Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Роль полиморфизмов генов апоптоза в формировании предрасположенности к раку молочной железы и раку легкого

На правах рукописи

УЛЫБИНА Юлия Михайловна

РОЛЬ ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНОВ АПОПТОЗА В ФОРМИРОВАНИИ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К РАКУ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И

РАКУ ЛЕГКОГО

14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 - тз

Санкт-Петербург 2008

003452457

Работа выполнена в ФГУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова Росмедтехнологий»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Имянитов Евгений Наумович Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Забежинский Марк Абрамович доктор биологических наук, профессор Комов Вадим Петрович

Ведущая организация: ФГУ «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи», г. Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится «/О» S'f 2008 г. в «_» часов на

заседании диссертационного совета Д 208.052.01 при ФГУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова Росмедтехнологий» по адресу: 197758, Санкт-Петербург, п. Песочный-2, ул. Ленинградская д.68.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова Росмедтехнологий» (197758, Санкт-Петербург, п. Песочный-2, ул. Ленинградская д.68) и на сайте (www.niioncologii.ru)

Автореферат разослан « ¿3» .Оит^г^АЛгш г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Р. В. Орлова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Индивидуальная предрасположенность к возникновению опухолей может быть обусловлена нормальными вариациями генома - генетическими полиморфизмами. Например, было показано, что риск возникновения карцином легкого, мочевого пузыря и толстой кишки увеличивается в случае носителъетва неблагоприятного сочетания полиморфизмов генов, вовлеченных в метаболизм табачных смол (Schwartz A G. et al, 2007, Garcia-Closas M et al, 2005; Hung R J. et al, 2003). Получено немало данных об аллельных вариантах генов стероидного метаболизма, принимающих участие в формировании риска опухолей репродуктивной системы ( Verla-Tebit Е et al., 2005; Berstein L M. et al, 2004, Gulyaeva L.F et al., 2008). Возможная ассоциация между полиморфизмами генов репарации и онкологическим риском также активно изучалась в течение последних лет (Dufloth RM. et al, 2008; Fontana L et al., 2008; Huang M Y. et al, 2008).

Также заслуживают пристального внимания гены, продукты которых принимают участие в апоптотическом ответе клетки на повреждение ДНК. В норме, когда изменения в химической структуре ДНК не могут быть устранены системой репарации, запускается программа клеточного суицида - апоптоза. Однако интенсивность этих процессов может колебаться в достаточно широком диапазоне, что во многом определяется генетической конституцией индивидуума. Таким образом, пониженная эффективность работы апоптотических каскадов может привести к накоплению в организме клеток, содержащих мутации в онкогенах или генах-супрессорах, что, безусловно, сопряжено с увеличением индивидуального онкологического риска. В пользу высказанного предположения свидетельствуют результаты некоторых фенотипических исследований, продемонстрировавших связь между сниженной способностью к апоптозу и повышенным онкологическим риском (Wang L Е et al, 2003; Camplejohn R.S et al, 2001; Zhao H. et al, 2001, Barber J В et al, 2000). Появились отдельные работы, касающиеся встречаемости полиморфизмов генов апоптоза в группах больных раком легкого и раком молочной железы (Frank В et al, 2005; Zhang X. et al, 2005; MaePherson G. et al, 2004; Wang LE. et al, 2003; Balkwill F, 2002). Однако систематического исследования, посвященного этой проблеме, до сих пор не проводилось.

Объективные сложности, возникающие при поиске низкопенентратных факторов риска развития заболеваний, в том числе и онкологических, связаны в первую очередь со слабостью искомых ассоциаций. Современные требования к улучшению эффективности молекулярно-эпидемиологических исследований направлены в основном на увеличение размеров используемых выборок и максимальное соответствие между группами пациентов и контролем по всем общим для них параметрам. Однако подобный подход также имеет свои ограничения, которые напрямую связаны с размерами существующих на сегодняшний день коллекций ДНК, а также с доступностью технологий, позволяющих проводить масштабное генотипирование (lmyamtov EN., 2008). Таким образом, возникает необходимость в разработке альтернативных путей поиска генетических полиморфизмов, повышающих риск развития онкологических заболеваний.

В настоящей работе был использован оригинальный подход к формированию групп пациентов и контроля. Вместо использования случайных выборок, мы оценивали встречаемость изучаемых полиморфизмов в группах, характеризующихся повышенной предрасположенностью и толерантностью к развитию онкологических заболеваний. Отбор пациенток в группу РМЖ производился с учетом наличия следующих признаков: раннее начало заболевания, наличие больных родственников и первично-множественная форма РМЖ. Условий для отбора пациентов с раком легкого в исследуемую выборку было два: раннее начало заболевания и тот факт, что появление опухоли произошло на фоне низкого потребления табачных изделий или у некурящих. В качестве контрольных групп были использованы пожилые онкологически здоровые индивидуумы (женщины и мужчины-курильщики 75 лет и старше), которые, на наш взгляд, обладают повышенной резистентностью к возникновению злокачественных новообразований. Для полиморфизмов, отобранных на этом этапе работе, было проведено традиционное молекулярно-эпидемиологическое исследование.

На основе описанного выше подхода был проведен двухстадийный систематический анализ кодирующих несинонимичных аллельных вариантов генов-участников процесса программируемой клеточной гибели, и изучено их влияние на риск развития рака молочной железы и рака легкого.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является оценка роли аллельных вариантов генов апоптоза в формировании риска рака молочной железы и рака легкого.

В связи с этим поставлены следующие задачи:

1) С помощью баз данных интернет-ресурса National Center for Biotechnology Information (NCBI) отобрать все кодирующие несинонимичные полиморфизмы основных генов-участников апоптоза, популяционная частота которых была ранее верифицирована и составляет не менее 1%.

2) Проанализировать и сравнить распределение частот генотипов и аллелей изучаемых генов в группах повышенного онкологического риска (пациентки, имеющие признаки наследственного РМЖ) и онкологической толерантности (пожилые онкологически здоровые женщины).

3) Проанализировать и сравнить распределение частот генотипов и аллелей изучаемых генов в группах повышенного риска рака легкого (малокурящие или некурящие пациенты с РЛ) и онкологической толерантности (пожилые онкологически здоровые мужчины-курильщики).

4) Выявить генетические варианты с достоверно различающейся частотой в группе экстремального онкологического риска и в группе толерантности и провести их сравнительный анализ в молекулярно-эпидемиологическом исследовании с традиционным подходом к формированию групп «случай» и «контроль».

Научная новизна полученных результатов

В настоящей работе впервые было проведено систематическое молекулярно-эпидемиологическое исследование полиморфизмов генов апоптоза, направленное на выявление низкопенетрантных генетических факторов, влияющих на предрасположенность к онкологическим заболеваниям, в частности, к раку молочной железы и раку легкого.

Практическая значимость работы

Проведенное исследование генного полиморфизма вносит вклад в разработку ДНК-тестов, направленных на выявление групп повышенного онкологического риска. Полученные значения встречаемости изученных полиморфизмов могут быть в дальнейшем использованы в молекулярно-эпидемиологических исследованиях, посвященных изучению роли апоптоза как в патогенезе рака, так и других заболеваний

Основные положения, выносимые на защиту

1) Альтернативой традиционному молекулярно-эпидемиологическому исследованию может служить использованный в работе оригинальный подход к формированию групп онкологических пациентов и контроля, характеризующихся, соответственно, повышенной предрасположенностью и толерантностью к развитию онкологических заболеваний.

2) Более трети всех полиморфных вариантов, выбранных с помощью базы Entrez SNP интернет-ресурса National Center for Biotechnology Information (NCBI) на основании верифицированной частоты, не были обнаружены в изученной популяции.

3) Не выявлена ассоциация между исследованными полиморфизмами генов апоптоза и риском развития рака легкого или рака молочной железы, что ставит под сомнение предположение о вовлеченности генетически обусловленного полиморфизма апоптотических механизмов в онкологическую предрасположенность.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на отечественных и международных научных форумах: на научно-практической конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии» (21-23 сентября 2006, Иркутск, Россия), на конференции INTAS «Genomics & Proteomics Workshop 2007» (6-8 September 2007, Киев, Украина), на научной межлабораторной конференции НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова (12 октября 2007, Санкт-Петербург, Россия) и конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2008» (18 апреля 2008, Санкт-Петербург, Россия).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 125 страницах и состоит из введения, обзора литературы, глав материалов и методов, результатов исследований, обсуждения полученных данных и выводов. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 15 рисунками. Библиографический указатель включает 252 публикации, в том числе 6 отечественных и 246 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Группы пациентов и контролен

Формирование групп для исследования проводилось путем отбора образцов по заданным критериям из постоянно пополняющихся коллекций (банков) ДНК, выделенной из лимфоцитов периферической крови онкологических больных и здоровых индивидуумов.

Для первого этапа исследования были отобраны образцы ДНК пациентов и здоровых людей, составившие следующие четыре группы: пациентки с РМЖ и пожилые женщины без онкологических заболеваний в анамнезе, пациенты с раком легкого и пожилые онкологически здоровые мужчины-курильщики. Все больные проходили лечение в НИИ онкологии им. проф. Н.Н Петрова, образцы собирались в период с 1996 по 2005 год.

Группа больных РМЖ была представлена 121 случаем. Средний возраст женщин составил 45,3 года (возрастной интервал 25 - 78 лет). Отбор пациенток производился с учетом наличия «отягощающих» признаков, а именно: раннее начало заболевания (диагноз был поставлен до 40 лет), наличие больных родственников (мать или сестра с РМЖ или раком яичника), и первично-множественная форма РМЖ.

Группа больных раком легкого составила 111 человек. 94 из них могут быть охарактеризованы как курильщики с относительно низким потреблением табачной продукции (средний стаж- 30 «пачко-лет»*, в интервале: 10 - 40 «пачко-лет»), 17 пациентов были некурящими. Средний возраст больных 54,3 года (возрастной интервал 32 - 64 лет).

