Автореферат и диссертация по медицине (14.00.13) на тему:Роль полиморфных вариантов гена индуцибельной NO-синтазы в формировании инфаркта мозга у больных с каротидным ишемическим атеротромботическим инсультом.
- Ученая степень
- кандидата медицинских наук
- ВАК РФ
- 14.00.13
Автореферат диссертации по медицине на тему Роль полиморфных вариантов гена индуцибельной NO-синтазы в формировании инфаркта мозга у больных с каротидным ишемическим атеротромботическим инсультом.
На правах рукописи
БОЦИНА Александра Юрьевна
РОЛЬ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНА ИНДУЦИБЕЛЬНОЙ Ш-СИНТАЗЫ В ФОРМИРОВАНИИ ИНФАРКТА МОЗГА У БОЛЬНЫХ С КАРОТИДНЫМ ИШЕМИЧЕСКИМ АТЕРОТРОМБОТИЧЕСКИМ
ИНСУЛЬТОМ
14.00.13 - «Нервные болезни»
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Москва-2009
1 о И ЮН 2000
003472542
Работа выполнена в ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».
Научный руководитель:
Член-корреспондент РАМН, профессор
Научный консультант:
Доктор биологических наук, профессор
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, профессор
Доктор медицинских наук, профессор
Вероника Игоревна Скворцова
Светлана Андреевна Лимборская
Алла Борисовна Гехт Марина Юрьевна Максимова
Ведущая организация:
ГОУ ВПО «Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».
Защита состоится «__»_2009 года в _ часов на
заседании Диссертационного совета Д 208.072.09 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РМГУ Росздрава по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1.
Автореферат разослан «___»_2009 года.
Ученый секретарь
диссертационного совета профессор
Л.В.Губский
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Введение
Сосудистые заболевания головного мозга и, в частности, ишемический инсульт - одна из наиболее важных и актуальных медицинских проблем нашего общества. Широкое распространение инсульта, высокий процент смертности и тяжелой инвалидизации определяют приоритетность исследований в области изучения патогенеза развития этого заболевания.
В настоящее время в изучении генетической предрасположенности инсульта, равно как и других мультифакторных заболеваний, используется анализ генетических ассоциаций, с помощью которого проводится изучение кандидатных генов, участвующих в формировании основных факторов риска сосудистой патологии. В последние несколько лет анализ генетических ассоциаций используется и для изучения аспектов индивидуальной чувствительности мозга к ишемическому повреждению и возможному прогнозированию течения и исхода заболевания.
Избыточная продукция оксида азота (N0) при обязательном участии фермента индуцибельной NO-синтазы (¡NOS) с последующим образованием токсического соединения пероксинитританиона (0N00") в настоящее время рассматривается как один из важнейших пусковых механизмов гибели клеток пенумбры в рамках нейроиммунного ответа. К основным нейротоксическим эффектам 0N00" относят выработку провоспалительных цитокинов, инактивацию ферментов антиоксидантной защиты, участие в окислении белков, что приводит к повреждению и дисфункции клеток, а также фрагментации ДНК [Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001]. Особое внимание привлекает факт относительно поздней экспрессии iNOS на этапе доформирования очага инфаркта [Samdani A.F. и соавт., 1997; Niwa M. И соавт., 2001], что в дальнейшем возможно определит избирательное применение селективных ингибиторов фермента в условиях стационаров. Участие гена NOS2, кодирующего синтез фермента iNOS, в формировании очага инфаркта мозга было многократно продемонстрировано на различных
моделях экспериментальной ишемии с применением нокаутных животных [1ас1есо1а С. и соавт., 1997; ЬоШ1 А.К. и соавт., 1999].
В связи с изложенным выше, представляет несомненный интерес проведение анализа структурных особенностей гена N082 и оценка их роли в формировании инфаркта мозга у больных с ишемическим инсультом в остром периоде.
Цель исследования
Изучение роли полиморфных вариантов гена индуцибельной N0-синтазы (N082) в формировании инфаркта мозга, течении и исходе заболевания у больных с каротидным ишемическим атеротромботическим инсультом.
Задачи исследования
1. Изучить клинические особенности развития каротидного ишемического атеротромботического инсульта и закономерности динамики формирования инфаркта мозга в остром периоде заболевания.
2. Проанализировать полиморфные варианты -2447С/0, -1659С/Т, -0,7 (ТААА)П 1/1) и. 8ег608Ьеи(150С/Т) гена N082 и их влияние на динамику формирования инфаркта мозга.
3. Оценить связь анализируемых полиморфных вариантов гена N082 с течением и исходом ишемического инсульта.
Научная новизна
Впервые проведено комплексное динамическое клиническое, МР-морфометрическое и молекулярно-генетическое исследование пациентов в остром периоде ишемического инсульта с целью изучения роли полиморфных вариантов -2447С/0, -1659С/Т, -0,7 (ТААА)„ № и 8ег608Ьеи(150С/Т) гена N082 в динамике формирования инфаркта мозга, течении и исходе заболевания.
Обнаружены статистически значимые ассоциации полиморфизмов 8ег608Ьеи(С/Т) и -1659С/Т гена N082 с динамикой формирования очага
инфаркта мозга, что косвенно может свидетельствовать о функциональной значимости вышеуказанных полиморфных вариантов.
Выявлено достоверное преобладание носителей гомозиготного С/С генотипа по полиморфизму 8ег608Ьеи(С/Т) гена N082 среди больных с отрицательной динамикой в неврологическом статусе в период с 1-х по 3-й сутки и в группах больных с умеренной и тяжелой инвалидизацией, по сравнению с носительством аллеля Т, независимо от исходного объема инфаркта мозга.
Практическая значимость работы
1. Полученная взаимосвязь полиморфизма 8ег608Ьеи(С/Т) гена N082 с динамикой формирования очагов инфаркта мозга, течением и исходом ишемического инсульта позволит применять анализ генотипов 8ег608Ьеи(С/Т) в качестве критерия прогнозирования течения и исхода заболевания.
2. Выявление генетических маркеров индивидуальной чувствительности мозга к ишемии расширяет возможности индивидуализированной профилактики ишемического инсульта и позволяет разработать новые подходы к диспансеризации здоровых лиц из группы риска.
3. Изучение генетических основ повреждающего действия ишемии позволяет выявить новые мишени для лечения инсульта. Ассоциация полиморфного варианта 8ег608Ьеи(С/Т) гена N082 с динамикой формирования инфаркта мозга показывает перспективность использования нейропротекторов, реализующих свое действие через высокоселективное ингибирование фермента ¡ЫОБ.
Положения, выносимые на защиту 1. Формирование объема инфаркта мозга, динамика неврологического статуса и степень функционального восстановления при ишемическом инсульте статистически значимо ассоциированы с полиморфным вариантом 8ег608Ьеи(С/Т) 16-го экзона гена N082, что косвенно свидетельствует о функциональной значимости данного участка, определяющего замену
аминокислоты серина на лейцин в последовательности первичной структуры белка фермента iNOS.
2. Высокодостоверное различие в относительной динамике объема исходно малых очагов инфаркта мозга у носителей С/С генотипа в сравнении с носителями аллеля Т по Ser608Leu(C/T) гена NOS2, позволяет предположить различную степень значимости избыточного синтеза NO для формирования очагов разного объема.
3. Обнаруженная связь полиморфизма гена NOS2, кодирующего синтез iNOS, с динамикой формирования инфаркта мозга, подтверждает участие важнейших медиаторов нейроиммунного ответа N0 и 0N00" в ишемическом повреждении головного мозга у больных с каротидным ишемическим атеротромботическим инсультом и обосновывает изучение и необходимость разработки нейропротекторов, реализующих свое действие путем высокоселективного ингибирования фермента iNOS.
Внедрение результатов исследования Результаты настоящего исследования применяются в работе неврологических отделений ГКБ №20 и №31 г.Москвы.
Апробация работы Апробация диссертации состоялась на совместной конференции кафедры фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии медико-биологического факультета ГОУ ВПО Российского государственного медицинского университета Росздрава и отдела молекулярных основ генетики человека Института молекулярной генетики РАН (протокол №7 от 12 декабря 2008 года).
Публикации:
По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 3 в центральной отечественной печати и 3 - в зарубежной.
Объем и структура работы Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста, включает 16 рисунков, 10 таблиц. Работа состоит из введения, обзора
литературы, описания применяемых методов, 2 глав собственных результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы состоит их 113 источников, включая 13 отечественных и 100 зарубежных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Общая характеристика больных и методы исследования
В основу работы положены результаты исследования 80 пациентов (славян из Московской популяции) с острым каротидным ишемическим атеротромботическим инсультом, поступивших в неврологические клиники РГМУ (ГКБ № 20 и ГКБ № 31 г. Москвы) за период 2002 - 2005 гг., соответствовавших критериям включения в исследование.
В исследование были включены 54 женщины и 26 мужчин в возрасте от 47 до 89 лет (средний возраст 69,8+1,14). Все пациенты получали унифицированную базисную терапию, реперфузионную и нейропротективную терапию.
