Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Роль полиморфных генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и гена Р53 в патогенезе онкологических заболеваний

003474803

На правах рукописи

ДМИТРИЕВА Алла Ивановна

РОЛЬ ПОЛИМОРФНЫХ ГЕНОВ ФЕРМЕНТОВ БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ И ГЕНА Р53 В ПАТОГЕНЕЗЕ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

14.00.16 - патологическая физиология 14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

2 3 1М 2009

Томск-2009

003474803

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, заслуженный деятель науки РФ

доктор медицинских наук

Новицкий

Вячеслав Викторович

Севостьянова Наталия Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Агафонов

Владимир Иванович

Степовая Елена Алсксссвна

Кондакова Ирина Викторовна

Ведущая организация: ГУ Российский онкологический центр имени H.H. Блохина РАМН

Защита состоится «_»_2009 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН по адресу: 634028, г. Томск, пр. Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН.

Автореферат разослан « ¿>4 » 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук "''л/ Е.Н. Амосова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние десятилетия отмечается большой рост и «омоложение» онкологических заболеваний. Существенными причинами увеличения числа злокачественных новообразований являются, с одной стороны, ухудшение социально-экономических условий, снижение жизненного уровня населения, распространение табакокурения, алкоголизма, загрязнение окружающей среды, с другой - недостаточный уровень профилактических мероприятий в сфере онкологии, и в том числе пропаганды среди населения знаний по профилактике злокачественных новообразований, а также по соблюдению здорового образа жизни, недостатки в организации и качестве медицинской помощи больным.

Онкогенез, как и любой морфогенетический процесс, является результатом действия многих генов так называемой генной сети, в которой онкогенам и генам-супрессорам отводится главная роль, а другим генам, в том числе генам биотрансформации ксенобиотиков - роль модификаторов функций главных генов (Kinzler K.W., Vogelstein В., 1997; Баранов B.C. и соавт., 2ООО; Колчанов H.A. и соавт., 2000; Пальцев М.А., 2004,Горбунова В.Н., Имянитов E.H., 2007; Имянитов E.H., Хансон К.П., 2007, Давыдов М.И., 2008).

Ген р53 играет центральную роль в поддержании стабильности генома и предотвращении удвоения поврежденной ДНК, при этом белок р53 либо временно блокирует процесс деления клетки для репарации ДНК или запускает апоптоз (программированную клеточную гибель), если эти повреждения невозможно устранить. р53 является фактором активации ряда генов, которые участвуют в иншбиции клеточного цикла, активации апоптоза и угнетении ангиогенеза опухоли. Важно подчеркнуть, что р53-зависимый апоптоз элиминирует из организма не только поврежденные клетки, но и клетки, в которых наблюдается нерегулируемая стимуляция пролиферации, вызываемая, например, онкогеном. Тот факт, что 50% опухолей содержит мутантный р53 в соматических клетках опухоли, подтверждает важную роль р53 в онкогенезе.

К изменению функциональной активности белков-онкосупрессоров в определенных условиях могут предрасполагать генетические полиморфизмы (Тюляндин С.А., 2000; Имянитов E.H., 2007; Бочков Н.П., 2008).

В качестве генов-модификаторв главных генов нередко могут выступать и гены «внешней среды», ответственные за метаболизм и инактивацию ксенобиотиков, в том числе табачного дыма, различных промышленных, сельскохозяйственных ядов и пр. (Wolf C.R., 1994; Foppa I., Spiegelman D., 1997; Le Marchand L. et al., 1998; Saarikoski S.T. et al., 1998; Garcia-Closas M., Lubin J.H., 1999; Spitz MR. et al., 2000; He J.-Q. et al., 2002; Perera F.P. et al., 2002; Пальцев M.A., 2004, Бочков Н.П., 2006; Копшш Б.П., 2006; Имянитов E.H., Хансон К.П., 2007).

Индивидуальная чувствительность к канцерогенным воздействиям определяется двумя основными явлениями: многостадийным характером процесса канцерогенеза и генетическим полиморфизмом факторов, играющих ведущую роль на каждом его этапе. Генетический полиморфизм, вовлеченный в метаболизм канцерогенов, исследуется в качестве возможного фактора риска возникновения различных онкологических заболеваний (Alexandrie А.-К. et al., 1994; Баранов B.C.,

2004; Пальцев М.А., 2004, Имянитов E.H., Хансон К.П., 2007; Давыдов М.И., 2008). Поступающие в организм чужеродные вещества (химические агенты, лекарственные средства, вирусы и др.) подвергаются метаболизму с участием ферментативной системы биотрансформации жирорастворимых эндогенных и экзогенных соединений в полярные водорастворимые производные. Как известно, процесс биотрансформации включает в себя две последовательные стадии. Ферменты первой фазы связывают ксенобиотики с образованием мутагенных промежуточных метаболитов (таких, как супероксид-анион-радикал и ароматические углеводороды), которые под действием ферментов второй фазы превращаются в нетоксичные для клетки водорастворимые продукты, легко выводимые из организма.

Генетически запрограммированная система биотрансформации, деградации и выведения ксенобиотиков делает каждого индивидуума уникальным в отношении его адаптационных способностей, т.е. устойчивости или чувствительности к повреждающим внешним факторам.

У человека наиболее активно в метаболизме канцерогенов участвуют несколько изоформ цитохрома Р-450. К ним в первую очередь относятся изоформы CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2E1 и CYP3A4. Так, для одной из изоформ цитохрома Р-450 - CYP1 AI, метаболизирующей канцерогенные углеводороды, была показана корреляция между наличием мутации Val —» Ile в 462 кодоне 7 экзона (в двух аллелях) и увеличением риска возникновения рака легкого в 9 раз при курении сигарет даже в умеренном количестве, вторым условием проявления данной корреляции было отсутствие активности фермента второй фазы детоксикации ксенобиотиков GSTM1 - глутатион-Б-трансферазы Ml [Hayashi S. et al., 1992; Alexandrie A.K. et al., 1994; Bartsch H., Hietanen E., 1996; Garcia-Closas M. et al., 1997; Пальцев M.A., 2004, Горбунова B.H., Имянитов E.H., 2007; Имянитов E.H., Хансон К.П., 2007]. Кроме того, наличие мутации в данном гене ассоциировано с повышенным риском развития рака молочной железы, рака простаты, колоректалыюго рака и рака почки. Для полиморфного гена CYP1B1 показана роль в развитии рака мочевого пузыря, опухолей мозга, рака почки, простаты, яичников, матки.

Делеционные формы генов глутатионтрансфераз GSTT1 и GSTM1, приводящие к отсутствию функции соответствующих ферментов, рассматриваются в качестве факторов риска возникновения рака легкого, рака молочной железы, пищевода, рака шейки матки, мочевого пузыря, неполипозного рака кишки.

В настоящее время обсуждается роль патологического аллеля гена GSTP1 в развитии рака легкого, мочевого пузыря, простаты.

У индивидуумов с наследственно ослабленным генотипом инактивация ксенобиотиков, в том числе промышленных, сельскохозяйственных ядов и лекарственных средств, должна происходить особенно медленно и, соответственно, условия неблагоприятного действия вредных метаболитов на организм особенно реальны.

Представленные материалы свидетельствуют о принципиальной возможности использования молекулярно-генетических тестов для лабораторного скрининга злокачественных опухолей человека как метода формирования групп повышенного онкологического риска. Вероятно, полиморфизмы генов ферментов

биотрансформации ксенобиотиков могут быть использованы в качестве дополнительных маркеров при ранней диагностике рака. Окончательная оценка практической ценности генетических маркеров рака требует продолжения научных исследований в данном направлении.

Все сказанное определяет актуальность изучения полиморфизма генов ферментов биотрансформации и оценки их взаимосвязи, а также гена белка-онкосупрессора р53 с риском развития опухоли и особенностями клинико-морфологического проявления злокачественных новообразований различной локализации.

Цель исследования: установить роль полиморфных генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков, их комбинаций и гена р53 в патогенезе онкологических заболеваний.

Задачи исследования:

1. Оценить распределение вариантных генотипов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков (СУР1А1, ОБГЛ, 08ТМ1, С8ТР1) и гена р53 у больных злокачественными новообразованиями различных локализаций (рак легкого, рак желудка, рак толстой кишки, рак предстательной железы).

2. Установить связь функционально неполноценных генотипов исследуемых генов с риском развития онкологических заболеваний и клинико-морфологическими особенностями опухолей.

3. Оценить распределение вариантных генотипов ферментов биотрансформации ксенобиотиков среди больных с распространенным злокачественным процессом.

4. Провести сравнительный анализ комбинаций вариантных генотипов ферментов биотраисформации ксенобиотиков у всех обследованных больных и выявить специфичные сочетания, предрасполагающие к развитию рака легкого, рака предстательной железы, рака желудка, рака толстой кишки.

5. Определить способы инактивации генов С8ТТ1, С5ТМ1 и 08ТР1 в опухолевых клетках легкого и установить роль гиперметилирования промотора гена СБТР! в развитии злокачественной трансформации клеток легкого.

6. Выявить особенности распределения вариантных генотипов СУР1А1, ОБ'ГП, С5ТМ1, ОЯТР! и р53 у больных раком легкого в зависимости от причастности к курению.

Научная новизна: В настоящей работе впервые проведено комплексное исследование роли генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и гена р53 в патогенезе онкологических заболеваний различных локализаций и выявлена связь неблагоприятных сочетаний генов СУР1А1, 05ТТ1, СБТШ, 08ТР1 с риском развития опухоли определенной локализации и ее клинико-морфологическими особенностями. Также впервые проанализированы механизмы участия полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков, их комбинаций и гена белка-онкосупрессора р53 в развитии злокачественных новообразований.

Получены новые данные сравнительного анализа по участию глутатион-8-трансфераз в патогенезе рака легкого, желудка, толстой кишки и предстательной железы.

Обосновано, что баланс активации/инактивации канцерогенов складывается из соотношения активностей реакций I и Г1 фаз биотрансформации ксенобиотиков (СУР1А1, СБТИ, С5ТМ1, С8ТР1) и может влиять на степень риска развития рака. Частота функционально неполноценных генотипов цитохрома Р-4501А1, глутатион-Б-трансфераз Т1, М1, Р1 и Про-аллеля гена р53 у обследованных по итогам проведенного исследования онкологических больных превышает таковую у здоровых лиц. Впервые выявлена взаимосвязь носительства патологических вариантов генов СУР1А1, СБТП, С8ТМ1, вБТР! и гена р53 с. наличием очагов метастазирования у больных раком легкого и раком желудка, со стадией злокачественного процесса у больных раком предстательной железы.

Получены новые данные, касающиеся профиля поражения генов глутатион-5-трансфераз в опухолях легкого, учитывающие все возможные способы инактивации генов данного семейства. Выявлена роль гиперметилирования промотора гена С8ТР1 и его сочетаний с полиморфными вариантами генов С5ТГ1, СБТМ1 и в8ТР1 в патогенезе рака легкого.

Установлено значительное увеличение частоты функционально неполноценных генотипов исследованных генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков у курящих больных раком легкого по сравнению с некурящими пациентами.

Впервые обосновано, что суммарное влияние функционально неполноценных вариантов генов цитохрома Р-450 и глутатион-8-трансфераз Т1, М1, Р1 превышает эффект индивидуальных вариантных генотипов, что увеличивает риск развития злокачественных новообразований. В результате сравнительного анализа выявлены комбинации генотипов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков, предрасполагающие к развитию рака легкого, рака предстательной железы, рака желудка и рака толстой кишки, а также определены протекторные комбинации в отношении злокачественных новообразований

Теоретическая и практическая значимость. Полученные по итогам проведенного исследования данные фундаментального характера, касающиеся полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков: цитохрома Р-4501А1 и глутатион-Б-трансфераз Т1, М1, Р1 и их комбинаций при опухолях легких, предстательной железы, желудка и толстой кишки, существенно расширяют имеющиеся представления о молекулярно-генетических механизмах возникновения и развития злокачественных новообразований. Установление роли полиморфизма генов СУР1А1, СБТИ, С8ТМ1 и 08ТР1 и их комбинаций в развитии злокачественных опухолей обосновывает возможность рекомендовать определение этих показателей в качестве диагностических параметров для выявления групп повышенного онкологического риска. Результаты исследования могут быть положены в основу разработки новых патогенетически оправданных подходов к профилактике и ранней диагностике онкологических заболеваний, а также прогнозированию клинического течения злокачественных опухолей.

Положения, выносимые на защиту: 1. Вал-аллель цитохрома Р-450 СУР1А1, делеционные варианты генов глутатион-8-трансфераз Т1, М1 и Р1 играют важную роль в этиопатогенезе рака легкого, рака желудка, рака толстой кишки и рака предстательной железы, поскольку доля

вариантных генотипов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков у онкологических больных статистически значимо превышает таковую у здоровых лиц.

2. Полиморфные варианты генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков СУР1А1 ОБТП, СБТМ!, ОБТР1 и гена онкосупрессора 53 участвуют в формировании повышенного риска возникновения злокачественных новообразований легкого, предстательной железы, желудка и толстой кишки.

3. Вариантные генотипы СУР1А1, ОБТП, С8ТМ1, й8ТР1 ассоциированы с клинико-морфологическими особенностями злокачественных новообразований легкого и предстательной железы и способствуют формированию неблагоприятного прогноза опухолей данных локализаций.

4. При мсстнораспространенном злокачественном процессе частота распределения вариантных генотипов генов СУР1А1, ОБТП, 08ТМ1 и гена онкосупрессора р53 превышает таковую при локализованном росте опухоли, что указывает на участие этих генов в процессе метасгазирования.

5. Курение модулирует риск развития рака легкого, особенно его немелко клеточной формы, при носительстве делеционных генотипов С8ТТ1, 08ТМ1, Вал-аллеля гена СУР! А1 и Про-аллеля гена р53.