Пожилые женщины (ПЖ) в количестве 142 человек (средний возраст 80,2 года, возрастной интервал 75-91 год) и мужчины (ПМ) - 110 человек (средний возраст 79,2 года, возрастной интервал 75 - 89 лет) были отобраны из коллекции онкологически здоровых индивидуумов. При выборе мы руководствовались критериями возраста - 75 лет и старше, - и статуса курения, в случае контрольной группы для исследования по раку легкого все 110 пожилых онкологически здоровых мужчин были курильщиками, минимальное потребление составляло 30 «пачко-лет», максимальное - 126 «пачко- лет». Отсутствие у них онкологических заболеваний было подтверждено как данными анамнеза, так и результатами врачебного осмотра. Образцы коллекционировались в период с 1998 по 2005 год.

Поскольку на первом этапе различия в распределении генотипов исследуемых полиморфизмов были обнаружены только между группами больных раком легкого и пожилыми онкологически здоровыми мужчинами-курильщиками, мы не проводили расширенного исследования для пациенток с РМЖ, тогда как работа по исследованию пациентов с раком легкого была продолжена На втором этапе для проведения традиционного молекулярно-эпидемиологического исследования была использована вся коллекция пациентов с раком легкого — 351 человек (средний возраст 60,5 года, возрастной интервал 30 - 84 лет), 48 из них были некурящими. Средний стаж курения, рассчитанный для 303 курящих пациентов, составил 41 «пачко-год», при минимальном потреблении 10 «пачко-лет», максимальном - 150 «пачко- лет».

Контрольная группа, использованная на втором этапе исследования, состояла из 538 онкологически здоровых человек (средний возраст 61,0 года, возрастной интервал 32 — 84 лет), и была подобрана с максимально возможным соответствием по возрасту, полу и статусу курения группе пациентов.

При изучении полиморфизма Н15302Азр гена Саэр8 возникла необходимость в дополнительном наборе образцов ДНК больных раком легкого без курения в анамнезе.

* - Интенсивность курения количественно выражали в «пачко - годах» (1 «пачко -год» эквивалентен выкуриванию 20 сигарет в день в течение года и вычисляется как количество пачек сигарет, выкуриваемых в день, умноженное на число лет курения).

Эта коллекция была сформирована непосредственно во время проведения нашего исследования путем изучения материалов в архивах НИИ онкологии им. H.H. Петрова и последующего выделения ДНК из патоморфологических образцов нормальных тканей больных раком легкого.

Критерии выбора полиморфных генетических вариантов

Выбор полиморфизмов проводился с помощью базы данных (http //www ncbi nlm ruh gov/entrez/querv fcgi9db~PubMed) Интернет-ресурса -Entrez SNP. Выбор генетических вариантов, потенциально значимых для последующего популяционного молекулярно-генетического изучения, был произведен с учетом следующих критериев:

• изменение должно затрагивать кодирующую область гена;

• замена должна быть смысловой (nonsynonymous substitution), то есть вариабельность на уровне ДНК приводит к изменению первичной структуры полипептида;

• данные о полиморфизме получены при изучении последовательности ДНК/кДНК, выделенной из здоровых человеческих клеток;

• заявленная популяционная частота полиморфизма определена и составляет не менее 1%.

Включение каждого конкретного генетического варианта в исследование определялось совокупностью перечисленных критериев.

Выделение ДНК

Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови

Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови проводилось посредством модифицированного соль-хлороформного метода (Müllenbach R. et al, 1989). Эритроциты лизировали посредством 3-кратного разведения крови дистиллированной водой (+4 °С). Лейкоциты осаждали центрифугированием. Осадок ресуспендировали в 1 мл раствора Трис-HCl (pH = 8,3), 1 тМ ЭДТА. Цитоплазматическую мембрану клеток разрушали, добавляя к суспензии Тритон Х-100 (конечная концентрация - 1%). Ядра осаждали центрифугированием.

Осадок ресуспендировали в 1 мл Трис-HCl (pH = 8,3) и лизировали лаурилсульфатом натрия до конечной концентрации 1%. Протеолиз белков и деградация комплексов «белок-ДНК» осуществлялись инкубацией пробы присутствии протеиназы К (200 мкг/мл) при +60 °С в течение 12 часов. Затем к лизату добавляли раствор NaCl (конечная концентрация 1,5М) и равный объем хлороформа. Экстракция проводилась в течение 30 минут при медленном покачивании. При необходимости процедура повторялась дважды Центрифугирование приводило к образованию в пробирке трех фаз. Верхняя водная фаза содержала растворенную ДНК и неорганические соли. Для осаждения ДНК к отобранной верхней фазе добавляли равный объем изопропанола (20 минут, при температуре -20 °С). Осадок собирали центрифугированием. ДНК промывали в 1 мл 70% этанола и растворяли в 0,5 мл 200 мМ раствора Трис-ЭДТА (pH = 7,6). Полученный раствор ДНК хранился при температуре -20 °С до использования в эксперименте.

Выделение ДНК из архивных патоморфологических образцов

Выделение ДНК нормальных тканей легкого из архивных патоморфологических срезов проводилось посредством оптимизированного нами

экспресс-протокола (Imyanitov Е N. et al., 2001). Ткани очищались от парафина при помощи промывания препаратов в трёх сменах ксилола по 20 мин. при комнатной температуре. Регидратацию клеток осуществляли инкубацией по 10 минут в двух сменах этанола: 96% и 70% Затем образцы погружались в лизирующий раствор (ЮтМ Трис-HCl, рН=8,3; 1 mM EDTA; 2% Тритон Х-100, протеиназы К - до 500 мкг/мл). Лизис клеток проводился при 65 °С в течение 12 часов и завершался инактивацией фермента посредством нагревания препарата до 95 °С. Дальнейшая экстракция и очистка ДНК проводилась в строгом соответствии приведенному выше протоколу выделения ДНК из лейкоцитов периферической крови.

Генотипирование

Аллель-специфическая ПЦР (AS-PCR)

ПЦР-амплификация происходила в объеме 20 мкл. Состав реакционной смеси: 1 ед. "hot-start" Тац-полимеразы, однократный ПЦР буфер, 1 мкл раствора ДНК, 1,5 - 3,0 mM MgCl2, по 200 мкМ каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дГТФ, дТТФ) и 100 нМ каждого праймера. Реакция начиналась с фазы активации Taq-полимерэзы (95 °С, 7 мин.). Последующие 33 - 35 циклов ПЦР состояли из фаз денатурации (95 °С, 30 с), отжига (55 °С - 65 °С, 60 с) и элонгации (72 °С, 60 с). Оптимизация условий ПЦР (подбор концентрации MgCl2 и температуры отжига праймеров) производилась эмпирически. Первоначально условия для всех проводимых реакций были оптимизированы с помощью real-time AS-PCR. Реакции, продемонстрировавшие высокую специфичность, в дальнейшем проводились методом «простой» аллель-специфической ПЦР. Результаты такой ПЦР оценивались по наличию или отсутствию продуктов реакции после проведения электрофореза в 10% трис-боратном полиакриламидном геле, с последующим окрашиванием 0,02% раствором бромида этидия. Фотодокументирование выполнялось с использованием гель-документирующей системы "Vilber Lourmat".

Аллель-специфическая ПЦР в режиме реального времени (real-time AS-PCR) проводилась на приборе "iQ iCycler" ("Bio-Rad"). В этом случае к описанной выше ПЦР-смеси добавляли интеркалирующий краситель SYBR-Green I (20х раствор, добавляется из расчета 1/100 объема реакции). Еще одним компонентом real-time PCR, не участвующим в реакции, но необходимым для корректной работы прибора, является другой флюорофор FAM (fluorescein) (400 пМ раствор, добавляется из расчета 1/40 объема реакции). Количество циклов в этом варианте ПЦР больше чем в описанном выше, порядка 50 циклов. Для контроля специфичности реакции применялось изучение полученных фрагментов с помощью построения так называемых "кривых плавления" (melting curves) и определения температуры плавления ПЦР-продукта.

Сравнение встречаемости опкоассоциированных генетических вариантов в группах повышенного онкологического риска и онкологической «толерантности»

На первом этапе для тестирования были подобраны наиболее демонстративные группы, характеризующиеся экстремальными степенями онкологической предрасположенности и толерантности. Идея данного подхода заключается в том, что если какой-либо полиморфизм действительно играет роль в предрасположенности к РМЖ или PJI, то различия в частоте аллелей будут

особенно ярко проявляться именно при сравнении таких «экстремальных» групп. В работе было проведено сравнение встречаемости выбранных полиморфизмов в описанных выше группах, а также подгруппах, сформированных с учетом дополнительных клинико-патологических характеристик. В случае РМЖ при обработке данных учитывались: возраст начала заболевания, наличие больных родственников и билатеральность, в случае РЛ - гистологический тип и статус курения.

Статистический анализ

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программного комплекса SPSS Version 10. Оценка соответствия распределения частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга (х2, с одной степенью свободы) проводилась только в контрольных группах. Показатели «отношения шансов» (OR) с 95% доверительным интервалом (95% CI), полученным при учете стандартной ошибки log,, OR, рассчитывались относительно группы частых гомозигот для каждого полиморфизма Ассоциацию между заболеванием и генотипом определяли с помощью двух статистических тестов. Тест на гетерогенность полученных результатов проводили, сравнивая распределение генотипов по каждому полиморфизму между группами пациентов и контролей с помощью "¿-квадрат критерия Пирсона с двумя степенями свободы. Анализ тенденций (trend test) проводили, используя Cochran-Armitage trend test с одной степенью свободы. "Приемлемой границей" уровня ошибки при отборе кандидатных полиморфизмов для второго этапа исследования считали р < 0,10, полученное хотя бы в одном из двух использованных статистических тестов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор кандидатных генов и полиморфизмов

Число генов, продукты которых тем или иным способом вовлечены в инициацию, реализацию и регуляцию апоптоза, достаточно велико. Использование базы данных Entrez Gene интернет-ресурса National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www ncbi.nlm nih.gov/SNP/) позволяет провести поиск по всем имеющимся в ней человеческим генам и отобрать те из них, которые имеют прямое или косвенное отношение к апоптозу. В том случае, когда условием поиска является наличие слова "apoptosis" в разделе "Gene Ontology", количество найденных генов составляет 619 (по данным на 1 апреля 2005 года). При планировании нашей работы мы сократили число этих генов до 50, выбрав лишь ключевых и наиболее важных участников.