Из исследования исключались больные с перенесенными ранее инсультами, острыми заболеваниями воспалительной и невоспалительной природы, острым инфарктом миокарда, сердечной, печеночной и почечной недостаточностью, эндокринными и аутоиммунными заболеваниями и другими состояниями, сопровождающимися нарушениями системной гемодинамики и метаболизма, а также пациенты с онкологической патологией.
В качестве сравнения использовалась группа славян из Московской популяции в количестве 50 человек, сравнимых по полу и возрасту с основной группой не, без инсультов в анамнезе и согласно данным нейровизуализации (КТ/МРТ головного мозга). Все данные о группе сравнения, включая образцы ДНК, были предоставлены Отделом Молекулярных Основ Генетики Человека ИМГ РАН.
Методы исследования 1. Клинико-инструментальные методы
Для стандартизации обработки клинического материала и проведения статистического анализа тяжесть состояния больных с ишемическим инсультом и выраженность у них неврологического дефицита оценивали по балльным шкалам Оргогозо [Orgogozo J.M., 1986] и NIHSS [Brott T.G. и соавт., 1989] на 1-е, 3-й, 7-е и 21-е сутки от развития ишемического инсульта. Группировка пациентов в зависимости от динамики тяжести состояния определялась по шкале Оргогозо. Динамика оценивалась как положительная в случае прибавления минимум пяти баллов по шкале в течение анализируемого периода наблюдения, и как отрицательная в случае уменьшения минимум на пять баллов по шкале. Состоянием без динамики считалось отсутствие прироста или уменьшения баллов по шкале Оргогозо в течение анализируемого периода. Степень функционального восстановления утраченных оценивалась по индексу Бартел [Barthel D., 1965] на 21-е сутки инсульта.
Ишемический характер инсульта был установлен по данным анамнеза и клинической картины заболевания, данных МРТ-исследования головного мозга. Патогенетический характер инсульта устанавливался в соответствии с критериями TOAST, на основании данных анамнеза и особенностей клинической картины заболевания, данных ультразвуковой допплерографии (УЗДГ) и дуплексного сканирования (ДС) магистральных артерий головы (МАГ), ЭКГ и ЭХО-КГ.
Для оценки изменения объема ишемического повреждения головного мозга всем пациентам проводилась магнитно-резонансная томография (МРТ) головного мозга и МР-морфометрия на 1-е, 3-й, 7-е и 21-е сутки от развития инсульта. Исследования выполняли на магнитно-резонансном томографе " Эллипс" ТМП-150, с индукцией магнитного поля 0,15 Тесла (научно-производственная фирма "A3", Россия). Морфометрическую обработку полученных изображений выполняли с применением программных пакетов
"OSIRIS" и "TOMOSOFT-Net"- комплекса прикладных программ томографа "Эллипс", который включает набор последовательностей сканирования, а также среду для редактирования и анализа получаемых изображений.
2. Молекулярно-генетическое исследование Молекулярно-генетическое исследование проводилось на базе Отдела Молекулярных Основ Генетики Человека ИМГ РАН. При проведении генетического анализа экстракцию геномной ДНК производили из лейкоцитов свежей незамороженной венозной крови по стандартной методике (9,0 мл крови с добавлением 1,0 мл ЭДТА) с применением экстракции смесью фенол/хлороформ. Прямая ДНК-диагностика полиморфных участков промотерной области -2447C/G, -1659С/Т, -0,7 (ТААА)п I/D и Ser608Leu(C/T) 16-го экзона гена NOS2 производилась путем амплификации в ПЦР участков с последующей их обработкой эндонуклеазами рестрикции и электрофорезом в полиакриламидном геле.
Выбор полиморфизмов гена NOS2 для анализа их роли в формировании инфаркта мозга определялся прежде всего частотой распределения минорных аллелей в популяции. На основании опубликованных данных по частоте распределения минорных аллелей полиморфных вариантов гена NOS2 в близкородственных европейских популяциях нами были выбраны для изучения вышеуказанные участки гена. Распределение аллельных вариантов изучаемых полиморфизмов соответствовало закону Харди-Вайнберга. Анализ полиморфизма гена NOS2 в группе сравнения показал, что выбранные участки гена отличаются достаточно высокими частотами распределения минорных аллелей.
3. Статистический анализ Статистическая обработка проводилась с помощью пакета статистических программ Statistica 7.0 с использованием стандартных методов вариационной статистики. Учитывая, что большинство совокупностей данных имели распределение отличное от нормального, для характеристики центральной тенденции значений была использована
медиана; а достоверность различий устанавливали с помощью непараметрического и-критерия Манна-Уитни. Анализ связи двух признаков проводился с использованием метода корреляции гамма. Качественные признаки оценивались с помощью критерия %2 с поправкой Йетса и двустороннего критерия Фишера. В качестве порогового уровня статистической значимости было принято значение 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Результаты клинико-инструментального исследования пациентов При поступлении в клинику состояние 34 больных (42,5%) расценивалось, как тяжелое (< 40 баллов по шкале Оргогозо). У 44 пациентов (57,5%) отмечалось состояние средней тяжести (>40 баллов по шкале Оргогозо), характеризовавшееся, в основном, отсутствием или незначительно выраженным общемозговым и менингеальным синдромами, умеренно выраженным очаговым дефектом.
Данные МР-морфометрии позволили нам разделить всех больных на 3 группы в зависимости от объема инфаркта мозга. В первую группу вошли пациенты с малым объемом ишемического очага (до 40 см3), во вторую - со средним объемом (40 - 90 см3). Третью группу составили больные с большим объемом инфаркта (более 90 см3).
Использование непараметрического метода анализа корреляции гамма выявило тесную связь между выраженностью неврологического дефицита по шкалам Оргогозо и МИББ на 1-е, 3-й, 7-е и 21-е сутки и объемами очага инфаркта мозга на те же сутки (таблица 1).
На основании данных МР-морофометрии проводилась оценка изменений объема очага инфаркта в остром периоде ишемического инсульта. Необходимо отметить, что средняя динамика очага рассматривалась не как разница средних объемов за определенный период, а как среднее их изменений в указанные промежутки времени.
Таблица 1. Коэффициенты корреляции выраженности неврологического дефицита на 1-е, 3-е, 7-е и 21-е сутки с объемами очага на те же сутки
Уочага,1-е сут V очага,3-е сут V очага,7-е сут V очага,21-е сут
ш.Оргогозо,1-е сут -0,536023
ШНвв, 1-е сутки 0,502385
ш.Оргогозо,3-е сут -0,508358
№Ш8,3-е сутки 0,479487
ш.Оргогозо,7-е сут -0,650485
МИББЛ-е сутки 0,558074
ш.Оргогозо,21 -есут -0,661597
1М1Щ8,21-е сутки 0,549451
Примечание: р<0,05 для всех представленных коэффициентов корреляции
В периоды с 1-х по 3-й и с 3-х по 7-е сутки отмечалось увеличение объема очага на 7,84 (1,9-47,3) мл и 2,5 (-3,7-19,94) мл соответственно. Наблюдались пациенты с прогрессирующим увеличением объема очага с 7-и по 21 сутки, но в целом достоверно чаще отмечалось уменьшение объема на 3,9 [-18,7-(-0,15)] мл (рис. 1). Полученные результаты отражают максимальную выраженность отека мозга в период с 3-х по 7-е сутки ишемического инсульта.
Рисунок 1. Динамика объема инфаркта мозга в остром периоде ишемического инсульта, см3
7,84
.................. 2,5
-3,9
А7-21
й1-3 Л 3-7
Период наблюдения, й
А1 -3 - период наблюдения с 1 по 3 сутки; ДЗ-7 - период наблюдения с 3 по 7 сутки; Д7-21- период наблюдения с 7 по 21 сутки.
С целью нивелирования исходных объемов и увеличения значимости вклада малых очагов была проведена оценка динамики в процентах. В период с 1-х по 3-й сутки отмечалось наибольшее увеличение очага - на 26,45 (6,74-83,33)%. В период с 3-х по 7-е сутки увеличение объема составило всего 6,46 (-22-26,04)%. С 7-х по 21-е сут наблюдалось уменьшение объемов инфаркта на 26,42 [-46,87-(-2,7)]% (рис. 2).
Рисунок 2. Динамика объема инфаркта мозга в остром периоде ишемического инсульта, %
30 26,45
-26,42
Период наблюдения,Д
Д1 -3 - период наблюдения с 1 по 3 сутки;
ДЗ-7 - период наблюдения с 3 по 7 сутки;
Д7-21- период наблюдения с 7 по 21 сутки.
Таким образом, при сравнении изменений объема очага в абсолютных и относительных величинах можно наблюдать, что в том и в другом случае увеличение объема очага инфаркта происходит в период с 1-х по 7-е сутки, в дальнейшем же следует его уменьшение. Не было отмечено достоверной разницы между увеличением объема инфаркта мозга в периоды с 1-х по 3-й и с 1-х по 7-е сутки. Полученные результаты относятся к оценке динамики объема очага, как в абсолютных, так и в относительных значениях.
При анализе динамики очагов исходно малого (<40 см3), среднего (4090 см3) и большого (>90 см3) объемов в относительных величинах необходимо отметить, что объем исходно больших очагов инфаркта мозга менее других меняется на протяжении периода наблюдения (рис.3).
