Автореферат и диссертация по медицине (14.01.08) на тему:Роль полиморфизма гена апоптоза P53 у больных ювенильным идиопатическим артритом

На правах рукописи

КОЖЕВНИКОВ АЛЕКСЕЙ НИКОЛАЕВИЧ

РОЛЬ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА АПОПТОЗА Р53 У БОЛЬНЫХ ЮВЕНИЛЬНЫМ ИДИОПАТИЧЕСКИМ АРТРИТОМ

14.01.08 — педиатрия 03.02.07 — генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 8 НОЯ 2013

005540122

Санкт-Петербург 2013

005540122

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт — Петербургский государственный педиатрический медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации» на кафедре педиатрии имени профессора И.М.Воронцова ФП и ДПО.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Новик Геннадий Айзикович Ларионова Валентина Ильинична

Официальные оппоненты:

Эрман Михаил Владимирович доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет», кафедра педиатрии, заведующий. Асанов Алий Юрьевич доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра медицинской генетики, заведующий.

Ведущее учреждение: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И.Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится 09 декабря 2013 г. в Ю00 часов на заседании совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора (кандидата) медицинских наук Д 208.087.03 при ГБОУ ВПО СПбГПМУ Минздрава России по адресу: 194100, Санкт-Петербург, ул. Литовская, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГБОУ ВПО СПбГПМУ Минздрава России по адресу: Санкт-Петербург, ул. Кантемировская, 16

Автореферат разослан « ноября 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.087.03 д.м.н., профессор

Чухловина М.Л.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Ювенильный идиопатический артрит (ЮИА) — это хроническое заболевание суставов у детей мультифакторной природы, которое характеризуется длительным прогрессирующим течением, приводящее к развитию контрактур и потери функции суставов. В основе заболевания лежит системный хронический воспалительный процесс [Кузьмина H.H., И.М.Воронцов., 2001; Cassidy J.Т., et al, 2005; Алексеева Е.И., Литвицкий П.Ф., 2007; Ravelli А., Martini А., 2007; Kim К.Н., Kim D.S., 2010].

Распространенность заболевания в различных странах у детей составляет от 16 до 150 случаев на 100000 населения. Смертность у детей от осложнений некоторых форм артрита в регионах достигает 2%, а стойкая инвалидность в отдельных группах детей с ЮИА достигает около 10% несмотря на применение современной антицитокиновой терапии и других лекарственных средств [Weiss J.E., Ilovvite N.T., 2007; Magni-Manzoni S., et al., 2008; Hoffart C„ Sherry D., 2010; Beukelman Т., et al., 2011]. Следовательно, необходимость прогнозирования характера течения ЮИА и его осложнений, выбор адекватной противоревматической терапии у ребенка на раннем этапе заболевания является актуальной задачей современного здравоохранения.

ЮИА включает несколько клинических форм артритов, объединенных между собой в группы на основании характера и исхода клинического течения, инструментальных и лабораторных признаков, имеющих различные патогенетические механизмы развития (ILAR 2001, 2004).

Клиническая гетерогенность ЮИА определяется мультифакторной природой заболевания и развивается на основе генетической предрасположенности под воздействием внешних факторов среды [Adams А., Lehman Т., 2005; Hahn Y.S., Kim J.G., 2010].

В настоящее время активно изучаются молекулярные основы развития и поддержания хронического воспаления в суставе. Снижение чувствительности клеток к Р55-зависимому пути апоптоза возможно является одним из ключевых механизмов, нарушения которых приводят к поддержанию хронического воспаления [Lee C.S., et al., 2000; Ramenghi U., et al., 2000; Taubert H., et al., 2000; Smolewska E„ et al., 2003, 2006, 2008]. Некоторыми исследователями получены данные о различных полиморфных вариантах гена Р53, связанных с изменением экспрессии гена и функциональной активности белка [Dumont Р., et al., 2003; Ghosh А., et al., 2004; Ghavamil S„ et al., 2009].

К настоящему времени не известна частота распределения полиморфных вариантов гена Р53 у детей с ЮИА и их связь с различными вариантами клинического течения заболевания и полом.

Проведение исследования, позволяющего выявить клинико-инструментальные, лабораторные показатели и молекулярно-генетические маркеры прогнозирования характера клинического течения и исходов ЮИА

у детей с различными вариантами заболевания представляется своевременным и актуальным.

Цель исследования

Выявить факторы прогнозирования характера течения и исходов различных вариантов ювенильного идиопатического артрита у детей на основе комплексного анализа результатов клинико-инструментального, лабораторного и молекулярно-генетического обследования.

Задачи исследования

1. Изучить клинические, инструментальные, лабораторные показатели характера течения ювенильного идиопатического артрита у обследованных детей и выделить различные группы на основании международных критериев ILAR.

2. Провести молекулярно-генетическое тестирование полиморфных вариантов Arg72Pro, ins/del 16bp, G13964C гена Р53 у детей с ювенильным идиопатическим артритом и у детей группы сравнения и изучить характер распределения их частот.

3. Провести сравнительный анализ распределения полиморфных вариантов Arg72Pro, ins/del 16bp, G13964C гена Р53 и их генотипов в группах детей с различными вариантами течения ювенильного идиопатического артрита в зависимости от пола, показателей активности артрита, характера суставного поражения и наследственной отягощенности по ревматологическим заболеваниям.

4. Провести анализ клинико-инструментальных и лабораторных показателей активности ювенильного идиопатического артрита у детей в зависимости от результатов молекулярно-генетического тестирования гена Р53 и выявить группы риска по наиболее тяжелому варианту течения ювенильного идиопатического артрита с исходом в артроз.

5. Провести комплексный анализ результатов клинико-инструментального, лабораторного и молекулярно-генетического обследования детей с ювенильным идиопатическим артритом и разработать способы прогнозирования «активного» артрита и клинико-медикаментозной ремиссии заболевания.

Научная новизна исследования

1. Впервые в России проведено исследование полиморфных вариантов Arg72Pro, ins/del 16bp, G13964C гена Р53 у детей с различными формами ювенильного идиопатического артрита. Получено распределение частот изученных полиморфных вариантов и генотипов гена Р53 в зависимости от клинико-рентгенологических, инструментальных и лабораторных показателей активности артрита, пола.

2. Впервые у девочек с ювенильным идиопатическим артритом выявлен различный характер клинического течения и исходы заболевания в зависимости от носительства изученных аллелей гена Р53 и их сочетания.

3. Впервые на основании комплексного анализа результатов клинико-инструментального, лабораторного и молекулярно-генетического

обследования выявлены группы риска детей по наиболее неблагоприятному варианту течения ювенильного идиопатического артрита с исходом в артроз.

Внедрение результатов в практику

Результаты исследования применены в учебном процессе на кафедре педиатрии имени профессора И.М.Воронцова ФП и ДПО ГБОУ ВПО СПбГПМУ Минздрава России, в клинической практике педиатрического отделения №3 клиники ГБОУ ВПО СПбГПМУ Минздрава России (г.Санкт-Петербург) и ортопедического отделения №7 (ревматоидного артрита и последствий травм) ФГБУ НИДОИ им.Г.И.Турнера Минздрава России (г.Санкт-Петербург).

Положения, выносимые на защиту

1. Дети с ювенильным идиопатическим артритом имеют различный характер клинического течения и исходы заболевания в зависимости от носительства полиморфных вариантов Arg72Pro, ins/del 16bp 3 и G13964C и их сочетаний гена Р53 и пола.

