Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Роль подтипов М-холинорецепторов в лечебном эффекте холинолитиков при экспериментальном паркинсонизме (галоперидоловая модель)

на правах рукописи

СЗ Е- ПГ /гъ гз

Дагаев

Сергей Глебович 003058173

Роль подтипов М-холинорецепторов в лечебном эффекте холинолитиков при экспериментальном паркинсонизме (галоперидоловая модель)

14 00 25 — фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2007

003058173

Работа выполнена в Федеральном Государственном Учреждении Науки «Институт Токсикологии» Федерального Медико-биологического Агенства

Научные руководители

Доктор медицинских наук профессор [Космачев Алексей Борисович Доктор медицинских наук Саватеева-Любимова Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты

Доктор медицинских наук профессор Лосев Николай Андреевич Доктор медицинских наук профессор Лапин Изяслав Петрович

Ведущее учреждение Военно-медицинская академия МО РФ

[« \67

Защита диссертации состоится «. мая_ 2007 1

в «_/_[_» часов на заседании Диссертационного совета Д 208 030 01

при Ф1 УН Институт 1 оксикологии ФМБА (192019, Санкт-Петербург,

у л Бехтерева, д 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН Институт Токсикологии ФМБА

ш>.

Автореферат разослан «апреля 2007 г

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор медицинских наук 1 Н Саватеева-Любимова

Введение

Актуальность нсслсдопаппп: нарушение функций холипергическою отдела нервной системы лежит в основе или сопутствует возникновению многих патологических состояний, к которым можно отнести паркинсонизм (Werneck G , 1997, Яхно Н Н , Нодель М Р , 2000), болезнь Альпгеймера (Рамш С М , Петров А Н , 1999, Takada-Takaton Y et al, 2007, Keverne I et al, 2005), некоторые нарушения сердечного ритма (Steve В , Mark Е D , 1999, (hessler С et al, 1999, Xiao-Li Xu et al, 2006), язвенную болезнь (Машковский M Д, 2005), отравления антихолинэстеразными ядами (11розоровский В Ь , Саватеев Н В , 1976, Крылов С С и др , 1999, Куценко С А , 2004) и другие виды патологии (Fukutake Т et al, 1993)

В связи с этим, холинергические лиганды, в частности блокаторы мускарино-вых рецепторов (синонимы М-холинолитики, М-холиноблокаторы), находят широкое применение в качестве лекарственных средств

Среди лекарственных средств, применяемых для коррекции экстрапирамидных расстройств, важное место принадлежит препаратам, обладающим центральной хо-линоблокирующей активностью (McEvoy J Р, 1983) Наибольшее распространение получило применение таких М-холиноблока горов как тригексифенидил (циклодол, паркопан, апо-трайгекс), а также близких по структуре и активности препаратов — трипериден (норакин) и бипериден (акинетон) Реже используются бенактизин (амизил, актозин, и т д), дифенилтропин (тропацин), дексетимид (тремблекс) До 1989 года применялся отечественный препарат амедин

В основе терапевтического действия мускариновых антагонистов так же, как и при возникновении побочных реакций, лежит их взаимодействие со специфическими биологическими мишенями — М-холинорецепторами Кроме того, необходимость длительно1 о применения холиноне1 ативных препаратов также приводит к развитию «нежелательных» эффектов В основном речь идет о проявлениях их периферического антихолинергическот действия В связи с этим, разработка новых лекарственных средств из указанной группы

должна быть, прежде всего, направлена на поиск веществ, обладающих высокой эффективностью, наряду с их безопасностью

В настоящее время взгляды на использование мускариновых антагонистов в терапевтических целях претерпели существенные изменения в связи с развитием представлений о гетерогенности мускариновых рецепторов Согласно этому представлению, мускариновые рецепторы в организме животных и человека образуют гетерогенную популяцию, состоящую из 5 генетически обусловленных подтипов Подтипы мускариновых рецепторов отличаются химическим строением, расположением на различных частях нейрона, особенностями тканевой локализации, системой вторичных посредников и др

Одним из путей повышения эффективности и безопасности М-холинолити-ков явилось создание селективных антагонистов Эта задача достаточно успешно решалась для веществ, обладающих периферичес* им действием Появились высокоэффективные противоязвенное (пирензепин) и бронхолитическое (атро-вент) средства Однако, поиск селективных центральных М-холинолитиков пока серьезных результатов не принес Причиной этого явилась фрагментарность сведений о распространенности подтипов М-холинорецепторов в мозге и их роли в организации его работы

Поэтому, для успешного поиска средств, обладающих необходимым профилем избирательности для лечения заболеваний, связанных с дисфункцией холи-нергической системы, необходимо изучение роли отдельных подтипов мускариновых рецепторов в механизмах развития патологии ЦНС и особенностей влияния на них потенциальных лекарственных препаратов

Цель исследования: поиск антипаркинсонических средств из числа ацетиленовых аминоспиртов на базе изучения профиля и>. избирательности в отношении отдельных подтипов мускариновых рецепторов Задачи исследования:

1 Провести скрининг активности соединений из ряда ацетиленовых аминоспиртов по их способности предупреждать развитие экстрапирамидных нарушений на модели нейролептического паркинсонизма

2 Изучить профиль фармакологической избирательное!и соединений и» ряда ацетиленовых аминоспиртов в сравнении с М-холиноблокаторами из других химических групп в .экспериментах па крысах

3 Разработать способы оценки активности мускариновых антаюнисгов в отношении М4-холинорецепторов w vivo

4 Определить роль блокады М^-холинорецентров в нротивопаркинсони-ческой активности препаратов в опытах на крысах

5 Оценить взаимодействие пентифина, соединения из ряда ацетиленовых аминоспиртов, с дофаминовыми рецепторами т viíio и /и vivo

6 Сопоставить антипаркинсоническую активность М-холиноблокаторов с их влиянием на высвобождение ацетилхолина в стриатуме крыс

Научная новизна работы:

Настоящее исследование продолжает никл работ, направленных на поиск препаратов, предназначенных для лечения паркинсонизма, а также на выяснение механизмов их лечебного действия Новизна определяется тем, что в ней впервые установлена роль блокады М4-холинорецепторов в лечебном действии препаратов при экспериментальном паркинсонизме Впервые обнаружено выраженное избирательное М^-холинолитическое действие у производных ацетиленовых аминоспиртов

Выявлена связь между способностью соединений блокировать М4-холинорецептор и их антипаркинсонической активностью Доказана перспективность поиска новых антипаркинсонических средств среди холинолити-ков, в частности, производных ацетиленовых аминоспиртов

Практическая значимость работы:

В ходе проведения исследования был разработан способ оценки степени блокады холинорецепторов, принадлежащих к подтипу М4 Сочетание указанного способа с ранее разработанными приемами для оценки состояния М,-, М2- и Мз-холинорецепторов дало возможность оценить профили рецепторной избирательности ряда мускариновых антагонистов /и vivo

В ходе этих исследований были выявлены мускариновые антагонисты, проявляющие высокую избирательность в отношении М-холинорецепторов, принадлежащих к М4- и Mi-подтипам На два таких соединения получены соответствующие патенты Кроме того, указанные соединения могут быть использованы в аналитических целях, как избирательные блокаторы М4- и Mr холиноре-цепторов Соединения, проявляющие высокую фармакологическую избирательность по отношению к Мд-подтипу, могут быть рекомендованы для дальнейшего изучения в качестве средств для лечения паркинсонизма