6. Суммарное влияние функционально неполноценных вариантов генов цитохрома Р-450 и глутатион-Б-трансфераз Т1, М1, Р1 превышает эффект индивидуальных вариантных генотипов, что увеличивает риск развития злокачественных новообразований. Выявлены специфичные комбинации генотипов, предрасполагающие к развитию рака легкого, рака предстательной железы, рака желудка и рака толстой кишки; определены интактные и протекторные комбинации полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в отношении злокачественных новообразований

Апробация и реализация работы. Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на конгрессах Российского общества онкологов (г.Баку и г.Москва, 2005, 2006); на X Российском онкологическом конгрессе (г.Москва, 2006), на Российско-американской конференции «Профилактика и лечение злокачественных опухолей, связанных с курением» (г.Москва, 2006), на научно-практической конференции с международным участием «Современные методы лечения онкологических больных: достижения и неудачи» (г.Барнаул, 2006), на I конгрессе Российского общества онкоурологов (г.Москва, 2006); на региональной конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (г.Томск, 2006); на 5 региональной научно-практической конференции урологов Сибири «Актуальные вопросы детской и взрослой урологии» (г.Томск, 2006); на конференции Всероссийской школы молодых онкологов «Актуальные вопросы онкоуролоши» (г.Москва, 2006), на научно-практической конференции с международным участием «Профилактика и лечение злокачественных новообразований в современных условиях» (г.Барнаул, 2007), на XI Российском онкологическом конгрессе (г.Москва, 2007), на II Российском симпозиуме «Молекулярно-генетическая диагностика злокачественных опухолей человека» (г.Москва, 2009).

s

Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедры патофизиологии (раздел «Патофизиология опухолевого роста»), кафедры биологии и генетики (разделы «Молекулярная генетика», «Популяционная генетика»), в лекционном курсе по молекулярной генетике для студентов медико-биологического факультета ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Росздрава, а также в практической деятельности ОГУЗ «Томский областной онкологический диспансер», в научно-практической деятельности НИИ гастроэнтерологии имени Г.К. Жерлова ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 24 работы, из нихЮ статей в ведущих рецензируемых журналах из «Перечня...» ВАК РФ, 14 статей и тезисов в материалах конференций, конгрессов, съездов.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 240 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 57 таблицами. Библиографический указатель включает 377 источников, из них 177 отечественных и 200 зарубежных.

ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В основу настоящей работа положены результаты комплексного клинико-лабораторного обследования 255 больных раком легкого, 133 больных раком предстательной железы, 90 больных раком желудка и 66 больных раком толстой кишки (рак ободочной кишки, рак сигмовидной кишки) (табл. 1).

В исследование были включены 255 больных раком легкого. Все они были радикально прооперированы в период с 2003 по 2007 год в онкологическом отделении ОГУЗ «Томский областной онкологический диспансер» («ТООД») г.Томска, в торако-абдоминальном отделении (зав. отделением - д.м.н. С.А. Тузиков) НИИ онкологии СО РАМН г.Томска. Среди этих пациентов было 232 мужчины и 23 женщины, средний возраст которых составил 56±9 лет. Диагноз рака легкого основывался на данных анамнеза и результатах рентгенологического, эндоскопического и морфологического обследований. Для формирования групп больных без метастазов (T1-4N0M0, 45,9% случаев, п=118) и больных, имевших очаги метастазирования в регионарных лимфоузлах и/или в отдаленных органах (T1-4N0-2M0-1, 54,1% случаев, п=137 пациентов) использовалась международная классификация рака легкого по системе TNM (1997г.). Гистологический тип опухоли определяли в соответствии с классификацией ВОЗ 1981г. Данное исследование проводилось в диагностическом отделении ОГУЗ «ТООД» (заведующий - д-р мед. наук Н. В. Севостьянова) и в отделении патологической морфологии НИИ онкологии СО РАМН (руководитель - д-р мед. наук, профессор В. М. Перельмутер). Во всех гистологических образцах уточнялся морфологический диагноз на основании унифицированных критериев различных типов рака легких в

соответствии с современной гистологической классификацией (Colby T.V. et al., 1995).

Мелкоклеточный рак легкого был диагностирован в 46 случаях (18%, среди которых 5 женщин и 41 мужчина), немелкоклеточный рак легкого - в 209 случаях (82%, среди которых 18 женщин и 191 мужчина). В группу немелкоклеточного рака легкого вошли плоскоклеточный PJI, аденокарциномы и крупнокяеточный РЛ.

В группу больных раком предстательной железы вошли 133 мужчины, средний возраст которых составил 74±8 года, которые в период с 2005 по 2007 год были поставлены на диспансерный учет в ОГУЗ «ТООД» и НМУ «Лечебно-диагностический центр» г.Томска. Диагноз рак предстательной железы основывался на данных анамнеза, результатах ультразвуковой и лабораторной диагностики, рентгенологического, морфологического и эндоскопического обследований. Для формирования групп больных в соответствии со стадией заболевания была использована отечественная четырехстадийная классификация. Среди обследованных больных не оказалось ни одного с первой стадией процесса, вторая стадия была установлена у 41 больного, третья - у 60 и четвертая - у 32 пациентов.

В исследование были включены 90 больных раком желудка, которые находились на диспансерном учете и стационарном лечении в ОГУЗ «ТООД» в период с 2005 по 2007 год. Среди этих пациентов было 41 женщина и 59 мужчин, средний возраст которых составил 59±12 лет. Диагноз рака желудка основывался на данных анамнеза и результатах рентгенологического, эндоскопического и морфологического обследований.

Для формирования групп больных без метастазов (T1-4N0M0, 68,9% случаев) и пациентов, имевших очаги метастазирования в регионарных лимфоузлах и/или в отдаленных органах (T1-4N0-2M0-1, 31,1% случаев), использовалась международная классификация рака по системе TNM (1997г.). Гистологическое исследование бионсийного и операционного материала больных (выполнено в лаборатории патоморфологии диагностического отделения ОГУЗ «ТООД») позволило разделить всех больных раком желудка на 2 группы в соответствии с классификацией P.Lauren (1956): в первую группу (п=54) вошли пациенты, имеющие интестиналышй гистотип (аденокарцинома), во вторую (п=36) -диффузный тип рака желудка, представленный мелко-, полиморфно-, и перстневидноклеточным раком.

В группу больных раком толстой кишки вошли 66 пациентов (39 женщин и 27 мужчин), средний возраст которых составил 69±8 лет, которые в период с 2005 по 2007 год были поставлены на диспансерный учет в ОГУЗ «ТООД» и радикально прооперированы в сочетании с химиотерапией. Диагноз рака толстой кишки основывался на данных анамнеза и результатах рентгенологического, эндоскопического и морфологического исследований.

Для формирования групп больных без метастазов (T1-4N0M0, п=40) и пациентов, имевших очаги метастазирования в регионарных лимфоузлах и/или в отдаленных органах (T1-4N0-2M0-I, п=26), использовалась международная классификация злокачественных новообразований по системе TNM (1997г.).

Взятие клинического материала у всех обследованных лиц производилось однократно до начала лечения. Впоследствии больным раком легкого проводилось комбинированное лечение (хирургическое лечение и лучевая терапия/ химиотерапия). Больные раком предстательной железы после постановки диагноза в большинстве случаев получали гормональную (антиандрогенную) или комплексную терапию. Больным раком желудка и кишечника проводились радикальные операции в сочетании с химио-/ лучевой терапией. Из исследования были исключены больные с обострением хронических воспалительных процессов, аутоиммунными заболеваниями, наследственными и психическими болезнями.

Таблица 1

Распределение обследованных лиц по группам наблюдения в соответствии с использованными методами исследования

Методы исследования Количество наблюдений

Здоровые доноры Больные раком легкого Больные раком предстательной железы Больные раком желудка Больные раком толстой кишки

1. Определение полиморфизма генов С5ТТ1,05ТМ1 231 255 131 90 66

2. Анализ полиморфизма гена ОБТР1 231 255 131 90 66

3. Определение гиперметилирования промотора гена 08ТР1 - 30 - - -

4. Анализ полиморфизма гена СУР1А1 231 255 131 90 66

5. Анализ полиморфизма гена р53 231 255 131 90 66

6. Анализ комбинаций полиморфных вариантов генов ОБТИ, 08ТМ1, С5ТР1, СУР1А1, р53 231 255 131 90 66

Группу сравнения составили здоровые лица (первичные и штатные доноры крови ОГУЗ «Томская областная станция переливания крови») (231 обследованный с сопоставимыми характеристиками по полу и возрасту).

Средний возраст онкологических больных оказался равным 56±9 лет, здоровых доноров - 49±5 лет, что позволило сделать заключение о возможности сопоставления обследованных лиц по их возрастной характеристике. При этом наибольшее количество обследованных больных и здоровых доноров составляли мужчины среднего возраста. Во все обследованные группы больных и в контрольную группу здоровых были включены индивидуумы только европеоидного

происхождения, поскольку существуют значительные межрасовые различия в распределении исследуемых генотипов и аллелей.

Материалом для исследования полиморфизмов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков, цитохрома CYP1A1, GSTT1, GSTM1, GSTP1 (кодируют соответственно глутатион S-трансферазы 91, pl и л1), гена-супрессора опухолевого роста р53 явилась ДНК, выделенная из лейкоцитов венозной крови стандартным методом с использованием фенол-хлороформной очистки [Lahiri D.K. et al., 1992].

В работе был изучен Mspl-полиморфизм (Ile/Val) гена CYP1A1, кодирующего фермент арилгидрокарбонгидроксилазу и участвующего в активации полициклических углеводородов [Белогубова Е.В. и соавт., 2004]. Типирование образцов по генам GSTT1 и GSTM1 проводили путем мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) [Spurdle А.В. et al., 2001] (рис. 1).

ER

GSTT1 GSTM1

Рис. 1. Примеры идентификации 0/0 и + генотипов по генам GSTTI и GSTMI: ER - контроль амплификации (183 п.н.); 1 - генотип GSTT1 0/0 GSTM1 0/0; 2, 5,1 - GSTT1 + GSTM1 + (131 и 114 п.н. соответственно); 3,4, 6 - GSTTI 0/0 GSTM1 +; 8 - GSTTI + GSTM1 0/0.

Для гена GSTP1 определяли полиморфизм, связанный с наличием в пятом экзоне гена «дикого типа» или «мутантного» аллелей, характеризующихся соответственно наличием или отсутствием сайта рестрикции для BSTMA I [Miller D. Р., 2002].

Гомозиготную делецию (del 105/deLl05) гена GSTP1 определяли по наличию на электрофореграммах фрагментов, размером 91 и 85 п.н., гетерозиготную делецию (GSTPl/dell05) выявляли по присутствию на электрофореграммах трех фрагментов, размером 176, 91 и 85 п.н. Наличие на электрофореграмме одного фрагмента, размером 176 п.н., свидетельствовало о наличии нормального (без делеции) гена GSTP1 (рис. 2).

Для изучения метилирования промотора гена GSTP1 из опухолевого материала больных раком легкого выделяли ДНК (метод фенол-хлороформной очистки). Перед постановкой метил-специфичной ПЦР [Jeronimo, С., 2001, Susan V.H., 2002] ДНК подвергалась бисульфитной модификации и очистке с помощью

набора реактивов«Wizard DNA clean-up system», Promega [Jeronimo, C., 2001, Susan V.H. 2002]. Наличие сайта метилирования определяли по присутствию на электрофореграмме участка, длиной 173 п.н., контролем амплификации служило обязательное наличие на электрофореграмме участка ДНК такой же длины, соответствующее неметилированной области гена GSTP1.

Рис. 2. Идентификация полиморфизма аллелей методом ПДРФ:

1, 2,3, 8, 9 - генотип ОБТРШеПОб (176, 91 и 85 п.н.); 4, 5, 6 - генотип ОБТР1 (176 п.н.); 7 -генотип вЭТР! <1е1105/<1е1105 (91 и 85 п.н.).

Исследование Аг^го-полиморфизма кодона 72 гена р53 проводили методом ПЦР/ПДРФ-анализа. Арг/про-полимофизм гена р53 выявлялся эндонуклеазой рестрикции Е^РМЬ

При оценке полученных данных были использованы методы статистического описания, а также методы проверки статистических гипотез [Лакин Г.Ф., 1980, Сергиенко В.И., Бондарева И.Б., 2006]. Для анализа имеющихся выборок данных использовали гипотезу нормальности распределения (критерий Колмогорова-Смирнова). При соответствии нормальному закону распределения признака в исследуемых выборках проверку гипотезы о равенстве средних выборочных величин проводили с использованием 1:-критерия Стьюдента. Для оценки достоверности различий выборок, не подчиняющихся критерию нормального распределения, использовали непараметрический критерий Манна-Уитни (и-тест). Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05 [Лакин Г.Ф., 1989; Сергиенко В.И., Бондарева И.Б., 2006].

При сравнении частот генотипов использовался стандартный критерий %2 Пирсона. При условии, когда объем выборки не превышал 5 случаев, использовали двусторонний критерий Фишера. Относительный риск (011) развития заболевания при определенном генотипе рассчитывался по стандартной формуле ОЯ=а/Ь х ё/с, где а и Ь - количество больных, имеющих и не имеющих мутантный генотип, соответственно, и ё и с — количество человек в контрольной группе, имеющих и не имеющих мутантный генотип. ОЯ указан с 95%-ным доверительным интервалом [Флейс Д., 1989].

91 п.н. 85 п.н.

176 п.н.

С целью обнаружения связи между исследуемыми показателями проводили корреляционный анализ путем вычисления коэффициента ранговой корреляции Спирмена (г). Коэффициент корреляции считали значимым, если вероятность ошибки не превышала 0,05 (5%).

Таблица 2

Последовательность праймеров и условия проведения ПЦР-ПДРФ-анализа

Ген Последовательность праймеров t" отжига, •с Длина продукта ПЦР, п.н. Эндонуклеаза рестрикции Длина продуктов ПДРФ, П.Н.

CYP1A1 F:5'-TAG-GAG-TCT-TGT-CTC-ATG-CC-3', R: 5'-GCA-CTT-AAG-CAG-TCT-GTT-TGA-G-3' («Медиген») 55 389 Mspl 208,110

ER F: 5'-CAA-GTC-TCC-CCT-CAC-TCC-CC-3'; R: 54}TG-CGA-GTG-GCT-CAG-TGT-GT-3' («Сибэнзим») 65, 63, 61 183

GS'ITl F: 5'-GGT-CAT-TCT-GAA-GGC-CAA-<JG-3'; R: 5'-TTT-GTG-GAC-TGC-TGA-GGA-CG-3' («Сибэнзим») 65, 63 61 131

GSTM1 F: 5'-TGC-TTC-ACG-TGT-TAT-GGA-GGT-TC-3'; R: 5'-GTT-GGG-CTC-AAA-TAT-ACG-GTG-G-3 '(«Сибэнзим») 65, 63 61 114 -

GSTP1 F: 5-ACC-CCA-GGG-CTC-TAT-GGG-AA-3'; R:5'-TGA-GGG-CAC-AAG-AAG-CCC-CT-3' («Медиген») 64 176 BSTMA1 91,85

GSTl'l met F; 5'-TTC-GGG-GTG-TAG-CGC-TCG-T-3'; R: 5'-GCC-CCA-ATA-CTA-AAT-CAC-GAC-3' («Медиген») 62 173

GSTP1 unmet F: 545AT-GTT-TGG-GGT-GTA-GTG-GTT-GT-3'; R:5'-CCA-CCC-CAA-TAC-TAA-ATC-ACA-AC-3' («Медиген») 62 173

p53 F:5'-TTG-CCG-TCC-CAA-GCA-ATG-GAT-GA-3'; R: 5'-TCT-GGG-AAG-GGA-CAG-AAG-ATG-AC-3' («Медиген») 62,5 199 BstFNI 113, 86

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Большинство онкологических заболеваний по своей природе являются мультифакториальными, так как в механизмы их возникновения и развития вовлекаются много разных функционально взаимосвязанных генов (генные сети), включающих, наряду с главными генами (онкогены и гены-супрессоры), другие, второстепенные, так называемые гены-модификаторы, эффект которых во многом определяется средовыми факторами [Kinzler K.W., Vogelstein В., 1997; Баранов B.C. и соавт., 2000; Колчанов H.A. и соавт., 2000; Пальцев М.А., 2004;Горбунова В.Н., Имянитов E.H., 2007; Давыдов М.И. и соавт., 2008].