Таким образом, мы остановились на следующих кандидатах:

- представители семейства цистеиновых протеаз (каспазы): Caspl, Casp2, Casp3, Casp4, Casp5, Casp6, Casp7, Casp8, Casp9, CasplO;

- рецепторы семейства TNF (death receptors) и их лиганды: TNFR1, Fas (Apol), DR3 (Apo2), DR4 (TrailRl), DR5 (TrailR2), DcRl, DcR2, DcR3, TNF, FasL, TRAIL;

- семейство белков Bcl2: Bcl-2, Bcl-x, Bid, Bik, Bad, Bäk, Bax, Bcl-W, Bim, Bok, Boo, Hrk, Mcl-1, Noxa, Puma;

- белки межмембранного пространства митохондрии: DIABLO/Smac, HTRA2/Omi, AIF;

- белки семейства IAP: cIAP-1, cIAP-2, Survivin, XIAP;

- адаптерные и другие белки: Apafl, TRADD, F ADD, FLIP, p53, p73, FAIM.

Выбор полиморфных вариантов этих генов проводился с учетом критериев, указанных в разделе «Материалы и методы». Результаты были опубликованы в работе Imyanitov Е. et al, 2005. Лишь у 22 генов были обнаружены одиночные замены (SNP), подходящие под наши условия. Таких полиморфизмов оказалось 37, их аминокислотные и нуклеотидные обозначения, а также идентификационные номера приведены в таблице 1. Оставшиеся 28 генов не исследовались в нашей дальнейшей работе, поскольку по состоянию на 1 апреля 2005 года в базе данных не было информации о существовании в них кодирующих несинонимичных однонуклеотидных замен с верифицированной популяционной частотой. Поскольку многие из выбранных нами полиморфизмов не изучались на российской популяции ранее, то частота их встречаемости сама по себе является интересной информацией для тех исследователей, кто работает в этой и смежной областях молекулярной биологии. Поскольку наши выборки не являлись случайными, мы не претендуем на определение полученных нами значений частот как среднепопуляционных, но настаиваем на том, что возможное расхождение не может быть значительным, особенно в тех случаях, когда результаты во всех исследованных группах совпадают.

Полиморфизмы, не обнаруженные в изучаемых группах или исключенные из исследования по техническим или иным причинам

14 полиморфизмов из первоначального списка не были найдены ни в одной из исследованных групп: Вс12 Т43А, Bik P148L, Bcl-x G160V, Casp5 L13F, H152R, L201V, Casp6 Е34А, К35Е, FAS Т16А, I122T, DR4 I33T, H297N, TNFR1 L75P, TRAIL E47D. Вероятных причин, на наш взгляд, может быть несколько. Восемь полиморфизмов из этого списка (Casp5 L13F, H152R, L201V, FAS Т16А, I122T, DR4 H297N, TNFR1 L75P, TRAIL E47D) были обнаружены только при изучении представителей негроидной расы, в основном афро-американцев, и их частота в европейской популяции либо не изучалась, либо была близка к нулевой. Тот факт, что эти полиморфизмы не были нами обнаружены, подтверждает важность учета этнических аспектов при выборе кандидатных полиморфизмов. С другой стороны, 8 из 14 ненайденных полиморфизмов (Вс12 Т43А, Bcl-x G160V, Casp5 L13F, H152R, FAS I122T, TNFR1 L75P, TRAIL E47D) были достаточно редкими, то есть имели «заявленную» частоту ниже 5%. Возможно, что именно в изучаемой популяции некоторые из них встречаются еще реже. Известно также, что в постоянно пополняемой базе Entrez SNP вносимая информация корректируется со временем путем накопления данных, поступающих из разных источников, поэтому нередко сведения о встречаемости того или иного полиморфизма оказываются неточными или даже вовсе ошибочными. Так, например, в апреле 2005 года частота полиморфизма P148L гена Bik была 4,8%, сегодня информация о какой бы то ни было частоте этой замены удалена из базы, и даже существование этого SNP вызывает сомнение.

Для детекции трех полиморфизмов (Caspl Q37K, DR3 G159D, DR5 L32P) нам не удалось подобрать оптимальных условий в рамках нашего метода, что объясняется трудностями, возникшими на этапе подбора аллель-специфических праймеров.

Kodupyioujiie нееиноншшчпые полиморфизмы апоптотических верифицированной популяционной частотой равной или превышающей

Таблица 1 генов с 1% (Entrez al, 2005)

№ п/п Название гена Локализация SNP SNP ID Нуклео-тидная замена Частота редкого аллеля

1 Вс12 18q21.3 Thr43Ala rsl 800477 A/G 1.3%

2 Bid 22ql 1.1 GlylOSer rs8190315 G/A 4.6%

3 Bik 22ql3.31 Prol48Leu rs 11574527 C/T 5 0%

4 Bcl-x 20ql 1.21 Glyl60Val rs7362890 G/T 4.8%

5 Caspl 1 lq23 Gln37Lys rs 17103567 C/A 14 0%

6 Casp2 7q34-q35 Leu 141 Val rs4647297 C/G 4.4%

7 Casp5 1 lq22 2-q22.3 Leul3Phe rs3181320 G/C 3.1%

8 AIa90Thr rs507879 G/A 42.8%

9 Hisl52Arg rs3181179 A/G 2 1%

10 Leu201 Val rs3181326 C/G 5.0%

11 Val318Leu rs523104 G/C 46.4%

12 Casp6 4q25 Glu34Ala rsl 1574696 A/C 5.0%

13 Lys35Glu rsl 1574697 A/G 20.0%

14 Casp7 10q25 Glu255Asp rs2227310 C/G 21.1%

15 Casp8 2q33-q34 His302Asp rsl 045485 C/G 8.2%

16 Casp9 Ip36.3-p36 1 Val28Ala rsl052571 T/C 49.2%

17 Hisl73Arg rs2308950 A/G 1 1%

18 Arg221Gln rsl052576 G/A 45.5%

19 CasplO 2q33-q34 lle479Leu rsl 3006529 A/T 35 2%

20 FAS 10q24.1 Thrl6Ala rs3218619 A/G 5.3%

21 llel22Thr rs3218614 T/C 1.0%

22 F AIM 3q22.3 Thrl 17 Ala rs641320 A/G 23.5%

23 Serl27Leu rsl 3043 C/T 14.3%

24 DR3 lp36.2 GIyl59Asp rsl 1800462 G/A 5.3%

25 DR4 8p21 Arg 141 His rs6557634 G/A 9.5%

26 Thr209Arg rs4871857 C/G 43 2%

27 Ala228Glu rs20576 C/A 40.6%

28 Lys441 Arg rs2230229 A/G 12.7%

29 ПеЗЗТЬг rs20577 T/C 2 8%

30 His297Asn rsl 7088980 C/A 3.4%

31 DR5 8p22-p21 Leu32Pro rsl 129424 T/C 50.0%

32 p53 17p13 1 Arg72Pro rsl 042522 G/C 44 5%

33 Survivm 17q25 Lysl29Glu rs2071214 A/G 9.2%

34 TNFR1 12p 13.2 Glnl21Arg rs4149584 A/G 3 8%

35 Leu75Pro rs4149637 T/C 2.4%

36 TRAIL 3q26 Glu47Asp rsl6845759 A/C 2.1%

37 XIAP Xq25 Pro423Gln rs5956583 C/A 35.6%

И, наконец, еще одна позиция, выпавшая из этой работы в самом начале, это замена Arg на Pro в 72-ом кодоне белка р53. Это один из немногих полиморфизмов, который можно считать систематически изученным (Suspitsin EN. et al, 2003, BonafeM etal, 2003, TommiskaJ. et al, 2005; Costa S. et al, 2008).

Таким образом, данные по распределению генотипов в изучаемых группах были получены для 19 полиморфных вариантов генов апоптоза.

Сравнение распределения вариантов апоптотических генов в группе пациенток с повышенной предрасположенностью к РМЖ и в группе онкологически здоровых пожилых женщин

Образцы от 121 пациентки с раком молочной железы и 142 онкологически здоровых пожилых женщин были подвергнуты анализу по определению генотипов по 19 полиморфизмам. Результаты генотипирования были получены для 100% образцов в обеих группах (табл. 2). Никаких статистически достоверных различий при сравнении отдельных полиморфизмов между группой больных РМЖ и здоровыми пожилыми женщинами выявлено не было. Никаких ассоциаций с дополнительными характеристиками, учтенными нами при обработке данных (возрастом начала заболевания, семейным анамнезом или билатеральностью), также обнаружено не было.

Для проверки возможных ошибок, допущенных при генотипировании, в контрольной группе был проведен анализ соответствия распределения генотипов равновесию Харди-Вайнберга (НWE).Сравнение не показало достоверных отличий от ожидаемого для всех полиморфизмов, за исключением одного - Casp5 А90Т (р=0,04). Мы исключили эту позицию из дальнейшего исследования.

Результаты исследования свидетельствуют об отсутствии взаимосвязи между 19 выбранными нами полиморфизмами и предрасположенностью к раку молочной железы. В отношении большинства исследованных полиморфизмов такая работа была проведена впервые.