2. Оценка риска формирования «активного» артрита и неблагоприятного исхода у детей с ювенильным идиопатическим артритом на фоне проводимой терапии должна проводиться на основании комплексного анализа результатов клинико-инструментального, лабораторного, молекулярно-генетического обследования и с учетом половых различий.

3. Выход в клинико-медикаментозную ремиссию ювенильного идиопатического артрита зависит от времени начала противоревматической терапии, характера суставного поражения и носительства полиморфного варианта аллеля Arg72 в гомозиготном состоянии гена Р53 и пола.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на XI Северо-Западной научно-практической конференции по ревматологии (С-Петербург, 2011 г.), V Региональной научно-практической конференции «Воронцовские чтения-2012» (С-Петербург, 2012г.), IV Российской научно-практической конференции «Аллергологические и иммунопатологические заболевания — проблема XXI века» (С-Петербург, 2012г.), VI Съезде ревматологов России (Москва, 2013г), I Международном Форуме «Молекулярная медицина — новая модель здравоохранения XXI века: технологии, экономика, образование» (С-Петербург, 2013г), XVIII Европейском конгрессе детских ревматологов PRES - 2011 (Брюгге - 2011 г), Международном конгрессе Европейского общества генетики человека ESHG-2013 (Париж - 2013г).

Конкретное участие автора в получении научных результатов

Автором был проведен анализ литературных данных, посвященный роли влияния нарушения апоптоза в патогенезе ЮИА, механизмах хронического воспаления. Сформулирована цель исследования, определены задачи, выбраны оптимальные методы исследования для проведения научной работы

(клинико-биохимический, рентгенологический, иммунологический, генетический). Был разработан план исследования. Автор осуществлял набор, клинический осмотр и динамическое наблюдение за пациентами в соответствии с планом исследования. Освоил молекулярно — генетические методы (выделение ДНК, амплификация, ПДРФ-анализ, электрофорез в геле) и самостоятельно выполнил все исследования полиморфизма Arg72Pro, ins/del 16bp intronS и G/C intronö гена Р53. Была разработана электронная база для статистической обработки данных и последующего анализа. На основании полученных результатов и их анализа были сформулированы выводы и практические рекомендации.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав с изложением общей характеристики пациентов, используемых методов исследования, собственных результатов исследования и их обсуждения, выводов, указателя литературы. Диссертация содержит 41 отечественных и 177 зарубежных источников литературы, проиллюстрирована 38 таблицами, 43 рисунками. Работа дополнена фотографиями суставов детей, изображениями результатов рентгенографии, компьютерной и магнитно-резонансной томографии пораженных суставов, документированными данными артроскопии и морфологического обследования. Представлен клинический пример.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы

В исследование включено 126 детей с различными вариантами ювенильного идиопатического артрита, которые проходили стационарное обследование и лечение на отделении ревматоидного артрита и последствий травм (зам.глав.врача к.м.н. Поздеева H.A.) ФГБУ «Научно-исследовательский детский ортопедический института имени Г.И.Турнера Минздрава России» и педиатрическом отделении №3 (зав.отд. к.м.н. Калашникова О.В.) клиники ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский Государственный Педиатрический Медицинский Университет Минздрава России» в период с 2009 по 2012гг. Группу сравнения составили 60 здоровых детей с неотягощенным семейным анамнезом по воспалительным артропатиям. Включение детей в проводимое исследование и разделение по группам проводилось на основании клинико-лабораторных критериев, предложенных Международным Конгрессом Ассоциации Ревматологов, ILAR, Edmonton 2001, second revision 2004 (рис.1).

Клинические и лабораторные методы Всем детям проводилось комплексное ревматологическое обследование, основанное на изучении анамнеза заболевания и особенностей клинико-рентгенологического течения болезни. Клиническое исследование суставов включало стандартные методы подсчета числа болезненных и отечных суставов, оценка функционального статуса осуществлялась с использованием

опросника СНА<3. Всем детям были выполнены: клинический анализ крови, биохимический анализ крови с исследованием уровня С-реактивного белка и сиаповых кислот, общего белка и фракций. Иммунологическое исследование крови проводилось в лаборатории диагностики аутоиммунных заболеваний СПбГМУ имени академика И.П.Павлова и включало определение ревматоидного фактора (РФ), антинуклеарного фактора клеточных линий НЕр-2 (АНФ) методом нРИФ и антигена НЬАВ27 методом ПЦР.

Дг-тн с хронике с г 2 до 18 лет со стаже Критерии исключения SEA-еиндром Ч | Ю ! Псориатяческий артрит ■ < | ЮИА с поражением глаз \ -4- ЮИА РФ + j < активна 1 на фоне (SEA-синдром - серонегативная энтезоарт кигш артритами болезни более 2-х лет Критерии включения 1А | 1 >1 ! О л иго артрит и=42 1 ^ Полиартрит к=47 "■••••■•••Ы Системный артрит а=10 . -N ЮА с >нтезопатией и=27; | ч йяртрпг | | клишисо-медикаментозваг лечения ремиссия не менее ! года 1 ропатия, РФ - ревматоидный фактор)

Рисунок 1. Группы детей, сформированные для исследования

Инструментальная диагностика Инструментальная диагностика заключалась в проведении цифровой рентгенографии пораженных суставов в двух стандартных проекциях, ультразвуковом сканировании суставов, компьютерной томографии суставов на томографе Philips Brilliance СТ 64 с 3D - реконструкцией и магнитно-резонансной томографии на томографе Philips Panorama 1,0Т. Некоторым больным была проведена диагностическая артроскопия с использованием современной оптической системы Karl Storlz 30° для детальной оценки характера макроскопических изменений синовиальной оболочки, проведения прицельной биопсии с последующим гистологическим анализом, и исключения ортопедической патологии не воспалительного характера.

Методы оценки активности ЮИА Для оценки степени активности заболевания и эффективности проводимого лечения были применены шкалы ACRpedi и JADAS71crp, адаптированные для педиатрической ревматологической практики [Ringold S., et al 2007; Consolaro A., et al 2008; Horneff J., et al 2012]. Индекс JADAS71crp рассчитывался по формуле: оценка активности заболевания врачом по визуально-аналоговой шкале ВАШ («0» = активности нет, «10» = активность максимальная) + оценка состояния заболевания ребенком/родителем по шкале ВАШ («0» = очень хорошо, «10» = очень

плохо) + количество активных суставов (0-71) + воспалительный маркер СРБ, рассчитанный по формуле (CRP mg/1 - 5)/5. При нормальном уровне СРБ от 0 до 5 mg/1 этот маркер был равен нулю. Низкая активность заболевания по индексу JADAS71 crp для детей с олигоартритом считалась, как равная менее 2, для детей с полиартритом менее 3,8. Индекс ACRpedi включал 6 параметров оценки и обозначался как ACRpelij 30, 50, 70, 90, согласно разработанным критериям.

Молекулярно-генетические методы

Молекулярно-генетическое тестирование полиморфизмов Arg72Pro, ins/del 16bp, G13964C гена Р53 выполнялось на базе лаборатории молекулярной диагностики с расширенной группой экогенетики НИЦ ГБОУВПО СПбГПМУ и медико-биологического отдела ООО «ЛЮМЕКС». Геномная ДНК была выделена из лейкоцитов цельной венозной крови методом фенольно-хлороформной экстракции. Идентификация аллелей выполнялась с помощью полимеразной цепной реакции с последующим рестрикционным анализом по описанным методам [Fleury I. et.al., 2003; van Rossum EFC. et al., 2004].