Вероятность возникновения в одной клетке нескольких генетических изменений резко повышается при нарушении работы систем, контролирующих целостность генома. В связи с этим нарушения, ведущие к генетической нестабильности, также являются неотъемлемым этапом опухолевой прогрессии [Курчин В.П., 2003; Копнин Б.П., 2006; Бочков Н.П., 2008]. Факторы, участвующие

в развитии онкопатологии, реализуются в человеческой популяции с высокой степенью вариабельности. В последнее время интенсивно развивается молекулярная эпидемиология, целью которой является поиск и практическое применение специфичных, чувствительных и обладающих прогностической информативностью маркеров патогенного воздействия окружающей среды и маркеров предрасположенности индивидов к злокачественным новообразованиям [Баранов B.C.и соавт., 2000; Давыдов М.И., 2006; Горбунова В.Н., Имянитов Е.Н., 2007].

К изменению функциональной активности белков-онкосупрессоров п определенных условиях могут предрасполагать генетические полиморфизмы (ГП) [Тюляндин С.А., 2000]. Полиморфными являются гены, представленные в популяции несколькими разновидностями - аллелями. В отличие от мутаций, приводящих к патологическим изменениям, влияние генетического полиморфизма на фенотип выражено менее отчетливо. Являясь в основном нейтральными, полиморфизмы меньше подвергаются естественному отбору, а поэтому их частота в популяции нередко весьма значительна. С другой стороны, генетические полиморфизмы далеко не всегда проявляются как нейтральные мутации. Значительно чаще ГП приводят к появлению белковых продуктов с несколько измененными физико-химическими свойствами и, соответственно, параметрами функциональной активности. При этом известно, что различные аллельныс варианты генов в зависимости от географических условий, диеты, этнической принадлежности могут предрасполагать, либо, напротив, препятствовать проявлению того или иного заболевания. Гены, аллельные варианты которых предрасполагают к определенным заболеваниям, получили название генов предрасположенности [Kinzler K.W., Vogelstein В., 1997; Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А, 2002; Баранов B.C., 2004; Пальцев М.А., 2004; Бочков Н.П., 2006].

Проведенный нами комплексный анализ полиморфизмов генов, кодирующих ферменты фазы 1 (CYP1A1) и фазы 2 (GSTT1, GSTM1 и GSTP1) биотрансформацин ксенобиотиков, позволил выявить ряд закономерностей и более четко определить спектр генов, вовлеченных в патогенез рака легкого, рака желудка, рака толстой кишки и рака предстательной железы.

Выбор исследованных генов был не случаен. Как известно, ген CYP1A1 кодирует цитохром Р-450, экспрессия которого наиболее активна в печени и легких. Если в белке, кодируемом данным геном, изолейцин заменен на Валин, то такой фермент в 2 раза более активен, чем исходный белок, и это сопровождается увеличением концентрации токсических метаболитов и накоплением свободных радикалов [Засухина Г.Д., 2005]. В немногочисленных исследованиях [Goldstein J.A., de Morais S.M.F., 1994; Benhamou S. et al., 1997; Sadec W., 1999; Wang H. et al., 2003; Ляхович B.B. и соавт., 1997; Улыбина Ю.М. и соавт., 2005; Имянитов Е.Н., 2007] показано, что некоторые ферменты семейства цитохромов (CYP), метаболизирующие канцерогенные составляющие табака (ПАУ) и стероидные гормоны, связаны с повышенным риском злокачественных новообразований легких, пищевода, головы и шеи, раком молочной железы. Следует отметить, что основное внимание исследователей, судя по имеющимся у нас данным литературы, сосредоточено на изучении полиморфизма гена CYP1A1 у больных раком легкого. Однако, канцерогенный эффект реактивных метаболитов, образующихся с участием

цитохрома Р-450-1А1, может проявляться и в других органах и тканях, являющихся «входными воротами» для ксенобиотиков, и в которых есть экспрессия этого цитохрома. Кроме того, реактивные метаболиты могут мигрировать из тканей, в которых они образовались, например клеток печени, где происходит основной метаболизм ксенобиотиков, и оказывать влияние на другие органы и ткани [11аито Н. е! а1., 1995; Ляхович В.В. и соавт., 1997]. Желудок и кишечник являются органами, подвергающимися контакту с поступающей водой и пищей. Кроме того, они являются также интенсивно перфузируемыми органами. Поэтому эпидемиологическое значение исследуемых генотипов для рака этих локализаций может быть весьма существенным.

Полученные нами результаты исследования полиморфизма СУР1А1 в группах больных раком легкого, раком желудка, раком толстой кишки и раком предстательной железы (рис. 3) выявили достоверное увеличение частоты Вал-аллеля по сравнению со здоровыми донорами.

ОБТМ!

0 Здоровые И Больные РЛ И Больные РЖ □ Больные РТК И Больные РПЖ

Рис. 3. Частота (в %) Вал-аллеля СУР1Л1, функционально неполноценных генотипов генов 05ТТ1, 05ТМ1 и СБТР1 у больных раком легкого, раком желудка, раком толстой кишки, раком предстательной железы; * - достоверность различий по сравнению с соответствующими показателями у здоровых доноров (р< 0,05).

РПЖ Ш////////Ш//Ш/////Ш/Ш/Ш 3.43

РТК шттштжжшттшэ 4,43

РЖ

РЛ Шт/Ш/Щ/ШШШ^^^ 5,86

0 12 3 4 5 6 7

Рис. 4. Показатели относительного риска ((Ж) развития злокачественных новообразований (рака легкого - РЛ, рака желудка - РЖ, рака толстой кишки - РТК, рака предстательной железы -РПЖ) для носителей Вал-аллеля СУР1А1 при р<0,05.

Таблица 3

Частота (в %) вариантных генотипов и аллелей генов СУР1А1, ОБТГ1, СБТМ1, С$ТР1, р53 у больных ракам легкого, раком предстательной железы, раком желудка, раком толстой кишки и у здоровых доноров

Ген Генотип Здоровые (п=231) Больные РЛ, (п=255) Больные РПЖ, (п=133) Больные РЖ (п=90) Больные РТК (п=66)

GSTT1 + 81,8 51,4 60,2 88,9 77,3

0/0 18,2 48,6 39,8 11,1 22,7

Р 0,000 0,000 0,099 0,515

OR(CI95%) 4,26 (2,76-6,59) 2,98 (1,79-4,97) - -

GSTM1 + 59,7 38,8 39,8 46,7 45,5

0/0 40,3 61,2 60,2 53,3 54,5

Р 0,000 0,000 0,046 0,054

0R(CI,5%) 2.34 (1,60-3,42) 2,24 (1,42-3,55) 1,70 (1,01-2,85) 1,78 (0,99-3,21)

GSTP1 GSTP1/GSTP1 72,3 54,1 33,8 46,7) 36,4

GSTPl/dell05 24,7 32,2 50,4 53,3 63,6

dell05/dell05 3 13,7 15,8 0 0

GSTP1 84,6 70,2 59,0 73,3 68,2

del 105 15,4 29,8 41,0 26,7 31,8

Р 0,000 0,000 0,000 0,000

OR(CI95%) 2,34 (1,68-3,25) 5,10 (3,14-8,31) 2,00 (1,29-3,10) 2,57 (1,61-4,11)

СУР1А1 Иле/Иле 94,4 74,1 82,0 76,7 77,3

Иле/Вал 5,6 25,9 18,0 23,3 22,7

Вал/Вал 0 0 0 0 0

Иле 97,2 87,1 91,0 88,3 88,6

Вал 2,8 12,9 9,0 11,7 11,4

Р 0,000 0,000 0,000 0,000

OR(CI95%) 5,86 (3,03-11,53) 3,43 (1,64-7,25) 5,06 (2,39-10,85) 4,43 (1,93-10,20)

р53 Арг/арг 58,5 52,2 39,8 34,4 43,9

Арг/про 32,0 39,2 47,4 47,8 43,9

Про/про 9,5 8,6 12,8 17,8 12,2

Apr 74.5 71,8 63,5 58,3 65,9

про 25,5 28,2 36,5 41,7 34,1

Р 0,383 0,002 0,000 0,067

OR (С195%) - 1,67 (1,19-2,35) 2,08 (1,43-3,04) -

Примечание: р - уровень статистической значимости различий параметров, достигнутый с помощью теста Хи-квадрат с поправкой Йейтса, по сравнению с аналогичными показателями у здоровых доноров; (Ж - относительный риск развития злокачественного новообразования.

Так, СЖ в группах обследованных составил 5,86; 5,06; 4,43; 3,43, соответственно, при р<0,05 (рис. 4). Таким образом, проведенные нами исследования полиморфизма СУР1А1 свидетельствуют, что наличие мутантного Вал-аллеля является фактором риска рака для всех изученных нами локализаций опухолей.

Поскольку в литературе нам не встретились данные по распределению вариантных аллелей СУР1А1 в зависимости от клинико-морфологических особенностей опухолевого роста изученных локализаций, мы провели исследование полиморфизма данного гена в зависимости от наличия очагов метастазирования у онкологических больных, гистологического типа опухоли и стадии заболевания.

Сравнительный анализ частоты патологического аллеля СУР1А1 в группах больных с разными гистологическими типами опухоли (РЛ и РЖ) не обнаружил достоверных различий, хотя в выборке немелкоклеточного рака легкого регистрировалась более высокая частота Вал-аллеля СУР1А1 (13,6%), чем у пациентов с мелкоклеточной формой опухолевого роста (9,8%) (рис. 5).

СЭТМ1

В Здоровые □ Больные с НМРЛ □ Богьные с МРЛ Б Богьные с ИРЖ о Бш*»ные с ДРЖ

Рис. 5. Частота (в %) вал-аллеля СУР1А1, функционально неполноценных генотипов генов ОЯТП, СЗТМ1 и 05ТР1 у больных мелкоклеточным и немелкоклеточным раком легкого (МРЛ, НМРЛ), ишестинальным и диффузным раком желудка (ИРЖ, ДРЖ); * - достоверность различий по сравнению с показателями у здоровых доноров (р< 0,05).

При изучении частоты распределения вариантных аллелей СУР1А1 в зависимости от стадии заболевания у больных раком предстательной железы статистически значимых различий выявлено не было.

У больных раком легкого и раком желудка, имеющих метастазы, было выявлено двукратное увеличение частоты Вал-аллеля, у больных раком толстой кишки с метастатическими очагами данный показатель был повышен в 4 раза по сравнению с таковым у пациентов соответствующих локализаций без очагов метастазирования (рис. 6). Полученные ассоциации, на наш взгляд, можно объяснить тем обстоятельством, что реактивные формы промежуточных метаболитов, интенсивно образующихся в процессе биоактивации ксенобиотиков под воздействием мутированного СУР1А1, способствуют ангиогенезу. В результате этого будет наблюдаться быстрый рост снабжающих опухоль кровеносных сосудов,

которые способствуют прогрессии опухоли и раннему метастазированию, что, I конечном итоге, и обусловливает неблагоприятный прогноз заболевания.

25

%

Больные Больные Больные Больные Больные Больные

РЛ с mis РЛ без РЖ с mts РЖ без РТК о РТК без

mis mts mts mts

Рис. 6. Частота (в %) вал-аллеля CYP1A1 у больных раком легкого, раком желудка и раком толстой кишки с метастазами и без таковых; * - достоверность различий по сравнению с показателями у пациентов без метастазов (р< 0,05).

Кроме того, в настоящее время для многих форм рака описано появление мутаторного фенотипа у клеток злокачественных новообразований, основной причиной которого считают мутационные нарушения ферментных систем репарации, что имитирует внутриклеточное возрастание концентрации мутагенов [Патрушев В.Л., 2004; Копнин Б.П., 2006; Горбунова В.Н., Имянитов E.H., 2007; Коничев A.C., Севостьянова Г.А. 2008]. Обсуждается также еще один возможный путь малигнизации нормальных клеток через образование эндогенных мутагенов. При этом повреждение систем репарации ДНК будет вторичным по отношению к первичному синтезу эндогенного мутагена. Помимо высокоэффективных репаративных систем, понижающих частоту спонтанного' мутагенеза в соматических клетках, защиту от эндогенных ксенобиотиков отчасти осуществляет иммунная система. Предполагается, что при ее участии элиминируются мутантные соматические клетки, экспонирующие мутантные белки на своей поверхности и распознающиеся как чужеродные антигены [Патрушев ВЛ., 2004; Горбунова В.Н., Имянитов E.H., 2007; Бочков Н.П., 2007]. Однако в большинстве случаев, по-Ейдиг.юму, этого iгс происходит, так как ^¡[утактные белки локализованы внутри клеток. Кроме того, для опухолевых клеток характерно ускользание из-под иммунологического надзора [Головизин М.В., 2001; М.А. Пальцев М.А. и соавт., 2007].

Известно, что этот фермент цитохрома CYP1AI осуществляет в клетке метаболическую активацию ксенобиотиков. Нередко, однако, промежуточные продукты биотрансформации, особенно на начальных этапах, могут быть весьма токсичными, обнаруживать более выраженную мутагенную, канцерогенную и даже тератогенную активность по сравнению с нативными ксенобиотиками и вследствие этого быть причиной различных патологических состояний и болезней. Токсический эффект промежуточных метаболитов в значительной мере определяется функциональным состоянием ферментов фазы 2 детоксикааии [Иващеяко Т.Э. и

соавт., 2003]. Логично предполагать, что сниженная активность или отсутствие некоторых ферментов фазы 2 детоксикации способствует более длительному сохранению в организме промежуточных продуктов биотрансформации ксенобиотиков, которые могут провоцировать и способствовать развитию патологических процессов, связанных со злокачественной трансформацией клеток.