Положения, выносимые на защиту:

1 Соединения из химической группы ацетиленовых аминоспиртов проявляют выраженную антипаркинсоническую активность

2 Ьлокада М-холинорецепторов играет значимую роль в антипаркинсо-нической активности мускариновых антагонистов

3 Соединение пентифин является избирательным блокатором мускариновых рецепторов, принадлежащих к подтипу М4

Апробация работы:

Основные положения работы доложены и обсуждены на XVIII съезде физиологического общества им И П Павлова, 2001, на XII Всероссийской конференции «Нейроиммунология», 2003, на 2-ом съезде токсикологов России, 2003, на конференции «Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты», 2004, на конференции «Нейрохимия Фундаментальные и прикладные аспекты», 2005, на European Neuropsychopharmacology 8th ECNP Regional Meeting, 2005, на конференции «Нейроспецифические метаболиты и энзиматиче-ские основы деятельности центральной нервной системы», 2006, на V Международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовекие чтения», 2006, на Всероссийской конференции с международным участием «Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга», 2006

Публикации: материалы диссертации опубликованы в 19 печатных работах, по материалам диссертации оформлено 2 патента на изобретение

Объем и стрлкчура диссертации- днсюршция иеюжепа на 1 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 игав, заключения и выводов иллюстрирована 5 рисунками и 15 таблицами Указатель литературы содержит 53 отечественных и 166 иностранных источника

Работа выполнена в рамках программы МЗ РФ, шифр 024, «Разработка научных основ медицинского обеспечения химической безопасности населения России», 2001-2005 гг и грантов РФФИ № 00-04-49412, 2000-2002 г г и № 03-0449696, 2002-2004 гг

Содержание работы

Материалы и методы

Эксперименты выполнены на 1800 белых нелинейных крысах-самцах Животных содержали в условиях вивария 11о завершении исследования крыс подвергали эвтаназии (эфирный наркоз) В случае необходимости взятия у животных тканей, операция производилась с применением общей анестезии, для взятия ткани мозга применяли гильотину В работе анализируются материалы, полученные автором в ходе нескольких серий исследований гга эксперимеггтальных животных

Холиноблокирующуго активность препаратов и их избирательность в действии на отдельные подтипы мускариновых рецепторов изучали в тестах предуггреждения ареколиновош и пилокарпинового тремора, пилокарпиновой саливации а также не связанных с поведенческой активностью спонтанных тремольных движений нижней челюсти Исследуемые холиноблокаторы плодили подкожно в 4-5 возрастающих по логарифмической шкале дозах за 30 миггут до введения холиггоггозитивных веществ Дозы ареколина (тремор), пилокарпина (тремор) пилокарпина (саливация) и пилокарпина (тремольпые движения нижней челюсти) составили 17,0 75 0, 35,0 и 4,0 мг/кг в/б, соответственно

В качестве модели экспериментального паркинсонизма использовали реакцию каталепсии, вызванную введением нейролептика галоперидоча, который применяли в широком диапазоне доз от 0,3 до 10,0 мг/кг 11аблтодетше за животными после введения галоперидола осуществляли в интервале 10-60 мин (60-90 мин при примеггеггии ггизких доз препарата) Исследуемые препараты

вводили за 30 минут до инъекции галоперидола Результат учитывали в альтернативной форме (есть каталепсия — нет каталепсии) За наличие каталепсии принимали нахождение животного у бортика в «позе лектора» в течение двух минут Для исключения эффекта обучаемости, каждую крысу тестировали на наличие каталепсии не более трех раз Полученные данные использовали для расчета показателя ЕД5о М-холиноблокатора

Действие пентифина на дофаминовые, адреналовые и М-холинорецепторы исследовали на семявыносящих протоках, изолированных семенных пузырьках и отрезках тонкой кишки животных 1ест-объекты под нагрузкой помещали в термостатируемый аэрируемый раствор 1 ироде Изменение тонуса тест-объекта регистрировали с помощью изометрического датчика на приборе «Hugo Basile», модели 4050, Италия В качестве агонистов использовали дофамин, ацетилхолин и норадреналин Препарат сравнения — SCH-23390, высокоселективный блокатор Д|-рецепторов

В работе был использован классический метод определения ацетилхолина в тканях животных (Crosland L , Slater Р , 1968) Крыс декапитировали, на холоду выделяли стриатум мозга После гомогенизации и обработки реактивами получали супернатант, содержащий «связанный» ацетилхолин, измерение концентрации которого производили биологическим методом на препарате спинной мышцы медицинской пиявки Содержание ацетилхолина в пробах (в г х 10~7) относительно массы мозга (в г) определяли по формуле (С х 10 х v)/p, где С — концентрация ацетилхолина (г х 10"7/л), v — объем супернатанта (л), р — вес мозга (г), 10 — разведение супернатанта

Использовали М-холиноблокаторы атропин, ишиин, амедин, амизил, цикло-дол, норакин, норглипин, пирензепин, метоктрамин, гексагидросиладифенидол, тропацин, призводные ацетиленовых аминоспиртов (шифр — CJI), включая пен-тифин, впервые полученые в лаборатории синтеза лекарственных препаратов Института Токсикологии Кузнецовым С Г и Либманом H M, а также холинопози-тивные вещества ареколин и пилокарпин Для изучения воздействия на дофами-нергическую систему применяли апоморфин, SCH-23390 и галоперидол

11ок£п;иели I Д„, и LDsn рассчтьпмчи мето юм пробш иилчим По пчишме данные обрабсиывали методами оиис.иечмюи сымклики и рсчрессионнот аначи-u Сравнение цхуишч неличин щхтодили с помощью 1-крикрпя С п.юдипа

Результаты исследования и их обсуждение Изучение эффективное!п ряда соединении в iccic Kaiancneiiii н conocí ап-Jiciuie сс с холнноблокирлющеп акпшнос! ыо

Для ряда соединений были установлены средне эффективные до?ы в теые но предупреждению развития экстранирамидныч нармнений (каталепсия), вызы-ваемыч однократным введением галоиеридола н дозе 10,0 mi/кг и/б Релевантность дозы нейролептика обусловлена предвари тельными исследованиями, в которыч была определена среднеэффект нвная каталепто1енная до м талопери-дола (0,3 ± 0,025 mi/кг), срсднесмертельная доза равнялась 44 7 ± 6,1 mi/ki Доза галоиеридола 10,0 мг/ki cocí аил яла приблизительно 14 от I,Dsn и \сгойчиво вызывала токсические эффекты — экстраиирамидные расстройства (каылеп-сию) у экспериментальных животныч

Сравнение среднечффективныч доз, необчодимыч для предо! вращения ра ¡вития специфического действия галоиеридола, позволило сделать вывод чю четыре соединения из исследованных аминосниртов обладают выраженной активностью 1ак, пенгифин в 53 раза активнее атропина CJ1-28 и CJI-22 — в 3 и 6 ра* соответственно CJI-23 rio активности в ном тесте сравним с циклодолом ич эффективность превосчоднт активность атропина примерно в 4 pata (ia6n 1)

Оценку чолиноблокирующей активности и conocíавление ее со способностью предотвращать развитие экстрапирамидыч нармнений изучаемыч соединений производили на основании данныч ареколиновою iecia (табл 2)