Рисунок 3. Динамика инфаркта мозга в остром периоде ишемического инсульта в зависимости от исходного объема очага, %
-40,21
Период наблюдений,Д
А1-3 - период наблюдения с 1 по 3 сутки;
ДЗ-7 - период наблюдения с 3 по 7 сутки;
Д7-21- период наблюдения с 7 по 21 сутки.
Несмотря на значительное увеличение объема малых и средних очагов с 1-х по 3-й сутки, отражающего развитие отдаленных последствий ишемии, в том числе локального воспаления в зоне ишемического повреждения, регресс объема на 7-21-е также значителен. Причем, чем больше объем очага к 1-м суткам, тем менее выражено его уменьшение в период с 1-х по 21-е сутки. В случае развития очага инфаркта большого объема процессы репарации продолжаются в течение более длительного периода времени, вероятно поэтому не наблюдается значительного регресса очага исходно большого объема в период с 7-х по 21-е сутки.
Результаты молекулярно-генетического исследования пациентов Результаты анализа полиморфизма гена N082 у больных с каротидным ишемическим атеротромботическим инсультом продемонстрировали высокую частоту распределения минорных аллелей анализируемых структурных вариантов (таб. 2).
Таблица 2. Генотипы и частоты аллелей полиморфизмов гена NOS2
Общее число больных с инсультом (п=80)
-2447 C/G СС CG GG С(%) G(%)
34 35 11 66,25 33,75
-1659 С/Т СС СТ ТТ С(%) Т (%)
53 25 2 84,8 15,2
-0.7 гер. DD ID И D (%) 1(%)
I/D 58 22 0 86,25 13,75
Ser608Leu СС СТ ТТ С(%) Т (%)
(С/Т) 54 23 3 82,2 17,8
Необходимо отметить, что частоты распределения минорных аллелей анализируемых полиморфизмов гена NOS2 в группе больных с инсультом и в группе сравнения значимо не различались. При анализе распределения основных факторов риска ишемического инсульта у больных с разными генотипами по данным полиморфным вариантам статистических различий выявлено не было (р>0,05). Полученные данные позволяют заключить, что анализируемые в нашей работе полиморфные варианты гена NOS2, кодирующего синтез iNOS, не участвует в формировании как независимой генетической предрасположенности к развитию ишемического инсульта, так основных факторов его риска.
1.Анализ связи полиморфных вариантов гена NOS2 с динамикой объема очага инфаркта мозга Статистический анализ с использованием метода корреляции гамма не выявил достоверной ассоциации между объемом инфаркта мозга на 1-е, 3-й, 7-е и 21-е сутки со всеми изучаемыми полиморфными вариантами гена NOS2 (р>0,05). Для выявления связи полиморфизма гена NOS2 с динамикой объема очага инфаркта мозга в абсолютных и относительных значениях проводился непараметрический метод корреляции гамма.
Обнаружена статистически значимая сильная прямая связь генотипа -1659С/Т с динамикой объема инфарктов мозга в абсолютных значениях с 1-х по 21-е сутки (р<0,05); а также обратная связь средней силы генотипа
8ег608Ьеи(С/Т) с абсолютной динамикой объема очагов в тот же период наблюдения (р<0,05). Выявлены обратные корреляции между носительством генотипа 8ег608Ьеи(С/Т) и изменением объема очага с 1-х по 3-й сутки в абсолютных и относительных значениях. Следует отметить, что характер связи генотипа с динамикой очага в абсолютных значениях слабее таковой с динамикой объема, оцениваемой в относительных значениях (таб.3)
Таблица 3. Коэффициенты корреляции анализ полиморфизма гена NOS2 с динамики объема очага инфаркта мозга
Д1-3, см3 Д1-3% ДЗ-7, см3 ДЗ-7% Д7-21, см3 А7-21%
-2447 C/G -0,143226 -0,145806 -0,037433 0,047619 0,210084 0,176471
-1659 СЯ -0,269231 0,092077 -0,468750 -0,274194 0,750000* 0,478261
-0,7 repeat I/D -0,211045 -0,003953 -0,312500 -0,045161 0,433333 0,182609
Ser608Leu С/Т -0,295038* -0,376414* -0,202346 -0,119266 -0,422222* -0,292453
Примечание: *- р<0,05
В отношении полиморфных вариантов 8ег608Ьеи (С/Т) и -1659С/Т, статистически значимая связь которых с динамикой объема очага инфаркта мозга была предварительно выявлена методом корреляционного анализа, проводилась оценка различия по динамике объема очага в группах носителей разных генотипов. Для этого все больные с инсультом были разделены на подгруппы в зависимости от носительства генотипов по полиморфным вариантам 8ег608Ьеи(С/Т) и -1659С/Т. Учитывая незначительное число пациентов - гомозигот по Т аллелю, пациенты с С/Т и Т/Т генотипами по 8ег608Ьеи(С/Т) были объединены в одну группу. Аналогичным образом были объединены пациенты, являющиеся носителями С/Т и Т/Т генотипов по полиморфизму -1659С/Т.
Выявлено статистически значимое различие в относительной динамике объема инфаркта мозга с 1-х по 3-й сутки между носителями С/С и С/Т+Т/Т генотипов по 8ег608Ьеи(С/Т) независимо от исходного объема очага (р=0,03). У больных с ишемическим инсультом, гомозиготных по аллелю С,
отмечается достоверно более выраженное увеличение очага инфаркта с 1-х по 3-й сутки, чем у носителей аллеля Т (рис.4)
Рисунок 4. Различие в динамике объема инфаркта мозга на 1-3-и сутки у больных с разными генотипами по полиморфизму 8ег608Ьеи(С/Т)
5ег6081_еи(СЛ")
Примечание: * р=0,03 по сравнению с С/С генотипом 8ег608Ьеи (150С/Т)
Как было отмечено ранее, увеличение объема очага инфаркта происходит с 1-х по 3-й и далее с 3-х по 7-е сутки. Если рассматривать изменение объема в относительных величинах, то приростом очага с 3-х по 7-е сутки можно пренебречь и принять, что увеличение очага с 1-х по 3-й сутки соответствует его распространению с 1-х по 7-е сутки. Выявлено статистически значимое различие в относительной динамике инфаркта с 1-х по 7-е сутки между носителями С/С и С/Т+Т/Т генотипов по 8ег608Ьеи(С/Т) независимо от исходного объема очага (р=0,04).
Полученные данные косвенно подтверждает функциональную значимость данного полиморфизма, которая на современном этапе не доказана в экспериментальных работах, однако предполагается, что нуклеотидная замена, способна влиять на стабильность структуры белка в связи с потерей дисульфидных связей между серинами. Нестабильность
фермента может отрицательно повлиять на его функциональную активность и соответственно привести к снижению синтеза оксида азота, который катализируется
Обнаружено статистически значимое различие в абсолютной динамике инфаркта в период с 7-х по 21-е сутки между носителями С/С и С/Т+Т/Т генотипов по полиморфным вариантам -1659С/Т и 8ег608Ьеи(С/Т). У носителей аллелей Т по -1659С/Т и 8сг6081_еи(С/Т) отмечался более выраженный регресс объема очага, у носителей гомозиготных генотипов С/С (р=0,02 и р=0,03 соответственно) (рис.5,б).
Рисунок 5. Различие в динамике объема инфаркта мозга на 7-21-е сутки у больных с разными генотипами по полиморфизму -1659С/Т
•1659С/Т
Примечание: * р=0,02 по сравнению с С/С генотипом -1659 С/Т
Рисунок 6. Различие в динамике объема инфаркта мозга на 7-21-е сутки у больных с разными генотипами по полиморфизму 8ег608Ьеи(С/Т)
I М.п-М,эх
5ег6081_еи(С/Т)
Примечание: * р=0,03 по сравнению с С/С генотипом 8ег608Ьеи (С/Т)
Выявлено высокодостоверное различие в относительной динамике объема исходно малых очагов инфаркта мозга с 1-х по 3-й сутки между носителями С/С генотипа и аллеля Т по 8ег608Ьеи(С/Т) (р=0,005). У больных, гомозиготных по аллелю С, отмечалось достоверно более выраженное увеличение очага инфаркта с 1-х по 3-й сутки, чем у носителей аллеля Т (рис.7). Также отмечалось статистически значимое различие в относительной динамике объема малого очага инфаркта с 1-х по 7-е сутки в группах носителей С/С и С/Т+Т/Т генотипов по данному полиморфному варианту (р=0,04).
Достоверность различия выраженности динамики объема инфаркта мозга с 1-х по 3-й сутки между носителями гомозиготного генотипа С/С и носителями аллеля Т терялась при оценке подгрупп с очагами исходно среднего и большого объема. С учетом полученных данных можно предположить, что снижение количества синтезируемого оксида азота не влияет на динамику доформирования исходно средних и больших очагов за счет действия множества других факторов гибели клеток в условиях ишемии.