Генетические варианты Casp8 можно считать наиболее изученными в отношении риска развития РМЖ. Для замены His302Asp в ряде случаев были получены достоверные различия между группами пациенток и контролем, было показано, что носительство относительно редкого His-варианта обладает протективным эффектом (MacPherson G. et al, 2004; Sigurdson A.J. et al, 2007). В 2006 году была создана международная организация «The Breast Cancer Association Consortium», которая провела комбинированный анализ данных, полученных методом «случай - контроль», по всем полиморфизмам, ассоциированным с РМЖ. Были опубликованы результаты, подтвердившие протективный эффект His-варианта Casp8 (для гетерозигот DH - OR: 0,89 (95%: 0,85-0,94), для гомозигот НН - OR: 0,74 (95% CI: 0,62-0,87)). В эту работу вошли данные 14 исследований, общее число пациентов составило более 17 тысяч, контролей - 16,5 тысяч человек (ВСАС, 2006; Сох A. et al, 2006). Однако в недавней работе по изучению риска развития опухолей мозга было достоверно показано, что носительство His-варианта, напротив, увеличивает шансы заболеть менингиомой и неврилеммомой слухового нерва (Rajaraman P. et al, 2007). Следует также упомянуть, что опубликовано несколько работ, данные которых не позволяют обнаружить какого-либо модифицирующего влияния полиморфизма гена Casp8 His302Asp на риск развития РМЖ (Frank В et al, 2005; Pharoah P.D. et al, 2007) Функциональная роль замены His302Asp пока не установлена.

Сравнение распределения вариантов апоптотических генов в группе пациенток с повышенной предрасположенностью к _РМЖ (группа РМЖ) и в группе онкологически здоровых пожилых женщин (группа ПЖ)_

ЭИР РМЖ (%) ПЖ (%) (Ж (95% С1) Н\¥Е Гетерогенность, р-Ье1 Тгегк! р-Пеш!

Вк! АА 118(97.5) 138 (97.2) 1

01уЮЗег Ав 3 (2.5) 4(2 8) 0.88 (0 21-3.62) 0.99 0.87 0.87

(О/А) Ов 0(0.0) 0(0 0) -

Саэр2 111 (91.7) 130(91.5) 1

Ьеи141Уа1 се 10(8 3) 12(8.5) 0.98 (0.41-2.35) 0.87 0.96 0 96

(С/О) СС 0(0 0) 0 (0.0) -

Сазр5 АА 39 (32.2) 60(42 3) 1

А1а90ТЬг АО 61 (50.4) 53 (37.3) 1 78 (1.03-3 06) 0.04 0.10 0.44

(О/А) во 21 (17.4) 29 (20.4) 1 11 (0.56-2 22)

Саэрб ОО 48 (39 7) 57(40 1) 1

Уа1318Ьеи СО 54 (44.6) 64(45.1) 1.00 (0.59-1.70) 0.91 0.97 0.87

(О/С) СС 19(15.7) 21 (14.8) 1.07 (0 52-2.23)

Са$р7 СС 70 (57.9) 81 (57.0) 1

01и255А$р СО 44 (36.4) 45 (31.7) 1 13 (0.67-1.91) 0.06 0 26 0.44

(С/О йв 7 (5.8) 16(11.3) 0 51 (0.20-1.30)

СаБр8 ОО 95 (78.5) 114(80.3) 1

н^зоглвр СО 25 (20.7) 25(17.6) 1.20(0.65-2.23) 0 52 0.59 0.93

(С/О) СС 1 (0 8) 3(2.1) 0.40 (0 04-3 91)

Са5р9 тт 44 (36.4) 60 (42.3) 1

Уа128А1а тс 52 (43.0) 57 (40.1) 1.24 (0.72-2.14) 0.22 0 60 0.33

(Т/С) СС 25 (20.7) 25(17.6) 1.36(0 69-2.68)

Савр9 во 117(96.7) 139(97.9) 1

НвПЗАги АО 3 (2.5) 3(2.1) 1.19(0.24-5.60) 0.99 0.54 0.40

(А/О) АА 1 (0.8) 0(0 0) -

Савр9 ОО 42 (34.7) 54 (38.0) 1

/\rg221Gln Ав 50(41.3) 62 (43.7) 1 03 (0.60-1.80) 0.55 0.53 0 33

(О/А) АА 29 (24.0) 26(18.3) 1 43 (0.74-2.79)

РМЖ (%) ПЖ (%) ОЯ (95% С1) Гетерогенность, р-Ье1 Тгепё р-й-епс!

СаврЮ тт 35 (28.9) 45 (31.7) 1

11е479Ьеи АТ 55 (45.5) 70 (49.3) 1.01 (0,57-1.78) 0.99 0.44 0.29

(А/Т) АА 31 (25.6) 27 (19.0) 1.47 (0.75-2.91)

Ранп Ов 111 (91 7) 130(91.5) 1

ТЬг117А1а Ав 9 (7.4) 12 (8.5) 0 88 (0.36-2.16) 0.87 0.53 0 86

(А/О) АА 1(0 8) 0 (0.0) -

Ра1ш ТТ 120 (99 2) 138 (97.2) 1

8ег127Ьеи ТС 1 (0.8) 4 (2.8) 0.29 (0.03-2.61) 0.99 0.24 0 24

(С/Т) СС 0 (0.0) 0 (0.0) -

Б114 Ов 26 (21.5) 32 (22.5) 1

Агё141Н15 АО 62 (51.2) 78 (54.9) 0.98(0 53-1.81) 0.50 0.67 0.50

(в/А) АА 33 (27.3) 32 (22.5) 1.27(0.62-2.58)

ОК4 СС 33 (27.3) 37 (26.1) 1

ТЬг209Агё Сй 61 (50 4) 75 (52.8) 0.91 (0 51-1.63) 0 78 0.93 0.99

(С/О) ОО 27 (22.3) 30 (21.1) 1 01 (0.50-2.03)

БЯ4 АА 96 (79.3) 104 (73 2) 1

А1а22801и АС 23 (19.0) 37(26.1) 0.67 (0.37-1.21) 0.49 0.32 0.37

(С/А) СС 2(1.7) 1 (0.7) 2.17(0.19-24.28)

БЯ4 АА 88 (72.7) 101 (71 1) 1

Lys441Arg АО 32 (26.4) 38 (26.8) 0 97 (0.56-1 68) 0.97 0.69 0.63

(А/О) во 1 (0.8) 3(2.1) 0.38 (0 03-3.74)

Бигу АА 116(95.9) 131 (92.3) 1

Ьуз12901и АО 4 (3.3) 11 (7.7) 0.41 (0.13-1.32) 0.89 0.17 0.34

(А/О) йв 1 (0.8) 0(0.0) -

тотш ОО 120 (99.2) 138 (97.2) 1

01п121Аг£ АО 1(0 8) 4 (2.8) 0.29 (0.03-2.61) 0,99 0 24 0.24

(А/О) АА 0(0 0) 0 (0.0) -

Х1АР АА 58 (47.9) 55 (38.7) 1

Рго42301п АС 39 (32.2) 58 (40.8) 0.64 (0.37-1.10) 0,18 0.27 0.30

(С/А) СС 24(19.8) 29 (20.4) 0.79 (0.41-1.51)

Всего 121 (100) 142 (100)

В нашей работе приведенные выше наблюдения о протективном действии Инварианта в отношении РМЖ не были подтверждены (табл. 2). Изучение полиморфизма гена Савр8 1Пя302А5р продемонстрировало сходное распределение его аллелей и генотипов в группах РМЖ и здоровых пожилых женщин (число носительниц редкого аллеля составило 22% и 20%, соответственно).

Сравнение распределения вариантов апоптотических генов в группе пациентов с повышенной предрасположенностью к РЛ и в группе онкологически здоровых пожилых мужчин-курильщиков

Образцы ДНК 111 пациентов с раком легкого и 110 онкологически здоровых пожилых курильщиков также были подвергнуты генотипированию по 19 полиморфизмам. Генотипы были определены для 100% образцов в обеих группах. Все полученные данные, а также рассчитанные статистические параметры сведены в таблицу 3. Анализ отклонений от равновесия Харди-Вайнберга (Н\¥Е) не выявил достоверных отличий от ожидаемого распределения генотипов по всем сравниваемым вариантам. Один из исследованных полиморфизмов показал достоверную ассоциацию с риском развития рака легкого (Савр8 Н1з302Аьр), по трем другим позициям (Савр5 А1а90ТЪг, Сазр5 Уа1318Ьеи, Б114 Ьуь441 Аг^>) результаты были близки к достоверным (р<0,10)

Полиморфизм Са.чр5 А 1а90ТИг(С>А) Мы обратили особое внимание на полиморфизм Сазр5 А1а90ТЬг(С>А), поскольку ранее он был исключен из дальнейшего исследования по РМЖ на основании результатов, полученных на первом этапе работы. Разница в распределении генотипов по полиморфизму А1а90ТЬг гена Савр5 в контрольной группе по сравнению с ожидаемыми частотами, рассчитанными по закону Харди-Вайнберга, была по-прежнему значительной, хотя и статистически недостоверной (рн\уе = 0,11). Мы объединили результаты, полученные в обоих исследованиях (по РМЖ и по РЛ) и обнаружили, что распределение генотипов в смешанной группе пациентов с онкологическими заболеваниями (Случай) - 232 человека - соответствует ожидаемому (рн\уе = 0,61), а в группе пожилых мужчин и женщин (Контроль) - 252 человека - отличается от теоретического с высокой степенью достоверности (рц\УЕ = 0,003). При этом частота редкого аллеля в обеих группах практически совпадает, а различия связаны с резким снижением числа гетерозигот по этому полиморфизму в группе пожилых людей. В связи с этим мы пришли к выводу об отсутствии влияния этого полиморфизма на риск развития изучаемых опухолей и не стали проводить расширенного исследования для этой позиции, несмотря на то, что достоверность показателя гетерогенности выборок была в «критической зоне» (р = 0,07).