Среднсэффсктивные дозы холиноблокатороп по их способности предупреждать развитие каталепсии (галоперидол 10,0 мг/кг в/б)

Название соединения п ЕД50, М|/КГ

или его шифр (кол-во животных) (М±т)

Атропин 132 1,230 ±0,200

Амедин 36 0,147 ±0,020

Пентифин 42 0,023 ± 0,002

Циклодол 36 0,395 ±0,04

I липин 34 0,340 ± 0,040

Норакин 36 0,410 ±0,050

Амизил 32 0,960± 0,12

Тропацин 46 1,130 ±0,060

Норглипин 36 11,200 ±0,130

СЛ-17 24 6,500 ± 1,500

СЛ-18 36 14,100 ±2,400

СЛ-22 18 0,148 ±0,080

СЛ-23 52 0,325 ± 0,070

СЛ-26 36 2,700 ±0,350

СЛ-28 36 0,074 ± 0,002

СЛ-31 36 20,100 ± 10,200

СЛ-32 18 10,300 ±3,400

Таблица 2

Среднеэффективные дозы различных холиноблокаторов по их способности предупреждать развитие тремора (ареколин 17,0 мг/кг в/б)

Название соедине- п ЕДзд, мг/кг

ния или его шифр (кол-во животных) (М±ш)

Атропин 28 1,320 ±0,100

Амедин 06 3,580 ±0,240

Пентифин 34 20,000 ±0,610

Циклодол 18 22,400 ± 0,370

Глипин 36 0,500 ± 0,004

Норакин 24 3,070 ±0,190

Амизил 36 2,670 ±0,350

Тропацин 36 21,400 ±0,200

Норглипин 36 17,900 ± 1,900

СЛ-22 30 18,700 ±2,010

СЛ-23 36 3,500 ±0,040

Прямое сопоставление способности изученных соединений предупреждать развитие экстрапирамидных нарушений с их активностью в тесте ареколиново-10

ю тремора выявило отсутствие тиаимосвянт них 1ффскюв поч\ чсшюе pupec-июпное уравнение имело шпкии уровень доиовертюеш Xapak'icpiiciiiKa MiMirictKoiо cipociniti ащч пкновыч лмппоишркш

По химическом структуре нрснарсны тн 1рмшы апешленопых аминоспир-тов, представляют собой гидрохлориды умещенных ацетиленовых аминоспир-тов бутииолов или цетпиполов общей формулы RiR2C(0H)CIhC = CCII;Am • HCl, где Ri ло C6IU, R2 — циклопешил или циклоюксил ipunia Am может представлять собой пинеридиновыи остаток, либо можс1 бьиь ммещена на морфолиновый, диэтаноламиновый или дшпопропиламиновый ос i а ток /1ля всех соединении ттого ряда является характерным наличие тройной свяш н основной углеродной цепочке, что обеспечивает способность мочекллы к конформациоиным изменениям под влиянием зарядов вводимых в молекулу радикалами Rb R2 и Am

Условием высокой активности соединения является наличие в его ырутпл р-ной формуле, в положении первого атома углерода фенольного кольца (R|), а у концевого — шшеридинового остатка Менее жесткие требования относятся к длине собственно углеродной цепочки (4-5 атомов утлерода) и второму радикалу первого атома углерода (R:) — 011 должен являтся кольцевой структурой произвольной длинны

Изучение фармакологнмсскои шбпратсчьносш иссюдлсммх препаратов к подтипам М-\олинорецсптороп

Основываяст. на данных об участи в орт аптппцпи фемольных движений нижней челюсти холинорецсигора Mi-подтипа чокачтнованнот в обчасш стриатума (Mayoiga А J et al 1999), нами быч рафаботаи способ кочичест-венной оценки фармакологической атсшвпосш соединении обладающих хочтг-ноблокируютцими свойствами в отношении Мд-подшпа рецепторов Суть предлагаемого способа заключалась в регистрации влияния возрастающих доз исследуемого соединения на количество движении нижней челюсти \ крыс (ДНЧ), вызванных введением пилокарпина в тестовой доте (4 0 мт/кт)

Используя разработанный метод определения фармакологической избирательности к М4- подтипу холинорецептора, провели изучение эффективности ряда холиноблокаторов Было показано, что величина ЕД50 угнетающего влияния пентифина на выраженность специфических движений нижней челюсти крыс, индуцированных пилокарпином, составляла 0,14 ±0,02 мг/кг (табл 3) Эффективные дозы изученных холиноблокаторов — глипина, атропина, цикло-дола и других — находились в дипазоне 0,28-8,2 мг/кг

Проведенная экспресс-оценка позволила построить ранжированый ряд активности ацетиленовых аминоспиртов по их способности предупреждать специфическую активность (ДНЧ), вызванную введением пилокарпина ЬД» > 20,0 мг/кг (СЛ-15, 18, 19, 20, 21, 29, 31, 35), 20>ЬД50>Ю,0 мг/кг (СЛ-27, 30, 32, 34, 37), 10,0>ЬД5о> 1,0 мг/кг (СЛ-16, 17, 22, 24, 25, 33, 36), ЕДчо < 1,0 мг/кг (СЛ-23, пентифин) Для трех наиболее активных соединений этого ряда была определена среднеэффективная доза, предотвращающая миметический эффект пилокарпина, использованного в дозе 4,0 мг/кг (табл 3)

Таблица 3

Холиноблокирующая активность мускариновых антагонистов в отношении холинорецепторов М4-подтипа в тесте подсчета ДНЧ

Препарат ЕД50, мг/кг (М ± м)

Атропин 1,40± 1,12

Глипин 0,28 ± 0,03

Амизил 2,20 ± 0,54

Норглипин 8,20 ± 0,37

• Норакин 2,40 ±0,08

Амедин 0,56 ±0,06

Циклодол 2,10 ± 0,19

Тропацин 5,60 ±0,15

Пентифин 0,14 ±0,02

СЛ-22 3,55 ±0,17

СЛ-23 0,26 ±0,09

Способность холинолитиков «нормализовать» количество ДНЧ в условиях действия пилокарпина изменяется следующим образом пентифин > СЛ-23 >

глипин > амедин > атропин Остальные соединения проявтякп акпштх ib r дозах более высоких, чем агропин, их акшвноегь снижается в ряду циклодол > амизил > норакин Наименьшая фармакологическая активность в от ношении М4-холинорецепторов, но данному тесту, отмечена для трех препаратов — СЛ-22, тропацин и норглипин

Оценка избирательности мускариновмх антагонистов, принадлежащих к различным группам химических пещеегп, в отношении М4- холинорспеп-торов в условиях in vivo

Схема изучения фармакологической активности препаратов по ич способности связываться с М- холинорецепторами определенных подтипов (М,-М3) и препятствовать развитию определенною паттерна поведенческой активности, при их преимущественной блокаде, была ранее предложена А Ь Космачевым на основании ряда исследований с использованием тканей, с преимущественным содержанием рецепторов одного подтипа, гидробионтах и млекопитающих При разработке набора тестов были решены задачи подбора дозы мимети-ка, проведено доказательство связи наблюдаемой реакции с возбуждением определенного подтипа центрального М-холинорецептора