Рисунок 7. Различие в динамике объема малого очага инфаркта мозга на 1-3-е сутки у больных с разными генотипами по 8ег608Ьеи(С/Т)
БегбОвЬеи (С/Т)
Примечание: * р=0,005 по сравнению с генотипом С/С 8ег608Ьеи (С/Т)
2. Распределение генотипов полиморфных вариантов гена N082 в зависимости от динамики тяжести состояния
Распределение генотипов по полиморфному варианту 8ег608Ьеи(С/Т) у пациентов с разной динамикой неврологического дефицита в период с 1-х по 7-е сутки независимо от исходного объема очага представлено в таблице 4. Выявлено относительно равномерное распределение генотипов полиморфизма 8ег608Ьеи(С/Т) в группе больных с положительной динамикой в неврологическом статусе и, напротив, преобладание носителей генотипа С/С в двух других группах больных. Статистический анализ выявил, что в группе больных с отрицательной динамикой в неврологическом статусе по шкале Оргогозо в период с 1-х по 7-е сутки достоверно преобладают носители генотипа С/С полиморфного варианта БегбОВЬеи (С/Т), по сравнению с группой пациентов, характеризующихся положительной динамикой, в которой распределение генотипов анализируемого полиморфизма относительно равномерно (критерий %2 с поправкой Йетса=5,75, р=0,02; двусторонний критерий Фишера р=0,006).
Таблица 4. Распределение генотипов по 8ег608Ьеи(С/Т) у пациентов с различной динамикой состояния по шкале Оргогозо с 1-х по 7-е сутки
С/С С/Т+Т/Т Число пациентов
Отрицательная динамика 17(94,4%)* 1(5,6%) 18
Без динамики 14(70%) 6(30%) 20
Положительная динамика 25(59,5%) 17(40,5%) 42
Примечание: * р=0,006 по сравнению с группой положительной динамики
При анализе распределения генотипов полиморфного варианта 8ег608Ьеи(С/Т) у пациентов с разной динамикой тяжести состояния с 1-х по 3-е сутки и с 7-х по 21-е сутки независимо от объема исходного очага также отмечалось относительно равномерное распределение С/С и С/Т+Т/Т генотипов полиморфизма 8ег608Ьеи(С/Т) в группе больных с положительной динамикой в неврологическом статусе и, напротив, в двух других группах больных преимущественно наблюдались носители аллеля Т. Однако достоверного преобладания носителей генотипа С/С среди пациентов с отрицательной динамикой в указанные периоды наблюдения по сравнению с двумя другими группами выявлено не было (р>0,05).
При анализе распределения генотипов полиморфного варианта 8ег608Ьеи(С/Т) у пациентов с разной динамикой тяжести состояния отдельно в подгруппах исходно малого, среднего или большого объема очага инфаркта мозга не отмечалось достоверного преобладания того или иного генотипа полиморфизма (р>0,05).
Анализ распределения генотипов полиморфных вариантов -2447С/(], -1659С/Т и -0,7 (ТААА)П гена N082 в зависимости от динамики тяжести состояния по шкале Оргогозо не выявил достоверных различий по генотипам ни в целом по группе, ни отдельно в подгруппах исходно малого, среднего или большого очага инфаркта мозга (р>0,05).
3. Распределение генотипов полиморфных вариантов гена N082 в зависимости от степени функционального восстановления
Распределение генотипов по полиморфному варианту 8ег608Ьеи(С/Т) у пациентов в зависимости от степени функционального восстановления представлено в таблице 5. Статистический анализ выявил, что в группе с умеренной инвалидизацией достоверно преобладают носители генотипа С/С по 8ег608Ьеи(С/Т), по сравнению с группой минимальной инвалидизации, в которой распределение генотипов анализируемого полиморфизма равномерно (критерий %2 с поправкой Иетса=4,85, р=0,03; двусторонний критерий Фишера р=0,01).
Таблица 5. Распределение генотипов по 8ег608Ьеи(С/Т) в зависимости от степени функционального восстановления по индексу Бартел
на 21 сутки
С/С С/Т+Т/Т Число пациентов
Тяжелая инвалидизация 14(73,7%) 5(26,3%) 19
Умеренная инвалидизация 18(90%)* 2(10%) 20
Минимальная инвалидизация 14(48,3%) 15(51,7%) 29
Примечание: * р=0,01 по сравнению с группой положительной динамики
При анализе распределения генотипов полиморфного варианта 8ег608Ьеи(С/Т) у пациентов с разной степенью функционального восстановления по индексу Бартел отдельно в подгруппах исходно малого, среднего или большого объема очага инфаркта мозга не отмечалось достоверного преобладания того или иного генотипа полиморфизма (р>0,05). Анализ распределения генотипов полиморфных вариантов -2447С/0, -1659С/Т и -0,7 (ТААА)П гена N082 в зависимости от степени функционального восстановления по индексу Бартел не выявил достоверных различий в генотипах ни в целом по группе, ни отдельно в подгруппах исходно малого, среднего или большого очага инфаркта мозга (р>0,05).
Исследование полиморфных вариантов -2447СЛЗ и -0,7 (ТААА)п Ю не выявило их корреляции с динамикой объема очага инфаркта мозга, динамикой тяжести состояния и степенью функционального восстановления (р>0,05). Это может быть обусловлено отсутствием функциональной значимости анализируемых полиморфных вариантов, либо отсутствием статистической достоверности в связи с относительно малым объемом выборки.
ВЫВОДЫ
1. Комплексный клинический, молекулярно-генетический и МР-морфометрический анализ выявил взаимосвязь полиморфного варианта 8ег608Ьси(С/Т) гена N082 с динамикой формирования очага инфаркта мозга в период с 1-х по 3-й и с 1-х по 7-е сутки от развития заболевания (г = -0,376 и г = -0,295, р<0,05), а также связь 8ег608Ьеи(С/Т) и -1659С/Т гена N082 с динамикой формирования очага инфаркта мозга в период с 7-х по 21-е сутки от развития заболевания (г = -0,422 и г =0,75 соответственно р<0,05) независимо от исходного объема независимо от исходного объема.
2. Установлено статистически значимое различие по выраженности динамики объема очага церебральной ишемии в группах носителей гомозиготного генотипа С/С и носителей аллеля Т полиморфного варианта 8ег608Ьеи(С/Т). Для носителей аллеля Т характерно менее выраженное увеличение объема очага с 1-х по 3-й сутки по сравнению с носителями гомозиготного генотипа С/С независимо от исходного объема очага (р=0,03).
3. В группе пациентов с малым объемом очага церебральной ишемии носительство гомозиготного генотипа С/С по полиморфизму 8ег608Ьеи(С/Т) высоко достоверно связано с более выраженным увеличением объема малого очага в период с 1-х по 3-й сутки по сравнению с носительством аллеля Т (р=0,005).
4. Установлено достоверное различие по выраженности динамики объема очага церебральной ишемии в группах носителей гомозиготного генотипа С/С и носителей аллеля Т полиморфных вариантов 8ег608Ьеи(С/Т) и -
1659С/Т. Для носителей протективной аллели Т характерно более выраженное уменьшение объема очага с 7-х по 21-е сутки по сравнению с носителями гомозиготного генотипа С/С (р=0,03 и р=0,02 соответственно).
5. Частота С/С генотипа достоверно преобладает у больных с отрицательной динамикой в неврологическом статусе (по балльной шкале Оргогозо) в периоды с 1-х по 3-й и с 7-х по 21-е сутки, а также среди пациентов с замедленным восстановлением нарушенных неврологических функций к концу острого периода ишемического инсульта (тяжелая или умеренная инвалидизация) по сравнению с носитсльством аллеля Т, независимо от исходного объема инфаркта мозга (р=0,006 и р=0,01 соответственно).
6. Исследование полиморфных вариантов -2447С/0 и -0,7 (ТААА)п 1/Б не выявило их корреляции с динамикой объема очага инфаркта мозга, динамикой тяжести состояния и степенью функционального восстановления (р>0,05).
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Целесообразно включить молекулярно-генетическую диагностику полиморфного варианта 8ег608Ьеи(С/Т) гена N082 в качестве молекулярно-генетического маркера индивидуальной чувствительности ткани мозга к ишемии с целью выявления группы риска по неблагоприятной динамике объема очага инфаркта мозга в случае острого сосудистого мозгового эпизода.
2. Рекомендуется использовать в группах риска по развитию ишемического инсульта своевременную превентивную нейропротективную терапию, стимулирующую синтез защитных нейротрофических факторов.
3. Целесообразна разработка и включение в комплекс интенсивной терапии ишемического инсульта нейропротекторов, избирательно подавляющих фермент ¿МОБ.
СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Скворцова В.И., Кольцова Е.А., Боцина А.Ю. Генетика ишемического инсульта.//Ж. неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова, приложение ИНСУЛЬТ, 2001, №4, с.10-18.
2. Скворцова В.И., Лимборская С.А., Сломинский П.А., Кольцова Е.А., Шетова И.М., Тупицина Т.В., Боцина А.Ю. Изучение роли миссенс-мутации (М235Т) гена ангиотензиногена в развитии ишемической болезни мозга.//Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2003, №1, с.53-54.