Исследованные нами гены ферментов второй фазы биотрансформации ксенобиотиков GSTT1, GSTM1 и GSTP1 кодируют три различные формы глутатион-S-трансфераз - Т1, Ml, Pl. В настоящее время известны аллельные варианты генов GSTT1, GSTM1, так называемые, нулевые аллели, которые на уровне фенотипа проявляются отсутствием белковых продуктов. Поскольку данные ферменты являются важными компонентами системы детоксикации, гомозиготность по нулевому аллелю одного или другого гена может быть связана с повышенной восприимчивостью организма к вредным воздействиям и, как следствие, с увеличением риска возникновения злокачественных новообразований.

Полиморфизм гена GSTM1, картированного на хромосоме 1р13.3, ведет к полной потере фермента [Seidegard J., Pero R.W. 1985], таким образом самоустраняясь из пути сопряжения и детоксикации реактивных метаболитов, особенно эпоксидов ПАУ [Smith G. et al., 1995]. Аналогичный вариант полиморфизма, приводящего к полной потере ферментативной активности, был обнаружен для гена GSTT1, расположенного на хромосоме 22qll.23 [Pemble S. et al., 1994]. GSTT1 участвует в детоксикации канцерогенных промежуточных продуктов сгорания табачного дыма, а именно моногалогенметанов и бутадиена. GSTP1 - это самая представленная изоформа глутатион-8-трансфераз в легких, которая детоксицирует ПАУ [Anttila S. et al., 1993]. Полиморфизм замены единственного нуклеотида в 5 экзоне гена GSTP1 (Ilel05VaI), расположенного на хромосоме llql3, проявляется значительным снижением активности фермента среди индивидуумов, которые несут одну или более копий Г (гуанина) (Ile/Val или Val/Val) по сравнению с теми, кто имеет А/А (аденин/аденин; Ile/Ile) генотип [Watson М.А. et al., 1998]. Наличие, по крайней мере, одной копии аллеля Г в гене GSTP1 также связано с увеличением уровня ДНК-аддуктов в ткани легкого [Butkiewicz D. et al., 2000].

Учитывая количество известных канцерогенных веществ и путей их метаболизма, в которых они, предположительно, взаимодействуют, исследование комбинаций этих генотипов может обеспечить лучшее понимание механизмов онкогенеза легкого. Представленные далее результаты показывают, что оценка вариантных генотипов глутатион-Б-трансфераз и (особенно) их комбинаций связаны с риском развития онкологических заболеваний и играют немаловажную роль в прогнозе течения опухолевого процесса. Оценивая полученные нами результаты, уместно напомнить, что делеционные формы генов GSTT1 и GSTM1, приводящие к отсутствию соответствующих ферментов, рассматриваются как факторы риска возникновения рака молочной железы, рака пищевода, рака шейки матки, рака мочевого пузыря, неполипозного рака толстой кишки, рака легкого [Zong S. et al., 1991, 1993; Kim J.W. et al., 2000; W.Tan, et al., 2001; Benhamou S. et al., 2002; Hung R.J. et al., 2003; Пальцев M.A., 2004; Имянитов E.H., 2007].

В настоящем исследовании было установлено, что индивидуальные эффекты каждого из исследуемых генов ведут к увеличению риска развития PJI. Наименьший относительный риск (OR) выявлен для носителей делеционного варианта гена GSTM1, он составил 2,34 (С[95% 1,60-3,42) (рис. 7). Большинство американских исследователей не находили значимого увеличения риска развития PJI, связанного с 0/0- генотипом GSTM1, в популяциях американцев европеоидного происхождения, однако объединение разрозненных данных и проведение мета-анализа позволило достигнуть статистически достоверных значений [Benhamou S. et al., 2002]. В крупном исследовании американцев европеоидного и африканского происхождения также сообщается об умеренном увеличении относительного риска развития PJI (1,3 и 1,5 соответственно), связанного с GSTMl-нуль генотипом [Cote M.L., 2005]. Немногочисленные же российские источники, напротив, сообщают о высоком риске PJÏ при носительстве нулевого аллеля гена GSTM1 [Ляхович В.В., 1997]. Акцент на страну проведения исследования и антропологические характеристики обследованных лиц нам представляется уместным, поскольку имеются значительные межрасовые и межпопуляционные различия в полиморфизме генов глутатион-Б-трансфераз [Watson М.А. et al.,1998]. Учитывая данные современной литературы, GSTMl-нуль генотип оценивается как вероятный фактор риска для развития РЛ, хотя для некоторых популяций и с малой величиной эффекта.

Для рака желудка, толстой кишки и предстательной железы также было зарегистрировано статистически значимое увеличение частоты нулевого генотипа GSTM1 по сравнению с контрольными значениями. Рисковая значимость при этом составила для рака желудка - 1,70, для рака толстой кишки - 1,78, для рака предстательной железы — 2,24.

А В

РПЖ РТК РЖ РЛ

ШвШШШШШШ 2.24

ттшттт^шл m

: : :

ШШШШШШ1!

¡¡2.98

'Ш, щшш

2.5

Рис. 7. Показатели относительного риска (ОК.) развития злокачественных новообразовании (рака легкого - РЛ, рака желудка - РЖ, рака толстой кишки - РТК, рака предстательной железы -РПЖ) для носителей нулевых генотипов С^ТМ 1 (А), 08ТГ1 (В) при р<0,05.

Анализ доли гомозигот по нулевому аллелю глутатион-8-трансферазы Т1 показал достоверную связь делеционной формы этого гена и риска развития рака легкого (OR=4,26), что согласуется с данными современной литературы, которые также постулируют увеличение относительного риска рака легкого, связанного с GSTT10/0 [Spitz M.R. et al., 2000, Hou S.M. et al., 2001, Sorensen M. et al., 2004]. Для рака предстательной железы было выявлено двукратное увеличение частоты нулевого генотипа GSTT1 по сравнению с аналогичным показателем у здоровых

лиц. Риск развития рака предстательной железы у носителей нулевого генотипа СБТП составил 2,98 (рис. 7).

В распределении вариантных генотипов гена ОБТП были получены достоверные различия между больными раком легкого и раком предстательной железы по сравнению со здоровыми лицами.

Из генов семейства глутатион-Б-трансфераз полиморфизм 08ТР1 наименее представлен в публикациях по раку легкого. Аллельные варианты данного гена (ОБТРШеЦОб - А/Г и с1е1105/(1е1105 - Г/Г), кодирующие синтез белка со сниженной ферментативной активностью, нами были объединены в одну группу показателей. При этом частота делеционного аллеля гена ОБТР1 (29,8%) почти в 2 раза превышала таковую у здоровых доноров (15,4%), а относительный риск развития рака легкого составил 2,34 (СЬзу. 1,68-3,25). Для рака желудка и кишечника также была установлена статистически более высокая частота , функционально неполноценного аллеля по сравнению со здоровыми лицами (26,7 и 31,8%, соответственно при р=0,000). Наибольшая частота делеционного аллеля данного гена регистрировалась в выборке больных раком предстательной железы (41%), при этом риск развития данного заболевания составил 5,10 (С195./. 3,14-8,31) (рис. 8).

РПЖ РТК РЖ РЛ

ШЖЖШИМ 7..Т7

О 1 2 3 4.5 6

Рис. 8. Показатели относительного риска (OR) развития злокачественных новообразований (рака легкого - РЛ, рака желудка - РЖ, рака толстой кишки - РТК, рака предстательной железы -РПЖ) для постелей нулевых генотипов GSTP1 при р<0,05.

Противоречивость данных литературы о влиянии глутатион-Б-трансфераз на формирование онкологического риска при различных онкологических заболеваниях побудило нас исследовать различные по механизмам развития онкопатологии (рак легкого, рак желудка, рак толстой кишки и рак предстательной железы) и сделать заключение о специфичности участия этих ферментов в канцерогенезе.

С клинической и особенно прогностической точки зрения метастазирование представляет собой важнейший этап в патогенезе злокачественных опухолей. Это свойство злокачественного онкологического процесса в значительной степени зависит от свойств первичной опухоли, а также от неоангиогенеза и подвижности опухолевых клеток [Engers R., Gabbert Н.Е., 2000; Meyer Т., Hart I.R., 1998; Георгиев Г.П., 2000; Заридзе Д.Г., 2000; Пожарисский K.M., Леенман Е.Е., 2000; Аничков Н.М., 2003; Давыдов М.И., 2008; Чиссов В.И. и соавт., 2009].

В настоящем исследовании установлено, что нулевые генотипы GSTT1, GSTM1 и патологические аллели GSTP1 играют важную роль в прогрессии злокачественных новообразований, поскольку нами была обнаружено достоверное

увеличение доли делеционных вариантов СЭТЛ и тенденция к преобладанию нулевых вариантов гена вЯТМ! у больных раком легкого с метастазами (рис. 9).

О Больные РЛ с mts а Больные РЛ без mts

в Больные РЖ с mts в Больные РЖ без mts

в Больные РТК с mts о Больные PTK без mts

Рис. 9. Частота функционально неполноценных генотипов GSTT1, GSTM1, GSTP1 у больных раком легкого, раком желудка, раком толстой кишки в зависимости от наличия очагов метастаз ироианпя.

Наличие метастатических очагов у больных раком желудка ассоциировано с более высокой частотой нулевых генотипов GSTT1 и GSTM1. Поскольку в доступной литературе мы не нашли данных по распределению генотипов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в зависимости от клинических особенностей опухолевого процесса, таких как стадия онкологического заболевания, распространенность опухолевого узла, наличие очагов метастазирования, прогрессирование заболевания, влекущее вслед за собой неблагоприятный исход, можно предположить, что нулевые генотипы GSTT1 и GSTM1, кодирующие функционально неполноценные ферменты второй фазы биотрансформации ксенобиотиков - глутатион-Б-трансферазы Т1 и MI, способствуют более длительному сохранению в организме активных промежуточных метаболитов, обладающих мутагенными и канцерогенными свойствами, которые могут не только провоцировать возникновение злокачественной опухоли, но и способствовать её метасгазированию и прогрессированию заболевания. Метастазирование злокачественных новообразований является динамическим, многоэтапным, каскадным процессом. Для образования метастатического очага необходимо разъединение, обособление малигнизированных клеток с полной утратой межклеточных кадхерин-катениновых контактов и выход их из озлокачествленного паренхиматозного комплекса в первичном опухолевом узле [Engers R., Gabbert Н.Е., 2000; Георгиев Г.П., 2000; Аничков Н.М., 2003; Галицкий В.А., 2003; Луценко C.B. и соавт., 2003; Давыдов М.И., 2008; Коничев A.C. и соавт., 2008].

Можно обсуждать следующую гипотезу возникновения метастазов на фоне высокой частоты функционально неполноценных генотипов GSTT1, GSTM1 и GSTP1: дефект ферментов биотрансформации ксенобиотиков (в частности, глутатион-8-трансфераз) приводит к повышенной восприимчивости клеток к повреждающим воздействиям окружающей среды, что способствует накоплению мутагенных и/или канцерогенных веществ, вызывающих мутации 1) в генах, кодирующих соединения, участвующие в образовании плотных межклеточных контактов. Вследствие этого происходит ослабление сил сцепления между клетками и последующий их отрыв друг от друга; в конечном итоге образуется метастатический очаг, 2) в генах, ответственных за ангиогенез, являющийся необходимой составляющей метастазирования опухолей.

Таким образом, блокирование работы ферментов второй фазы биотрансформации приводит к снижению дифференцировки опухоли и повышению ее пролиферативной активности, а также повышает способность трансформированных клеток к метает аз ированию, что определяет прогрессию опухолевого процесса.

Изучая особенности распределения вариантных генотипов GSTT1, GSTM1 и GSTP1 у больных раком предстательной железы в зависимости от стадии заболевания, мы обнаружили, что доля патологических вариантов гена GSTT1, GSTM1 и GSTP1 увеличивается, начиная со второй стадии, при этом достигает статистически значимых различий на III и IV стадиях развития опухоли. С. Jerónimo et al. (2001) утверждают, что потеря функции глутатион-З-трансфераз играет критическую роль на ранних этапах онкогенеза простаты. Такие выводы были сделаны на основании иммуногистохимического исследования ткани предстательной железы у больных раком простаты и с преднеопластическими изменениями в предстательной железе. Было обнаружено, что экспрессия ферментов резко снижена в опухолевой ткани и в метапластически измененных образцах, причем такие изменения коснулись не только ткани, в которой ген GSTP1 был инактивирован метилированием. Тем не менее, С. Niais et al. (2005) на основании анализа литературы подвергли сомнению наличие высокого риска развития рака предстательной железы при наличии делеционных вариантов генов GST и выдвинули предположение, что GST выступают предрасполагающими факторами к раку вообще. Следует отметить, что в качестве кандидатных на содержание аутосомно-домипантного гена наследственного рака простаты были предложены, по крайней мере, семь регионов генома, включая Iq24-lq25 (НРС1), Iq42-q43 (РСАР), Xq27-q28 (НРСХ), 1р36 (САРВ), 20ql3 (НРС20), 17pll (ELAC2) и 16q23 [Nwosu V. et al., 2001; Bratt O., 2002; Simard J. et al., 2002]. Ни один из данных регионов не был последовательно идентифицирован в различных популяциях, и ни один из данных генов не был столь же специфичньм для рака предстательной железы, как, например, делеция в районе 5q21 при колорекгальном раке. Это дает основание считать, что генетическое предрасположение к раку простаты не может следовать стандартной схеме. Вместо мутаций в определенных генах, приводящая к высокому риску генетическая восприимчивость к раку простаты может зависеть от распространенных полиморфизмов, умеренно увеличивая риск болезни у гетерозигот или гомозигот. Полиморфизмы в генах, связанных с рецепторами и

метаболизмом гормонов, защитой клетки, репарацией ДНК и метаболизмом куклеотидов могут быть вовлечены в канцерогенез.

В раковых образованиях, вызванных химическими канцерогенными веществами, полиморфизмы генов метаболизма ксенобиотиков могут существенно смоделировать риск развития рака простаты. Среди них особое место занимают глутатион-8-трансферазы, которые защищают против потенциально мутагенных эндогенных, и экзогенных соединений. Действительно, полиморфизмы в GSTT1 и GSTP1 как связанные с увеличением риска развития рака простаты, были описаны в работах С. Steinhoff et al. (2000), A. Gsur et al (2001), Z. Kote-Jarai et al. (2001).

