, 140, 154]. Нами показано, что постепенное повышение артериального давления со второй недели после перевязки почечной артерии приводило к выбросу сердечных натрийуретических пептидов из кардиомиоцитов на 30 сутки эксперимента. Однако, несмотря на их активное выделение, выявлено, что на 30 сутки развития вазоренальной гипертензии происходило снижение влияния данных пептидов на артериальное давление. Одно из основных воздействий НП, направленных на снижение АД, осуществляется посредством экспрессии рецепторов на клубочках нефронов, что приводит к ингибированию выработки ренина, и впоследствии альдостерона [127]. В литературе существуют данные о снижении плотности рецепторов к ПНП и МНП, локализованных на клубочках нефрона, при вазоренальной гипертензии, развившейся вследствие перевязки или сужении одной или двух почечных артерий [95, 160]. В наших экспериментах, по-видимому, наблюдаемые морфофункциональные изменения в контралатеральной почке вызывали сокращение количества рецепторов- к НП, располагающихся на мембранах клубочков. Это приводило к ослаблению антагонистического действия ПНП и МНП на ренин - ангиотензин — альдостероновую систему и поддержанию высокого уровня артериального давления.

К 60 суткам эксперимента нами выявлено возвращение среднего артериального давления к исходным показателям. Также в данный период мы не наблюдали изменений биохимических показателей функционального состояния почек у крыс относительно 30 суток. По-видимому, у животных происходила адаптация организма к новым условиям, вызванных гиперфункцией контралатеральной почки и атрофией левой после перевязки левой почечной артерии.

Морфофункциональные изменения контралатеральной почки, отмеченные на 30 сутки, сохранялись к 60 суткам. В клубочках наблюдалось утолщение базальной мембраны, обедненные органеллами подоциты, плазматические капилляры. Для 60 суток, в отличие от 30, характерно разрастание мезангия. В проксимальных канальцах преобладали клетки с сохраненными ультраструктурными компонентами. За счет этого не происходило процессов нарушения реабсорбции, выявленных на 30 сутки, в результате чего содержание калия, мочевины и креатинина достоверно не отличались от показателей, полученных на 30 сутки. По-видимому, изменений артериального давления, биохимических показателей функционального состояния почек и морфофункциональных изменений правой почки следует ожидать в более отдаленные сроки.

На 60 сутки после односторонней тотальной ишемии почки в секреторных кардиомиоцитах правого предсердия наблюдались изменения в микроциркуляторном русле: капилляры имели узкие просветы, отмечалось образование сладжей эритроцитами. Эндотелиальная стенка была набухшая, некоторые эндотелиальные клетки содержали миелиноподобные структуры. Ядра кардиомиоцитов имели ядрышки, преобладал эухроматин, но в ряде кардиомиоцитов выявлены ядра с инвагинациями и характерным отеком в перинуклеарном пространстве. Обнаружено существенное расхождение вставочных дисков. Комплекс Гольджи хорошо развит, наблюдалась гиперплазия и гипертрофия его компонентов, которые располагались не только около ядра, но и на периферии предсердных миоцитов. Как и на 30 сутки, отмечалась мозаичность изменений митохондрий: 44% митохондрий имела нормальные кристы, 38% содержали внутримитохондриальные вакуоли. Выявленные изменения в секреторных кардиомиоцитах правого предсердия свидетельствовали о преобладании нарушающих адаптацию изменений при хроническом действии односторонней ишемии почки. Причем, наличие деструктивных изменений внутриклеточных органелл кардиомиоцитов при сохранении синтетической активности говорило о напряженности системы внутриклеточной регуляции в условиях адаптации к вазоренальной гипертензии. Таким образом, обнаруженные изменения ультраструктуры миокарда правого предсердия на 60 сутки постишемического периода были более выраженными, чем на 30 сутки. По-видимому, дальнейшие необратимые нарушения в кардиомиоцитах будут происходить в более отдаленные сроки.

Как и на 30 сутки, на 60 сутки после перевязки в правом предсердии мы обнаружили с помощью электронно - микроскопической иммуноцитохимии второй тип гранул, содержащих предсердный и мозговой натрийуретические пептиды одновременно, с одинаковой степенью мечения антителами гранул А - и В - типов.