3. Скворцова В.И., Лимборская С.А., Сломинский П.А., Кольцова Е.А., Шетова И.М., Боцина А.Ю., Шамалов Н.А. Роль полиморфных вариантов генов ренин-ангиотензиновой системы в развитии ишемического инсульта в московской популяции.//Ж. неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова, 2003,103, №3 с.47-51.
4. Skvortsova V.I., Limborska S.A., Shetova I.M., Koltsova E.A., Botsina A.Yu., Tupitsina T.V., Slominsky P.A. The role of polymorphisms of candidate genes (angiotensin converting enzyme, angiotensinogen and endothelial nitric oxide synthase) in the carotid ischemic atherothrombotic stroke .//Abstracts of the 5th World Stroke Congress, 22-26 June 2007, Vancouver, Canada, p 211.
5. Dmitrieva V.G., Dergunova L.V., Botsina A.Yu., Platonova I.A., Tvorogova T.V., Shaykhutdinova E.F., Torshina E.V., Skvortsova V.I., Limborska S.A. Analysis of iNOS expression in rats under brain experimental ischemia.// European Journal of Human Genetics. 2005, v. 13, p. 365.
6. Botsina A.Yu, Tupitsina T.V., Shetova I.M., Slominsky P.A., Limborska S.A., Skvortsova V.I. Association of NOS2 polymorphisms Ser608Leu(150C/T) and -1659C/T with brain infarction formation in patients with ischemic atherothrombotic stroke from Moscow population.//
Abstracts of the XVIIIth European Stroke Conference, 26-29 May 2009, Stochkholm, Sweden.PO №9.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДС - дуплексное сканирование
КТ - компьютерная томография
МАГ - магистральные артерии головы
MP - магнитно-резонансный
МРТ - магнитно-резонансная томография
п.н. - пара нуклеотидов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
УЗДГ - ультразвуковая доплерография
ЭКГ - электрокардиография
ЭХО-КГ - эхокардиография
iNOS - inducible NO-synthase (индуцибельная NO-синтаза) NO - оксид азота
NOS2 - inducible NO-synthase 2 (ген, кодирующий синтез фермента) ONOO" - пероксинитританион
Для заметок
Оглавление диссертации Боцина, Александра Юрьевна :: 2009 :: Москва
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1 .Основные современные методы исследования генетической составляющей ишемического инсульта
1.1.1. Ассоциативные исследования генетических факторов риска развития ишемического инсульта.
1.1.2. Ассоциативные исследования индивидуальной чувствительности мозга к ишемическому повреждению.
1.1.2.1. Роль генов липидного обмена в формировании индивидуальной чувствительности мозга к ишемическому повреждению.
1.1.2.2. Роль генов митохондриального и рецепторного путей апоптоза в формировании индивидуальной чувствительности мозга к ишемическому повреждению.
1.1.3. Полногеномное сканирование.
1.2. Индуцибельная ЫО-синтаза и оксид азота в реализации биохимических механизмов ишемии мозга.
1.2.1. Изоформы ЫО-синтазы: еЫОБ, пЫОБ, /АЮБ.
1.2.2. Функционирование изоформ ЫО-синтазы на разных этапах ишемического повреждения мозга.
1.2.3. Роль оксида азота в развитии ишемического повреждения мозга.
1.2.4. Взаимодействие ¡ЫОБ с белками ПАРП-1 и ЦОГ-2 на этапах ишемического повреждения мозга.
1.2.5. Применение ингибиторов гУУОБ в моделях экспериментальной ишемии.
1.3. Ассоциативный анализ полиморфных вариантов генов N081,
N082 и N083.
ГЛАВА 2. КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Клиническая характеристика больных.
2.2. Методы исследования.
2.2.1. Клинические методы.
2.2.2. Лабораторные и инструментальные методы.
2.2.3. Генетические методы исследования.
2.2.4. Статистическая обработка данных.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИКО-ИНСТРУМЕНТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ПАЦИЕНТОВ.
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ПАЦИЕНТОВ.
4.1. Распределение основных факторов риска ишемического инсульта в зависимости от генотипов полиморфных вариантов N082.
4.2. Анализ связи полиморфных вариантов гена N082 с динамикой объема очага инфаркта мозга.
4.3. Распределение генотипов полиморфных вариантов гена N082 в зависимости от динамики тяжести состояния.
4.4. Распределение генотипов полиморфных вариантов гена N082 в зависимости от степени функционального восстановления.
Введение диссертации по теме "Нервные болезни", Боцина, Александра Юрьевна, автореферат
Сосудистые заболевания головного мозга и, в частности, ишемический инсульт - одна из наиболее важных и актуальных медицинских проблем нашего общества. Широкое распространение ишемического инсульта, высокий процент смертности и тяжелой инвалидизации определяют приоритетность исследований в области изучения патогенеза развития заболевания.
Многочисленные эпидемиологические исследования доказали важность роли генетической составляющей в частоте развития сосудистых заболеваний головного мозга.
В большинстве случаев ишемический инсульт - это мультифакторное заболевание, в формировании которого принимают участие как внешние факторы, так и индивидуальные генетические особенности индивидуума.
В настоящее время в изучении генетической предрасположенности инсульта, равно как и других мультифакторных заболеваний, используется анализ генетических ассоциаций, с помощью которого проводится изучение кандидатных генов, участвующих в формировании основных факторов риска сосудистой патологии.
В последние несколько лет анализ генетических ассоциаций используется и для изучения аспектов индивидуальной чувствительности мозга к ишемическому повреждению и возможному прогнозированию течения и исхода заболевания. В рамках исследований, проведенных на кафедре фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии ГОУ
ВПО РГМУ совместно с Отделом Молекулярных Основ Генетики Человека
ИМГ РАН, была определена связь Rsa-I полиморфизма гена ПАРП-1 и
ВатШ полиморфизма гена р53, основных индукторов митохондриального звена апоптоза с объемами очага инфаркта мозга на 1-е, 3-й, 7-е и 21-е сутки и тяжестью заболевания [12]. Выявлена связь rs3740720 полиморфизма гена
F ADD и полиморфизма -1677 G/A гена Fas с формированием обширного б очага инфаркта мозга и тяжестью течения заболевания [7]. Полученные данные косвенно подтверждают участие механизмов программированной клеточной гибели в ишемическом повреждении ткани головного мозга.
Избыточная продукция оксида азота (N0) при обязательном участии фермента индуцибельная 1чЮ-синтаза (¡N05!) с последующим образованием токсического соединения пероксинитританиона в настоящее время рассматривается как один из важнейших пусковых механизмов тканевого повреждения на разных этапах ишемии мозга. Участие гена N082, кодирующего синтез в формировании очага инфаркта мозга было многократно продемонстрировано на различных моделях экспериментальной ишемии. Особое внимание привлекает факт относительно поздней экспрессии /АЮБ, что в дальнейшем возможно определит избирательное применение селективных ингибиторов фермента в условиях стационаров, куда пациенты с ишемическим инсультом не всегда госпитализируются в первые сутки от развития заболевания.
В связи с изложенным выше, представляет интерес проведение анализа структурных особенностей гена N082, кодирующего синтез фермента /АЮБ у больных с ишемическим инсультом в остром периоде.
Цель работы: Изучение роли полиморфных вариантов гена индуцибельной №>синтазы (N082) в формировании инфаркта мозга, течении и исходе заболевания у больных с каротидным ишемическим атеротромботическим инсультом.
Задачи исследования
1. Изучить клинические особенности развития каротидного ишемического атеротромботического инсульта и закономерности динамики формирования инфаркта мозга в остром периоде заболевания.
2. Проанализировать полиморфные варианты -2447СЛЗ, -1659С/Т, -0,7 (ТААА)П 1/1) и 8ег608Ьеи(150С/Т) гена N082 и их влияние на динамику формирования инфаркта мозга.
3. Оценить связь анализируемых полиморфных вариантов гена N082 с течением и исходом ишемического инсульта.
Научная новизна
1. Впервые проведено комплексное динамическое клиническое, МР-морфометрическое и молекулярно-генетическое исследование пациентов в остром периоде ишемического инсульта с целью изучения роли полиморфных вариантов -2447С/0, -1659С/Т, -0,7 (ТААА)П 1/Б и 8ег608Ьеи(150С/Т) гена N082 в динамике формирования инфаркта мозга, течении и исходе заболевания.
2. Обнаружены статистически значимые ассоциации полиморфизмов 8ег608Ьеи(С/Т) и -1659С/Т гена N082 с динамикой формирования очага инфаркта мозга, что косвенно может свидетельствовать о функциональной значимости вышеуказанных полиморфных вариантов.
3. Выявлено достоверное преобладание носителей гомозиготного С/С генотипа по полиморфизму 8ег608Ьеи(С/Т) гена N082 среди больных с отрицательной динамикой в неврологическом статусе в период с 1-х по 3-й сутки и в группах больных с умеренной и тяжелой инвалидизацией, по сравнению с носительством аллеля Т, независимо от исходного объема инфаркта мозга.
Практическая значимость работы
1. Полученная взаимосвязь полиморфизма 8ег608Ьеи(С/Т) гена N082 с динамикой формирования очагов инфаркта мозга, течением и исходом ишемического инсульта позволит применять анализ генотипов 8ег608Ьеи(С/Т) в качестве критерия прогнозирования течения и исхода заболевания.