Методы статистического анализа

Статистическая оценка полученных данных распределения генотипов и аллелей гена Р53 проводилась при помощи программы для персонального компьютера Microsoft Excel и пакета программ «STATISTICA» (версия 6 0, StatSoft Inc, 2001) и «MedCalc» (версия 12.6.0.) Сравнительный анализ частот генотипов, аллельных вариантов гена Р53 проводился с использованием стандартного критерия у? Пирсона (Pearson Chi-square) и двустороннего критерия Фишера (Fisher Exact Test), где р<0,01 считался статистически достоверным. Когда объем выборки не превышал 5 случаев, использовался критерий х2 с поправкой Йетса. Оценка результатов распределения генотипов аллельных вариантов гена Р53 в исследованных группах детей, проводилась на соответствие ожидаемым частотам при равновесии Харди-Вайнберга. Для проведения математического моделирования использовались методы множественной линейной и логистической регрессии, корреляционный анализ. Статистическая мощность полученных моделей вероятности течения активного артрита и клинико-медикаментозной ремиссий определялась путем вычисления их чувствительности, специфичности и прогностической способности методом ROC-анализа [Тот Fawcett 2005]. Для оценки распределения генотипов был применен кластерный анализ с построением дендрограммы (Cluster, vers 1.1).

Клинико-лабораторная характеристика детей с ЮИА

Все дети были разделены на 4 большие группы: «олигоартрит», «полиартрит», «системный артрит» и «ЮА с энтезопатией» и затем каждая из них по полу. Было обследовано 126 детей, из них 79 девочки (62,7%) и 47 мальчик (37,3%), средний возраст детей составил 10 ± 4,43 года. В градациях по возрастам группу до 3 лет составили 1,6%, группу от 3 до 7 лет — 24,8%, от 7 до 11 лет - 23,2%, старше 11 лет - 50,4 % детей. В группу детей с

олигоартикулярным вариантом ЮИА включено 42 ребенка, которые были разделены на 2 подгруппы в зависимости от возраста дебюта заболевания: олигоартрит младшего и старшего возраста (29 и 13 детей соответственно). Группу полиартрита составила 47 детей. Группу ЮА с энтезопатией составили 27 детей, куда были отнесены детей с анкилозирующим спондилоартритом (табл.1)

Табтща 1

Клинико-инструментальные и лабораторные показатели у детей с ЮИА

Показатель Группы детей — Средний возраст, лет соэ мм/ч СРБ мг/л JADAS71 CRP Эрозии суставов % Артроз % Терапия

Олигоартрит раннего возраста (п=29) «активный» артрит девочки *3 (п=13) 8 ±2,7 28,0 ± 8,2 8,3 ±3,1 13,5 ±2,0 53,8% 15,4% БТ-15,4%; МТХ-61,6%; НПВС± В\С 27%.

«активный» артрит мальчики *1 (п=4) 8 ±2,1 33,8 ±9,2 11,7 ±2,6 15,3 ±2,7 75.0% 75,0% 100% - МТХ

ремиссия девочки (11=9) 5 ±2,2 9,0 ±3,1 2,6 ± 1,4 1,9 ±0,6 33,3% 0% МТХ -55,5%; НПВС + В\С 11,1% моно НПВС 33,3%

ремиссия мальчики (п=3) 8 ±0,4 10,3 ± 2.2 1,5 ±0,2 1,4 ±0,2 33,3% 0% МТХ -66,7%; моно НПВС 33,3%.

Олигоартрит старшего возраста (п=13) «активный» артрит девочки (п=3) 13 ± 1,1 29,3 ± 8,2 11,7 ±2,7 15,3 ±2,7 33,3% 0% МТХ-66,7%, НПВС + В\С 33,3%

ремиссия девочки (п=10) *5 13 ±2,5 11,0 ±2,7 1,7 ±0,6 1,7 ±0,6 10% 0% SSA-20%; моно НПВС 80%.

Полиартрит (п=47) «активный» артрит девочки (п=21) 11 ±4,1 30,2 ±9,1 9,1 ±11,2 32,8 ± 11,0 100% 38,1% БТ-42,9%, МТХ-57,1%

«активный» артрит мальчики (п=16) 8 ±3,4 28,5 ±9,5 6,7 ± 10.7 31,4± 10,9 100% 56,3% БТ-25%, МТХ - 75%

ремиссия девочки (П=8) 7 ±2,8 10,2 ±3,2 2,8 ± 1,4 2,2 ± 0,4 62,5% 12,5% 100%-МТХ

ремиссия мальчики (п=2) 14 ±2,5 12,5 ±2,5 1,2 ± 1,0 1,4 ±0,1 50% 0% 100%-МТХ

Системный артрит (11=10) «активный» артрит девочки (п=б) 9 ±2,3 35 ± 4,0 17,3 ±3,8 40,4 ± 2,6 100% 33,3% 50% Г + МТХ + Цс 50% Г + МТХ

«активный» артрит мальчики (п=4) 9 ±2,3 32,0 ± 4,4 25,3 ± 3,4 36,5 ±5,5 100% 25% 50% - БТ; 50% Г + МТХ + Цс

ЮА с энтезопатней (п=27) «активный» артрит девочки (п=5) 14 ±1,4 26,6 ± 4,4 7,2 ± 3,2 14,4 ± 1,8 60% 0% МТХ -66,7%; SSA-33,3%.

«активный» артрит мальчики (п=9) 13 ±2,9 24,0 ±4,5 18,3 ±8,3 21,6 ± 12,3 77,8% 55,6% БТ-22,2%; МГХ -33,3%; SSA 33,3%; моно НПВС 11,1%

ремиссия девочки (гг=3) 14 ± 1,1 11,0 ± 1,0 1,4 ±0,2 1,6 ±0,2 22,2% 0% 100% НПВС

ремиссия мальчики (п=9) 13 ± 2,5 11,0 ±2,9 1,6 ±0,4 1,3 ±0,4 0% 0% SSA-22,2%, моно НПВС 77,8%

(БТ - биологическая генно-инженерная терапия, MTX - различные схемы терапии препаратом меготрексат, SSA - еульфасалазин, Цс - циклоспорин, В\С внутрисуставное введение ГКС- препаратов. * меткой обозначено количество дети, которым была проведена диагностическая аргроскопия)

Большинство детей с олигоартритом и полиартритом имели дебют заболевания в возрасте до 5 лет. В зависимости от эффективности проводимой терапии все дети были разделены на две подгруппы: «активный» и «неактивный» артрит, т.е. достигшие клинико-медикаментозной (фармакологической) ремиссии не менее 1года, согласно разработанным критериям [Love 11 D.J., et al„ 2000; Wallace C.A., et a!., 2004, 2006]. Все дети с «активным» артритом находились в диапазоне критерия ACRpedi 30-50. Дети с клинико-медикаментозной ремиссией не имели обострения в течение 1-1,5 лет после отмены лекарственных препаратов и находились в диапазоне критерия ACRpedi > 90.

Для оценки характера суставного поражения в работе использовались анатомические изменения костной ткани, описываемые в литературе как классические критерии стадии ЮРА, разработанные Штейнброкером в 1988г. Артроз был диагностирован в случае сочетания нескольких клинических (наличие внешней деформации сустава со стойкой комбинированной контрактурой с ограничением сгибательно-разгибательных и ротационных движений не менее чем на 10-15°) и рентгенологических признаков (изменение осевых характеристик, деформация эпифизов, образующих сустав, сужение суставной щели, нарушение целостности и истощение хрящевого покрова, дистрофические изменения костной ткани).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ

Распределение генотипов по гену Р53 у детей с ЮИА

Сравнительный анализ распределения генотипов Arg72Pro, ins/del 16bp intron 3, G13964C intron 6 по гену P53 у детей с ЮИА и группой сравнения не выявил достоверных различий (р>0,05). Полученные нами результаты распределения частот аллелей по изученным полиморфным локусам Arg72Pro, ins/del 16bp, G13964C гена Р53 соответствуют равновесию Харди-Вайнберга и совпадают с частотами, полученными исследователями западноевропейских стран [Ojeda JM, et al 2003; Ressiniotis Т., et al 2004; Hrstka R, et al 2008; Zheng Hu., et al 2010].