В связи с тем, что к 60 суткам эксперимента ядра и аппарат Гольджи секреторных кардиомиоцитов не подверглись сильным изменениям, восстановление общего количества секреторных гранул и преобладание А - типа гранул над В — типом' свидетельствовало о накоплении предсердного и мозгового натрийуретических пептидов.

В данный период, как и на 30 сутки, в интерстициальном пространстве нами не обнаружено разрастания коллагеновых волокон и фибробластов, находившихся в активном состоянии. Это связано с тем, что сердечные натрийуретические пептиды обладают антифибролитической активностью и являются одним из локальных факторов регулирования процессов ремоделирования сердца [77].

Предсердный и мозговой натрийуретические пептиды оказывают релаксирующее действие на мезангиоциты [170]. На 60 сутки после перевязки левой почечной артерии обнаружено увеличение количества мезангиальных клеток, по сравнению с интактной серией и 30 сутками после перевязки, что, с одной стороны, свидетельствовало об увеличении патологических процессов в гломерулярном аппарате контралатеральной почки. Однако в этих условиях сердечные натрийуретические пептиды, способствуя уменьшению сокращения мезангиальных клеток, увеличивали площадь клубочковой поверхности, тем самым, стабилизируя процессы клубочковой фильтрации. Как следствие такого воздействия пептидов не происходили изменения биохимических показателей функционального состояния почек (количество калия, мочевины и креатинина в плазме крови оставались на том же уровне, что и на 30 сутки). Причем сниженная концентрация калия в данный период способствовала уменьшенной "выработке альдостерона. Таким опосредованным способом предсердный и мозговой натрийуретические пептиды вызывали ингибирование ренин — ангиотензин - альдостероновой системы и наблюдаемое снижение артериального давления в исследуемый период. Также нормализация артериального давления на 60 сутки после перевязки левой почечной артерии происходила за счет увеличенной секреции ПНП и МНП, наблюдаемой на 30 сутки эксперимента.

Таким образом, на 30 сутки после перевязки левой почечной артерии * ' происходило развитие вазоренальной гипертензии, о чем свидетельствовало увеличение артериального давления, повышение концентрации мочевины и креатинина в плазме крови и уменьшение уровня калия в плазме крови. Изменение биохимических показателей крови было обусловлено нарушением процессов клубочковой фильтрации, канальцевой реабсорбции вследствие морфофункциональных изменений в контралатеральной почке. В этот же период наблюдались изменения ультраструктуры секреторных кардиомиоцитов правого предсердия; имеющие компенсаторно-приспособительный характер. Выявлено, что постепенное повышение артериального давления со второй недели после перевязки левой почечной артерйи вызывает выброс сердечных натрийуретических пептидов из кардиомиоцитов на 30 сутки. Однако, несмотря на выделение предсердного и мозгового натрийуретических пептидов из кардиомиоцитов правого предсердия, артериальное давление не снижалось. Возможной причиной нарушения регуляции явились гиперактивация ренин — ангиотензин -альдостероновой системы, вызванная перевязкой левой почечной артерии, и сокращение плотности рецепторов к сердечным натрийуретическим пептидам в почках. На 60 сутки после перевязки левой почечной артерии у животных происходила адаптация к хроническому действию односторонней ишемии левой почки. Так значения артериального давления возвращались к исходным показателям; содержание калия, мочевины, креатинина в плазме крови достоверно не отличались от показателей на 30 сутки эксперимента. Морфофункциональные изменения контралатеральной почки, отмеченные на 30 сутки после перевязки, сохранялись к 60 суткам. В исследуемый период изменения в секреторных кардиомиоцитах правого предсердия были более выраженными, чем на 30 сутки эксперимента, что свидетельствовало о преобладании нарушающих адаптацию изменений при хроническом действии односторонней ишемии почки. Наблюдалось восстановление общего количества секреторных гранул, содержащих предсердный и мозговой натрийуретические пептиды, с преобладанием А — типа гранул над В - типом. Наблюдаемая нормализация артериального давления происходила за счет опосредованного действия ПНП и МНП на мезангиоциты и увеличенной секреции данных пептидов на 30 сутки эксперимента.

89