Представляется очевидным, что в развитии онкопатологии имеет значение баланс активностей различных глутатион-S-трансфераз, поскольку они имеют перекрывающуюся субстратную специфичность, и некоторые, из них полиморфны [Raunio Н., Pelkonen О., 1995; Ляхович В.В. и соавт., 1997; Reszka Е., Wasowicz W., 2001]. В связи с этим риск онкопатологии, связанный с нулевыми генотипами GSTT1 и GSTM1, может снижаться за счет активности других GST. Возможный механизм опухолевой трансформации клеток на фоне высокого уровня нулевых генотипов GSTT1 и GSTM1 состоит в следующем: функционально неполноценные ферменты второй фазы биотрансформации ксенобиотиков - глутатион-S-трансферазы 01 и р.1 способствуют накоплению большого количества активированных канцерогенов. В результате этого образуются ДНК-адцукты, которые вызывают повреждения ДНК, не подвергающиеся репарации [Ryberg D. et al., 1997; Butkiewiez D. et al., 2000; Miller D.P. et al., 2002]. Было показано [To-Figueras J. et al., 1996; Lloid D.R. et al., 2000; Wani M.A. et al., 2000; Hussain S.P. et al., 2004], что в клетках, поврежденных эпоксидами диола бензпирена, возникает мутация в гене р53, За счет снижения белковой функции исчезает способность гена р53 останавливать клеточный цикл для свершения репарационных процессов [Lloid D.R. et al., 2000; Wani M.A. et al., 2000; Liu G. et al., 2001; Киселев Ф.Л. и соавт., 2005; Копнин Б.П., 2006; Горбунова В.Н., Имянитов Е.Н., 2007], что в дальнейшем приводит к повреждению клетки и канцерогенезу.

С целью изучения механизмов участия полиморфных генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и гена-онкосупрессора р53 в канцерогенезе в настоящем исследовании была предпринята попытка оценить частоту распределения вариантных генотипов ФБК у всех обследованных нами онкологических больных (рак легкого, рак желудка, рак толстой кишки, рак предстательной железы) в зависимости от статуса р53.

На первом этапе изучения полиморфизма гена р53 у онкологических больных было установлено значимое увеличение частоты про-аллеля в группах больных раком предстательной железы (на 43,1%) и раком желудка (на 63,5%) по сравнению с аналогичным показателем у здоровых лиц (25,5%) (табл. 3). При раке легкого и раке толстой кишки также отмечалось увеличение частоты вариантного генотипа р53 (хотя и статистически не значимое), что указывает на важную роль этого фактора в развитии злокачественных новообразований.

В исследовании полиморфизма 72-го кодона р53 в опухолевых клетках больных раком желудка Новосибирской области, проведенном В.А.Белявской и соавт. (2006), была выявлена статистически более высокая частота про-аллеля у

больных раком желудка по сравнению со здоровыми донорами. Несмотря на известный факт, что про-аллель более эффективно индуцирует РаэЬ/Раз-опосредованный апоптоз опухолевых клеток цитотоксическими Т-лимфоцитами, позитивная роль про-аллеля не проявлялась при нарушении передачи апоптотического сигнала в опухолевой клетке вследствие мутаций в гене р53. В этом случае клетка не только не подвергается апоптозу, но способна «переадресовать» индукцию апоптотического сигнала на контактирующий с ней цитотоксический Т-лимфоцит, приводя его к гибели [Белявская В.А. и соавт., 2006]. Выявленная нами «рисковая значимость» про-гомозиготности (аллеля) в комбинации с соматическим мутагенезом р53 может свидетельствовать о том, что рак желудка у носителей про-аллеля развивается именно по такому сценарию. Предполагается, что согласованное функционирование обоих аллелотипов р53 обеспечивает более эффективную защиту от комбинированного влияния трансформирующих сигналов, воздействующих на эпителий слизистой желудка [Белявская В.А. и соавт., 2006]. Для более полного понимания роли генетического статуса в процессе возникновения и прогрессии злокачественных новообразований необходимы дальнейшие исследования с учетом анализа генетической идентичности ДНК, выделенных из нормальных и опухолевых клеток одного и того же пациента.

На втором этапе исследования все группы обследованных были разделены на 2 подгруппы: 1- лица, имеющие арг/арг-генотип р53, 2- лица, имеющие арг/про- и про/про-генотипы р53. Анализ полученных результатов по распределению вариантаых генотипов исследованных генов ФБК у онкологических больных и здоровых доноров позволил установить, что общей характеристикой для всех обследованных групп (здоровые, больные РЛ, РЖ, РТК, РПЖ), имеющих в генотипе про-аллель р53, явилось увеличение частоты патологических генотипов генов СУР1А1, ОБТП, С5ТМ1, 08ТР1 по сравнению с лицами, несущими арг-аллель р53 в гомозиготном состоянии. Так, для выборки здоровых доноров с про-аллелем р53 было установлено статистически значимое увеличение частоты Иле/Вал-генотипа СУР1А1 (34,4%) по сравнению со здоровыми лицами, имеющими арг-аллель р53 (7,4% при р=0,000). У больных онкологическими заболеваниями с про-аллелем р53 при сравнении с аналогичной группой здоровых лиц статистически значимых различий по частоте вариантного генотипа СУР1А1 обнаружено не было. Однако в подгруппах больных раком легкого и раком предстательной железы, имеющих про-аллель р53, выявлялись статистически более высокие значения частоты Иле/Вал-генотипа (45,1 и 27,5% соответственно), чем у пациентов с арг/арг-генотипом р53 (8,3 и 3,8%, соответственно, при р=0,000), что подтверждалось высокими значениями ОЯ (9,10, С195%=4,26-19,85 и 19,34 С195%=2,61-398,79, соответственно). Частота 0/0-генотипа генов С8ТТI и 08ТМ1 значительно чаще встречалась у здоровых лиц с про-аллелем р53 (27,1 и 54,2% соответственно), при этом она оказалась статистически более низкой, чем у больных раком легкого с аналогичным генотипом р53 (54,1 и 72,9%, соответственно, при р<0,01). Риск развития рака легкого при таком неблагоприятном сочетании про-аллеля р53 и функционально неполноценного СБТП составил 3,17 (С195%= 1,72-5,85), С8ТМ1 - 2,28 (С195%=1,25-4,19). Среди больных раком легкого выявленные у пациентов с арг- и про-аллелем

р53 достоверные различия в распределении вариантных генотипов касались только гена GSTM1 (50,4 и 72,9%, соответственно). Частота патологических генотипов GSTT1 и GSTM1 у больных раком толстой кишки с про-аллелем р53 обнаруживалась значительно чаще, чем у пациентов без мутации онкосупрессора (35,1, 67,6 и 6,9 и 37,9%, соответственно, при р<0,05). Как показали результаты проведенного нами исследования в группе больных раком желудка, у пациентов с про-аллелем р53 определялось увеличение частоты функционально неполноценного генотипа только по гену GSTT1 (16,9% при р=0,03).

У больных РПЖ с про-аплелем р53 была установлена статистически более высокая частота функционально неполноценного генотипа гена GSTP1 по сравнению со здоровыми лицами, имеющими про-аллель р53 (68,8 и 46,9%, соответственно, при р=0,005), при этом риск развития РПЖ возрастает в 2,49 раза (С195%= 1,28-4,87). Внутригрупповых различий в распределении вариантных генотипов GSTP1 при РПЖ выявлено не было, как, например, при раке легкого, когда частота патологических генотипов у пациентов с про-аллелем р53 обнаруживалась в 1,5 раза чаще, чем у больных PJI с арг/арг-генотипом р53 (р=0,008).

Таким образом, на основании данных о множественном интенсивном мутагенезе р53 у онкологических больных высказано мнение [Жаров A.A., Новичкова Н.И., 2005], что экспозиция мутагенов внешней среды является важным фактором индукции мутационных процессов посредством негативного влияния на белковые компоненты репарационной системы, стресс-активации транскрипционной активности гена р53 с превращением его в активно мутирующий ген [Белявская В.А. и соавт., 2006]. Обнаруженный нами мутагенез гена р53 у онкологических больных можно объяснить влиянием широкого спектра экзомутагенов и эндогенных мутагенов воспалительного гснеза, возникающих в организме при действии повреждающих агентов [Breton J. et al., 2003; Имянитов E.H., 2007].

На сегодняшний день является общепризнанной многоударная модель канцерогенеза, и все злокачественные новообразования расцениваются как сложные патологические процессы, в патогенез которых включено повреждение многих генов. Исследуя риск, связанный с комбинациями инактивированных вариантов генов глутатион-Б-трансфераз, мы можем подтвердить сложность основных механизмов развития злокачественных новообразований. Нами была предпринята попытка построить анализ данных таким образом, чтобы оценить суммарный вклад повреждения нескольких генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в канцерогенез.

При анализе данных исследования все генотипы были разделены на протекторные (защитные), снижающие риск развития рака, интактные (не влияющие на развитие заболевания), и рисковые, статистически значимо повышающие риск развития злокачественного новообразования у здоровых носителей данного генотипа.

Установлено, что среди обследованных нами больных раком легкого генотип СУР 1А1 Иле/И ле/G STT10/GSTM10/G S TP 1 /de 1105 встречался у 9 пациентов, в группе контроля он обнаруживался лишь в одном случае из 231 (р=0,037). Риск

развития рака легкого у лиц с таким неблагоприятным сочетанием генотипов возрастает в 8,4 раза (С1?5% 1,08-178,71). К предрасполагающим следует также отнести комбинации: CYPlAlItae/Ban/GSTTl+/GSTM10/GSTPl/dell05, CYPiAlHne/Ban/GSTT10/GSTM10/GSTPl/deII05, CYPlAlHne/Baji/GSTTIO/

GSTM10/GSTPldell05/dell05, которые регистрировались у больных раком легкого и вовсе не обнаруживались у здоровых лиц (р<0,05).

, Протекторную роль в развитии онкопатологии, в частности рака легкого, выполняют следующие сочетания генотипов:

CYPlAlHHeMne/GSTTl+/GSTMl+/GSTPl/GSTPl, CYPlAl№ie/Ban/GSTTl+/ GSTM1+/GSTP1/GSTP1, CYP1А1 Иле/Иле/GSTTK/GSTM 10/GSTP1/GSTP1,

СYP1A1 Иле/йле/GSTT 1+/GSTM1+/GSTP1 /del 105 (при p<0,05, OR=0,00-0,51).

Все остальные комбинации для рака легкого оказались интактными.

Таким образом, исходя из полученных результатов, можно заключить, что фактором устойчивости к развитию рака легкого является сбалансированное сочетание вариантных генотипов ферментов первой и второй фаз биотрансформации (например, повышение активности CYP1A1 вследствие мутации компенсируется гармоничным функционированием ферментов детоксикации), для формирования риска рака легкого имеет значение дисбаланс активации/детоксикации ксенобиотиков. Среди больных раком легкого встречаются лица, имеющие нормальную или повышенную активность цитохрома Р-4501А1 на фоне значительного нарушения работы ферментов детоксикации в результате мутационных изменений двух и более изоформ глутатионтрансфераз.

При распределении предрасполагающих сочетаний генотипов у больных раком легкого в зависимости от наличия очагоз регионарного метастазирования было установлено, что у пациентов, имеющих метастазы, обнаруживалось увеличите данного показателя по сравнению с таковым у больных без метастазов, при этом статистические различия между выборками больных с метастазами и без таковых были показаны для комбинаций CYPlAliLie/Ifae/GSTTl+/GSTMl+/ GSTPldell05/dell05 и CYPlAl^e/Ban/GSTTl+/GSTM10/GSTPldell05/dell05.

При оценке распределения неблагоприятных генотипов у больных раком легкого в зависимости от гистологического типа опухоли нами было показано, что для больных немелкоклеточным раком легкого характерно увеличение частоты предрасполагающих комбинаций, содержащих мутированный аллель гена цитохрома Р-450 и функционально неполноценный генотип GSTM1: CYPlAlUne/Ban/GSTTlO/GSTMlO/GSTPl/GSTPl (3,8%), СУР1А1Иле/Вал/С8ТТ1+/ GSTM10/GSTPIdeli05/dell05 (2,4%), CYPlAlHne/BaWGSTTlO/GSTMlO/ GSTPldell05/ del 105 (7,2%), у больных мелкоклеточным раком легкого данные комбинации встречались в 2,2; 0,0 и 4,3% случаев соответственно. Полученные нами данные можно объяснить тем, что в этиопатогенезе немелкоклеточкого рака легкого принимают участие полиароматические углеводороды, которые в норме подвергаются аетгизации с участием ферментов цитохрома Р-450 и детоксикации глутатионтрансферазой Ml. Повышение активности CYP1A1 вследствие замены изолейцина на валин и нарушение работы ферментов второй фазы биотрансформации из-за делеции генов GST способствуют более длительному нахождению промежуточных продуктов метаболизма ксенобиотиков (активные

формы), которые вызывают различные соматические мутации ДНК, в том числе в гене р53, в генах репарации и пр., и таким образом могут принимать участие в злокачественной трансформации клетки.

Это предположение подтверждают полученные нами данные при изучении полиморфизмов генов CYP1A1, GSTT1, GSTM1 у больных раком легкого под влиянием фактора курения, которое мы провели, основываясь на клинико-эпидемиологических наблюдениях. При этом было обосновано, что курение является немаловажным фактором риска рака легкого, гортани, пищевода, почек, мочевого пузыря и, возможно, молочной железы [Bartsh H., 2000;Braitwaite K.L., Rabbits P.H., 2000; Давыдов М.И., Полоцкий Б.Е., 1994; Харченко В.П., Кузьмин И.В., 1994; Зырянов Б.Н. и соавт., 1997; Левшин В.Ф., Заридзе Д.Г., 2003; Давыдов М.И., 2008; Кушлинский Н.Е., 2008; Чиссов В.И. и соавт, 2009]. Как известно, табачный дым содержит около 4000 соединений [Wang S.S., Samet J.S., 1997;Левшин В.Ф., Заридзе Д.Г., 2003; Заридзе Д.Г., 2005; Белицкий Г.А., 2006] и является модельной средой, воздействие которой позволяет идентифицировать многие гены, участвующие во взаимодействии организма с окружающей средой.

Установлено, что частота «функционально активных» генотипов и аллелей CYP1 Al у курящих больных раком легкого более чем в 4 раза превышала таковую у некурящих пациентов при р<0,001 и в б раз - у здоровых лиц (рис.10). При этом риск развития рака легкого у курящих носителей вал-аллеля CYP1A1 составил 4,78 (С195% 1,79-13,84), что оказалось несколько ниже данных, приводящихся в литературе [Hayashi S. е.а., 1992; Bartsch H. е.а., 2000].

Рис. 10. Частота (в %) вал-аллеля СУР1А1, функционально неполноценных генотипов генов 08ТТ1, ОБТШ и ОБТР! у больных раком легкого в зависимости от причастности к курению; * - достоверность различий по сравнению с показателями у некурящих (р< 0,05).