В таблице 4 приведены среднеэффективные дозы мускариновых антагонистов в фармакологических тестах по предупреждению пилокарпиновог о тремора, ареколинового тремора, пилокарпиновой саливации и ДНЧ, а также показатели М1/М4, М2/М4 и М3/М4, характеризующие их избирательность в отношении М4- холинорецепторов

Холиноблокнрующая активность (ЕДз0) и избирательность мускариновых антагонистов

к М4-холниорецепторам т vivo

ЕД,», мг/кг (М±т) Избирательность по отношению к М.-ХР

Пилокаршшовый тремор Ареколиновый тремор Пилкарпиновая саливация днч м,/м4 Мг/М4 М3/М4

Препарат Mi Мз Мз М4

Атропин 1,240±0,130 1,320±0,100 1,300±0,160 1,400±1,120 0,9 0,9 0,9

Глипин 0,230±0,080 0,500 ±0,004 0,26(^0,040 0,280±0,030 0,8 1,8 0,9

Амизил 2,250±0,360 2,670±0,350 2,240±0,300 2,200±0,540 1,0 1Л 1,0

Норглипин 8,340±0,250 17,900±1,900 2,720±0,410 8Д0О±О,37О 1,0 2Д 0,3

Норакин 3,320±0,150 3,070±0,190 8,000±0,680 2,400±0,080 1,4 1,3 3,3

Амедин 1,380±0,180 3,580±0Д40 2,300±0,240 0,560±0,060 2,5 6,4 4,1

Циклодол 5,400+0,380 22,400±0,370 4,100±0,400 2,100±0,190 2,6 10,7 2,0

Тропацин 13,300±1,590 21,400±0,200 22,600±3,240 5,600±0,150 2,4 3,8 4,0

Пентифин 9Д)0±0,910 20,000±0,610 5,600±0,430 0,140±0,020 65,7 142,9 40,0

СЛ-22 0,920±0,072 18,700±2,010 1,360±0,070 3,550±0,170 0,3 5,3 0,4

CJI-23 0,069±0,009 3,500±0,040 0,250±0,001 0,255±0,090 0,3 13,7 1,0

Анализ данных, представленных в таблице 4 поюпмваег, чго а||юшш пи-пин, амизил и норглипин не проявляют тропность но отношению к Мнгодпшу холинорецепторов Амедин, циклодол, тропацин, иенгифин, СЛ-22, СЛ-23 проявляют более выраженную избирательность к М4-рецепторам, чем к Мг-подтипу Кроме того, следует отметить, что амедин и тропацин характеризуются более выраженной избирательностью к М4-холинорецепторам нежели к рецепторам М3-подтипа В ряду изученных холиноблокаторов привлекает особое внимание пентифин, фармакологическая избирательность которого к рецепторам М4-подтипа существенно превосходит таковую к рецепторам других подтипов Показатели его фармакологической избирательности, выраженные отношениями М1/М4, М2/М4 и М3/М4, составили 65,7, 142,9, 40,0 Анализ фармакологического профиля ацетиленовых аминоспиртов позволил выявить высокоизбирательный, по отношению к М1-подтипу холинорецептора, препарат СЛ-23, который характеризуется соотношением вычисленных средне эффективных доз 1 50 3,6 3,7 (Мг М2- М3- М4-), соответственно

Представляется крайне важным тот факт, что из ряда исследованных соединений наибольшей способностью блокировать М4-подтип холинорецепторов обладают именно те препараты, которые в практической медицине используются как антипаркинсонические средства (циклодол, амедин, тропацин), что, в свою очередь, тоже свидетельствовует об определенной роли М4-холинорецептора в патогенезе паркинсоноподобных состояний Построение математической модели, отражающей зависимость прошвога-лоперидоловой активности препаратов от их избирательности к различным подтипа»! М-холинорсцептороп

11араметры модели рассчитывали на основе показателя, обратного величине ЬД50 (1/ЬД50), для каждого теста, который был обозначен как «эффективность холиноблокатора» (таб 5)

Уровень эффективности холиноблокаторов (1/ЕД50), приведенный к дозе, _ эквиэффективной 1 мг/кг атропина _

Препарат М, м2 М3 м< Галоперидол

Атропин 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00

Амедин 0,90 0,37 0,57 2,50 8,36

Пентифин 0,13 0,07 0,23 10,00 53,49

Циклодол 0,23 0,06 0,32 0,67 2,73

Глипин 5,39 2,64 5,00 5,00 3,62

Норакин 0,37 0,43 0,16 0,58 3,00

Амизил 0,55 0,49 0,58 0,64 1,28

Тропацин 0,09 0,06 0,06 0,25 1,09

Норглипин 0,15 0,07 0,48 0,17 0,11

СЛ 22 1,35 0,07 0,96 0,39 8,31

СЛ 23 17,97 0,38 5,20 5,49 3,78

При проведении линейного регрессионного анализа было показано, что практически все модели, предполагающие связь между функциональной активностью отдельно взятого подтипа М-холинорецепторов и способностью лиганда оказывать антигалоперидоловое действие, не имели прогностического значения Для проверки гипотезы о совместном влиянии блокады различных подтипов холинорецепторов на способность предупреждать развитие двигательных расстройств, модель строилась на основании всего ряда холиноблокаторов с учетом уровня блокады каждого из подтипов (М1-М4) холинорецепторов Получена линейная модель вида

У=Ь+а, х ((Х3)3/Х,) + а2 х ((Х,)2/Х2) с высоким уровнем значимости по критерию Фишера (Р<0,001), где за У принималась активность холиноблокатора по способности предупреждать развитие каталепсии, вызванной введением галоперидола При этом свободный член уравнения был равен 2,99 (Р<0,05), а коэффициенты а1=0,16 и а2 = 0,03 (Р<0,01 и Р<0,001, соответственно), что предполагает включение рецепторов М4- и М2-подтипов в систему с антагонистическими свойствами Блокада

М|-\олинорецепгороп прогиподсйств\ а развитию кшаюничсокою синдрома а блокада М2-нодтипа не оказывает корригирующею дсиивия, и, тнможно потенцирует развитие каталепсии

Наибольшая эффективность пентифина в коррекции экстрапирамидных нарушений, обусловленных действием Д2-блокатора галоперидола, по сравнению с другими исследованными соединениями, определила необходимость из\чения его возможного непосредственного влияния на дофаминершческую систему

Таблица 6

Блокирующее действие иеитифина и 8СН-23390

на некоторые рецепторы изолированных органов крыс

Вещества ЕСад, М

Д-Р Л-Р М,-ХР

SCH-23390 3 X 10"12 > 5 х К) s > 5 х Ю"'

Пентифин 7 х Ю"5 8 х 10 й 2 х Ш~7

где Д-Р - дофаминовый рецептор Л-Р - адреналовый рецептор Mi-XP - М|-холинорецеитор

Способность пентифина связываться с рецепторами различных медиатор-ных систем в экспериментах т vitio возрастает в ряду репепторы дофаминовой < адреналовой < мускариновой систем

Для проверки негативной роли блокады М2-подтипа, введение галоперидола осуществляли на фоне одновременного введения двух чолинолитиков — пентифина и метоктрамина 0,066 мг/кг в/б (или пентифина и CJI-2 0,086 мг/кг в/б) (табл 7)