Однако мы провели повторный независимый анализ генотипов в контрольных группах, который подтвердил полученное ранее распределение. Поэтому предположение о том, что наблюдаемое отклонение может быть объяснено ошибками генотипирования, кажется маловероятным. Можно предположить, что оно является результатом действия отрицательного отбора, направленного на гетерозиготных по данному полиморфизму индивидуумов в стареющей части популяции. Это может быть связано с функциональными особенностями самой замены в 90 кодоне (прямой отбор), или же с опосредованным действием отбора, при условии генетической сцепленности с другим полиморфизмом, ассоциированным с какой-либо характерной болезнью старения.

Сравнение распределения вариантов апоптотических генов в группе пациентов с повышенной предрасположенностью к раку _легкого (группа РЛ) и в группе онкологически здоровых пожилых мужчин-курильщиков (группа ПМ)._

РЛ (%) ПМ (%) ОН (95% С1) Гетерогенность, р-Ии Тгепс! ге51, р-1гепс1

В1<1 АА 108(97 3) 109 (99 1) 1

СТуШБег Ав 3 (2 7) 1(0 9) 3 03 (0.31-29.6) 0.99 0 32 0 32

(О/А) ОО 0(0 0) 0(0 0) -

Саэр2 се 102 (91 9) 101(91 8) 1

Ьеи141Уа1 се 9(8.1) 9(8 2) 0 99 (0.38-2 60) 0 90 0.98 0 98

(С/О) СС 0(0 0) 0(0 0) -

Саяр5 АА 29(26 1) 34 (30.9) 1

А1а90ТЬг АО 61 (55 0) 44 (40.0) 1 62 (0 87-3 05) 0.11 0 07 0 58

(О/А) Ов 21 (189) 32 (29 1) 0.77(0 37-1.61)

Са$р5 СС 48 (43.2) 52 (47.3) 1

УаШ8Ьеи СС 43 (38.7) 49 (44.5) 0.95 (0.54-1.68) 0.86 0.09 0.14

(С/С) СС 20 (18.0) 9 (8.2) 2.41 (1.02-5.70)

Сазр7 СС 57(514) 57 (51.8) 1

01и255А5р се 50 (45 0) 44 (40 0) 1 14(0 65-1 96) 0 99 0.32 0 62

(С/О) ее 4(3 6) 9(8 2) 0.44(0 12-1.52)

Са$р8 СС 77 (69.4) 92 (83.6) 1

Ш$302Азр ев 33 (29.7) 18 (16.4) 2.19 (1.44-4.19) 0.65 0.03 0.01

(С/С) СС 1 (0.9) 0 (0.0) -

Савр9 ТТ 40 (36 0) 38 (34 5) 1

Уа128А1а ТС 57(51.4) 52 (47.3) 1 04(0 58-1.86) 0.96 051 0 44

(Т/С) СС 14(12.6) 20(18 2) 0 67(0 30-1 50)

СаэрЭ ов 108 (97 3) 102 (92 7) 1

НЫ73Аг§ Ав 3 (2.7) 8(7 3) 2 82 (0 73-10 94) 0 92 0 12 0.12

(А/О) АА 0(0 0) 0(0 0) -

Саэр9 ОО 39 (35.1) 37 (33.6) 1

Аг^2Ю1п Ай 56 (50 5) 53 (48 2) 1.00(0 56-1 80) 0 99 0.75 0.57

(О/А) АА 16(14 4) 20(18 2) 0.76(0 34-1.68)

СаэрЮ ТТ 33 (29 7) 43(39.1) 1

11е479Ьеи АТ 52 (46.8) 43 (39 1) 1 58 (0 85-2 89) 0 13 0 33 0.28

(АЯ) АА 26 (23.4) 24 (21 8) 1 41 (0 69-2 89)

SNP PJl (%) ПМ (%) OR (95% CI) HWE Гетерогенность,p-het Trend test, p-trend

Faim GG 101 (91 0) 106(96 4) 1

Thrll7Ala AG 10(9 0) 4(3 6) 2.62 (0 80-8.63) 0 98 0.10 0 10

(A/G) AA 0(0 0) 0 (0.0) -

Faim AA 109 (98 2) 108 (98.2) 1

Serl27Leu AG 2(1.8) 2(1 8) 0 99 (0 14-7 16) 0 99 0 99 0 99

(C/T) GG 0 (0.0) 0(0 0) -

DR4 GG 27 (24 3) 32 (29.1) 1

Argl41Hjs AG 64 (57 7) 53 (48 2) 1 43 (0 76-2 68) 0 94 0.37 0 99

(G/A) AA 20(18 0) 25 (22 7) 0 95 (0 43-2 07)

DR4 GG 22(19.8) 32 (29 1) 1

Thr209Arg CG 61 (55 0) 49 (44.5) 1 81 (0.94-3.51) 0 52 021 0.39

(C/G) CC 28 (25 2) 29 (26 4) 1.40 (0 66-2 98)

DR4 AA 81 (73.0) 87 (79 1) 1

Ala228Glu AC 27 (24.3) 21 (19 1) 1 38 (0 72-2 63) 0 86 0.56 0 29

(CIA) CC 3(2 7) 2(1 8) 1 61 (0 26-9 89)

DR4 AA 70 (63.1) 84 (76.4) 1

Lys441Arg AG 38 (34.2) 23 (20.9) 1.98 (1.08-3.64) 0.66 0.08 0.06

(A/G) GG 3 (2.7) 3 (2.7) 1.20 (0.23-6.13)

Surv AA 101 (91 0) 100(90 9) 1

Lysl29Glu AG 10 (9 0) 10(9.1) 0 99 (0.40-2.48) 0 89 0.98 0 98

(A/G) GG 0(0 0) 0(0 0) -

TNFR1 GG 108 (97.3) 103 (93.6) 1

Glnl21Arg AG 3(2 7) 7(6 4) 0 41 (0 10-1.62) 0 94 0 19 0 19

(A/G) AA 0(0 0) 0(0 0) -

X1AP AA 6 (40 0) 55 (38.7) 1

Pro423Gln AC 7 (46 7) 58 (40 8) 1.11 (0 35-3 50) 0 18 0 79 0 68

(С/А)(ж) CC 2(13 3) 29 (20.4) 0 63 (0 12-3 33)

X1AP Pro423Gln A 53 (55 2) 70 (63.6) 1 0 22 0 22

(C/A) (m) С 43 (44 8) 40 (36 4) 1.42 (0 81-2 48)

Всего 111 (100) 110(100)

Полиморфизм Casp8 His302Asp(C>G) Единственным полиморфизмом, no которому были получены статистически достоверные результаты, была замена Asp на His в 302 кодоне гена Casp8. Оба оценочных теста: на гетерогенность и на степень ассоциации в зависимости от числа вариантных аллелей (trend test) -показали достоверные различия: p-het = 0,03 и p-trend = 0,01, соответственно. Мы уже неоднократно упоминали, что существуют данные, свидетельствующие о связи этого полиморфизма со сниженным риском развития рака молочной железы. Однако для рака легкого мы получили достоверное увеличение риска, ассоциированное с носительством редкого С-аллеля, по отношению к частым GG-гомозиготам (OR: 2,26 (95% CI: 1,18-4,30)).

Полиморфизм Casp5 Val318Lea(G>C) По уровню значимости показатели гетерогенности сравниваемых выборок и trend-теста, полученные для этого полиморфизма, были выше традиционных р < 0,05 (р = 0,09 и p-trend = 0,14, соответственно), но все еще находились в рамках принятых нами условий отбора (р < 0,10 хотя бы по одному из проведенных тестов). Число редких гомозигот СС было значительно выше в группе больных, чем в контроле, а показатель odds ratio, рассчитанный по отношению к частым гомозиготам, составил ORcc: 2,41 (95% CI: 1,02-5,70).

Полиморфизм DR4 Lys441Arg(A>G) Третьим полиморфизмом, для которого оценочные статистические показатели находились в «критической зоне», была замена Lis на Arg в 441 кодоне гена DR4 (p-het = 0,08; p-trend = 0,06). Гетерозиготное носительство редкого G-аллеля, а также комбинация генотипов AG/GG показали ассоциацию с увеличенным риском развития рака легкого по сравнению с частым АА генотипом (ORa(;: 1,98 (95% CI: 1,08 - 3,64), и ORag+gg: 1,89 (95% CI: 1,06 - 3,38), соответственно)

Таким образом, три указанных выше полиморфизма были отобраны для второго этапа работы. Каждый из них был протестирован в рамках традиционного молекулярно-эпидемиологического исследования.

Молекулярно-эпидемиологическое исследование с традиционным подходом к формированию групп «случай» (пациенты с раком легкого) и «контроль»

На втором этапе для проведения традиционного молекулярно-эпидемиологического исследования была использована вся имеющаяся в нашем распоряжении коллекция пациентов с раком легкого, то есть мы дополнительно проанализировали еще 240 образцов ДНК. В целом, группа пациентов состояла из 351 человека, при этом 48 из них были некурящими. Контрольная группа, использованная на втором этапе исследования, состояла из 538 онкологически здоровых человек и была подобрана с максимально возможным соответствием по возрасту, полу и статусу курения группе пациентов. Выборки такого размера являются достаточными для того, чтобы детектировать значения OR, равные 1,68 (для Casp5 Val318Leu), 1,55 (для Casp8 His302Asp) и 1,52 (для DR4 Lys441Arg), с 80% мощностью на 5% уровне достоверности. Результаты второго этапа исследования приведены в таблице 4.

Ни один из протестированных полиморфизмов не продемонстрировал ассоциации с риском развития рака легкого на этом этапе исследования. Дальнейший анализ данных, в котором были приняты во внимание гистологический тип опухолей, статус курения и пол пациентов, привел к результатам, изложенным ниже.

Таблица 4

Результаты молекулярно-эпидемиологическое исследования с традиционным

подходом к формированию групп «случай» (пациенты с РЛ) и «контроль».