Таблица 2

Распределение генотипов гена Р53 у детей с ЮИА и группы

Группы детей ЮИА (n=126) Здоровые дети (60) Достоверность, р

Полиморфизм абс % абс %

3 intron ins/dell 6bp del/del (dd) ins/del (id) ins/ins (ii) 89 35 2 70,6 27.8 1,6 45 14 1 75,0 23.3 1,7 р>0,05

4 exon Arg72Pro Arg/Arg (AA) Arg/Pro (AP) Pro/Pro (PP) 62 56 8 49.2 44,4 6,4 31 23 6 51,7 38,3 10,0 р>0,05

6 intron G13964C GG GC CC 98 27 1 77.8 21,4 0.8 47 12 1 78,3 20,0 1,7 р>0,05

Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов по исследованным полиморфизмам гена Р53 в группе мальчиков с «активным» артритом и мальчиков с ремиссией заболевания статистически значимых различий не выявил. Аналогичный анализ, проведенный у девочек с «активным» артритом и клинико-медикаментозной ремиссией, выявил статистически значимые увеличения частот генотипов, содержащих аллель 72Рго и 13964С у девочек с «активным» артритом в сравнении с частотами аналогичных генотипов другой группы (р=0,0002. х2=16,8; GC 28,6% и 3.3%, СС 2,0% и 0,0%, р=0,01, соответственно) (рис.2). Различий в

распределении генотипов интронного полиморфизма ins/del I6bp у девочек в исследованных группах выявлено не было (р=0,069).

Рисунок 2. Распределение генотипов А^72Рго гена Р53 у детей с _«активным» артритом и ремиссией._

Дальнейший анализ распределения частот аллелей генотипов по исследованным полиморфным сайтам гена Р53 проводился у детей с различными вариантами течения ЮИА.

Группа детей с олигоартритом Сравнительный анализ распределения частот аллелей генотипов по исследованным полиморфным локусам гена Р53 у девочек с «активным» олигоартритом и клинико-медикаментозной ремиссией с дебютом в раннем возрасте выявил статистически значимое увеличение частот генотипов, содержащих аллель 72Pro (р=0,0001 и х,2 = 19,2) (рис.3). При этом все девочки с клинико-медикаментозной ремиссией ЮИА имели гомозиготный генотип Arg/Arg (аллель 72Arg 100%) (рис.3). Значимых различий распределения частот аллелей генотипов по полиморфным локусам ins/del 16bp (р=0,24) и G13964C (р=0,09) в группе девочек с различными вариантами течения олигоартрита и дебютом в раннем возрасте выявлено не было.

Мальчики с «активным» олигоартритом и клинико-медикаментозной ремиссией не имели достоверных различий распределения частот аллелей генотипов Arg72Pro (р=0,34), ins/del 16bp (р=0,34), и G13964C (р=0,42) гена Р53.

п

Анализ распределения частот генотипов Arg72Pro, ins/del 16bp и G13964C гена Р53 у девочек с «активным» олигоартритом и клинико-медикаментозной ремиссией с дебютом в старшем возрасте не выявил статистически значимых различий (р>0,05). При этом обращает внимание, что все девочки с «активным» олигоартритом, несмотря на высокую активность заболевания, имели генотип Arg/Arg.

т Arg/Arg (АЛ) uAi^Pro (АР) a Pro/Pro (РР)

Рисунок 3. Распределение генотипов Аг§72Рго гена Р53 у девочек с олигоартритом с дебютом в раннем возрасте и полиартритом

Группа детей с полиартритом Увеличение частот генотипов, содержащих аллель 72Рго гена Р53, выявлено у девочек с «активным» полиартритом в сравнении с частотами аналогичных генотипов у девочек с клинико-медикаментозной ремиссией (р=0,0058 и х2=Ю>3)- При этом было отмечено, что наиболее тяжелый вариант суставного поражения имели девочки — носители аллеля 72Рго в гомозиготном состоянии. Все девочки с полиартритом с выходом в клинико-медикаментозную ремиссию имели генотип Arg/Arg (Аллель Arg72 100%). Значимых различий распределения частот аллелей генотипов по полиморфным локусам ins/del 16bp (р=0.11) и G13964C, (р=0,04) у девочек с различными вариантами течения полиартрита выявлено не было.

Не выявлено статистически значимых различий в частотах распределения генотипов исследованных полиморфизмов гена Р53 у мальчиков с «активным» полиартритом и мальчиков с клинико-медикаментозной ремиссией. При этом наиболее тяжелый вариант суставного поражения встречался у мальчиков как с генотипом Arg/Arg, так и генотипами Arg/Pro и Pro/Pro гена Р53.

Дети с системным артритом Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов по полиморфным локусам Arg72Pro, ins/del I6bp и G13964C гена Р53 у детей с системным артритом не выявил достоверных различий (р>0,05).

Группа детей с ЮА с энтезопатией Анализ особенностей распределения частот генотипов по исследованным полиморфизмам гена Р53 в группе мальчиков с «активным» артритом и мальчиков с клинико-медикаментозной ремиссией не выявил достоверных различий (р>0,05). Все мальчики с анкилозирующим спондилоартритом имели вариант Arg/Pro гена Р53 в сочетании с вариантами ins/del или вариантами ins/del и G/C. Не выявлено различий в частотах распределения генотипов исследованных полиморфизмов гена Р53 у девочек с «активным» ЮА с энтезопатией по сравнению с частотами этих генотипов у девочек с клинико-медикаментозной ремиссией (р>0,05).

Группа детей с суставным поражением В группу детей с суставным поражением были включены дети с олиго-, полиартритом и ЮА с энтезопатией. Анализ распределения частот генотипов Arg72Pro гена Р53 в группе девочек с суставным поражением показал, что 64,1% детей с клинико-медикаментозной ремиссией имели генотип Arg/Arg, в то время как 85,3% девочек с персистирующим «активным» артритом на фоне терапии были носителями аллеля 72Рго, как в гетерозиготном, так и гомозиготном состоянии (р=0,0005, yj=\2,2). Не выявлено достоверных различий распределения частот генотипов Arg72Pro гена Р53 у мальчиков с клинико-медикаментозной ремиссией в сравнении с частотами генотипов у мальчиков с персистирующим «активным» артритом (рис.4).

Рисунок 4. Распределение генотипов Arg72Pro у детей _суставным поражением (п=116)._

□ Актив ный ¿ртрит тРемнсоия |

Таким образом, анализ распределения частот аллелей и генотипов, изученных полиморфных вариантов гена Р53, позволил установить достоверные различия частот генотипов полиморфизма Arg72Pro у девочек с олигоартритом с дебютом в раннем возрасте и полиартритом в зависимости от характера течения заболевания.

Дальнейшие исследования были направлены на изучение связи различных аллелей и генотипов полиморфизма Arg72Pro гена Р53 с характером течения заболевания, уровнем лабораторных показателей,

характеризующих воспалительную активность, с проводимой медикаментозной терапией и исходами ЮИА.