Таблица"/

ЕД50 холнноблокаторов в тесте предупреждения ЭПН (каталепсия) у крыс, вызванных введением галоперидола (10,0 мг/кг в/б) (М ± ш)

Препарат Условия определения ЕД50 Пентифин Циклодол Амелии

1алоперидол 0,023 ± 0,003 0,340 ± 0,020 0,148 ± 0,018

Галоперидол + метоктрамин 0,094 ±0,001* 1,410 ±0,020* 0,470 ± 0 08*

Галоперидол + CJI-2 0,141 ±0,015* 1,120 ±0,060* 0,680 ± 0 05*

*— достоверное отличие от контроля (галоперидол) (IM),01)

При введении метоктрамина увеличение ЕДю пентифина по предупреждению каталепсии было 5-кратным, а при введении СЛ-2 — 7-кратным Слсдова-гельно, одновременное с пентифином (н/к) введение М2-избирателыю10 аша-гониста (в/б) приводило к значительному снижению «антигалоперидоловой» эффективности, т е увеличению дозы пентифина, купирующей экстрапирамидные нарушения Таким образом, основным критерием при направленном отборе препаратов, обладающих холиноблокирующей активностью, с целью получения максимального эффекта по предупреждению экстрапирамидных нарушений, представляется наличие у лиганда высокой фармакологической избирательности к М.<-подтипу и, низкой — к М2-подтипу холинорецептора

Влияние пентифина на уровень ацетилхолина в условиях блокады Д2-рецепторов

Содержание связанного ацетилхолина является величиной обратно пропорциональной выбросу медиатора в синаптическую щель Таким образом, по этому показателю, можно косвенно судить о возбуждении холинореактивньгх структур изучаемой области мозга В таблице 8 представлены результаты оценки уровня связанного ацетилхолина в области стриатума при введении различных лигандов

Таблица 8

Уровень связанного АХ (г х 10"7/г ткани) в стриатуме крыс при парентеральном введении различных препаратов (М ± ш)

Контрочь (ф/р-р) 11=12 Галоперидол п=6 Атропин п=8 Пентнфин п=10

21,2 ±2,0 9,2 ± 1,8 6,8 ± 1,7 20,5 ± 3,3

Как следует из анализа данных таблицы 8, введение галоперидола вызывает статистически значимое понижение связанного ацетилхолина на 56 % от исходного уровня Этот показатель при введении ЬД50 атропина (1,23 м1/кг) снижался на 67 % от исходного уровня (Р<0,001), а при введении ЬД50 пентифина (0,023 мг/кг) — значимо не изменялся (табл 8) При оценке влияния этих холи-нолитиков на уровень связанного ацетилхолина в стриатуме в условиях моде-

лирования нейролептического паркинсонизма было пока юно чю атропин не изменял сниженный уровень связанною ацстлхолина (табл 9), а пснгифин — способствовал «нормализации» уровня ацетилхолина ло значений конIроля

Таблица 9

Уровень связанного ацегилхолина (г х 10 7/г гкани) п стрнатумс крыс при парентеральном введении галоперидола и холипоблокатора в дозе, предупреждающей развитие каталепсии (М ± т)

Контроль (ф/р-р) п=12 Атропнн+Галоперидол п=6 Пентифнн+Галоперидол п=10

21,2 ±2,0 6,1 ±3,1 14,9 ±54

Исходя из предположения о регулирующей роли анетилхолина в поддержании уровня дофамина, можно было ожидать, что однонаправленные фармакологические эффекты, т е предупреждение экстрапирамидных нарушений, должны обеспечиваться одинаковым уровнем ацетилхолина Учитывая, что снижение внутриклеточного ацетилхолина является следствием его увеличенного выброса в синаптическую щель, можно предположить, что гиперхоли-нергия не оказывала в этом случае влияния на функциональное состояние до-фаминергическои системы Наличие защитного эффекта холиноблокаторов, вероятно, объясняется их влиянием нз постсинаптические М-холинорецепторы стриатума

Заключение

На базе Института Токсикологии д х н профессором С I Кузнецовым и д х н Н М Либманом был синтезирован ряд химических соединений из группы ацетиленовых аминоспиртов и, к началу настоящего исследования, было известно, что некоторые из них обладают холиноблокиругощей активностью Из 21 изученных соединений, в тесте фармакологической избирательности к М^-подтипу холинорецептора, было отобрано 9 наиболее активных (СЛ-17, СЛ-18, СЛ-22, СЛ-23, СЛ-26, СЛ-28, СЛ-31, СЛ-32, пентифин) Анализ их эффективности в сравнении с холиноблокаторами из других химических групп проводили на общепринятой модели нейролептического паркинсонизма (гало-

19

цсридоловая каталепсия) Среди них высокая активность по предупреждению каталепсии сравнимая с применяющимся корректором экстрапирамидных на-рмнений циклодолом, отмечена у 4 соединений (СЛ-22, СЛ-23, СЛ-28, пеши-фин) При этом активность соединений СЛ-17, СЛ-18, СЛ-26, СЛ-31, СЛ-32 в тесте каталепсии была значительно ниже активности неселективного холиноб-локатора атропина Отсутствие в исследованной группе соединений с промежуточными значениями фармакологической активности делит их на группы высоко* и низкоактивных веществ .

Анализ химического строения высокоактивных соединений выявил и\ особенности, которые заключаются в наличии определенных концевых радикалов и основной углеродной цепи Обязательным является наличие феноль-ного кольца в положении первого атома углерода, а у концевого — пипериди-нового остатка Менее жесткие требования относятся к длине собственно углеродной цепочки (4-5 атомов углерода) и второму радикалу первого атома у1ле-рода — он должен являтся кольцевой структурой произвольной длинны Соблюдение вышеперечисленных условий, очевидно, обеспечивает строго определенную конформацию молекулы, коррелирующую с ее высокой биолошчс-ской активностью Это положение хорошо иллюстрируется при сравнении структуры соединения СЛ-17 иСЛ-23 (введение в радикал циклопенгил ме-тильной группы увеличивает активность почти в 20 раз)

Для выявления М4-избирательных свойств была разработана методика оценки фармакологической избирательности холиноблокатора к М4-подтипу рецептора Показано, что способность холинолитиков нормализовать количество ДНЧ в условиях действия пилокарпина изменяется следующим образом пентифин > СЛ23 > I линии > амедин > атропин

На основе анализа эффективности ряда лигандов, обладающих холинобло-кирующей активностью, было высказано предположение о профиле фармакологической селективности, которым должен обладать холиноблокатор максимально эффективный в предупреждении развития эксграпирамидных нарушений вызванных нейролептиком Для проверки гипотезы о значении одновре-

меннои блокады р.иличных подпиши холинорсцсшоров на способной ь ряда холиноблоепторов предупреждать развитие двигательных расстройств с учетом уровня блокады каждого из подтипов (М1-М4) холинорецепторов, была построена регрессионная модель с высоким уровнем значимости по критерию Фишера (Р<0,001) Модель предполагает включение рецепторов М4- и М2-подтипов в систему с антагонистическими свойствами Ьлокада М4-холинорецепторов противодействует развитию кататонического синдрома, а блокада М2- холинорецепторов не оказывает коррширующею действия, и, возможно, потенцирует развитие каталепсии