SNP РЛ (%) Контроль (%) OR (95% Cl) HWE p-het p-trend

Casp5 Val318Leu (G/C) GG 137 (39 0) 221 (41 1) 1 1 00 0 42 0 27

CG 158 (45 0) 248 (46 I) 1 03 (0 76-1 38)

CC 56(18 0) 69(12 8) 1 31 (0 87-1 98)

Casp8 His302Asp (C/G) GG 263(74 9) 420 (78 1) 1 0 89 0.55 0 27

CG 83 (23 6) 112(20 8) 1 18(0 86-1 63)

CC 5(1.4) 6(1 1) 1 33(0 40-4 40)

DR4 Lys441 Arg (A/G) AA 250(71 2) 399 (74 2) 1 0 72 051 0 27

AG 89 (25 4) 126 (23 4) 1 13 (0.82-1 54)

GG 12(3 4) 13(2.4) 1.47 (0.66-3 28)

Всего 351 (100) 538(100)

Полиморфизмы DR4 Lys441Arg(A>G) и CaspS Val318Leu(G>C)

Разделение выборки рака легкого на группы в зависимости от гистологического диагноза, статуса курения или возраста не позволило выявить никаких ассоциаций между этими двумя полиморфизмами и риском развития той или иной формы заболевания (табл. 5).

Полиморфизм CaspS His302Asp(C>G)

В отличие 01 шиосшельно многочисленных публикаций по изучению связи полиморфизма 302 колона icua Саьр8 с риском развития рака молочной железы, ею свя ¡ь с раком .ici roi о ото не была изучена. Некоторые попытки, предпринятые KiiiaiicKTiMii и корейскими исследовак'лямп, ни к чему не привели, поскольку His-аллсль в азиа1скои популяции практически не встречается. Однако исследованные ими другие полиморфизмы СаьрВ дали основание предполагать, что этот ген может быть вовлечен в формирование наследственной предрасположенности к раку легкого (Son J. Wet al, 2006; Sim T. et al, 2007).

Статистическая обработка данных, учитывающая гистологический диагноз, не позволила выявить никаких ассоциаций между генотипом и морфологией опухоли. Но при проведении дальнейшего анализа с учетом статуса курения мы обнаружили неожиданный результат. Полиморфизм Casp8 His302Asp был ассоциирован с увеличенным риском развития рака легкого у некурящих (ORco+cc: 2,83 (95% CI: 1,21 - 6,67), p-het = 0,04, p-trend = 0,01). Частота встречаемости носителей редкого His-аллеля Casp8 в группе некурящих онкологических пациентов (19/48 (40%)) была значительно выше, чем в контрольной группе в целом (118/538 (22%)) или в группе здоровых некурящих пациентов (12/64 (19%)) (табл. 5).

Данные последних лет дают основания считать, что рак легкого, развивающийся у некурящих людей, является особой формой заболевания (Subramaman J., Govindan R., 2007; Sun S. et al, 2007). Генетическая предрасположенность к образованию таких опухолей может определяться факторами, не играющими роли при развитии рака легкого у курильщиков. Таким образом, полученные нами результаты оказались особенно интересными, но, несомненно, потребовали подтверждения на увеличенной выборке некурящих больных раком легкого С этой целью нами была сформирована коллекция из 127 образцов ДНК, выделенных из патоморфологических образцов нормальных тканей пациентов с раком легкого. Отсутствие курения в анамнезе было подтверждено путем изучения материалов в архивах НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова.

Распределение вариантов апоптотических генов в группе пациентов с повышенной предрасположенностью к раку легкого _ (группа РЛ) и в группе онкологически здоровых пожилых мужчин-курильщиков (группа ПМ).__

Группы CaspS Val318Leu (G/C) Casp8 His302Asp (C/G) DR4 Lys441Arg (A/G) Всего (%)

GG (%) CG (%) CC (%) GG (%) CG (%) CC (%) AA (%) AG (%) GG (%)

Контроль 221 (41 1) 248(46.1) 69(12 8) 420 (78.1) 112 (20 8) 6(1.1) 399(74 2) 126 (23.4) 13 (2 4) 538(100)

Курящие 196 (41 3) 215 (45.4) 63 (13 3) 368(77.6) 100(21.1) 6(13) 351 (74.1) 112(23 6) 11 (2.3) 474(100)

Мужчины 151 (41 9) 160 (44.5) 49 (13 6) 279 (77 5) 77(214) 4(1.1) 264 (73.4) 86 (23 8) 10(2.7) 360(100)

Женщины 45 (39 5) 55(48 2) 14(12 3) 89 (78.1) 23 (20.1) 2(1.8) 87(76 3) 26 (22 8) 1(0 9) 114(100)

Некурящие 25 (39 1) 33 (51.6) 6 (9.3) 52 (81.3) 12(18.7) 0(0 0) 48 (75 0) 14(21 9) 2(3 1) 64 (100)

Мужчины 10 (50 0) 7 (35 0) 3 (15.0) 18(90 0) 2(10 0) 0(0 0) 14 (70 0) 6 (30 0) 0(0 0) 20 (100)

Женщины 15 (34 1) 26 (59.1) 3 (6.8) 34 (77 3) 10 (22.7) 0(0 0) 34(77 3) 8(18 2) 2(4 5) 44 (100)

Всего мужчин 161 (42 4) 167(44 0) 52(13.6) 297 (78 2) 79 (20 8) 4(10) 278(73 2) 92 (24.2) 10(2.6) 380(100)

Всего женщин 60 (38 0) 81 (51 3) 17 (10.7) 123 (77 8) 33 (20 9) 2(13) 121 (76 6) 34(21.5) 3 (1.9) 152(100)

Пациенты с PJI 137 (39.0) 158 (45 0) 56(18 0) 263 (74.9) 83 (23.6) 5(1.4) 250 (71.2) 89 (25 4) 12 (3.4) 351 (100)

Курящие 119(39 3) 134(44 2) 50 (16.5) 234 (77.2) 65 (21.5) 4 (1.3) 216(71.3) 77 (25.4) 10(3.3) 303(100)

Мужчины 111 (38.3) 132 (45 5) 47 (16.2) 226 (78 0) 61 (20 0) 3(10) 211 (72 8) 71 (24 5) 8 (2.7) 290 (100)

Женщины 8 (61 5) 2(15.4) 3 (23 1) 8(61 5) 4 (30 8) 1(7 7) 5 (38 5) 6(46 2) 2(15.3) 13(100)

Некурящие 18(37.5) 24 (50.0) 6(12.5) 29 (60.4) 18 (37.5) 1 (2.1) 34 (70 8) 12 (25.0) 2(4 2) 48(100)

Мужчины 6 (35 3) 10 (58.8) 1 (5.9) 12 (70 6) 5 (29 4) 0(0 0) 12(70 6) 5 (29 4) 0(0 0) 17(100)

Женщины 12 (38 7) 14 (45.2) 5(16 1) 17(54 8) 13 (42 0) 1(3 2) 22(71.0) 7(22.6) 2 (6.4) 31 (100)

НМРЛ 117(39.4) 130(43 8) 50(16 8) 222 (74.7) 70 (23.6) 5(1.7) 208 (70.0) 79 (26.6) 10 (3.4) 297 (100)

ПРЛ 74 (39 2) 82 (43.4) 33 (17 4) 141 (74 6) 45 (23 8) 3(16) 134 (70.9) 49 (25.9) 6 (3.2) 189(100)

АЛ 33 (42.3) 35 (44.9) 10(12 8) 55 (70 5) 22 (28 2) 1 (1.3) 55 (70 5) 21 (26.9) 2(2 6) 78 (100)

Другие типы 10(33 3) 13 (43.3) 7(23 4) 26 (86 7) 3(10 0) 1 (3.3) 19 (63 3) 9 (30 0) 2 (6.7) 30 (100)

МРЛ 20 (37 0) 28 (51 9) 6(11.1) 41 (75 9) 13(24 1) 0 (0.0) 42 (77 8) 10(18.5) 2 (3.7) 54 (100)

Возраст <50 лет 12(33 3) 18(50 0) 6(16 7) 26 (72.2) 9 (25.0) 1 (2.8) 22(61 1) 12 (33.3) 2(5 6) 36(100)

Возраст >50 лет 125 (39.7) 140 (44 4) 50(15 9) 237 (75.2) 74 (23.5) 4(1.3) 228 (72 4) 77 (24 4) 10 (3.2) 315(100)

Всего мужчин 116(37.8) 138(45.0) 53 (17.2) 236(76 9) 67 (21.8) 4(1.3) 219(71 3) 76 (24 8) 12 (3.9) 307 (100)

Всего женщин 21 (47.7) 20 (45.5) 3(6 8) 27(61 4) 16(36.3) 1 (2 3) 31 (70 5) 13 (29.5) 0(0 0) 44(100)

HMPJI - немелкоклеточньш PJI, ПРЛ - плоскоклеточный РЛ, АЛ - аденокарцикома легкого, МРЛ - мелкоклеточный РЛ

Частота встречаемости носителей редкого Н^-аллеля Савр8 во вновь сформированной группе некурящих пациентов (28/127 (22%)) практически совпадала с таковой в контрольной группе (72/351 (21%)). При объединении всех некурящих пациентов в одну выборку число носителей «опасных» генотипов достигло 27% (47/175), что по-прежнему достоверно не отличалось от контроля (011 = 1,42 (95% С1: 0,93 - 2,17), р-ка = 0,25, р-1гепс1 = 0,13). Таким образом, полученное ранее достоверное увеличение числа носителей редкого аллеля в группе некурящих больных раком легкого не подтвердилось при увеличении объема изучаемой выборки.

В целом негативный характер результатов второго этапа исследования заставляет задуматься над одной из возможных причин нахождения нами различий в распределении генотипов между исследуемыми группами на первом этапе. Можно предположить, что возрастные особенности использованной нами контрольной группы (> 75 лет) могли повлиять на распределение генотипов. Например, в том случае, если какой-нибудь из изучаемых вариантов играет роль в процессах, связанных со старением или увеличением продолжительности жизни, его представленность в такой группе может отличаться от популяционной. Получаемая в этом случае разница в распределении генотипов между группой пациентов и контролем может быть никак не связана с исследуемым заболеванием.