Изучение распределения полиморфных вариантов генов глутатион-Б-трансфераз Т1, М1 и Р1 у больных раком легкого в зависимости от причастности к курению показало, что у курящих больных раком легкого частота нулевого генотипа гена 05ТТ1 составила 55,3%, что статистически значимо превышало аналогичные показатели у некурящих пациентов и здоровых лиц (29,2 и 18,2% соответственно при р<0,001). При этом следует отметить, что для курящих лиц с 0/0-генотипом

ОБТИ риск развития рака легкого составляет 2,99 (С195% 1,57-5,74) по сравнению с некурящими, имеющими данный генотип С8ТТ1 (рис. 11).

Частота гомозигот по нулевому аллелю гена глугатион-Б-трансферазы М1 у обследованных нами курящих больных раком легкого (72,1%) несколько превышала таковую у больных РЛ Новосибирской области (54,6%) [Ляхович В.В. и соавт., 1997] и статистически значимо отличалась от таковой у некурящих (29,2%) (р=0,000). Для курящих лиц, имевших 0/0-генотип С8ТМ1, по сравнению с некурящими, риск развития рака лёгкого возрастает в 6,26 раза (С195% 3,22-12,24).

0 1 2 3 4 5 6 7

Рис. 11. Показатели относительного риска (OR) развития рака легкого для курящих носителей Вал-аллеля CYP1A1, нулевых генотипов GSTT1 и GSTM1 при р<0,05.

Более высокая величина OR для 0/0-генотипа GSTM1 у курящих пациентов может быть объяснена большей чувствительностью носителей нуль-генотипа GSTM1 к патогенным эффектам загрязнителей окружающей среды в области низких концентраций, а также балансом детоксификации/токсификации компонентов табачного дыма в разных метаболических путях, концентрационными различиями в насыщении активностей этих путей [Nyberg F. et al., 1998].

Курение как комплексный фактор риска вовлекает много других существенных механизмов развития заболевания. Увеличение вследствие этого распространенности заболевания чисто статистически может снижать показатели риска, характерные для индивидуальных генетических признаков, так как их распределение среди больных стремится к таковому во всей популяции [Вавилин В.А. и соавт., 2000; Заридзе Д.Г., 2005; Горбунова В.Н., Имянитов E.H., 2007; Давыдов М.И., 2008].

Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) являются главными канцерогенными компонентами табачного дыма. При попадании в организм они сначала активируются ферментами семейства цитохромов, в частности CYP1A1, а затем инактивируются глутатионтрансферазами, в частности GSTM1 и GSTT1. Логично ожидать, что сочетание «профицитного» генотипа CYPIA1 с «дефицитными» вариантами GST может существенно усиливать риск рака легкого, особенно его ПАУ-ассоциированной разновидности - плоскоклеточной формы. В настоящей работе было установлено значимое увеличение частоты «профицитного» варианта гена CYP1A1 (в 6 раз) и «дефицитных» вариантов GSTT1 (в 2,6 раза), GSTM1 (в 2,7 раза) у курящих больных немелкоклеточным раком легкого (представленного главным образом плоскоклеточной карциномой) по сравнению с

некурящими пациентами этой группы. При этом (Ж плоскоклеточного рака легкого для курящих носителей «профицитного» генотипа СУР1А1 составил 9,09 (095% 2,57-38,33), «дефицитного» ОБГП - 4,39 (С195% 2,00-9,80), «дефицитного» СБТМ1 -6,37 (С195% 3,02-13,62) (рис. 12). При изучении полиморфных вариантов генов ФБК в выборке мелкоклеточного рака легкого под влиянием фактора курения статистически значимые различия в распределении генотипов были зарегистрированы только для гена С5ТМ1, при этом (Ж оказался примерно на том же уровне", что и для немелкоклеточной формы рака легкого (6,37 и 7,20 соответственно).

0 2 4 6 S 10

Рис. 12. Показатели относительного риска (OR) развития немелкоклеточного рака легкого для курящих носителей Вал-аллеля CYP1A1, пулевых генотипов GSTT1 и GSTM1, GSTPldell05 прир<0,05.

Таким образом, курение в сочетании с «профицитным» CYP1A1 и «дефицитными» генотипами генов GSTT1, GSTM1 является более значимым для развития плоскоклеточного рака легкого, чем для мелко клеточной формы опухоли. При этом наибольшую рисковую значимость представляют иле/вал-генотип CYPiAl и нулевой генотип GSTM1.

Глутатионзависимая токсификация показана для дигалоалкенов, гидрохинонов и изотиоцианатов, предшественников органических тиоцианатов и нитрозогуанидинов [Monks TJ. et а1.,1990]. В противном случае, когда исходный ксенобиотик обладает высокой реакционной способностью, дефект гена и/или низкая активность белка являются факторами риска. Конъюгацией с глутатионом достигается детоксификация компонентов табачного дыма - эпоксидов полиароматических углеводородов, которые являются субстратами преимущественно GSTM1 [Ketterer В. et al., 1999; Кулинский В.И., 1999], и монозамещенных галоалкенов, являющихся субстратами GSTT1 [РешЫе S. et al., 1994; Белицкий Г.А., 2006], и мы наблюдаем возрастание рисковой значимости нуль-генотипов.

Полученные результаты позволяют отнести изученные нами полиморфные гены к числу кандидатных генов рака легкого с умеренными эффектами. Следует отметить, что в настоящее время в изучении природы комплексных заболеваний придается большое значение генам с умеренными эффектами [Seillier-Moiseiwitsch F. et al., 1997; Вавилин В.А. и соавт., 2002]. Вероятно, роль генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в развитии рака легкого сходна с той, которую они играют в развитии бронхиальной астмы. Согласно данным эпидемиологических

исследований, онкозаболевания лишь в 5% случаев обусловлены наследственными генетическими факторами, а в 95% - взаимодействием внешних канцерогенных воздействий с генетическими факторами, в результате которого формируется «приобретенная восприимчивость» [Perera F., 1997]. Такие особенности биологии суперсемейств ферментов биотрансформации ксенобиотиков, как множественность форм, перекрывающаяся субстратная специфичность и индуцибельность, позволяют существенно восполнить дефекты индивидуального фермента в метаболизме ксенобиотиков активностью других. Поэтому в условиях нормального состояния окружающей среды риск развития заболевания, обусловленный данными ферментами, может быть минимальным. Ухудшение состояния окружающей среды, сопряженное с дисбалансом токсификации/детоксификации ксенобиотиков, возрастанием вероятности активирования онкогенов или инакгивирования генов-супрессоров опухоли, увеличивает этиопатогенетическую значимость этой ферментативной системы и может иметь важные последствия для эпидемиологии PJ1 в силу широкой распространенности полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в популяции европеоидов (40-60 и 10-20% носителей гомозиготной делеции GSTM1 и GSTT1, соответственно [Zong S. et al., 1993; Deakin M. et al, 1996; Garte S. et al, 2001]).

Внешними факторами, для которых установлено, что они обладают канцерогенными свойствами, являются выхлопные газы дизелей и табачный дым. Многие компоненты этих сложных химических смесей претерпевают метаболизм in vivo по пути усиления токсичности. Нельзя исключить в этой связи, что эти экзогенные факторы и другие промышленные, сельскохозяйственные яды играют важную роль в этиологии и патогенезе рака легкого. Именно у индивидуумов с наследственно ослабленным генотипом инактивация ксенобиотиков, в том числе табачных канцерогенов, промышленных и сельскохозяйственных ядов, должна происходить особенно медленно и соответственно условия неблагоприятного действия вредных метаболитов на организм особенно реальны. Это возможно за счет участия глутатион-Б-трансфераз в транспортной функции [Oakley A.J. et al, 1999; Кулинский В.И, 1999], в метаболизме эндогенных интермедиатов воспаления [Wang W, Ballatori N, 1998; ЖолдаковаЗ.И, Харчевникова H.B, 2002; Пальцев М.А, 2004], участия в сигнальной трансдукции [Stoilov I. et al, 1997; Галицкий В.А, 2003].

Наряду с анализом вариантных генотипов ферментов биотрансформации ксенобиотиков, мы исследовали Арг/Про-полиморфизм белка-онкосупрессора р53 у больных раком легкого в зависимости от причастности к курению. Показано, что в группе курящих больных отмечалась наибольшая частота встречаемости Про-аллеля (31,6%) по сравнению с некурящими (18,5%). Риск развития рака легкого у курящих носителей Про-аллеля составил 2,04 (С195% 1,21-3,44) по сравнению с некурящими.

С целью определения роли генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и гена белка-онкосупрессора р53 в механизмах возникновения рака легкого под воздействием фактора курения мы проанализировали распределение полиморфных генотипов CYP1A1, GSTT1, GSTM1, GSTP1 у курящих и некурящих больных раком легкого, имеющих про-аллель р53. Показано, что у курящих пациентов, несущих про-аллель р53, частота «функционально активного» генотипа

СУР1А1 и нулевого генотипа С8ТМ1 более чем в 2 раза превышает аналогичные показатели у некурящих больных. При этом относительный риск развития ракг легкого у курящих носителей про-аллеля р53 и вал-аллеля СУР1А1 составил 3,67 (С195% 1,16-12,36); нулевого генотипа СБТМ1 -11,03 (С195%3,56-35,44).

При анализе выборки курящих больных раком легкого в зависимости от статуса р53 было установлено, что для пациентов, имеющих про-аллель р53, характерно четыреххкратное увеличение Иле/Вал-генотипа СУР1А1 по сравнению с аналогичным показателем у курящих больных с арг/арг-генотипом р53. Риск развития рака легкого при этом у курящих носителей про-аллеля р53 в сочетании с Иле/Вал-генотипом СУР1А1 составил 7,42.

Частота патологических генотипов ОБТП, С8ТМ1 и С5ТР1 у курящих носителей про-аллеля р53 превышала таковую у пациентов с арг-аллелм р53 на 32, 37 и 44% соответственно (р<0,05). (Ж рака легкого для курящих носителей функционально неполноценного генотипа СБТТ! с про-аллеля р53 составил 1,87, для СБТШ - 3,16, для 08ТР1 -2,06.

Полученные нами в ходе исследования данные подтверждают общие представления об участии генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и гена белка-онкосупрессора в патогенезе рака легкого под воздействием внешнего фактора курения.

Таким образом, основываясь на полученных данных, можно сделать заключение, что курение на фоне нарушения работы I и II фаз биотрансформации ксенобиотиков способствует возникновению рака легкого, принимая опосредованное участие в р53-зависимом канцерогенезе. Патогенетическую роль при этом играют ферменты СУР1А1 и С8ТМ1, что не противоречит данным литературы [УлыбинаЮ.М. и соавт., 2005].

По итогам настоящего исследования была зарегистрирована корреляционная сопряженность у больных раком легкого Вал- аллеля СУР1А1 с нулевым генотипом С8ТТ1, С8ТМ1, С8ТР1, Про-генотипом р53 (г=-0,37; 0,45 и -0,47 и -0,33 соответственно при р<0,05), а также патологических генотипов СУР1А1, С8ТТ1, 08ТМ1 с курением (г=-0,24; 0,22 и -0,38 соответственно при р<0,05),

Таким образом, в то время как тестирование изолированных генотипов генов ФБК представляется малоперспективным в связи с незначительной выраженностью эффекта, комбинация неблагоприятных вариантов данных генов может обсуждаться как значимый фактор увеличения онкологического риска для рака легкого.

Показано, что частота комбинаций морфологически и функционально полноценных аллелей исследованных генов у здоровых доноров более чем в 5 раз превышала этот показатель у больных раком предстательной железы (х,2=25,20; р=0,000), при этом относительный риск ((Ж) развития рака предстательной железы оказался равным 0,15, что указывает на защитную роль данного генотипа. К благоприятному сочетанию следует отнести также комбинацию СУР1А1Иле/Иле/С8ТТ1+/С8ТМ10/08ТР1Л38ТР1, которая выявлялась в 27,3 % случаев у здоровых лиц и у 10,3% больных раком предстательной железы (х2=13,21; р-0,000; СЖ=0,31).

Анализ сочетания генотипов у больных раком предстательной железы выявил статистически значимое увеличение частоты следующих неблагоприятных

комбинаций: С YP lAlHne/BanGSTTl +/GSTM10/GSTP1 /GSTP1 (x2=3,66; p=0,05; OR=5,41), CYP1A1 Иле/Иле/GSTTl 0/GSTM10/GSTP1/del 105 (x2=24,82; p=0,000; OR=34,81), CYP 1A1 Иле/Иле/GSTT 1+/GSTM1+/GSTP1 del 105/del 105 (%2=5,07; p=0,024; OR=6,36), CYP 1A1 Иле/В ал/GSTT 10/GSTM10/GSTP 1 /del 105 (x2=9,76; p=0,001), CYP 1A1 Иле/Иле/ GSTT10/GSTM10/GSTPldeI105/dell05 (x2=6,25; p=0,012) по сравнению с аналогичными показателями у здоровых жителей г.Томска.

Следует отметить, что риск развития рака предстательной железы моделируют как вариации цитохрома Р-450, так и глутатионтрансфераз. При этом наибольшую рисковую значимость имеет сочетание функционально неполноценных генотипов GST всех трех исследованных изоформ, а также комбинация, характеризующаяся гомозиготной делецией GSTP1 на фоне нормальных генотипов GSTT1, GSTM1.

Для оценки суммарного вклада полиморфных вариантов генов глутатион-S-трансфераз в механизмы прогрессии рака предстательной железы были проанализированы комбинации вариантных генотипов глутатион-Б-трансфераз в зависимости от стадии злокачественного процесса. Были рассмотрены сочетания функционально полноценных (CYP1A1 Иле/Иле; GSTT1+; GSTM1+; GSTP1) и неполноценных (CYP1A1 Иле/Вал; GSTT10; GSTM10; GSTPl/dell05; de!105/dell05) генов. Результаты исследования показали, что доля протекторных генотипов (CYPlAltoe/№ie/GSTTl+/GSTMl+/GSTPl/GSTPl; CYP 1А1 Иле/Иле/GSTT 1 +/ GSTM10/GSTP 1/GSTP1, С YP 1А1 Иле/Вал/GSTTl 0/GSTM 10/GSTP 1/del 105) у больных раком предстательной железы последовательно снижалась, начиная со второй стадии заболевания, и не обнаруживалась на четвертой стадии процесса.

Частота комбинаций, предрасполагающих к развитию рака предстательной железы (CYP1A1 Иле/В ал05ТТ 1+/GSTM10/GSTP 1 /GSTP 1, CYP1A1 Иле/Иле/ GSTT10/GSTM10/GSTPl/dell05, CYP 1А1 Иле/Иле/GSTTl +/GSTM1+/GSTP1 del 105/ del 105), напротив, увеличивалась, начиная со II стадии заболевания и достигала своих максимальных значений на IV стадии процесса, и значимо отличалась от соответствующих показателей у здоровых лиц. В то же время статистически значимых различий в распределении комбинационных генотипов у больных раком простаты с разными стадиями заболевания выявлено не было.