Применение математического анализа позволило построить модель, описывающую связь фармакологических свойств антагонистов М-холинорецеп-тора с эффективностью коррекции двигательных нарушений, вызванных блокадой Д2-рецепторов Из анализа модели следовало, что определяющим фактором является способность препарата максимально блокировать М4-холинорецептор. при минимальном влиянии на М2-подтип рецептора Оказалось, что в ряду обследованных холиноблокаторов, именно у пеггтифина наиболее высока избирательность по отношению к М4-холинорецептору К этом ряду следующими стоят официнальныс препараты — циклодол и амедин

•

Выводы

1 Соединения пентифин, СЛ-22, СЛ-21, СЛ-28, из химической группы ацетиленовых аминоспиртов, проявляют выраженную антипаркинсониче-скую активность, сопоставимую и, в отдельных случаях, превосходящую активность официального препарата циклодол

2 На модели нейролептического паркинсонизма показано, что в организации нарушения деятельности экстрапирамидной системы ведущим фактором является возбуждение М4-подтипа холинорецептора Эффективность блокады М4-холинорецептора определяет способность лиганда оказывать защитное действие

3 Эффективность М-холиноблокаторов в отношении экстрапирамидных нарушений в условиях нейролептического паркинсонизма обусловлена как их высокой фармакологической избирательностью к М4-холиноре-цептору, так и низкой избирательностью к М2-холинорецептору

4 Пентифин предотвращает увеличение выброса ацетилхолина в области стриатума, вызванное введением галоперидола, что не наблюдается в случае коррекции экстрапирамидных нарушений неселективными холи-ноблокаторами

5 Способность пентифина связываться с рецепторами различных медиа-торных систем в экспериментах in vitro снижается в ряду рецепторы мускариновой > адреналовой > дофаминовой систем В экспериментах т vivo, с применением метода «открытого поля» и изучением параметров ориентировочного рефлекса, было выявлено отсутствие непосредственного влияния пентифина на дофаминергическую систему

6 На основании проведенных фармакологических тестов показано, что пентифин является избирательным блокатором мускариновых рецепторов, принадлежащих к подтипу М4

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1 Роль отдельных подтипов М-холинорецепторов ЦНС (системный подход) // Тез докл «XVIII съезд физиологического общества им И П Павлова» — Казань, М,ГЭОТАР-МЕД,2001 —С 75(Соавт КосмачевА Б, Долго-Сабуров В Б, Муковский JI А, Саватеева Т Н, Филько О А, Хоботова 3 И)

2 1 еоретическое обоснование оптимизации профиля рецепторной селективности мускариновых антагонистов для лечения нейролептического паркинсонизма // Психофармакол и биол наркология. 2002 № 3-4 с 389 (Соавт С 1 , Косма-чев А Ь, Филько О А, Соловьева Н Ь, Беляев В А, Долго-Сабуров В Ь)

3 Новые подходы к оценке типовой принадлежности мускариновых рецепторов различных отделов головного мозга // Психофармакол и биол наркология

2002 №3-4 с 453 (Coam Соловьева 11 I., Космачев Л Ь I 1одосиновикова Н П, Филько О Л , Дол го-Сабуров В Ь)

4 Математический анализ типовой принадлежноет и мускариновых репей горов модулирующих сердечный и дыхательный ритм у крыс // Бюлл эксперим биол 2002,1 133, №4, С 595-597 (Соавт Лычаков Л В, Беляев В А, Косма-чев А Б, Глухова Р И, Долго-Сабуров В Б)

5 Изучение действия пентифина на некоторые нейромедиаторные системы орг анизма in vi tro II Бюлл эксперим биол 2003, Т 136, №8, С 200-201 (Соавт

Ь Н Горбатова, В Б Долго-Сабуров, Ф С Духович)

6 Способ количественной оценки избирательной блокады мускариновых холи-норецепторов М4-подтипа в условиях целостного организма // Ьюлл эксперим биол и мед 2003 - 1 135, №5 - С 524-526 (Соавт КосмачевЛ Б Либ-ман Н М, Кубарская Л Г, Храброва А В , Саноцкий В И , Филько О А Долго-Сабуров В Б)

7 Антикаталептогенная эффективность совместного применения центральных холиноблокаторов на модели экспериментальной) паркинсонизма // Нейроим-мунология (Мат XII Всеросс конф "Нейроиммупологая") 2003 Т 1 , № 2,

С 43-44 (Соавт Филько О А , Кубарская Л Г, Храброва А В , Долго-Сабуров В Б)

8 Межмедиаторные взаимодействия в патогенезе интоксикации нейролептиками 2-й съезд токсикологов России, 10-13 ноября 2003г М , 2003 с 334 (Соавт Филько О А Кубарская Л Г, Храброва А В, Долго-Сабуров В Б)

9 Экспериментальное моделирование токсического паркинсонизма // 2-й съезд токсикологов России, 10-13 ноября 2003i М,2003 с 339 (Соавт А Н Петров, М К Шевчук, А В Лычаков, Ь Н Кучер)

10 Влияние блокады М4-холинорецепторов на кататонический синдром у крыс, вызванный введением галоперидола//Ьюлл эксперим биол и мед 2004

Т 137 №2 С 174-177 (Соавт А Б Космачев, О А Филько, Л Г Кубарская, А В Храброва, В А Беляев, Н II 11одосиновикова, Н М Либман, В И Саноцкий, В Б Долго-Сабуров)

11 Влияние холиноблокаторов на содержание ацетилхолина в стриатуме крыс при нейролептическом паркинсонизме // Бюлл эксперим биол и мед 2004

Т 137 №2 С 187-189(Соавт КосмачевА Б,СоловьеваН Е,ФилькоО А, СаноцкийВ И,Долго-СабуровВ Б)

12 Влияние блокады М2-холинорецепторов на кататонический синдром у крыс, вызванный введением галопервдола//Бкшл эксперим биол мед 2004 Т 137, № 5, С 535-537 (Соавт О А Филько, JI Г Кубарская, А В Храброва, JI А Муковский,Р И Глухова,В И Саноцкий,В Б Долго-Сабуров)

13 Снижение эффективности защитного действия при применении двух холиноблокаторов в условиях интоксикации нейролептиком // С б науч конфер "Медико-биологической проблемы противолучевой и противохимической защиты" СПб ООО "Издательство Фолиант", 2004 С 338 (Соавт О А Филько,

JI Г Кубарская, А В Храброва, Н Е Соловьева, Н М Либман, А Я Беспалов, В Б Долго-Сабуров)

14 The role of М- and GABA-ergic system in the development of the neuroleptic-mduced extrapyramidal disturbances // «European Neuropsychophaimacology» 8th ECNP Regional Meeting, Moscow, Russia, Apnl 14-16 2005 V 15 Suppl 2 S 210 (Соавт Philko O A, Solovieva N E, Kubarskaya L G, Khrabrova A V, Dolgo-Saburov V В)

15 Межмедиаторные взаимодействия в условиях различной степени Д2 блокады у крыс Тез док и стендовых сообщений "Нейрохимия Фундаментальные и прикладные аспекты", 2005, М, с 92 (Соавт О А Филько, Л Г Кубарская,

А В Храброва, Н Е Соловьева, Л Я Либин, В Б Долго-Сабуров)