Используя нашу коллекцию ДНК онкологически здоровых индивидуумов, мы увеличили выборку пожилых (75 лет и старше) курящих людей до 341. Мы проанализировали добавленную группу (231 образец ДНК) по трем полиморфизмам, представляющим для нас интерес, и объединили полученные данные с уже имеющимися. Поскольку в литературе нет данных о частоте встречаемости интересующих нас полиморфизмов в российской популяции, результаты второго этапа нашего исследования, полученные для контрольной группы, были использованы для сравнения как средне-популяционные (табл. 6).

Таблица б

Сравнение результатов генотипирования группы пожилых онкологически здоровых курящих индивидуумов (ПЗК) и контрольной группы, испочъзованной на

ПЗК (%) Контроль (%) ОН (95% С1) р-Ье( р-1гепс!

Саврб Уа1318Ьеи (О/С) во 150 (44 0) 221 (41.1) 1 0 57 0.29

се 154 (45.1) 248(46 1) 0 91 (0 69-1 22)

СС 37(10 9) 69(12.8) 0 79(0 50-1 24)

СаврЭ ШэЗОгАзр (С/О) 00 264 (77 4) 420(78 1) 1 0 67 0 97

СО 75 (22 0) 112(20 8) 1 07 (0 77-1 48)

СС 2(0 6) 6(1 1) 0 53 (0 12-2.30)

0114 Ьуз441А^ (А/О) АА 263 (77.1) 399(74 2) 1 0 54 0 43

Ав 69(20 2) 126 (23 4) 0 83 (0 60-1.16)

во 9(2 6) 13(2 4) 1 05(045-2 44)

Всего 341(100) 538(100)

Сравнение полученных значений со средними в изучаемой популяции не выявило статистически достоверных различий. Таким образом, нам не удалось обнаружить искажающего влияния возрастных особенностей группы, использованной нами в качестве контрольной на первом этапе исследования, на представленность изучаемых полиморфизмов.

ВЫВОДЫ

1) Систематический анализ полиморфизмов генов апоптоза подтвердил встречаемость генетических вариантов Bid (G10S), Casp2 (L141V), Casp5 (А90Т, V318L), Casp7 (E255D), Casp8 (H302D), Casp9 (V28A, H173R, R221Q), CasplO (I479L), FAIM (T117A, S127L), DR4 (R141H, T209R, A228E, K441R), Survivin (K129E), TNFR1 (Q12IR), XIAP (P423Q) в изучаемой популяции.

2) Кодирующие полиморфизмы апоптотических генов (Bid (G10S), Casp2 (L141V), Casp5 (А90Т, V318L), Casp7 (E255D), CaspS (H302D), Casp9 (V28A, H173R, R221Q), CasplO (I479L), FAIM (T117A, S127L), DR4 (R141H, T209R, A228E, K441R), Survivin (K129E), TNFR1 (Q121R), XIAP (P423Q)) не ассоциированы с увеличенным риском развития рака молочной железы.

3) Кодирующие полиморфизмы апоптотических генов (Bid (G10S), Casp2 (L141V), Casp5 (А90Т, V318L), Casp7 (E255D), Casp8 (H302D), Casp9 (V28A, H173R, R221Q), CasplO (I479L), FAIM (T117A, S127L), DR4 (R141H, T209R, A228E, K441R), Survivin (K129E), TNFR1 (Q121R), XIAP (P423Q)) не ассоциированы с увеличенным риском развития рака легкого.

4) Необычное распределение генотипов полиморфизма гена Casp5 А90Т может быть связано с различными шансами достижения долголетия у их носителей (Phwe= 0.003).

5) В целом, результаты проведенной работы ставят под сомнение предположение о вовлеченности генетических вариаций в системе апоптоза в формирование онкологического риска.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Улыбина Ю.М. Роль полиморфизмов генов апоптоза в формировании предрасположенности к раку легкого / Улыбина Ю.М., Кулигина Е.Ш., Митюшкина Н.В., Розанов М.Е., Зайцева O.A., Яцук О.С., Пономарева Д.Н., Того A.B., Devilee Р., Имянитов Е.И. // Вопросы онкологии, 2008, Т. 54. №2 Приложение. Петровские чтения - 2008, тезисы 4-й Российской конференции по фундаментальной онкологии, С. 28 -29.

2) Улыбина Ю.М. Ассоциация между полиморфизмом I157T гена Chek2 и риском пограничных серозных опухолей яичника у жительниц России / Соколенко А Г., Лобейко О.С., Крылова Н.Ю., Максимов С.Я., Урманчеева А.Ф., Мацко Д.Е., Никонов А.А, Суспицын E.H.,Кулигина Е.Ш., Иевлева А.Г., Улыбина Ю.М., Митюшкина Н.В, Розанов М.Е., Порханова H В., Шиманска-Пастернак И., Любински Я., Того A.B., Имянитов E.H. // Сибирский онкологический журнал -2006, Т. 20, №4, С. 12-15.

3) Улыбина Ю.М. Комбинированное влияние полиморфизмов CYP1A1 и GSTM1 на предрасположенность и толерантность к раку легкого / Улыбина Ю М., Белогубова Е.В., Суворова И.К., Кулигина Е.Ш., Карпова М.Б., Лемехов В.Г., Романенко СМ., Колосков A.B., Кучинский АП, Шуткин В.А., Hirvonen А., Хансон К.П., Того A.B., Имянитов E.H. // Вопросы онкологии, 2005, том 51, №1, Приложение. Петровские чтения - 2005, тезисы Российской конференции по фундаментальной онкологии, С.25.

4) Улыбина Ю.М. Распределение аллелей гена CYP1A1 у больных раком лёгкого, доноров среднего возраста и пожилых людей без онкологической патологии / Белогубова Е.В., Того A.B., Суворова И.К., Карпова М.Б., Улыбина

Ю.М. Зайцева О.А., Яцук О.С, Шуткин ВА., Рябоконь СА., Соколенко А.П., Иевлева А.Г., Чекмарева Е.В., Лемехов В.Г., Колосков А.В., Кучинский А.П., Хансон К.П., Имянитов Е.Н. // Вопросы онкологии - 2004, Т. 50, №2, С. 165 - 168.

5) Ulybina Y.M. СНЕК2 HOOdelC mutation is frequent among Russian breast cancer patients / Chekmariova E.V., Sokolenko A.P., Buslov K.G., levleva A.G., Ulybina Y.M., Rozanov M.E., Mitiushkina N.V., Togo A.V., Matsko D.E., Voskresenskiy D.A., Chagunava О L , Devilee P., Cornelisse C., Semiglazov V.F., Imyanitov E N. // Breast Cancer Res Treat - 2006, Vol. 100, P. 99 - 102.

6) Ulybina Y.M. High frequency of BRCA1 5382msC mutation in Russia breast cancer patients / Sokolenko A.P., Mitiushkina N.V., Buslov K.G., Bit-Sava E.M., levleva A.G., Chekmariova E.V., Kuligina E.Sh., Ulybina Y.M , Rozanov M.E., Suspitsm EN., Matsko D.E., Chagunava O.L., Trofimov D.Yu., Devilee P., Cornelisse C., Togo A.V., Semiglazov V.F., Imyanitov E.N. // Eur J Cancer - 2006, Vol. 42, P. 1380 - 1384.

7) Ulybina Y.M. Combined CYP1A1/GSTM1 at-risk genotypes are overrepresented in squamous cell lung carcinoma patients but underrepresented in elderly tumor-free subjects / Belogubova E.V., Ulybina Yu M., Suvorova I.K., Kuligina E.Sh, Karpova M.B., Shutkm V.A., Koloskov A.V., Kuchinskiy A.P., Togo A.V., Hanson K.P., Hirvonen A., Imyanitov E N. // J Cancer Res Clm. Oncol - 2006, Vol. 132, P. 327 - 331.

8) Ulybina Y.M. "Comparasion of extremes" approach provides evidence against the modifying role of NAT2 polymorphism in lung cancer susceptibility / Belogubova E.V., Kuligina E.Sh., Togo A.V., Karpova M В., Ulybma J.M., Shutkin V.A., Hanson K.P, Popowski K., Mosyagin I., Cascorbi I., Hirvonen A., Imyanitov E.N. // Cancer Letters, 221, 2005, P. 177-183

9) Ulybina Y.M A novel approach for assessment of cancer predisposing roles of GSTMl and GSTT1 genes: use of putatively cancer resistant elderly tumor-free smokers as the referents / Belogubova E.V., Togo A.V, Karpova M.B., Kuligina E.Sh., Buslov K.G., Ulybina J.M., Lemehov V.G., Romanenko S M., Shutkin V.A., Hanson K.P., Hirvonen A , Imyanitov E.N. // Lung Cancer - 2004, Vol. 43, P. 259 - 266.

10) Ulybina Y.M. Evidence against involvement of p53 polymorphism in breast cancer predisposition / Suspitsin E.N., Buslov К G, Grigoriev M.Yu., Ishutkina J.G., Ulybina J.M., Gorodinskaya V.M., Pozharisski K.M., Bcrstein L.M., Hanson K.P., Togo A. V., Imyanitov E.N // Int J Cancer - 2003, Vol. 103, P. 431 -433.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю сердечную признательность чл.-корр РАМН, проф. Самойлову Владимиру Олеговичу за постоянное внимание и ценные рекомендации. От всей души благодарю научного руководителя диссертационной работы проф. Имянитова Евгения Наумовича за мудрое руководство и неустанную поддержку. Искренне признательна сотрудникам патологоанатомической лаборатории, в особенности Иванцову А.О., за активное содействие в наборе архивного патоморфологического материала. Приношу сердечную благодарность сотрудникам лаборатории молекулярной онкологии - своим друзьям и коллегам: к.б.н. Кулигиной Е.Ш., к м.н. Суспицину Е.Н., к.м.н. Буслову К.Г., Соколенко А.П., Розанову М.Е., Чекмаревой Е.В., Митюшкиной Н.В., Яцук О.С, Зайцевой О.А., Рикуновой Л.В., Пономаревой Д.Н. за помощь в выполнении работы. Хочу сказать отдельное спасибо Иевлевой Аглае Геннадиевне и к б.н. Того Александру Викторовичу за безграничное терпение, постоянную помощь и моральную поддержку.