При изучении комбинаций полиморфных генов CYP1A1, GSTT1, GSTM1 и GSTP1 было установлено, что сочетания С YP 1А1 Иле/Иле/GSTTl 0/GSTM 1 +/ GSTP1/GSTP1 и С YP 1А1 Иле/Иле/GSTTl +/GSTM10/GSTP 1/GSTP 1 также значительно чаще встречаются среди здоровых лиц, чем у больных раком желудка (р<0,05; OR<0,5), что позволяет отнести данные комбинации к протекторным.

В ходе исследования были выявлены неблагоприятные сочетания генов цитохрома Р-450, глутатион-8-трансфераз Tl, Ml, PI, которые способствуют развитию рака желудка: CYP 1А1 Иле/В ал/GSTT 1+/GSTM1+/GSTP1 /del 105. Данная комбинация встречается в 7,8% случаев у больных раком желудка и в 0,9% в группе здоровых лиц (х2=8,96; р=0,002), при этом риск развития злокачественного новообразования данной локализации при носительстве такого сочетания увеличивается в 9,6 раза. Другая предрасполагающая комбинация (СYP 1А1 Иле/Иле/GSТТ1 +/GSTM10/ GSTPl/dell05) вьивлялась в 3 раза чаще в группе больных по сравнению с группой контроля (х2=13,11; р=0,000; OR=3,85).

Исходя из полученных нами данных, можно предположить, что рисковут значимость для рака желудка формируют гены GSTP1 и CYP1A1.

При анализе сочетаний генотипов по генам CYP1A1, GSTT1, GSTM1 и GSTP было выявлено, что сочетание только нормальных аллелей по всем четырем гена: значительно чаще встречается у здоровых жителей г. Томска (27,3%), чем у больны раком кишечника (7,6%) (х2=10,19; р=0,001), что позволяет судить об это! сочетании как о факторе устойчивости. Подобным эффектом обладает такж комбинация CYP1А1 Иле/Иле/GSTT 10/GSTM1+/GSTP1 /GSTP 1 (х2=5Д5; р=0,022 (Ж=0,00).

Наличие в генотипе человека комбинации СУР1А1Иле/Ил< GSTT10/GSTM10/GSTP 1/dell 05 значительно (в 23 раза С195%2,67-516,71 увеличивает риск развития рака кишечника. К предрасполагающим сочетания] следует отнести также сочетания СYP1А1 Иле/Вал/GSTT 10/ GSTM10/GSTP1/GSTP1 (ЗС2=6,55; р=0,010) и С YP 1А1 Иле/В ал/GSTT 1 +/ GSTM10/GSTPl/dell05 (х2=28,01 р=0,000), которые встречались только у больных раком кишечника и н обнаруживались у здоровых лиц. Наличие функционально неполноценны генотипов всех трех генов глутатионтрансфераз при нормальном функционировании цигохрома Р-450, а также увеличение активности фермента в результате мутации гена CYP1A1 в сочетании со снижением активности GST за сче делеции хотя бы в двух из трех исследованных генов можно расценивать как фактор предрасположенности к раку кишечника.

К интактным, относительно рака толстой кишки, генотипам были отнесены все остальные сочетания, поскольку статистически значимых различий доли носителей данных генотипов в группе больных раком кишечника и у здоровых лиц выявлено не было.

Таким образом, резюмируя полученные данные о распределении комбинаций генотипов, можно утверждать, что к протекторным комбинациям следует отнести сочетание нормальных генотипов всех исследованных генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков (обеспечивают устойчивость к раку легкого, раку простаты, раку кишечника), сочетание делеционного варианта гена GSTM1 и нормальных генотипов остальных генов (CYP1A1, GSTT1, GSTP1) (препятствует развитию рака легкого, рака простаты и рака желудка). Развитию злокачественной трансформации при раке желудка и кишечника препятствует наличие у индивидуума комбинации С YP 1А1 Иле/Иле/GSTT 10/GSTM 1+/GSTP1 /GSTP 1. Протекторными комбинациями только для рака легкого, по нашим данным, являются: CYPlAlHrie/Ban/GSTTl+/GSTMl+/GSTPl/GSTPl, CYP 1А1 Иле/Иле/ GSTT1+/GSTM1 +/ GSTPl/dell05.

Для формирования рака легкого была выявлена специфичная предрасполагающая комбинация, характеризующаяся наличием патологических генотипов всех четырех способных образовывать полиморфные варианты генов (р=0,000), для других злокачественных новообразований (РПЖ, РЖ, РТК) данная комбинация являлась интактной.

Для рака предстательной железы были выявлены три таких неблагоприятных сочетания: CYPlAl№ie/BanGSTTl+/GSTM10/GSTPl/ GSTP1 (наличие в генотипе данной комбинации увеличивает риск развития заболевания более чем в 5 раз),

CYP1A1 Иле/Ил e/GSTTl+/GSTMl +/GSTP1 del 105/del 105, СYP1A1 Иле/Илe/GSTT 10/ GSTM10/GSTP1 del 105/del 105. Гомозиготная делеция гена GSTP1 как при нормальных, так и делеционных генотипах GSTT1 и GSTM1 значительно увеличивает риск развития РПЖ.

Рисковыми специфичными для развития рака желудка, по нашим данным, являются комбинации, характеризующиеся нарушением работы ферментов биотрансформации ксенобиотиков как первой, так и второй фаз: С YP 1А1 Иле/В ал/GSTT 1+/GSTM l+/GSTPl/dell05 и CYP 1А1 Иле/Иле/G STT1 +/ GSTM10/GSTPl/dell05.

Для рака толстой кишки специфичных сочетаний вариантных генотипов ферментов биотрансформации ксенобиотиков выявлено не было.

Общими для формирования нескольких злокачественных новообразований оказались комбинации: CYP 1А1 Иле/Иле/GSTT 10/GSTM10/GSTP 1 /del 105 (РЛ, РПЖ, РТК) и С YP 1А1 Иле/В ал/GSTT 1+/G STM10/G STP1 /del 105 (РЛ и РТК), CYP1 A№e/Baji/GSTT10/GSTM10/GSTPl/dell05 (РЛ и РПЖ), которые практически не выявлялись у здоровых людей. Данный факт свидетельствует в пользу положения об общих аспектах участия ферментов первой и второй фаз биотрансформации ксенобиотиков в канцерогенезе.

Следует отметить также наличие значительного количества (9 из 24) интактных комбинаций, которые не вовлечены в патогенез ни рака легкого, ни рака предстательной железы, ни рака толстой кишки, ни рака желудка.

Мы полагаем, что такого рода сочетания генотипов свидетельствуют о преобладании эффекта делеционного варианта гена в патогенезе специфичной для данной патологии комбинации, не исключая при этом модулирующего эффекта остальных генов. Это доказывает тот факт, что для большинства больных онкологическими заболеваниями наиболее неблагоприятной является комбинация функционально неполноценных вариантов всех исследованных нами генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков, способных образовывать полиморфные варианты, т.е. высокая активность различных цитохромов (фаза 1) в сочетании с низкой или нормальной активностью ферментов фазы 2 - наиболее неблагоприятные предвестники будущих мультифакториальных заболеваний.

Универсальность вовлечения данных генов в формирование онкологического риска может быть обосновано некоторыми важными свойствами этих ферментов, значимых для патогенеза злокачественных новообразований: 1. GST имеют большое количество субстратов экзогенного происхождения, многие из которых являются канцерогенами. Нарушение работы этих ферментов может создать условия для реализации канцерогенного потенциала вещества и генотоксического эффекта; 2. Учитывая важную роль ферментов GST в метаболизме липофильных и стероидных соединений, можно утверждать, что снижение активности или потеря этих ферментов может привести к нарушению элиминации метаболитов стероидных гормонов, в том числе и метаболитов тестостерона. 3. Исходя из важной роли GST в обезвреживании продуктов ПОЛ и пероксидов ДНК, можно утверждать, что снижение их активности приведет к усилению свободно-радикальной агрессии на ДНК. 4. Исходя из известного факта о важной роли GST в метаболизме эйкозаноидов (простагландинов и лейкотриенов), можно предположить, что

дисфункция этих ферментов неизбежно скажется на состоянии противоопухолевого иммунитета и процессах метастазирования [Саприн А.Н, 1991, Nebert D.W., Carvan M.J, 1997; Кулинский В.И, 1999; Ляхович B.B. и соавт, 2000; Барышников А.Ю., 2003; Баранов B.C., 2004; Cote M.L. et al. 2005;].

Рис. 13. Предполагаемая схема участия генов ферментов биотралсформации ксенобиотиков и гена р53 в канцерогенезе по данным литературы и результатам настоящего исследования.

В качестве маркеров предрасположенности к раку легкого, раку предстательной железы, раку желудка, раку толстой кишки нами были изучены гены ферментов биотрансформации ксенобиотиков, а также ген-супрессор опухолевого роста р53. Результаты проведенного исследования позволили установить, что баланс активации/инактивации канцерогенов складывается из соотношения активностей реакций I и II фаз биотрансформации ксенобиотиков (СУР1А1, СБТИ, ОБТМ!, С5ТР1) и может влиять на степень риска развития рака. Увеличение риска подтверждает постулат о том, что сумма эффектов отдельных генотипов всегда ниже суммарного эффекта генотипа и оправдывает проведенное исследование.

Важно подчеркнуть, что само наличие неблагоприятного аллеля не позволяет судить ни о времени начала заболевания, ни о его тяжести, ни даже с уверенностью о том, что тестируемый наверняка заболеет именно этой болезнью. Генетическое тестирование в досимптоматический период дает возможность выявить существующие пока только в геноме наследственные тенденции к развитию

будущих болезней и, исходя из современного врачебного опыта, наметить пути их ранней профилактики [Баранов B.C., 2004; Пальцев М.А., 2004; Горбунова В.Н., Имянитов E.H., 2007; Давыдов М.И., 2008].

В целом, полученные нами результаты исследования полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков у онкологических больных свидетельствуют об общности некоторых аспектов канцерогенеза, а также о том, что свойства факторов риска проявляют:

для рака легкого - патологический аллель CYP1A1, нулевые генотипы GSTT1 и GSTM1, функционально неполноценный аллель GSTP1;

для рака желудка - патологический аллель CYP1 Al, нулевой генотип GSTM1, функционально неполноценный аллель GSTP1, про-аллель р53;

для рака толстой кишки - патологический аллель CYP1A1, нулевой генотип GSTM1, функционально неполноценный аллель GSTP1;

для рака предстательной железы - патологический аллель CYP1A1, нулевые генотипы- GSTT1 и GSTM1, функционально неполноценный аллель GSTP1, про-аллель р53.

Помимо свойства факторов предрасположенности к онкологическим заболеваниям патологические аллели и генотипы исследованных генов играют, по-видимому, патогенетическую роль в развитии злокачественного процесса, формировании его клшшко-морфологических особенностей. Степень риска возникновения рака и развития его клинических особенностей, связанная с изученными генами, зависит также от комбинации генотипов. Для онкологических заболеваний исследованных локализаций выявлены протекторные, предрасполагающие и интактные сочетания вариантных генотипов.

Значение подобных исследований заключается в том, что на их основе можно ранжировать популяции по уровням риска развития мультифакториальных заболеваний и более эффективно организовать профилактические мероприятия, поскольку масштабы воздействия факторов окружающей среды на человеческую популяцию неизмеримо велики. Такой подход сделает возможным выделение в популяциях или производственных контингентах с вредными условиями труда групп повышенного риска для организации профилактических мероприятий.

Помимо генотипирования полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков с целью выявления лиц с высоким онкологическим риском следует также проводить анализ аномального метилирования, который может использоваться в ранней неинвазивной диагностике злокачественных новообразований.

Гиперметилирование промоторных областей генов приводит к ингибированию транскрипции. В качестве механизма инактивации генов этот процесс является столь же значимым и настолько же эффективным, как и мутация ДНК [Cameron Е.Е. et al,1999; Jones P.A., Laird P.W. 1999; Robertson K.D., Jones P.A., 2000; Залетаев Д.В., 2002; Herman J.G., Baylin SB, 2003]. Кроме того, аномальное гиперметилирование промоторов генов описано как опухолеспецифичное изменение, которое появляется в очаге поражения на самых ранних этапах онкогенеза [Залетаев Д.В., 2002; Залетаев Д.В., Немцова М.В., 2007]. Так, в исследовании J.C. Soria et al. (2002) гиперметилирование промотора гена GSTP1

было выявлено у 6% бывших курильщиков (п=100), при этом анализировало материал эпителия бронхов с признаками дисплазии.

По данным литературы, в опухолях легкого доля инактивированногс метилированием гена GSTPI составляет от 7 до 33% [Zochbauer-Muller S et al, 2002 Topaloglu O. et al, 2004; Залегтаев Д.В, 2005]. Недостатком этих и настоящей исследований является то, что, все они выполнены на малых выборках, что связано прежде всего, со сложностью получения материала. Нами было проанализировано 30 образцов ДНК опухолей, после бисульфитной модификации которой определяли гиперметилирование промотора гена GSTP1. Было показано, что в 16,7% проанализированных опухолей легкого ген GSTP1 инактивируется метилированием. При этом в трех случаях участки аномального метилирования гена GSTP1 обнаруживались в немелкоклеточных опухолях легкого и в двух случаях у больных мелкоклеточным раком легкого.

Метилирование промоторной области гена GSTP1 рассматривалось нами прежде всего как способ инактивации данного гена для проведения комплексной оценки всех способов инактивации генов глутатион-8-трансфераз. Для этого был построен профиль инактивированных вариантов генов глутатион-Б-трансфераз (рис.2). Во всех 30 образцах опухолей легкого присутствовали инактивированные (делецией или метилированием) варианты генов глутатион-8-трансфераз. В 33,3% случаев был инактивирован один из вариантов генов GSTT1, М1 и Р1, наиболее часто обнаруживалось поражение двух их этой группы генов (46,7%), в пяти случаях нарушение коснулось трех генов глутатион-Б-трансфераз и в одном случае были выявлены все четыре исследуемых типа нарушений. Выявление всех четырех типов нарушений не является артефактом, поскольку в данном случае глутатион-трансферазная активность была полностью заблокирована только в опухолевой ткани за счет метилирования гена GSTP1 и делеции генов GSTT1 и GSTM1, при этом продукт делеционного варианта гена GSTP1, вероятнее всего, проявлял ферментативную активность на уровне макроорганизма, полное же отсутствие ферментов этой группы не совместимо с жизнью. Нужно отметить, что все выявленные нами случаи гиперметилирования промотора гена GSTP1 сопровождались гетерозиготной делецией этого же гена. Возможно, делеция в 5 экзоне влияет на состояние этого участка гена и облегчает метилирование в данном регионе, где содержится большое количество CpG нуклеотццов.