2. Выявление генетических маркеров индивидуальной чувствительности мозга к ишемии расширяет возможности индивидуализированной профилактики ишемического инсульта и позволяет разработать новые подходы к диспансеризации здоровых лиц из группы риска.
3. Изучение генетических основ повреждающего действия ишемии позволяет выявить новые мишени для лечения инсульта. Ассоциация полиморфного варианта 8ег608Ьеи(С/Т) гена N082 с динамикой формирования инфаркта мозга показывает перспективность использования нейропротекторов, реализующих свое действие через высокоселективное ингибирование фермента /ЖЖ
Положения, выносимые на защиту
1. Формирование объема инфаркта мозга, динамика неврологического статуса и степень функционального восстановления при ишемическом инсульте статистически значимо ассоциированы с полиморфным вариантом 8ег608Ьеи(С/Т) 16-го экзона гена N082, что косвенно свидетельствует о функциональной значимости данного участка, определяющего замену аминокислоты серина на лейцин в последовательности первичной структуры белка фермента ¿N08.
2. Высокодостоверное различие в относительной динамике объема исходно малых очагов инфаркта мозга у носителей С/С генотипа в сравнении с носителями аллеля Т по 8ег608Ьеи(С/Т) гена N082, позволяет 9 предположить различную степень значимости избыточного синтеза N0 для формирования очагов разного объема.
3. Обнаруженная связь полиморфизма гена N082, кодирующего синтез ¡N05, с динамикой формирования инфаркта мозга, подтверждает участие важнейших медиаторов нейроиммунного ответа N0 и ОЫОО" в ишемическом повреждении головного мозга у больных с каротидным ишемическим атеротромботическим инсультом и обосновывает изучение и необходимость разработки нейропротекторов, реализующих свое действие путем высокоселективного ингибирования фермента ¡N08.
Заключение диссертационного исследования на тему "Роль полиморфных вариантов гена индуцибельной NO-синтазы в формировании инфаркта мозга у больных с каротидным ишемическим атеротромботическим инсультом."
выводы
1. Комплексный клинический, молекулярно-генетический и МР-морфометрический анализ выявил взаимосвязь полиморфного варианта 8ег608Ьеи(С/Т) гена N082 с динамикой формирования очага инфаркта мозга в период с 1-х по 3-й и с 1-х по 7-е сутки от развития заболевания (г = -0,376 и г = -0,295, р<0,05), а также связь 8ег608Ьеи(С/Т) и -1659С/Т гена N082 с динамикой формирования очага инфаркта мозга в период с 7-х по 21-е сутки от развития заболевания (г = -0,422 иг = 0,75 соответственно р<0,05) независимо от исходного объема независимо от исходного объема.
2. Установлено статистически значимое различие по выраженности динамики объема очага церебральной ишемии в группах носителей гомозиготного генотипа С/С и носителей аллеля Т полиморфного варианта 8ег608Ьеи(С/Т). Для носителей аллеля Т характерно менее выраженное увеличение объема очага с 1-х по 3-й сутки по сравнению с носителями гомозиготного генотипа С/С независимо от исходного объема очага (р=0,03).
3. В группе пациентов с малым объемом очага церебральной ишемии носительство гомозиготного генотипа С/С по полиморфизму 8ег608Ьеи(С/Т) высоко достоверно связано с более выраженным увеличением объема малого очага в период с 1-х по 3-й сутки по сравнению с носительством аллеля Т (р=0,005).
4. Установлено достоверное различие по выраженности динамики объема очага церебральной ишемии в группах носителей гомозиготного генотипа С/С и носителей аллеля Т полиморфных вариантов 8ег608Ьеи(С/Т) и -1659С/Т. Для носителей протективной аллели Т характерно более выраженное уменьшение объема очага с 7-х по 21-е сутки по сравнению с носителями гомозиготного генотипа С/С (р=0,03 и р=0,02 соответственно).
5. Частота С/С генотипа достоверно преобладает у больных с отрицательной динамикой в неврологическом статусе (по балльной шкале Оргогозо) в периоды с 1-х по 3-й и с 7-х по 21-е сутки, а также среди пациентов с замедленным восстановлением нарушенных неврологических функций к концу острого периода ишемического инсульта (тяжелая или умеренная инвалидизация) по сравнению с носительством аллеля Т, независимо от исходного объема инфаркта мозга (р=0,006 и р=0,01 соответственно).
6. Исследование полиморфных вариантов -2447СЛЗ и -0,7 (ТААА)п 1ЛЭ не выявило их корреляции с динамикой объема очага инфаркта мозга, динамикой тяжести состояния и степенью функционального восстановления (р>0,05).
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Целесообразно включить молекулярно-генетическую диагностику полиморфного варианта 8ег608Ьеи(С/Т) гена N082 в качестве молекулярно-генетического маркера индивидуальной чувствительности ткани мозга к ишемии с целью выявления группы риска по неблагоприятной динамике объема очага инфаркта мозга в случае острого сосудистого мозгового эпизода.
2. Рекомендуется использовать в группах риска по развитию ишемического инсульта своевременную превентивную нейропротективную терапию, стимулирующую синтез защитных нейротрофических факторов.
3. Целесообразна разработка и включение в комплекс интенсивной терапии ишемического инсульта нейропротекторов, избирательно подавляющих фермент ¡N08.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 2009 года, Боцина, Александра Юрьевна
1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж.: Молекулярная биология клетки. «Мир» М., 1994.
2. Ворлоу Ч.П., Деннис М.С., ван Гейн Ж., и др. Инсульт. Практическое руководство для ведения больных. С-П. Политехника 1998.
3. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. М. Медицина 2001.
4. Гусев Е.И., Скворцова В.И., Коваленко A.B., Соколов М.А. Механизмы повреждения ткани мозга на фоне острой фокальной церебральной ишемии. Журн неврол и психиатр 1999;2:65-70.
5. Иллариошкин С.Н. Генетика сосудистых заболеваний мозга. Очерки ангионеврологии. Под ред. Суслиной З.А. М.: Атмосфера, 2005: с.341.
6. Кольцова Е.А. Роль структурных особенностей генов ренин-ангиотензиновой систем, эндотелиальной NO-синтазы и р53 в развитии основных факторов риска цереброваскулярной патологии и в формировании инфаркта мозга. Дис.Канд мед наук.М,2002.
7. Кольцова К.В. Роль полиморфных вариантов генов, участвующих в рецепторном пути индукции апоптоза (Fas, FADD и каспазы-8) в патогенезе ишемического инсульта. Дис.Канд мед наук.М,2007.
8. Скворцова В.И. Участие апоптоза в формировании инфаркта мозга. Инсульт. Приложение Журн неврол и психиатр 2001;2:12-18.
9. Чистяков Д.А., Воронько O.E., Савостьянов К.В. и др. Полиморфные маркеры генов эндотелиальной NO-синтазы и сосудистого рецептораангиотензина II и предрасположенность к ишемической болезни сердца. Генетика 2000. Т. 36. № 12. С. 1707-1711.
10. Шамалов Н.А. Динамика восстановительных процессов при ишемическом инсульте по данным сопоставления клинических и томографических показателей. Дис.канд.наук. М,2004.
11. Шетова И.М. Роль полиморфных вариантов генов-регуляторов апоптоза: поли (АДФ-рибозы) полимеразы-1, апоптоз-индуцирующего фактора и р53 в патогенезе ишемического инсульта. Дис.Канд мед наук.М,2005.
12. Adams H.Jr., Bendixen В., Kapelle L. et al. Classification of subtype of acute ischemic stroke. Definitions for use in a multicenter clinical trial. Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment. Stroke 1993;24:35-41.
13. Allan S.M., Rothwell N.J. Cytokines and acute neurodegeneration. Neuroscience 2001 ;2:734-744.
14. Armengou A., Hurtado O., Leira R. et al. L-arginine levels in blood as a marker of nitric oxide-mediated brain damage in acute stroke: a clinical and experimental study. J Cereb Blood Flow Metab 2003;23(8):978-984.
15. Bachschmid M., Thurau S., Zou M.H., Ullrich V. Endothelial cell activation by endotoxin involves superoxide/NO-mediated nitration of prostacyclin synthase and thromboxane receptor stimulation. FASEB J 2003; 17: 914— 916.
16. Barnes P.J., Adcock I.M. Transcription factors and asthma. Eur Respir 1998;12:221-234.
17. Beck K-F., Eberhardt W., Frank S. et al. Inducible NO synthase: role in cellular signalling. J Exp Biol 1999;202:645-653.
18. Bevan S., Porteous L., Sitzer M., Markus H.S. Phosphodiesterase 4D gene, ischemic stroke and asymptomic carotyd atherosclerosis. Stroke 2005;36:949-953.
19. Butler A.R., Megson I.L., Wright P.G. Diffusion of nitric oxide and scavenging by blood in the vasculature. Biochim Biophys Acta 1998;1425:168-176.
