Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Роль полиморфизмов генов репарации ДНК в формировании предрасположенности к раку молочной железы

Рак молочной железы (РМЖ) занимает ведущее место в структуре онкологической заболеваемости у женщин, составляя 1/5 от всех новых случаев злокачественных новообразований. Число пациенток с диагнозом РМЖ, как абсолютное, так и относительное, сохраняет устойчивую тенденцию к возрастанию в России и странах Запада [Imyanitov E.N., Hanson К.Р., 2004]. Несмотря на некоторые позитивные сдвиги в вопросах ранней диагностики РМЖ, благодаря более широкому применению скрининговых обследований, в частности, рутинной маммографии, весьма пессимистическим остается прогноз для жизни при установленном диагнозе РМЖ. По данным НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова, 76% больных РМЖ, прослеженных свыше 20 лет, умерли от «основного» заболевания [Моисеенко В.М. и соавт., 1997].

Однако высокая социальная значимость РМЖ является не единственной причиной актуальности его изучения. Вопросы этиологии и патогенеза РМЖ во многом остаются неясными. Злокачественные опухоли молочной железы обладают высокой степенью клинической, морфологической и биологической гетерогенности. При генеалогическом анализе, в семьях пациентов нередко прослеживается тенденция наследования предрасположенности к РМЖ, иногда заболевание встречается в виде так называемых «семейных форм» [Lynch Н.Т. et al., 1978]. Меры, направленные на повышение эффективности профилактики РМЖ и выявлении заболевания на ранних стадиях требуют дальнейшего усовершенствования.

Демографические изменения в человеческой популяции, характеризующиеся увеличением пропорции пожилых людей в большинстве развитых и развивающихся стран мира, еще более обостряют проблему. Риск развития РМЖ, как и многих других злокачественных новообразований, напрямую зависит от возраста индивида. Так, среди женщин старше 65 лет этот риск в 6,5 раз больше, чем на всем протяжении жизни до 65 лет, и в 150 раз выше, чем у женщин до 30 лет [Imyanitov E.N., Hanson К.Р., 2004]. Помимо возрастания риска развития РМЖ, связанного с общим увеличением продолжительности жизни, в последние десятилетия были более четко обозначены и другие факторы предрасположенности к развитию данного новообразования.

Несмотря на многообразие выявленных факторов риска РМЖ, все они в настоящее время могут быть выделены в две основных категории: избыточная экспозиция к эстрогенам и нарушения в системе поддержания стабильности клеточного генома [Singletary S.E., 2003].

Пролиферативный эффект эстрогенов на клетки молочной железы известен несколько десятилетий. Кроме того, как было показано относительно недавно, в основе действия эстрогенов играет роль не только механизм промоции на клетки опухоли: некоторые метаболиты эстрогенов способны оказывать прямое повреждающее действие на ДНК, то есть выступать в роли инициаторов развития злокачественной трансформации [ZhuB.T., Conney А.Н., 1998].

Биологические механизмы, направленные на поддержание стабильности генома клетки и их связь с развитием злокачественных опухолей молочной железы в последнее время изучаются наиболее активно. Подобный интерес обусловлен следующими основными причинами: во-первых, все изученные к настоящему времени гены предрасположенности к РМЖ (BRCA1, BRCA2, ATM, СНЕК2) участвуют в механизмах распознавания или репарации повреждений ДНК; во-вторых, в многочисленных исследованиях достоверно показана связь между риском РМЖ и конституциональной хромосомной нестабильностью [Iau Р.Т. et al., 2001; Natarajan А.Т., 2002; Colleu-Durel S. et al., 2004; Imyanitov E.N. et al., 2004].

В этой связи представляется обоснованным изучение генетических вариантов среди генов, отвечающих за процессы распознавания и репарации двунитевых разрывов в молекулах ДНК. Процесс повреждения молекулы ДНК, в результате которого образуются двунитевые разрывы, по современным представлениям, лежит в основе возникновения хромосомных аберраций. Восстановление двунитевых разрывов ДНК в клетке происходит благодаря системе белков репарации, осуществляющих гомологичную и негомологичную рекомбинацию [Hoeijmakers J.H.J., 2001; Elliott В., Jasin М., 2002]. Генетически детерминированная гетерогенность данных белков, предположительно, может влиять на эффективность их работы, что приводит к более быстрому накоплению случайных мутаций по типу делеций или перестроек участков хромосом. Вероятно, некоторое увеличение груза аберраций привносят также ошибки ДНК-полимераз в процессе репликации ДНК [Islas A.L., 1998; Mahajan K.N., 2002].