Полиморфизм Arg72Pro гена Р53 и клинико-лабораторные показатели активности и характер течения ЮИА

СОЭ, СРБ и число активных суставов Не выявлено статистически значимых различий динамики уровня показателей СОЭ, СРБ и числа активных суставов у мальчиков и девочек на протяжении «активной» фазы заболевания в зависимости от носительства аллелей и генотипов Arg72Pro гена Р53.

Эрозии в суставах и артроз Исследован характер суставного поражения у детей с ЮИА — носителей различных аллелей и генотипов Arg72Pro гена Р53. Оказалось, что все девочки с клинико-медикаментозной ремиссией и эрозиями в суставах в анамнезе заболевания имели генотип, содержащий аллель Arg72 гена Р53 в гомозиготном состоянии, в то время как у большинства девочек с «активным эрозивным» артритом преобладали генотипы, содержащие аллель 72Рго (Arg/Pro - 59,4%, Pro/Pro - 12,5%, р=0,003, %2=\ 1,6). Получены аналогичные различия распределения частот аллелей и генотипов Arg72Pro гена Р53 у мальчиков с эрозиями в суставах, однако малое количество мальчиков с ремиссией артрита (п=2) не позволило провести анализ. Не выявлено различий распределения частот аллелей и генотипов Arg72Pro гена Р53 у мальчиков и девочек, имеющих артроз как исход заболевания. Однако, было обнаружено достоверное преобладание генотипа содержащего аллель 72Рго в гомозиготном состоянии у девочек с артрозом (р<0,01).

Корреляционно-регрессионный анализ Анализ уровня показателей СОЭ, СРБ, частоты эрозий в суставах и артроза у детей с ЮИА в зависимости от носительства аллелей и генотипов Arg72Pro гена Р53 проводился с помощью метода линейной корреляции с построением уравнения множественной регрессии, где р<0,01 считался статистически значимым. Результаты множественного линейного регрессионного анализа представлены в виде коэффициента детерминации R2, стандартной ошибки, Г-критерия и значения р, а значения корреляционного анализа - в виде коэффициента корреляции г с 95% доверительным интервалом.

У девочек с ЮИА - носителей генотипа, содержащего аллель 72Рго гена Р53 в гомозиготном состоянии, выявлен высокий риск формирования артроза, как исхода заболевания (OR=25,7, р<0,0001) (рис.5). У девочек -носителей генотипов, содержащих аллель Arg72 в гомозиготном состоянии и аллель 72Рго в гетерозиготном состоянии гена Р53, показатели лабораторной активности заболевания, частота возникновения эрозий в суставах и артроз достоверно не отличались. У мальчиков - носителей различных вариантов генотипов Arg72Pro гена Р53 достоверной связи с уровнем лабораторных

показателей активности артрита, частотой возникновения эрозий в суставах и артроза не выявлено.

генотип Pro/Pro . OR=25 7

..... артроз

Рисунок 5. Линейный регрессионный анализ прямой связи

генотипа Pro/Pro и артроза у девочек с ЮИА.

Анализ медикаментозной терапии у детей с ЮИА В группах мальчиков и девочек с ЮИА, разделенных в зависимости от проводимой противоревматической терапии, не выявлено достоверных различий распределения частоты полиморфных вариантов Arg72Pro, ins/del 16bp и G13964C и генотипов гена Р53. Не получено прямой корреляционной связи между лекарственными препаратами, используемыми для лечения детей с ЮИА, и вариантами аллелей и генотипов изученных полиморфизмов гена Р53.

Влияние полиморфизма Arg72Pro на формирование «активного» артрита и клинико-медикаментозной ремиссии ЮИА

«Активный артрит» У мальчиков и девочек с различными вариантами ЮИА с целью изучения влияния генотипов Arg72Pro гена Р53 на характер течения заболевания был использован метод построения уравнений одномерной линейной регрессии. Результаты линейного регрессионного анализа представлены в виде значений коэффициента детерминации R2, Т'-критерия и значения р.

Таблица 3

Вероятность формирования «активного» артрита у детей - носителей генотипов, содержащих аллель 72Рго, с различными вариантами ЮИА.

Показатель Группы детей Коэффициент детерминации, R2 Стандартная ошибка Т-критерин Уровень значимости, р

я У Олигоартрит с дебютом в раннем возрасте 0,41667 0,40654 1,0249 Р=0,3524

а* л Полиартрит 0,20000 0,15000 1,3333 Р=0,2011

« ЮА с энтезопатией 0,41538 0,25904 1,604 Р=0,1284

р Олигоартрит с дебютом в раннем возрасте 0,90000 0,09083 9,9087 Р<0,0001

¡'■> т 4J Полиартрит 0,53333 0,13818 3,860 Р=0,0006

ЮА с энтезопатией -0,25000 0,38188 -0,655 Р=0,5370

У девочек — носителей генотипов, содержащих аллель 72Рго гена Р53 с олигоартритом с дебютом в раннем возрасте и полиартритом, выявлена ассоциация с формированием «активного» артрита (R2=0,9, Т=9,9, р<0,0001; R2=0,533, Т=3,8, р=0,0006, соответственно). У девочек с ЮА с энтезопатией не выявлено никаких достоверных ассоциации между генотипами аллеля 72Рго в гомозиготном и гетерозиготном состоянии гена Р53 и формированием «активного» артрита. У мальчиков — носителей генотипов, содержащих аллель 72Рго гена Р53 достоверных ассоциаций с риском формирования «активного» артрита выявлено не было.

У мальчиков и девочек с ЮИА с целью оценки комплексного вклада молекулярно-генетических и клинико-лабораторных факторов на характер течения заболевания, а также определения прогностической значимости данных факторов были построены модели с использованием методов логистической, множественной линейной регрессии с построением кривой ROC-анализа. Модель «активного артрита» включала анализ результатов клинико-инструментального обследования (раннее начало заболевания до 3-х лет, поздняя БПВП-терапия, наличие эрозий суставов и артроза), лабораторных факторов (уровень СОЭ мм/ч и СРБ мг/л) и результатов молекулярно-генетического тестирования полиморфизмов Arg72Pro гена Р53. Результаты логистической регрессии представлены в виде значений коэффициента отношения шансов OR с 95% доверительным интервалом и уровнем значимости р. У девочек с ЮИА была получена высокая информативность прогнозирования «активного» артрита в отношении такого инструментального признака, как эрозии в суставах (R2=0,279, Т=2,68, OR=4,99, 95%ДИ 1,2-20,3, р=0,009) и такого молекулярно-генетического маркера, как носительство генотипов, содержащих аллель 72Pro (R2=0,45, Т=4,837, OR=19,88, 95%ДИ 3,0-83,6, р=0,0002). Применение ROC- анализа в отношении «активного» артрита с построением характеристической кривой показало хорошую прогностическую способность модели «носительство генотипов содержащих аллель 72Рго + эрозии суставов», которая имела высокие показатели специфичности и чувствительности с площадью под кривой (AUC) 0,849 (95% доверительный интервал равен 0,745 - 0,923). Для сравнения прогностическая модель «носительство генотипа Arg/Arg + эрозии суставов» имела более низкие показатели чувствительности и специфичности в отношении «активного» артрита, с площадью под кривой (AUC) 0,503 (95% доверительный интервал равен 0,383 - 0,623) (рис.6).