20. Cai H., Wilcken D.E.,Wang X.L. The Glu-298-->Asp (894G->T) mutation at exon 7 of the endothelial nitric oxide synthase gene and coronary artery disease. JMolMed 1999;77(6):511-514.
21. Castillo J., Rama R., Davalos A. Nitric oxide-related brain damage in acute ischemic stroke. Stroke 2000;31(4):852-857.
22. Cramer J.P., Mockenhaupt F.P., Ehrhardt S., Burkhardt J. et al. iNOS promoter variants and severe malaria in Ghanian children. Trop Med Int Health 2004;9(10): 1074-1080.
23. Dell'Albani P., Santangelo R., Torrisi L.et al. JAK/STAT pathway mediates cytokine-induced iNOS expression in primary astroglial cell cultures. J Neurosci Res 2001 ;65(5):417-424.
24. Dirnagl U., Iadecola C., Moskowitz M.A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci 1999;22:391-397.
25. Dirnagl U., Simon R.P., Hallenbeck J.M. Ischemic tolerance and endogenous neuroprotection. Trends Neurosci 2003;26:248-254.
26. Eliasson M.J., Sampei K., Mandir A.S. et al. Poly(ADP-ribose) polymerase gene disruption renders mice resistent to cerebral ischemia. Nat Med 1997;3:1089-1095.
27. Endres M., Wang Z.Q., Namura S et al. Ischemic brain injury is mediated by the activation of poly(ADP-ribose)polymerase. J Cereb Blood Flow Metab 1997;17:1143-1151.
28. Foster C., ClarkH.B., RossM.E., IadecolaC.Inducible NOS expression in human cerebral infarcts. Acta Neuropathol 1999;97(3):215-220.
29. Geller D.A., Lowenstein C.J., Shapiro R.A. et al. Molecular cloning and expression of inducible nitric oxide synthase from human hepatocytes. Proc Natl Acad Sci 1993;90:3491-3495.
30. Giardino I., Fard A.K., Hatchell D.L. et al. Aminoguanidine inhibits reactive oxygen species formation, lipid peroxidation, and oxidant-induced apoptosis. Diabetes 1998;47:1114-1120.
31. Gomez L.M., Anaya J.M., Vilchez J.R., et al. A polymorphism in the inducible synthase gene is associated with tuberculosis. Tuberculosis 2007;87(4):288-94.
32. Granger C., Dewis L.S., Peters M.C. et al. Stroke rehabilitation: analysis of repeated Barthel index measures. Arch Phys Med Rehabil. 1979;60:14-17.
33. Gretarsdottir S., Thorleifson G., Reynisdottir S.T. et al. The gene encoding phosphodiesterase 4D confers risk of ischemic stroke. Nat Genet 2003;35:131-138.
34. Guix F.X., Uribesalgo I., Coma M., Munoz F.J. The physiology and pathophysiology of nitric oxide in the brain. Prog Neurobiol 2005;76:126-152.
35. Ha H.C., Snyder S.H. Poly(ADP-ribose) polymerase is a mediator of necrotic cell death by ATP depletion. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96:13978-13982.
36. Hara H., HuangPL., PanahianN. et al. Reduced brain edema and infarction volume in mice lacking the neuronal isoform of nitric oxide synthase after transient MCA occlusion. J Cereb Blood Flow Metab 1996;16(4):605-611.
37. Hassa P.O., Hottiger M.O. The functional role of poly(ADP-ribose) polymerase 1 as novel coactivator of NF-kB in inflammatory disorders. Cell Mol Life Sci 2002;59:1534-1553.
38. Hassan A., Gormley K., O'Sullivan M. et al. Endothelial nitric oxide gene haplotypes and risk of cerebral small-vessel disease. Stroke 2004;35(3):654-659.
39. Hassan A., Markus H. Genetics and ischemic stroke. Brain 2000; 123:17841812.
40. Hegele R.A., Dichgans M. Update in genetics of stroke and cerebrovascular disease 2007. Stroke 2008;39:252-254.
41. Helgadottir A., Gretasdottir S., St Clair D., et al. Association between the gene encoding 5-lipoxygenase activating protein and stroke in a Scottish population. Am J Num Genet 2005;76:505-509.
42. Helgadottir A., Manolescu A., Thorleifson G. et al. The gene encoding 5-lipoxygenase activating protein confers risk of myocardial infarction and stroke. Nat Genet 2003;36:233-239.
43. Hingorami A.D., Liang C.F., Fatibene J. et al. A common variant of the endothelial nitric oxide synthase (Glu298~>Asp) is a major risk factor for coronary artery disease in the UK. Circulation 1999; 100(14): 1515-1520.
44. Hobbs M.R., Udhayakumar V., Levesque M.C. et al. A new promoter polymorphism associated with increased nitric oxide production and protection from severe malaria in Tanzanian and Kenyan children. Lancet 2002;360(9344): 1468-1475.
45. Hogg N., Kalyanaraman B., Joseph J.et al. Inhibition of low density lipoprotein oxidation by NO. FEBS Lett 1993;334(2):170-174.
46. Holla L.I., Stejskalova A., Znojil V., Vasku A. Analysis of the inducible nitric oxide synthase gene polymorphisms in Czech patients with atopic diseases. Clin Exp Allergy 2006;36(12): 1592-1601.
47. Hou L., Osei-Hyiaman D.,Yu H. et al. Association of a 27-bp repeat polymorphism in ecNOS gene with ischemic stroke in Chinese patients. Neurology 2001;56(4):490-496.
48. Hu J., FerreiraA., VanEldikL.J.SlOOp induces neuronal death through nitric oxide release from astrocytes. J Neurochem 1997;69(6):2294-2301.
49. Huang Z., Huang PL., Panahian N.et al. Effects of cerebral ischemia in ice deficient in neuronal nitric oxide synthase. Science 1994;265:1883-1885.
50. Iadecola C., Foster C., Nogawa S. et al. Cyclooxygenase-2 immunoreactivity in the human brain following cerebral ischemia. Acta Neuropathol(Berl) 1999;98:9-14.
51. Iadecola C., Niwa K., Nogawa S. et al. Reduced susceptibility to ischemic brain injury and N-methyl-D-aspartate-mediated neurotoxity in COX-2-deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA 2001;98:1294-1299.
52. Iadecola C., Ross M.E. Molecular pathology of cerebral ischemia: delayed gene expression and strategies for neuroprotection. Ann NY Acad Sci. 1997;835:203-217.
53. Iadecola C., Zhang F., Casey R. et al. Delayed reduction of ischemic brain injury and neurological deficits in mice lacking the inducible nitric oxide synthase gene. J Neurosci 1997;17(23):9157-9164.
54. Iadecola C., Zhang F., Xu S. et al. iNOS expression in brain following cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab 1995;15(3):378-384.
55. Iadecola C., Zhang F., Xu X. Inhibition of iNOS ameliorates cerebral ischemic damage. Am J Physiol. 1995;268:R286-R292.
56. Ichihara S., Yamada Y., Fujimura T. et al. Association of a polymorphism of the endothelial constitutive nitric oxide synthase gene with myocardial infarction in the Japanese population. Am J Cardiol 1998;81(l):83-86.
57. Johannesen J., Pie A., Pociot F. et al. Linkage of the human inducible nitric oxide synthase gene to type 1 diabetes. J Clin Endocrin Metab 2001 ;86(6):2792-2796.
58. Joshi M.S., Ferguson T.B. Jr., Han T.H. et al. Nitric oxide is consumed, rather than conserved, by reaction with oxyhemoglobin under physiological conditions. Proc Natl Acad Sci USA 2002;99:10341-10346.
59. Kaise M., Miwa J., Suzuki N. et al. Inducible nitric oxide synthase gene promoter polymorphism is associated with increased gastric mRNA expression of iNOS and increased risk of gastric carcinoma. Eur J Gastroenterol Hepatol 2007;19(2):139-145.
60. Kawaguchi Y., Tochimoto A., Hara M. et al. NOS2 polymorphisms associated with the susceptibility to pulmonary arterial hypertension with systemic sclerosis: contribution to the transcriptional activity. Arthritis Res Ther 2006;8(4):R104.
61. Kim Y.M, Talanian R.V, Billiar T.R. Nitric oxide inhibits apoptosis by preventing increases in caspase-3 like activity via two distinct mechanisms. J Biol Chem 1997;272:31138-31148.
62. Kleinert H., Wallerath T., Euchenhofer C. et al. Estrogens increase transcription of the human eNOS gene. Hypertension. 1998;31:582-588.
63. Kun J.F., Mordmuller B., Perkins D,J. et al. Nitric oxide synthase G954C, increased NO production and protection against malaria. J Infect Dis 2001;184:330-336.
64. Lipton P. Ischemic cell death in brain neurons. Physiol Rev 1999;79: 1431— 1568.
65. Liu K., Li Q., Zhang L., Zheng X. The dynamic detection of NO during stroke and reperfusion in vivo. Brain Inj 2009;23(5):450-8.
66. LiuY.,LaaksoM.P., KaronenJ.O. etal. Apolipoprotein E polymorphism and acute ischemic stroke: a diffusion- and perfusion-weighted magnetic resonance imaging study. JCerebBloodFlowMetab. 2002;22:1336-1342.