16 Влияние блокады дофаминергической и глутаматной систем на перекисное окисление липидов в стриатуме и гиппокампе крыс в условиях экспериментального паркинсонизма // Мат Всеросс конф с междунар участием «Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга», 2006, М «Информкнига», - с 395 (Соавт Либин Л Я, Кубарская Л Г, Филько О А, Храброва А В , Соловьёва Н Е, Долго-Сабуров Б В,ЕщенкоН Д)

17 Влияние дофаминсргической и глугамапюи систем на выброс ацсшлхо'шна и активность ацегилхолинэстеразы п ириагуме и Iшшокампс крыс в \словиях экспериментального паркинсонизма // Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга 2(Х)6 — M — С 110-113 (Соапт Соловьева H Е , Ку барская Л Г, Филько О А , Храбро-ва А В, Саноцкий В И , Либин Л Я )

18 Роль ацетилхолинестеразы в стриатуме и гиппокампе крыс //Мат конф «Ней-роспецифические метаболиты и этимологические основы деятельности Г (НС» 2006 — 11енза, С 97-98 (Соавт КубарскаяЛ 1 , Филько О А,ХраброваА В, Соловьева H Ь, Либин ЛЯ, Ьгценко 11 Д, Долго-Сабуров В Ь )

19 Изменение показателей перекисного окисления липидов в некоторых отделах головного мозга крыс в условиях центральной блокады D2- и NMDA-рецепторов // Морфология -2006 - Т 129-№ 2 с 54 (Соавт Либин Л Я , Ещенко H Д, Филько О А, Ку барская Л Г, Храброва А В , Соловьева 11 Е )

Патенты

1 Гидрохлорид 1 -фенил-1 -циклопентил-4-тпшерггдино-2-бутин-1 -ола (пенти-фин), обладающий М4 холиноблокирующей активностью Патеггг на изобретение № 2224516 приоритет 17 октября 2002 Зарегистрировано в Г осу дарственном реестре изобретений РФ 27 февраля 2002 (Соавт Космачев А Ь , Либман H M, Филько О А , Храброва А В , Ку барская Л Г, Соловьева H Е , Долго-Сабуров В Б )

2 1 идрохлорид 1-4>енил-1-(Г-метилциклоггентил)-4-ш!перидино-2-бутин-1-ола (СЛ 23), обладающий M1 холиноблокирующей активностью 11а г ен г на изобретение № 2273478 приоритет 13 мая 2004 Зарегистрировано в 1 осу дарственном реестре изобретений РФ 10 апреля 2006 (Соавт Космачев А Ь Филько О А, Либмагг H M, Кубарская Л Г Храброва А В, Соловьева H Е , Подосиновикова H П, Беляев В А , Долго-Сабуров В Б )

Актуальность проблемы

Нарушение функций холинергического отдела нервной системы лежит в основе или сопутствует возникновению многих патологических состояний, к которым можно отнести паркинсонизм (Werneck G., 1997; Яхно Н. Н., Нодель М. Р., 2000), болезнь Альцгеймера (Рамш С. М., Петров А. Н., 1999; Takada-Takatori Y. et al., 2007; McQuail J. A. et al., 2006; Keverne J. et al., 2005), некоторые нарушения сердечного ритма (Steve В., Mark Е. D., 1999; Giessler С. et al, 1999; Xiao-Li Xu et al., 2006), язвенную болезнь (Машковский M. Д., 2005), отравления антихолинэстеразными ядами (Прозоровский В. Б., Саватеев Н. В., 1976; Крылов С. С. и др., 1999; Куценко С. А., 2004) и другие виды патологии (Fukutake Т. et al., 1993).

В связи с этим, холинергические лиганды, в частности блокаторы мускариновых рецепторов (синонимы: М-холинолитики, М-холино-блокаторы), находят широкое применение в качестве лекарственных средств.

Среди лекарственных средств, применяемых для профилактики и коррекции экстрапирамидных расстройств, важное место принадлежит препаратам, обладающим центральной холиноблокирующей активностью (McEvoy J. P., 1983). Наибольшее распространение, в настоящее время, получило применение таких М-холиноблокаторов как тригексифенидил (циклодол, паркопан, артан, апо-трайгекс, трифен), а также очень близких по структуре и активности препаратов — трипериден (норакин) и бипериден (акинетон). Реже используются бенактизин (центральный холинолитик, обладающий наряду с транквилизирующим, спазмолитическим действием, имеющий синонимы — амизил, актозин, парасан и т. д.), дифенилтропин (тропацин), дексетимид (тремблекс). До 1989 года применялся также отечественный препарат амедин. До появления синтетических холинолитиков в клинике паркинсонизма использовали атропин и препараты красавки.

В основе терапевтического действия мускариновых антагонистов так же, как и при возникновении побочных реакций, лежит их взаимодействие со специфическими биологическими мишенями — М-холинорецепторами. Кроме того, необходимость длительного применения холинонегативных препаратов также приводит к развитию «нежелательных» эффектов; в основном, речь идет о проявлениях их периферического антихолинергического действия. Таким образом, разработка новых лекарственных средств из указанной группы должна быть, прежде всего, направлена на поиск веществ, обладающих высокой эффективностью, наряду с их безопасностью.

В связи с этим, на определенном этапе развития лекарственной токсикологии противоречие, возникающее между высокой терапевтической активностью и переносимостью препаратов, считалось принципиально непреодолимым. В настоящее время взгляды на использование мускариновых антагонистов в терапевтических целях претерпели существенные изменения в связи с развитием представлений о гетерогенности мускариновых рецепторов. Согласно этому представлению, мускариновые рецепторы в организме животных и человека образуют гетерогенную популяцию, состоящую из 5 генетически обусловленных подтипов. Подтипы мускариновых рецепторов отличаются химическим строением, расположением на различных частях нейрона, особенностями тканевой локализации, системой вторичных посредников и др.

Одним из путей повышения эффективности и безопасности М-холинолитиков явилось создание селективных антагонистов. Эта задача достаточно успешно решалась для веществ, обладающих периферическим действием. Появились высокоэффективные противоязвенное (пирензепин) и бронхолитическое (атровент) средства. Однако, поиск центральных

М-холинолитиков селективного действия пока серьезных результатов не принес. Причиной этого явилась фрагментарность сведений о распространенности подтипов М-холинорецепторов в мозге и их роли в организации его работы.

Поэтому для успешного поиска средств, обладающих необходимым профилем избирательности для лечения заболеваний, связанных с дисфункцией холинергической системы, необходимо изучение роли отдельных подтипов мускариновых рецепторов в механизмах развития патологии и особенностей влияния на них потенциальных лекарственных препаратов.

Целью настоящего исследования являлся поиск антипаркинсонических средств из числа ацетиленовых аминоспиртов на базе изучения профиля их избирательности в отношении отдельных подтипов мускариновых рецепторов.

Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести скрининг активности соединений из ряда ацетиленовых аминоспиртов по их способности предупреждать развитие экстрапирамидных нарушений на модели нейролептического паркинсонизма.

2. Изучить профиль фармакологической избирательности соединений из ряда ацетиленовых аминоспиртов в сравнении с М-холиноблокаторами из других химических групп в экспериментах на крысах.

3. Разработать способы оценки активности мускариновых антагонистов в отношении Mt-холинорецепторов in vivo.

4. Определить роль блокады М^-холинорецепторов в осуществлении противопаркинсонической (антигалоперидоловой) активности соединений в опытах на крысах.