У мальчиков с ЮИА была получена высокая информативность прогнозирования «активного» артрита в отношении 2-х клинико-рентгенологических признаков. Это наличие эрозий суставов (R2=0,413, Т=3,089, OR=12,6, 95%ДИ 1,9-80,9, р=0,0038) и дебют ЮИА в возрасте до 3-х лет (R2=0,442, Т=3,26, OR=16,37, 95%ДИ 1,0-152,6, р=0,0023). Информативность молекулярно-генетического признака носительства генотипов, содержащих аллель 72Pro, у мальчиков по сравнению с девочками в отношении «активного» артрита значительно ниже (R2=0,158, T=l,23, OR=4,01, 95%ДИ 0,57-27,69, р=0,227). Для оценки результатов ROC-

анализа у мальчиков в отношении «активного» артрита была использована модель, учитывающая генотип Arg72Pro гена Р53. Была выявлена хорошая прогностическая способность модели «носительство генотипов содержащих аллель 72Рго + эрозии суставов + раннее начало заболевания до 3-х лет» с высокими показателями чувствительности и специфичности, с площадью под кривой (AUC) 0,884 (95% доверительный интервал равен 0,750 - 0,961). Для сравнения, прогностическая модель «носительство генотипов Arg/Arg + эрозии суставов + раннее начало заболевания до 3-х лет» у мальчиков с ЮИА имеет более низкие показатели чувствительности и специфичности, с площадью под кривой (AUC) 0,682 (95% доверительный интервал равен 0,523 -0,816) (рис.7).

Аллель_Р(о + Эрозии

ICIQ-Specifioty

«носительство генотипов содержащих аллель 72Рго + эрозии суставов» AUC=0,849 (95% ДИ 0,745 - 0,923)

ArgWg ♦ Эрозии

10ü-Specificjty

«носительство генотипа Arg/Arg + эрозии суставов» AUC=0,503 (95% ДИ 0,383 - 0,623)

Рисунок 6. ЯОС-кривая модели результатов прогнозирования _«активного» артрита у девочек с ЮИА_

Агл#ль._Рго + Урозин-» Ран*вв_иачалс_ЮИА

-Li

1 С0-5реС|11С|1у

«носительство генотипов содержащих аллель 72Рго + эрозии суставов + раннее начало заболевания до 3-х лет» АЦС=0,884 (95% ДИ 0,750 - 0,961)

ArgWg + Зрззи* -» Рачне«_начвло„ЮИА

ICO- Specificity

«носительство генотипа Arg/Arg + эрозии суставов + раннее начато

заболевания до 3-х лет» AUC=0,682 (95% ДИ 0,523 - 0,816)

Рисунок 7. ЯОС-кривая модели результатов прогнозирования _«активного» артрита у мальчиков с ЮИА_

Клинико-медикаментозная ремиссия У мальчиков и девочек с ЮИА с целью прогнозирования клинико-медикаментозной ремиссии были построены модели с использованием методов множественной линейной и логистической регрессии. Модель включала анализ результатов клинико-инструментального обследования (отсутствие контрактур, ранняя БПВП-терапия, отсутствие эрозий суставов), лабораторных факторов (уровень СОЭ < ЗОмм/ч, СРБ < 20мг/л в периоде «активного» артрита) и результатов молекулярно-генетического исследования полиморфизма Arg72Pro гена Р53. У мальчиков с ЮИА не было получено информативных признаков для прогнозирования течения артрита, кроме такого инструментального критерия, как отсутствие эрозий суставов. Хотя информативность этого признака не является весомой для прогнозирования клинико-медикаментозной ремиссии, но он может быть рекомендован для прогнозирования ремиссии ЮИА (Я2=0,347, Т=2,194, (Ж=9,56, 95%ДИ 1,09-83,5, р=0,034).

£rg\Arg + Отсутствие_эрозии

О 20 40 60 80 100 '00-Specíficlty

«носительство генотипа Arg/Arg + отсутствие эрозий суставов» AUC=0,799(95% ДИ 0,649-0,905)

АгдЧАгд + рзнмяя_БПВП_терапия

20 1 0 60 80 100 lOO-Spscificity

«носительство генотипа Arg/Arg + ранняя БПВП-терапия» AUC=0,849 (95% ДИ 0,745-0,923)

мальчики

девочки

Рисунок 8. РЮС-кривая модели результатов прогнозирования ремиссии артрита у мальчиков и девочек с ЮИА_

В результате анализа моделей прогнозирования клинико-медикаментозной ремиссии ЮИА у девочек была получена информативность в отношении такого клинического признака, как ранняя БПВП-терапия (R2=0,256, Т=2,36, OR=5,02, 95%ДИ 1,1-22,2, р=0,009) и такого молекулярно-генетического маркера, как носительство генотипа Arg/Arg гена Р53 (R2=0,503, Т=4,95, OR=16,92, 95% ДИ 3,3-83,5, р<0,0001). При сравнении данных ROC-анализа у девочек с ЮИА получена более высокая чувствительность и специфичность модели прогнозирования ремиссии «носительство генотипа Arg/Arg + ранняя БПВП-терапия» по сравнению с показателями информативности модели «носительство генотипа Arg/Arg + отсутствие эрозий суставов»у мальчиков (рис.8).

Таким образом, у детей с ЮИА целесообразно использовать молекулярно-генетический метод анализа аллелей и генотипов

полиморфного локуса Arg72Pro гена Р53, как одного из способов прогнозирования варианта клинического течения заболевания, в сочетании с изучением показателей характера суставного поражения, степени активности артрита, пола и возраста ребенка.

Распределение частот генотипов полиморфных вариантов Arg72Pro 4 exon, ins/del 16bp intron 3 и G13964C intron 6 гена Р53 у детей с ЮИА

Проведен сравнительный анализ распределения частот генотипов полиморфных вариантов Arg72Pro, ins/del 16bp и G13964C гена Р53 у детей с ЮИА в зависимости от пола. Не выявлено достоверных различий распределения частот изученных генотипов гена Р53 у детей с ЮИА и группы сравнения (табл.4).

Таблица 4

Сравнительный анализ распределения частот изученных полиморфных

вариантов гена Р53 у детей с ЮИА и группой сравнения

Показатель Генотип Частота генотипов у девочек Я Частота генотипов у мальчиков Н Уровень значимости, Р

ЮИА (п~ 79) Группа сравнения (п=30) ЮИА (п=47) Группа сравнения (п=30)

del/del-Arg/Arg-GG 0,519 0,567 0,362 0,467 р>0,05

ins/del-Arg/Arg-GG 0,025 0 0,021 0 р>0,05

del/del-Arg/Arg-GC 0 0 0,021 0 р>0,05

del/del-Arg/Pro-GG 0,192 0,2 0,191 0,267 р>0,05

ins/del-Arg/Pro-GG 0,061 0 0,149 0,067 р>0,05

del/del-Arg/Pro-GC 0,051 0 0,043 0 р>0,05

ins/del-Arg/Pro-GC 0,076 0,067 0,17 0,167 р>0,05

ins/del-Pro/Pro-GC 0,061 0,133 0.021 0,033 р>0,05

ins/ins-Pro/Pro-GC 0 0 0,021 0 р>0,05

ins/ins-Pro/Pro-CC 0,013 0,033 0 0 р>0,05

Все дети с ювенильным идиопатическим артритом были разделены на три условные подгруппы по характеру распределения в них трех полиморфных локусов Arg72Pro, ins/del I6bp и GI3964C гена Р53. В первую подгруппу были включены дети, не имеющие ни одного из минорных полиморфных вариантов 72Pro, insl6bp, 13964С гена Р53. Во вторую подгруппу вошли дети, имеющие в генотипе один из указанных выше полиморфных вариантов гена Р53. Третью подгруппу составили дети — носители двух минорных полиморфных вариантов 72Pro, ins!6bp, 13964С гена Р53 в любых комбинациях. В четвертую подгруппу вошли дети, содержащие все три указанные минорные полиморфные варианты гена Р53.