Лицензия ЛР № 020593 от 07.08 97

Подписано в печать 22.10.2008. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0 Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 3602Ь

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул , 29. Тел.: (812)550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76

Актуальность проблемы

Индивидуальная предрасположенность к возникновению опухолей может быть обусловлена нормальными вариациями генома - генетическими полиморфизмами. Например, было показано, что риск возникновения карцином легкого, мочевого пузыря и толстой кишки увеличивается в случае носительства неблагоприятного сочетания полиморфизмов генов, вовлеченных в метаболизм табачных смол (Schwartz A.G. et al, 2007; Garcia-Closas M. et al, 2005; Hung R.J. et al, 2003). Получено немало данных об аллельных вариантах генов стероидного метаболизма, принимающих участие в формировании риска опухолей репродуктивной системы (Verla-Tebit Е. et al., 2005; Berstein L.M. et al., 2004; Gulyaeva L.F. et al., 2008). Возможная ассоциация между полиморфизмами генов репарации и онкологическим риском также активно изучалась в течение последних лет (Dufloth RM. et al., 2008; Fontana L. et al., 2008; Huang M.Y. et al., 2008).

Также заслуживают пристального внимания гены, продукты которых принимают участие в апоптотическом ответе клетки на повреждение ДНК. В норме, когда изменения в химической структуре ДНК не могут быть устранены системой репарации, запускается программа клеточного суицида - апоптоза. Однако интенсивность этих процессов может колебаться в достаточно широком диапазоне, что во многом определяется генетической конституцией индивидуума. Таким образом, пониженная эффективность работы апоптотических каскадов может привести к накоплению в организме клеток, содержащих мутации в онкогенах или генах-супрессорах, что, безусловно, сопряжено с увеличением индивидуального онкологического риска. В пользу высказанного предположения свидетельствуют результаты некоторых фенотипических исследований, продемонстрировавших связь между сниженной способностью к апоптозу и повышенным онкологическим риском (Wang L.E. et al, 2003; Camplejohn R.S. et al, 2001; Zhao H. et al, 2001; Barber J.B. et al, 2000). Появились отдельные работы, касающиеся встречаемости полиморфизмов генов апоптоза в группах больных раком легкого и раком молочной железы (Frank В. et al, 2005; Zhang X. et al, 2005; MacPherson G. et al, 2004; Wang L.E. et al, 2003; Balkwill F., 2002). Однако систематического исследования, посвященного этой проблеме, до сих пор не проводилось.

Объективные сложности, возникающие при поиске низкопенентратных факторов риска развития заболеваний, в том числе и онкологических, связаны в первую очередь со слабостью искомых ассоциаций. Современные требования к улучшению эффективности молекулярно-эпидемиологических исследований направлены в основном на увеличение размеров используемых выборок и максимальное соответствие между группами пациентов и контролем по всем общим для них параметрам. Однако подобный подход также имеет свои ограничения, которые напрямую связаны с размерами существующих на сегодняшний день коллекций ДНК, а также с доступностью технологий, позволяющих проводить масштабное генотипирование (1туап'йо\ ЕЖ, 2008). Таким образом, возникает необходимость в разработке альтернативных путей поиска генетических полиморфизмов, повышающих риск развития онкологических заболеваний.

В настоящей работе был использован оригинальный подход к формированию групп пациентов и контроля. Вместо использования случайных выборок, мы оценивали встречаемость изучаемых полиморфизмов в группах, характеризующихся повышенной предрасположенностью и толерантностью к развитию онкологических заболеваний. Отбор пациенток в группу РМЖ производился с учетом наличия следующих признаков: раннее начало заболевания, наличие больных родственников и первично-множественная форма РМЖ. Условий для отбора пациентов с раком легкого в исследуемую выборку было два: раннее начало заболевания и тот факт, что появление опухоли произошло на фоне низкого потребления табачных изделий или у некурящих. В качестве контрольных групп были использованы пожилые онкологически здоровые индивидуумы (женщины и мужчины-курильщики 75 лет и старше), которые, на наш взгляд, обладают повышенной резистентностью к возникновению злокачественных новообразований. Для полиморфизмов, отобранных на этом этапе работе, было проведено традиционное молекулярно-эпидемиологическое исследование.

На основе описанного выше подхода был проведен двухстадийный систематический анализ кодирующих несинонимичных аллельных вариантов генов-участников процесса программируемой клеточной гибели, и изучено их влияние на риск развития рака молочной железы и рака легкого.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы являлась оценка роли аллельных вариантов генов апоптоза в формировании риска рака молочной железы и рака легкого.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) С помощью баз данных интернет-ресурса National Center for Biotechnology Information (NCBI) отобрать все кодирующие несинонимичные полиморфизмы основных генов-участников апоптоза, популяционная частота которых была ранее верифицирована и составляет не менее 1%.

2) Проанализировать и сравнить распределение частот генотипов и аллелей изучаемых генов в группах повышенного онкологического риска (пациентки, имеющие признаки наследственного РМЖ) и онкологической толерантности (пожилые онкологически здоровые женщины).

3) Проанализировать и сравнить распределение частот генотипов и аллелей изучаемых генов в группах повышенного риска рака легкого (малокурящие или некурящие пациенты с PJI) и онкологической толерантности (пожилые онкологически здоровые мужчины-курильщики).

4) Выявить генетические варианты с достоверно различающейся частотой в группе экстремального онкологического риска и в группе толерантности и провести их сравнительный анализ в молекулярно-эпидемиологическом исследовании с традиционным подходом к формированию групп «случай» и «контроль».

Научная новизна полученных результатов

В настоящей работе впервые было проведено систематическое молекулярно-эпидемиологическое исследование полиморфизмов генов апоптоза, направленное на выявление низкопенетрантных генетических факторов, влияющих на предрасположенность к онкологическим заболеваниям, в частности, к раку молочной железы и раку легкого.

Практическая значимость

Проведенное исследование генного полиморфизма вносит вклад в разработку ДНК-тестов, направленных на выявление групп повышенного онкологического риска. Полученные значения встречаемости изученных полиморфизмов могут быть в дальнейшем использованы в молекулярно-эпидемиологических исследованиях, посвященных изучению роли апоптоза как в патогенезе рака, так и других заболеваний.

Основные положения, выносимые на защиту

1) Альтернативой традиционному молекулярно-эпидемиологическому исследованию может служить использованный в работе оригинальный подход к формированию групп пациентов и контроля, характеризующихся повышенной предрасположенностью и толерантностью (соответственно) к развитию онкологических заболеваний.

2) Более трети от всех полиморфных вариантов, выбранных с помощью базы Entrez SNP интернет-ресурса National Center for Biotechnology Information (NCBI) на основании верифицированной частоты, не были обнаружены в изученной популяции.

3) Не выявлена ассоциация между исследованными полиморфизмами генов апоптоза и риском развития рака легкого или рака молочной железы, что ставит под сомнение предположение о вовлеченности генетически обусловленного полиморфизма апоптотических механизмов в онкологическую предрасположенность.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на научно-практической конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии» (21-23 сентября 2006, Иркутск, Россия), на конференции INTAS «Genomics & Proteomics Workshop 2007» (6-8 September 2007, Киев, Украина), на научной межлабораторной конференции НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова (12 октября 2007 г., Санкт-Петербург, Россия) и на конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения — 2008» (18 апреля 2008 г., Санкт-Петербург, Россия).

Структура п объем диссертации

Диссертация изложена на 125 страницах и состоит из введения, обзора литературы, глав материалов и методов, результатов исследований, обсуждения полученных данных и выводов. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 15 рисунками. Библиографический указатель включает 252 публикации, в том числе 6 отечественных и 246 зарубежных.

1) Систематический анализ полиморфизмов генов апоптоза подтвердил встречаемость генетических вариантов Bid (G10S), Casp2 (L141V), Casp5 (А90Т, V318L), Casp7 (E255D), Casp8 (H302D), Casp9 (V28A, H173R, R221Q), CasplO (I479L), FAIM (T117A, S127L), DR4 (R141H, T209R, A228E, K441R), Survivin (K129E), TNFR1 (Q121R), XIAP (P423Q) в изучаемой популяции.2) Кодирующие полиморфизмы апоптотических генов (Bid (G10S), Casp2 (L141V), Casp5 (А90Т, V318L), Casp7 (E255D), Casp8 (H302D), Casp9 (V28A, H173R, R221Q), CasplO (I479L), FAIM (T117A, S127L), DR4 (R141H, T209R, A228E, K441R), Survivin (K129E), TNFR1 (Q121R), XIAP (P423Q)) не ассоциированы с увеличенным риском развития рака молочной железы.3) Кодирующие полиморфизмы апоптотических генов (Bid (G10S), Casp2 (L141V), Casp5 (А90Т, V318L), Casp7 (E255D), Casp8 (H302D), Casp9 (V28A, H173R, R221Q), CasplO (I479L), FAIM (T117A, S127L), DR4 (R141H, T209R, A228E, K441R), Survivin (K129E), TNFR1 (Q121R), XIAP (P423Q)) не ассоциированы с увеличенным риском развития рака легкого.4) Необычное распределение генотипов полиморфизма гена Casp5 А90Т может быть связано с различными шансами достижения долголетия у их носителей (PHWE = 0,003).5) В целом, результаты проведенной работы ставят под сомнение предположение о вовлеченности генетических вариаций в системе апоптоза в формирование онкологического риска.