Выводы об онкологической значимости какого-либо генетического варианта делаются, как правило, на основании сравнения его частоты встречаемости в группах пациентов и здоровых доноров. При этом контрольные группы чаще всего формируются из числа посетителей пунктов переливания крови, т.е. из лиц среднего возраста. Хотя подобный подход является наиболее простым с организационной точки зрения, его корректность в отношении онкологической патологии вызывает определенные возражения. Как упоминалось выше, рак является заболеванием преимущественно людей пожилого возраста, вероятность его возникновения в течение жизни составляет около

40% [Chu K.C. et al., 1996]. Таким образом, средневозрастные контрольные группы почти наполовину состоят из потенциальных онкологических пациентов, что может серьезно осложнять поиск онко-ассоциированных полиморфизмов. В то же время, лица, достигшие преклонного возраста без какой-либо злокачественной патологии, могут быть уже отнесены не к стандартной, а к онкологически-толерантной категории [Того А.В. и соавт., 1999]. С другой стороны, справедливо ожидать, что пациенты с необычно ранним началом заболевания или с первично-множественными опухолями представляют собой «крайний» случай повышенного онкологического риска, что нередко сочетается с отягощенным семейным анамнезом [Narod S.A., 1994]. В связи с этим представляется перспективным подход к исследованию вероятных онко-ассоциированных генетических вариантов, основанный на сравнении частот их встречаемости как в «стандартных» группах (пациенты - доноры), так и в «крайних» группах высокого и низкого риска развития злокачественной патологии (пациенты с первично-множественными, либо ранними РМЖ и пожилые онкологически здоровые доноры). Подобный подход к поиску онко-ассоциированных генетических маркеров привлекателен еще и тем, что позволяет повысить статистическую достоверность результатов без значительного увеличения размеров тестируемых групп.

В настоящей работе представлены результаты поиска вероятных кандидатов на роль генетических маркеров высокого риска развития РМЖ среди генов, отвечающих за репарацию двунитевых разрывов ДНК.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы является изучение структурных вариантов генов, осуществляющих рекомбинационную репарацию, и оценка их влияния на формирование риска рака молочной железы у человека.

В связи с этим поставлены следующие задачи:

1) Идентифицировать потенциально-значимые полиморфные варианты генов, осуществляющих рекомбинационную репарацию, пользуясь доступными в сети Internet базами данных (NCBI, GeneCard, CancerGenes, HGMD), а также с привлечением сведений, опубликованных в специализированных периодических изданиях;

2) Сравнить частоту выбранных полиморфизмов в «крайних» группах онкологического риска (группа пациенток с билатеральным РМЖ и группа пожилых онкологически здоровых женщин);

3) Выявить в группах крайнего онкологического риска и толерантности генетические варианты с наиболее различающейся в указанных группах частотой и провести их анализ посредством «классического» молекулярно-эпидемиологического исследования с привлечением групп здоровых доноров среднего возраста и неселективных случаев РМЖ;

4) Изучить потерю интактных аллелей в клетках опухоли, как одного из механизмов злокачественной прогрессии, используя ДНК, выделенную из карцином молочной железы носителей мутации.

Научная новизна полученных результатов.

Впервые изучена на группе пациенток с диагнозом «рак молочной железы» и здоровых донорах, проживающих преимущественно в Северо-Западном регионе России, встречаемость полиморфных вариантов в генах репарации двунитевых повреждений ДНК (RAD50, MRE11A, NBS1). Показано, что 0,6% здоровых женщин среднего возраста (18-45 лет) Северо-Запада России являются носителями наследственной мутации NBS1 657del5. Гетерозиготное носительство NBS1 657del5 ассоциировано с повышенным риском развития РМЖ, причем среди больных, носителей указанной мутации, отмечается тенденция к более раннему, по сравнению с «не-носителями», началу заболевания. Не обнаружено ассоциации между носительством мутации NBS1 657del5 и какими-либо другими клинико-морфологическими особенностями РМЖ. Установлено, что в опухолях молочной железы у носителей данной мутации наблюдаются потери гетерозиготности в области мутации, при этом делеции может подвергаться как интактный, так и мутантный аллель. Не выявлено связи между распространенным полиморфизмом reHaNBSl E185Q (популяционная частота - 37%) и предрасположенностью к РМЖ. Поскольку большинство протестированных в ходе работы генетических вариантов представленны в изученной группе как мономорфные (частота менее 0,005), это не позволяет в настоящее время определенно ответить на вопрос о взаимосвязи таких полиморфизмов с предрасположенностью к РМЖ.

Практическая значимость.

Диссертация имеет научно-теоретический характер.

Апробация работы.

Результаты работы были представлены на Конференции по фундаментальной онкологии (15 апреля 2005 г., Санкт-Петербург, Россия), Российско-Американской конференции по биотехнологии (26-28 мая 2005 г., Санкт-Петербург, Россия) и на научной конференции лаборатории молекулярной онкологии, лаборатории онкоэкологии, лаборатории канцерогенеза и старения ГУН НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова Росздрава (20 апреля 2006 г., Санкт-Петербург, Россия).

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 77 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав материалов и методов, результатов исследований, обсуждения полученных данных и выводов. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 8 рисунками. Библиографический указатель включает 172 публикации на русском и английском языках.

выводы

1. Встречаемость мутации NBS1 657del5 среди здоровых женщин среднего возраста (18-45 лет) Северо-Запада России составляет 0,6%.

2. Гетерозиготное носительство мутации NBS1 657del5 ассоциировано с повышенным риском развития рака молочной железы (х-квадрат тест: р = 0,046).

3. У пациенток с диагнозом РМЖ и БРМЖ, являющихся носителями мутации NBS1 657del5, отмечается тенденция к более раннему началу заболевания.

4. Развитие РМЖ у носителей мутации NBS1 657del5 не связано с утратой интактного аллеля гена NBS1.