Проведен анализ характера распределения генотипов гена Р53 у детей с «активным» артритом и клинико-медикаментозной ремиссией ЮИА в зависимости от пола методом построения уравнения линейной и логистической регрессии (табл.5 и 6).

Таблица 5

Распределение генотипов гена Р53 у девочек с «активным» ЮИА, оцененное методом построения уравнения линейной и логистической регрессии.

Показатель Генотип Коэффициент детерминации, Я2 Стандартная ошибка Т- критерий Отношение шансов (Ж 95% доверительный интервал для отношения шансов Уровень значимості .Р

(1еІ/£ІеІ-Лг;»/Лг8-СС І -0,43357 0,10630 -4,0785 0,13 0,046-0,415 Р=0,0004

ііи/<1е1-Агщ/Аі^-СС (ІеІМеї-Лгц/Рго-СО 11 0,10526 0,14455 0,7282 1,5 0,473 -5,157 Р=0,4689

іш/ае1-Аг§/Рго-СС сієі/(1є1-Агй/Рго-СС III 0,34921 0,17322 2,0160 6,8 0,805 - 57,82 Р=0,0476

іпя/іІеІ-Аге/Рго-СС іік/сієі-Рго/Рго-СС іпв/іш-Рго/Рго-СС іш/іпї-Рго/Рго-СС IV 0,47619 0,16884 2,8204 19,5 2,25 - 168.27 Р=0,0062

Таблица 6

Распределение генотипов гена Р53 у мальчиков с «активным» ЮИА, оцененное методом построения уравнения линейной и логистической

регрессии.

Показатель Генотип Коэффициент детерминации, Я2 Стандартная ошибка Т- критерий Отношение шансов Ой 95% доверительный интервал для отношения шансов Уровень значимості ,Р

с!е1Л1е1-А^/Аг«-СС І -0,17824 0,14882 -1,1977 0,45 0,121 -1,668 Р=0,23

іпв/сІеІ-Аг^А^-СС аеі/аеі-Аге/Рго-сс 11 0,13072 0,17873 0,7314 1,9 0,341 -10,68 Р=0,46

іш/аеІ-Аг^Рго-СС (ІеІ/аеІ-Агй/Рго-СС III 0,09286 0,18750 0,4952 1,5 0,273 -8,970 Р=0,62

іпзЛІеІ-А^/Рго-СС іпї/аеІ-Рго/Рго-СС іт/іт-Рго/Рго-СС іпв/іпв-Рго/Рго-СС IV 0,03333 0,17315 0,1925 1,2 0,251 -5,409 Р=0,84

Выявлен высокий риск формирования «активного» артрита у девочек, имеющих генотипы, включающие три полиморфных вариантов 72Рго, \nsl6bp, 13964С гена Р53 в любых сочетаниях (IV подгруппа) ((Ж=19,5, р=0,0062). Информативность показателя отношения шансов формирования «активного» артрита у девочек — носителей двух минорных полиморфных вариантов 72Рго, гт16Ьр, 13964С гена Р53 в любых комбинациях (III подгруппа) не была доказана (ОЯ=6,8, р=0,047). Девочки - носители генотипов, не содержащих ни одного из минорных полиморфных вариантов 72Рго, 1т16Ър, 13964С гена Р53 (I подгруппа), имеют достоверно высокие шансы формирования клинико-медикаментозной ремиссии заболевания на фоне проводимой противоревматической терапии (СЖ=10, р<0,0001).

У мальчиков с ЮИА не выявлено достоверных различий характера распределения генотипов гена Р53 (табл. 6).

Проведен кластерный анализ распределения генотипов гена Р53 с различными вариантами клинического течения ЮИА с построением дендрограммы (рис.9).

КОМИССИЯ ОЛигоаргрИШ о дебютом в старшсм возрасте Д^ВОЧКЦ Ремиссия олигоартрита с дебютом в раннем возрасте девочки \..........? Ремиссия полиартрита девочки 1 \ Ремиссия ЮА с энтезопатией мальчику __ _ ___ «Активный» олигоартрит с дебютом в старшем возрасте девочки________ Ремиссия олигоартрита с дебютом в раннем возрасте мальчики---------------"""" Ремиссия полиартрита мальчики_- «Активный» ЮА с энезопатией девочки.....-•-..... «Активный» олигоартрит с дебютом в раннем возрасте мальчики;« Ремиссия ЮА с энтезопатией девочки^ «Активный» полиартрит девочки- «Активный» полиартрит мальчики- «Активный» олигоартрит с дебютом в раннем возрасте девочки........................................— «Активный» ЮА с энезопатией мальчики ...........................................

Рисунок 9. Дендрограмма кластеризации характера распределения генотипов гена Р53 у детей с различными вариантами клинического течения ЮИА

Девочки с «активным» олигоартритом с дебютом в раннем возрасте и полиартритом, мальчики с «активным» полиартритом и ЮА с энтезопатией содержали два и более минорных полиморфных варианта 72Pro, ins 16bp, 13964С гена Р53 в любых сочетаниях и были объединены в единый (первый) кластер. Девочки с клинико-медикаментозной ремиссией олигоартрита с дебютом в раннем и старшем возрасте, ремиссией полиартрита были носителями одного из полиморфных вариантов 72Рго, ins!6bp, 13964С гена Р53 либо вообще не имели ни одного из указанных вариантов полиморфизмов. Дети с остальными клиническими формами артрита имели генотипы, указанные во всех четырех подгруппах.

Было выявлено, что девочки с генотипами ins/del-Pro/Pro-GC и ins/ins-Pro/Pro-CC гена Р53 имели наиболее тяжелый вариант течения заболевания с выходом во множественный артроз.

Таким образом, генотипы, содержащие как аллели Arg72, так и 72 Pro гена Р53, у девочек с ЮИА вносят вклад в характер течения и исходы ювенильного идиопатического артрита. Аллель 72Рго гена Р53 у девочек с ЮИА ассоциируется с высоким риском персистирования «активного» артрита на фоне лечения. С высокой вероятностью выхода в клинико-медикаментозную ремиссию артрита у девочек с ЮИА ассоциируется генотип, содержащий аллель 72Arg гена Р53.

Для прогнозирования характера течения заболевания и выявления групп риска с наиболее неблагоприятным вариантом ЮИА у детей целесообразно использовать молекулярно-генетическое тестирование гена Р53 в сочетании с изучением клинико-анамнестических, инструментальных и лабораторных данных.

ВЫВОДЫ

1. Выделены следующие группы детей: с «активным» олигоартритом с дебютом в раннем возрасте (13,5%), ремиссией олигоартрита с дебютом в раннем возрасте (9,5%), «активным» олигоартритом с дебютом в старшем возрасте (2,4%), ремиссией олигоартрита с дебютом в раннем возрасте (7,9%), с «активным» полиартритом (29,4%), ремиссией полиартрита (7,9%), с системным артритом (7,9%), с «активным» ЮА с энтезопатией (11,9%), ремиссией ЮА с энтезопатией (9,5%) на основании проведенного клинического, инструментального и лабораторного обследования в соответствии с особенностями течения заболевания. Соотношение девочек и мальчиков составило 2:1.

2. Распределение частот аллелей по изученным полиморфным локусам Arg72Pro, ins/del 16bp, G13964C гена Р53 соответствует равновесию Харди-Вайнберга. Не получено достоверных различий в распределении изученных полиморфных вариантов и генотипов гена Р53 у детей с ювенильным идиопатическим артритом и группы сравнения.