67. LiuY.,NuutinenJ., LaaksoM.P. etal. ApoE polymorphism and acute stroke: a study with diffusion- and perfusion-weighted MRI and MR angiography. ActaNeurolScand. 2006; 114(5):323-328.
68. Lohmussaar E., Gschwendtner A., Mueller J.C. et al. ALOX5AP gene and PDE4D gene in a central European population of stroke patients. Stroke 2005;36:731-736.
69. Loihl A.K., Campbell I., Murphy S. The expression of NOS-2 following permanent focal ischemia and the role of NO in infarct generation in male, female and NOS-2 deficient mice. Brain Res. 1999;830:155-164.
70. Mandir A.S., Poitras M.F., Berliner A.R. et al. NMDA but not non-NMDA excitotoxicity is mediated by Poly(ADP-ribose) polymerase.J Neurosci 2000;20:8005-8010.
71. Markus H.S. Ruigrok Y, Ali N, Powell J.F. Endothelial nitric oxide synthase exon 7 polymorphism, ischemic cerebrovascular disease, and carotid atheroma. Stroke 1998;29:1908-1911.
72. Martin M.C., Martinez A., Mendoza J.L. et al. Influence of the NOS2A on inflammatory bowel disease susceptibility. Immunogenetics 2007;59(11):833-837.
73. MatarinM, Simon-SanchezJ, Fung H.C. Structural genomic variation in ischemic stroke. Neurogenetics. 2008 May;9(2):101-8.
74. Meschia J.F., Brott T.G., Brown R.D. Jr. et al. Phosphodiesterase 4D and 5-lipoxygenase activating protein in ischemic stroke. Ann Neurol 2005;58:351-361.
75. Morris B.J., Glenn C.L., Wilcken D.E., Zhang X.L. Influence of an inducible nitric oxide synthase promoter variant on clinical variables in patients with coronary artery disease. Clin Sci (London) 2001;100(5):551-556.
76. Morris B.J., Markus A., Glenn C.L. et al. Association of a functional inducible niric oxide synthase promoter variant with complications in type 2 diabetes. J Mol Med 2002;80(2):96-104.
77. Murphy S. Production of nitric oxide by glial cells. Glia 2000;29:1-14.
78. MyllykangasL.,PolvikovskiT., SulkavaR. etal. Association of lipoproteinlipase Ser477Ter polymorphism with brain infarction: a population-based neuropathological study. AnnMed. 2001;33(7):486-492.
79. Nakagami H., Ikeda U., Maeda Y. et al. Coronary artery disease and endothelial nitric oxide synthase and angiotensin-converting enzyme gene polymorphisms. J Thromb Thrombolysis 1999;8(3):191-195.
80. Nanetti L., Taffi R., Vignini A. et al. Reactive oxygen species plasmatic levels in ischemic stroke. Mol Cell Biochem 2007;303(1-2): 19-25.
81. Nilsson-Ardnor S., Wiklund P.G., Lindgren P. et al. Linkage of ischemic stroke to the PDE4D region on 5q in a Swedish population.Stroke 2005 Aug;36(8): 1666-1671.
82. Niwa M., Inao S., Takayasu M. et al. Time course of expression of three nitric oxide synthase isoforms after transient middle cerebral artery occlusion in rats. Neurol Med Chir (Tokyo). 2001;41(2):63-72.
83. Nogawa S., Foster C., Zhang F. et al. Interaction between inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 after cerebral idchemia. Proc Natl AcadSci 1998;95( 18): 10966-10971.
84. Nogawa S., Zhang F., Ross ME. et al. Cyclo-oxygenase-2 gene expression in neurons contributes to ischemic brain damage. J Neurosci 1997; 17:27462755.
85. Nurmi A., Lindsberg P.J., Koistinaho M., et al. Nuclear factor-kappa B contributes to infarction after permanent focal ischemia. Stroke 2004;35:987-991.
86. Ou P., Wolff S.P. Aminoguanidine: a drug proposed for prophylaxis in diabetes inhibits catalase and generates hydrogen peroxide in vitro.Biochem Pharmacol 1993;46:1139-1144.
87. Park E-M., Cho S., Frys K.A. et al. Inducible NO-synthase contributes to gender differences in ischemic brain injury. J Cereb Blood Flow Metab 2006;26:392-401.
88. Park E-M., Sunghee C., Kelly F. et al. Interaction between inducible nitric oxide synthase and poly(ADP-ribose)polymerase in focal ischemic brai injury. Stroke 2004;35:2896-2901.
89. Parmentier S., Bohme G.A., Lerouet D. et al. Selective inhibition of inducible nitric oxide synthase prevents ischemic brain injury. Br J Pharmacol 1999;127(2):546-552.
90. Poirier O., Mao C., Mallet C. et al. Polymorphisms of the endothelial nitric oxide synthase gene no consistent association with myocardial infarction in the ECTIM study. Eur J Clin Invest 1999;29(4):284-290.
91. Sairanen T., Ristimaki A., Karajalainen-Lindsberg M.L. et al. Cyclooxygenase-2 is induced globally in infarcted human brain. Ann Neurol 1998;43:738-747.
92. Samdani A.F., Dawson T.M., Dawson V.L. Nitric oxide synthase in models of focal ischemia. Stroke 1997;28(6): 1283-1288.
93. Sugimoto K., Iadecola C. Delayed effect of administration of COX-2 inhibitor in mice with acute cerebral ischemia. Brain Res 2003;960:273-276.
94. Sugimoto K., Iadecola C. Effects of aminoguanidine on cerebral ischemia in mice: comparison between mice with and without iNOS gene. Neurosci Lett 2002. 331(l):25-28.
95. Szabo C. Physiological and pathophysiological roles of nitric oxide in the central nervous system. Brain Res Bull 1996;41:131-141.
96. Taffi R., Nanetti L., Mazzanti L. et al. Plasma levels of nitric oxide and stroke outcome. J Neurol 2008;255(l):94-98.
97. Takahashi K., Greenbrg J.H., Jackson P. et al. Neuroprotective effects of inhibiting poly(ADP-ribose) synthetase on focal cerebral ischemia in rats. J Cereb Blood Flow Metab 1997;3:1137-1142.
98. Tuna M., Yilmaz D.M., Erman T., et al. Effect of neutralization of rat interleukin 6 bioactivity on inducible nitric oxide synthase up-regulation and cerebral ischemic damage. Neurol Res 2008; Nov 25 Epub ahead of print.
99. Vakili A., Zahedi-Khorasani M. Effect of aminoguanidine on postishemic damage in rodent model of stroke. Pak J Pharm Sei 2008;21(1):24-28.
100. Wang X.L., Mahaney M.C., Sim A.S. et al. Genetic contribution of the endothelial constitutive nitric oxide synthase gene to plasma nitric oxide levels. Arterioscler Thromb Vase Biol 1997;17:3147-3153.
101. Wang X.L.,Sim A.S., Badenhop R.F. et al. A smoking-dependent risk of coronary artery disease associated with a polymorphism of the endothelial nitric oxide synthase gene. Nat Med 1996;1:41-45.
102. Warpeha K.M., Xu M., Liu L. et al. Genotyping and functional analysis of a polymorphic (CCTTT)n repeat of NOS2A in diabetic retinopathy. FASEB J. 1999;13:1825-32.
103. White B.C., Sullivan J.M., De Gracia D.J. et al. Brain ischemia and reperfiision: molecular mechanisms of neuronal injury. J Neurol Sei 2000;179:1-33.
104. Willmot M., Gibson C., Gray L. et al. Nitric oxide synthase inhibitors in experimental ischemic stroke and their effects on infarct size and cerebral blood flow: a systematic review. Free Radic Biol Med 2005;39(3):412-425.
105. Yahashi Y., Kario K., Shimada K., Matsuo M. The 27-bp repeat polymorphism in intron 4 of the endothelial cell nitric oxide synthase gene and ischemic stroke in a Japanese population.Blood Coagul Fibrinolysis. 1998;9(5):405-409.
106. Yildiz G., Demiiyurek A.T., Sahin-Erdemli I. et al. Comparison of antioxidant activities of aminoguanidine, methylguanidine and guanidine by luminol-enhanced chemiluminescence. Br J Pharmacol 1998;124:905-910.
107. Yu S.W., Wang H., Poitras M.F. et al. Mediation of poly(ADP-ribose) polymerase-1-dependent cell death by apoptosis-inducing factor. Science 2002;297:259-263.
108. Zee R.Y., Cheng S., Hegener H.H. et al., Genetic variants of ALOX5AP, and risk of incident myocardial infarction and ischemic stroke: a nested case-control approach. Stroke. 2006;37(8):2007-2011.
109. Zhao X., Haensel C., Araki E. et al. Gene-dosing effect and persistence of reduction in ischemic brain injury in mice lacking inducible nitric oxide synthase. Brain Res 2000;872:215-218.
110. Zhu D.Y., Liu S.H., Sun H.S. et al. Expression of inducible nitric oxide synthase after focal cerebral ischemia stimulates neurogenesis in the adult rodent dentate gyrus. J Neurosci 2003;23:223-229.