Ранее С. Jerónimo et al. (2002) пытались найти связь между полиморфизмом гена GSTP1 и метилированием промотора этого гена при раке предстательной железы. Их поиски были сосредоточены на образцах, в которых метилирование не было обнаружено, и предположение этих исследователей о том, что отсутствие в ткани метилирования промотора гена GSTP1 приводит к обязательной инактивации гена за счет делеции, не подтвердилось. Однако в этом же исследовании было показано, что в тех образцах, в которых не было обнаружено метилирование, в 62,5% случаев глутатион-Б-трансферазная активность была резко снижена. На наш взгляд, только дальнейшие комплексные исследования суммарного влияния полиморфных вариантов глутатион-Б-трансфераз и метилирования могут объяснить взаимодействия ферментов внутри этого семейства.

Аномальное метилирование промоторной области гена GSTP1 в трансформированной ткани простаты было выявлено многочисленными исследователями [Lee W-H. et al. 1997, Brooks J.D. et al., 1998; Millar D. S. et al.1999, Kimura F. et al., 2000; Caims P. et al. 2001, Jerónimo С. et al. 2002]. Это одно из немногих генетических изменений, которое имеет высокую специфичность именно к раку предстательной железы.

Таким образом, характерной чертой опухолевых клеток является дисбаланс метилирования геномной ДНК, который вносит значительный вклад в создание генетической и фенотипической нестабильности. Метилирование, являясь эпигенетической модификацией ДНК, может в случае нарушения приводить к генетическим изменениям, делая очевидной взаимосвязь между генетическими и эпигенетическими процессами при возникновении и развитии опухоли. Нарушение паттерна метилирования проявляется на ранних стадиях злокачественной трансформации клеток млекопитающих. С медицинской точки зрения, это открывает возможности для ранней диагностики онкологического заболевания. В связи с этим анализ гиперметилирования специфических генов опухоли, генов-супрессоров (р16, р53), генов репарации ДНК (HMLH1) опухолевого роста и генотипирование генов первой и второй фаз ферментов биотрансформации ксенобиотиков являются перспективными направлениями профилактики и ранней диагностики злокачественных новообразований. Полиморфизмы в генах, связанных с рецепторами и метаболизмом гормонов, защитой клетки, репарацией ДНК и метаболизмом нуклеотидов, могут быть вовлечены в канцерогенез.

ВЫВОДЫ:

1. Полиморфизм гена CYP1A1 у больных со злокачественными новообразованиями (рак легкого, рак желудка, рак толстой кишки, рак предстательной железы) характеризуется более высокой частотой Вал-аллеля по сравнению с таковой у здоровых лиц.

2. При распределении полиморфных генотипов генов семейства глутатион-S-трансфераз у больных раком легкого, раком желудка, раком толстой кишки, раком предстательной железы увеличена частота встречаемости делеционных вариантов генов GSTM1, GSTP1 и GSTT1 (только у пациентов со злокачественными новообразованиями легкого и предстательной железы) выше, чем у здоровых доноров.

3. Частота Про-аллеля гена-онкосупрессора р53 у больных раком желудка и больных раком предстательной железы превышает таковую у здоровых лиц.

4. Рисковую значимость для возникновения и развития рака легкого имеет носительство функционально неполноценных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков CYP1A1, GSTT1, GSTM1 и GSTP1, для рака предстательной железы - CYP1A1, GSTT1, GSTM1, GSTP1, для рака желудка -CYP1A1, GSTM1 и GSTP1, для рака толстой кишки - CYP1A1, GSTM1 и GSTP1.

5. При местнораснространенном раке легкого частота Вал-аллеля CYP1A1 и делеционного генотипа GSTT1 превышает таковую у больных раком легкого без метастазов. У больных раком желудка с очагами регионарного метастазирования

увеличена частота распределения вариантных генотипов генов СУР1А1, ОБТИ вБТМ! и гена-онкосупрессора р53, у больных раком толстой кишки - СУР1А1 С5ТМ1 по сравнению с таковой у пациентов без метастазов.

6. Частота Вал-аллеля гена СУР1А1 при немелкоклеточном раке легкого выше, ; частота делеционного генотипа С8ТМ1, напротив, ниже таковой пр! мелкоклеточном типе опухоли.

7. Прогрессия рака предстательной железы сопровождается увеличением частоть носительства патологических вариантов генов С8ТТ1, С8ТМ1, ОБТРЬ

8. Суммарное влияние функционально неполноценных вариантов генов цитохром; Р-450 и глутатион-8-трансфераз Т1, М1, Р1 превышает эффект индивидуальны) вариантных генотипов, что увеличивает риск возникновения злокачественны) новообразований.

9. Для предрасполагающих к возникновению опухолей легкого, предстательно! железы, желудка, толстой кишки комбинаций генов ферменто! биотрансформации ксенобиотиков характерным является наличие двух и боле< функционально неполноценных генотипов СУР1А1, СБТП, СБТМ1 С8ТР1, длз протекторных - присутствие не более одного полиморфного генотипа.

10. В клетках опухоли легкого ген С8ТР1 инактивируется делецией и метилированием, при этом инактивированные варианты генов семейства глутатион-8-трансфераз обнаруживаются в 100% случаев.

11. Курение модулирует риск развития рака легкого, увеличивая его при носительстве делеционных генотипов 05ТТ1, ОБТМП, Вал-аплеля гена СУР1А1 и Про-аллеля гена р53. Курение в сочетании с «профицитным» генотипом СУР1А1 и «дефицитными» генотипами генов СБТП, С5ТМ1, 08ТР1 является более значимым для развития немелкоклеточного рака легкого, чем для мелкоклеточной формы опухоли.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Особенности репаративного синтеза ДНК и полиморфизм генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков у больных раком легкого / Н. В. Севостьянова, М Б. Фрейдин, Л. М. Огородова, В. П. Пузырев, Н. В. Чердынцева, Н. Н. Плотникова, С. А. Коломиец, Л. Н. Уразова, А. Б. Карпов, Р. М. Тахауов, И. А. Тен, Е. В. Неруш, А. И. Дмитриева // Пульмонология.-2005.-Т. 15,№ 1.-С. 11-15.

2. Особенности репаративного синтеза ДНК у больных раком легкого / Е. В. Неруш, В. В. Новицкий, Н. В. Севостьянова, Н. В. Чердынцева, Н. Н. Плотникова, С. А. Коломиец, О. В. Черемисина, А. И. Дмитриева, Н. А. Давыдова // Бюллетень СО РАМН. - 2005. - № 2. - С. 79-81.

3. Особенности полиморфизма генов ферментов 2-ой фазы биотрансформации ксенобиотиков у больных центральным раком легкого / Н. В. Севостьянова, Е. Л. Чойнзонов, А. И. Дмитриева и др. // «Новые технологии в онкологической практике»: материалы Российской научно-практической конференции с международным участием. - Барнаул, 2005. - С. 284-285.

4. Полиморфизм генов ферментов второй фазы детоксикации ксенобиотиков у больных раком легкого / Н. В. Севостьянова, Е. Л. Чойнзонов, А. И. Дмитриева и др.//Онкология.-2005.-Т. 7, № 1.-С. 16-18.

5. К вопросу о генетических и эпигенетических факторах риска рака легкого / Н. В. Чердынцева, Н. В. Севостьянова, Л. Н. Уразова, Е. Л. Чойнзонов, С. А. Коломиец, А. И. Дмитриева и др. // Молекулярная медицина. - 2005. - № 3. -С. 49-55.

6. Изучение полиморфизма генов GSTT1, GSTM1 у больных плоскоклеточной и мелкоклеточной формами рака легкого / А. И. Дмитриева, С. А. Коломиец, Н. В. Севостьянова и др. // «Современные методы лечения онкологических больных: достижения и неудачи»: материалы Российской научно-практической конференции с международным участием. - Барнаул, 2006. - С. 183.

7. Исследование полиморфизма ферментов биотрансформации ксенобиотиков у больных раком предстательной железы / Н. А. Давыдова, С. П. Селиванов, Н. В. Севостьянова, А.И.Дмитриева, В.В.Новицкий // «Современные методы лечения онкологических больных: достижения и неудачи»: материалы Российской научно-практической конференции с международным участием. -Барнаул, 2006.-С. 185.

8. Исследование полиморфных вариантов генов глутатион-8-трансфераз TI, М1 и PI у больных раком предстательной железы / Н.А.Давыдова, А.И.Дмитриева, С.П.Селиванов и др. // «Актуальные вопросы детской и взрослой урологии»: материалы V-региональной научно-практической конференции урологов Сибири.-Томск, 2006.-С. 149-150.

9. Изучение полиморфизма генов глутатион-Б-трансфераз Ml, Т1 и PI у больных раком предстательной железы / Н.А.Давыдова, А.И.Дмитриева, С.П.Селиванов и др. // «Актуальные вопросы онкоурологии»: материалы Всероссийской школы молодых ученых. - М., 2006. - С. 19-20.

10. Сравнительный анализ функционального полиморфизма генов CCR5, р53, GSTT1 и GSTM1 у больных раком легкого и атопической бронхиальной астмой / М. В. Флеминг, П. А. Гервас, Н. В. Чердынцева, В. В. Климов, А. Ю. Добродеев, Н. В. Севостьянова, Н. А. Давыдова, А. И. Дмитриева // Материалы VI Съезда аллергологов и иммунологов СНГ, Российского национального конгресса аллергологов и иммунологов, III Российской конференции по иммунотерапии. -M., 2006.-C.3U.

11. Полиморфизм генов GSTT1, GSTM1 у больных плоскоклеточной и мелкоклеточной формами рака легкого / А. И. Дмитриева, С. А. Коломиец, Н. В. Севостьянова и др. // «X Российский онкологический конгресс»: материалы конгресса. - М„ 2006. - С. 203.

12. Полиморфизм генов ферментов глутатион-Б-трансфераз у больных раком легкого: связь с опухолевой прогрессией / Н. В. Чердынцева, Н. В. Севостьянова, М. В. Флеминг, А. И. Дмитриева и др. // Молекулярная медицина. — 2006. — № 4. -С. 46-52.

13. Сравнительный анализ распределения полиморфных вариантов генов GSTT1 и GSTM1 у больных раком легкого в зависимости от причастности к курению / А. И. Дмитриева, В. В. Новицкий, Н. В. Севостьянова и др. // «Профилактика и

лечение злокачественных новообразований в современных условиях»: материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - Барнаул, 2007. - С. 238.

14. Анализ полиморфных вариантов генов глутатион-Б-трансфераз Т1, М1 и Р1 у больных раком предстательной железы / Н. А. Давыдова, А. И. Дмитриева, Н. В. Севостьянова и др. // «XI Российский онкологический конгресс»: материалы конгресса. - М., 2007. - С. 224.

15. Инактивация генов глутатион-Б-трансфераз у больных раком легкого / А. И. Дмитриева, Н. А. Давыдова, Н. В. Севостьянова и др. // «XI Российский онкологический конгресс»: материалы конгресса. - М., 2007. - С. 189-200.

16. Генетический полиморфизм глутатион-Б-трансфераз 01, ц1 при раке легкого / А. И. Дмитриева, Н. В. Севостьянова, С. А. Коломиец и др. // Вопросы онкологии. - 2007. - Т. 53, № 6. - С. 660-663.

17. Анализ генотипов СБТИ, С8ТМ1 и экспрессии мутантного белка р53 при центральном раке легкого / Н. В. Севостьянова, Е. Л. Чойнзонов, А. К Дмитриева и др. // Онкология. - 2008. - Т. 10, № 1. - С. 35-38.

18. Генетический полиморфизм глутатион-8-трансфераз 01 и ц1 у больных гаюскоклеточным и мелкоклеточным раком легкого / Н. В. Севостьянова, Е. Л. Чойнзонов, А. И. Дмитриева и др. // Российский онкологический журнал. -2008. -№ 1.-С. 28-31.

19. Полиморфизм генов глутатион-Б-трансфераз у больных раком предстательной железы / Н. А. Давыдова, А. И. Дмитриева, С. П. Селиванов и др. // Урология. -2008.-№2.-С. 26-29.

20. Изучение гена хемокинового рецептора СС115 при раке легкого /

A. И. Дмитриева, Н. В. Севостьянова, Н. А. Давыдова и др. // Молекулярная медицина. - 2008. - № 2. - С. 43-47.

21. Анализ генотипов СБТП, в8ТМ1 и их комбинаций, экспрессии мутантного белка р53 при центральном раке легкого / А. И. Дмитриева, II. В. Севостьянова, Н. А. Давыдова и др. // Технологии живых систем. - 2008. - Т. 5, № 2-3. - С. 9197.

22. Полиморфизм С8ТТ1 и СвТМ у больных раком легкого / А. И. Дмитриева,

B. В. Новицкий, Н. В. Севостьянова и др. // «Молекулярно-генетическая диагностика злокачественных опухолей человека»: сборник тезисов II Российского симпозиума. - М., 2009. - С. 11-12.

23. Полиморфизм генов ферментов детоксикации ксенобиотиков у больных злокачественными новообразованиями желудочно-кишечного тракта / Н. В. Севостьянова, А. М. Некрасова, А. П. Кошель, А. И. Дмитриева и др. // «Молекулярно-генетическая диагностика злокачественных опухолей человека»: сборник тезисов II Российского симпозиума. - М., 2009. - С. 27-28.

24. Анализ полиморфных генотипов СБТП, 05ТМ1 у больных раком предстательной железы и раком легкого / Н. А. Давыдова, А. И. Дмитриева, Н. В. Севостьянова и др. // Технологии живых систем. - 2009. - Т. 6, № 1. -

C. 23-28.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГП - генный полиморфизм ЦРЖ - диффузный рак желудка •1РЖ - интестинальный рак желудка VIРЛ - мелкоклеточный рак легкого :1МЛ - немелкоклеточный рак легкого

ОГУЗ «ТООД» - областное государственное учреждение здравоохранения «Томский

областной онкологический диспансер»

ПА У - полициклические ароматические углеводороды

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РЖ - рак желудка

РЛ - рак легкого

РГ1Ж - рак предстательной железы РТК - рак толстой кишки

Ф1Ж - ферменты биотрансформации ксенобиотиков

СУР1А1 - ген семейства ферментов цитохрома Р-450 типа 1А1

ОБ'ГП, СБТМ!, вБТР! - гены глутатион-Б-трансфераз 01, ц1 и л 1, соответственно

Тираж 130 экз. Отпечатано в КЦ «Позитив» 634050 г. Томск, пр. Ленина 34а