3. Выявлено статистически значимое преобладание генотипов, содержащих аллель 72Рго, у девочек с «активным» олигоартритом с дебютом в раннем возрасте (92,3%) и полиартритом (66,7%) в отличие от девочек с клинико-медикаментозной ремиссией (р<0,001)

4. Не выявлено статистически значимых различий распределения частот изученных аллелей и их генотипов гена Р53 у мальчиков с ювенильным идиопатическим артритом в зависимости от варианта артрита и клинического течения заболевания.

5. Девочки - носительницы генотипов, содержащие аллель 72Pro гена Р53 как в гомозиготном, так и гетерозиготном состоянии, имели более агрессивный характер течения ювенильного идиопатического артрита. Девочки — носители генотипов, имеющих аллель 72Рго в гомозиготном состоянии в сочетании с другими минорными аллелями гена Р53, имеют наиболее неблагоприятный вариант течения заболевания с высоким риском формирования артроза, как исхода ювенильного идиопатического артрита. (OR=25,7, р=0,005).

6. Критериями прогнозирования выхода в клинико-медикаментозную ремиссию у девочек с ювенильным артритом являются клинико-генетические факторы такие, как носительство Arg/Arg (OR=16,9, р<0,0001) и ранняя противоревматическая терапия (OR=5,02, р=0,009).

7. Не выявлено у мальчиков с ЮИА прямой связи и ассоциаций различных генотипов гена Р53 с характером течения заболевания, вариантом суставного поражения и показателями лабораторной активности артрита.

8. Отсутствие рентгенологических признаков эрозий суставов у мальчиков с ЮИА имеет информативное значение в прогнозировании клинико-медикаментозной ремиссии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Прогнозирование риска развития «активного» артрита у девочек с ювенильным идиопатическим артритом должно быть основано на комплексной оценке характера суставного поражения и результатов молекулярно-генетическом тестирования гена Р53 (наличие аллеля 72Рго как в гомозиготном, так и в гетерозиготном состоянии).

2. Оценка вероятности выхода в клинико-медикаментозную ремиссию ЮИА у девочек должна быть основана на анализе сроков начала противоревматической терапии в сочетании с результатами молекулярно-генетического тестирования гена Р53 (выявление генотипа Arg/Arg).

3. Выявление у девочек с ювенильным идиопатическим артритом носительства аллеля 72Рго в гомозиготном состоянии в сочетании с аллелями imlöbp, 13964С как в гомозиготном, так и гетерозиготном состоянии гена Р53 позволяет выделить их в группу риска формирования наиболее неблагоприятного варианта течения заболевания с высокой вероятностью формирования артроза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Современная диагностика ювенильного хронического артрита / Кожевников А.Н., Поздеева H.A., Москаленко A.B., Прокопович E.B. // Тезисы докладов XV Российского национального конгресса «Человек и его лекарство» Санкт-Петербург 2010 — С.82.

2. Случаи туберкулезного поражения суставов у детей в практике врача-ревматолога / Кожевников А.Н., Селизов В.В., Новик Г.А., Дубко М.Ф., Поздеева H.A. // Лечащий врач - 2010 №10 - С.51-53. (из перечня ВАК ведущих рецензируемых научных журналов и изданий)

3. Роль нарушений апоптоза в формировании ювенильного хронического артрита / Кожевников А.Н., Москаленко M.B., Поздеева H.A., Новик Г.А., Ларионова В.И // Материалы III Российской научно-практической конференции «Аллергические и иммунопатологические заболевания — проблема XXI века» Санкт-Петербург 2011 - С.30-32.

4. Роль полиморфизма гена Р53 в генезе ювенильного идиопатического артрита / Кожевников А.Н., Москаленко M.B., Поздеева H.A., Новик Г.А., Ларионова В.И // Материалы V региональной научно-практической конференции «Воронцовские чтения» Санкт-Петербург 2012 - С. 97-98.

5. Роль нарушения апоптоза в формировании ювенильного идиопатического артрита / Кожевников А.Н., Москаленко M.B., Поздеева H.A., Новик Г.А., Ларионова В.И. // Педиатрическая фармакология — 2012 том 9 №3 - С.52-57. (из перечня ВАК ведущих рецензируемых научных журналов и изданий)

6. Кожевников А.Н. Нарушение системы апоптоза у детей с ювенильным идиопатическим артритом // Педиатр — 2012 том 3 №3 — С. 13-20

7. Теория нарушения системы апоптоза у детей в патогенезе ювенильного идиопатического артрита / Кожевников А.Н., Москаленко М.В., Поздеева Н.А., Новик Г.А., Ларионова В.И // Материалы IV Российской научно-практической конференции «Аллергические и иммунопатологические заболевания — проблема XXI века» Санкт-Петербург 2012 — С.44-49.

8. Роль нарушения системы апоптоза у детей с ювенильным идиопатическим артритом / Кожевников А.Н., Никитин М.М., Поздеева Н.А., Новик Г.А., Ларионова В.И // Актуальные вопросы педиатрии. Сборник материалов межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 90-летию ГБУЗ ПК «Детская городская больница №3» Пермь 2013 - С. 107-113.

9. Роль нарушения апоптоза в формировании ювенильного идиопатического артритом / Кожевников А.Н., Никитин М.М., Поздеева Н.А., Новик Г.А., Ларионова В.И., Виссарионов С.В., Сляднев М.Н. // Научно-практическая ревматология. Тезисы. 2013 №51 - С.74-75.

10. Association of the polymorphisms P53 gene with juvenile idiopathic arthritis in children Russian Federation / Alexey N Kozhevnikov, Michael V Moskalenko, Nina A Pozdeeva, Margarita F Dubko, Valentina I Larionova, Gennagy A Novik // Pediatric Rheumatology - 2011, 9 - P. 108.

11. The role of violation of the apoptosis on the formation juvenile idiopathic arthritis / A. Kozhevnikov, M. Moskalenko, G. Novik, V. Larionova, N. Pozdeeva // Ann Rheum Dis - 2012, 71 - P.701

12. Polymorphisms P53 gene in children with juvenile idiopathic arthritis / A. N. Kozhevnikov, M.M. Nikitin, N.A. Pozdeeva, V.I. Larionova, G.A. Novik, S.V. Vissarionov, M.N. Slyadnev // European Journal of Human Genetics — 2013, 12 supl 2 — P.470

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ACR — Ассоциация Коллегии Ревматологов

ACRpedi 30,50,70,90 - критерий эффективности терапии у детей с ЮНА

J ADAS - Критерий активности артрита у детей с ЮНА

ILAR - Международного Конгресса Ассоциации Ревматологов

Arg (А) — аргинин

С — цитозин

G - гуанин

Pro (Р) — пролин

Ехоп - экзон, участок гена содержащий информацию

Intron — интрон, участок гена не содержащий информации

bp (нп) — нуклеотидная пара

del (d) — делеция

ins (i) — инсерция

МТХ - метотрексат

SSA — сульфасалазин

БПВП - базисная противовоспалительная терапия БП - биологические препараты

В\С - внутрисусавное введение лекартственного препарата

ГКС — глюкокортикостероидный препарат

НПВС — нестероидный противовоспалительный препарат

РФ — ревматоидный фактор

ЦС - циклоспорин

ЮИА — Ювенильный идиопатический артрит ЮРА — Ювенильный ревматоидный артрит ЮХА — Ювенильный хронический артрит

Подписано в печать 05.11.2013г. Формат 60x84/16 У.п.л. 1,56 Уч.-изд.л 1,56 . Тир. ЮОэкз. Отпечатано в типографии ООО «Турусел» 197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова д.38. toroussel@mail.ru Зак. № 13499 от 05.11.2013г.