5. Оценить взаимодействие пентифина, соединения из ряда ацетиленовых аминоспиртов, с дофаминовыми и мускариновыми рецепторами в экспериментах in vitro и in vivo.

6. Сопоставить антипаркинсоническую активность М-холиноблокаторов с их влиянием на высвобождение ацетилхолина в стриатуме крыс.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Соединения из химической группы ацетиленовых аминоспиртов проявляют выраженную антипаркинсоническую («антигало-перидоловую») активность.

2. Блокада М-холинорецепторов играет значимую роль в антипаркинсо-нической («антигалоперидоловой) активности мускариновых антагонистов.

3. Соединение пентифин является избирательным блокатором мускариновых рецепторов, принадлежащих к подтипу М4.

Научная новизна работы

Настоящее исследование продолжает цикл работ, направленных на поиск препаратов, предназначенных для лечения паркинсонизма, а также на выяснение механизмов их лечебного действия. Новизна работы определяется тем, что в ней впервые установлена роль блокады М-холинорецепторов в лечебном действии препаратов при экспериментальном паркинсонизме. Впервые обнаружено выраженное избирательное Мгхолинолитическое действие у производных ацетиленовых аминоспиртов.

Выявлена связь между способностью соединений блокировать Мгхолинорецептор и их антипаркинсонической активностью. Доказана перспективность поиска новых антипаркинсонических средств среди холинолитиков, в частности производных ацетиленовых аминоспиртов.

Практическая значимость работы

В ходе проведения исследования был разработан способ количественной оценки степени блокады холинорецепторов, принадлежащих к подтипу М*. Сочетание указанного способа с ранее разработанными приемами для оценки состояния Мр, М2- и Мз-холинорецепторов дало возможность оценить профили рецепторной избирательности ряда мускариновых антагонистов in vivo.

В ходе этих исследований были выявлены мускариновые антагонисты, проявляющие высокую избирательность в отношении М-холинорецепторов, принадлежащих к подтипу Mr и Mr. Соединения, проявляющие указанные свойства, могут быть рекомендованы для дальнейшего изучения в качестве средств для лечения паркинсонизма.

На два таких соединения получены соответствующие патенты. Кроме того указанные соединения могут быть использованы в аналитических целях, как избирательные блокаторы МЦ- и Мг холинорецепторов.

Апробация диссертационного материала

Основные положения работы доложены и обсуждены: на XVIII съезде физиологического общества им. И. П. Павлова, 2001; на XII Всероссийской конференции "Нейроиммунология", 2003; на 2-ом съезде токсикологов России, 2003; на конференции «Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты», 2004; на конференции "Нейрохимия: Фундаментальные и прикладные аспекты", 2005; на 8th ECNP Regional Meeting «European Neuropsychopharmacology», 2005; на конференции "Нейроспецифические метаболиты и энзиматические основы деятельности центральной нервной системы", 2006; на V Международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения», 2006; на Всероссийской конференции с международным участием

Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга», 2006.

Материалы диссертации опубликованы в 19 печатных работах по материалам диссертации оформлено 2 патента на изобретение.

Работа выполнена в рамках программы МЗ РФ, шифр 024, «Разработка научных основ медицинского обеспечения химической безопасности населения России», 2001-2005 гг. и грантов РФФИ № 00-04-49432, 2000-2002 гг. и № 0304-49696,2002-2004 гг.

1. Обзор литературы

Паркинсонизм — синдром, характеризующийся гипокинезией, ригидностью, тремором. Болезнь Паркинсона (БП) — представляет собой идиопатическое нейродегенеративное заболевание, обычно возникающее в среднем или пожилом возрасте (Northoff G. et al., 2000).

Этиологическими факторами могут служить как генетические нарушения, так и воздействие среды обитания — вирусные инфекции, интоксикация (тяжелые металлы, токсины), медикаментозное лечение (прием нейролептиков, резерпинсодержащих средств), атеросклероз сосудов головного мозга, тяжелые и повторные черепно-мозговые травмы (Tanner С. М. et al., 1999; Northoff G. et al., 2000; Denny-Brown D. et al., 1958; Tippen J., Dunner F. J., 1981; Howard R., 1989; Saver J. L. et al., 1993; Saposnik G. et al., 1999; Saposnik G. et al., 2001; Руководство по психотерапии, 1979).

Основными задачами лечения паркинсонизма являются:

1) подавление активности холинергической системы, направленное на восстановление баланса между дофамином и ацетилхолином;

2) повышение уровня дофамина до нормального, что также нацелено на восстановление баланса между уровнями дофамина и ацетилхолина.

Для воздействия на холинергическую систему применяют ряд соединений из различных химических групп, препятствующих возбуждению М-холинергического отдела центральной нервной системы. По мере развития заболевания холиноблокаторы применяются по разным показаниям. Так, на ранних этапах их применение корригирует дефицит дофамина, возникающий вследствие его пониженной выработки черной субстанцией, а на поздних — они применяются с целью коррекции избытка дофамина, возникающего как результат побочного действия его предшественника — леводопы. Как было отмечено во введении, в современной практике применяются следующие препараты: тригексифенидил, трипериден, бипериден, бенактизин, дифенилтропин. Из природных соединений в клинике длительное время использовали атропин и препараты красавки.

Для воздействия на состояние дофаминергической системы применяется ряд соединений различных химических групп, способствующих:

1) восполнению дефицита дофамина — леводопа, предшественник дофамина, проникающий, в отличии от дофамина, через гемато-энцефалический барьер;

2) увеличению биодоступности леводопы тканям ЦНС, за счет ингибирования в периферическом кровотоке катехол-О-метил-трансферазы — толкапон;

3) увеличению времени жизни дофамина в тканях мозга, за счет снижения активности МАО-В — селегилин;

4) непосредственному возбуждению рецепторов дофамина при использовании прямых агонистов дофамина — перголид, ропинирол, апо-морфин.

Эффективность терапии определяется как этиологическим фактором, обусловливающим возникновение паркинсонизма, так и стадией его развития. Наиболее распространенной является точка зрения о том, что современная терапия паркинсонизма (болезни Паркинсона) является средством улучшения качества жизни и не влияет на ее продолжительность (Stanley F. et al., 2004).

Выводы

1. Соединения пентифин, CJ1-22, CJ1-23, CJI-28, из химической группы ацетиленовых аминоспиртов, проявляют выраженную антипаркинсоническую («антигалоперидоловую») активность, сопоставимую и, в отдельных случаях, превосходящую активность официнапыюго препарата циклодол. Наиболее выраженным «антигалоперидоловым» действием обладает соединение пентифин, превосходящее по галоперидоловому тесту циклодол в 17 раз.

2. На модели нейролептического паркинсонизма показано, что в организации нарушения деятельности экстрапирамидной системы ведущим фактором является возбуждение Мгподтипа холинорецептора. Эффективность блокады Мгхолинорецептора определяет способность лиганда оказывать корригирующее действие в условиях этой модели.

3. Эффективность М-холиноблокаторов в отношении экстрапирамидных нарушений в условиях нейролептического паркинсонизма обусловлена как их высокой фармакологической избирательностью к Mr холинорецептору, так и низкой избирательностью к Мг-подтипу холинорецептора.

4. Пентифин предотвращает значимое увеличение выброса ацетилхолина в области стриатума, вызванное введением галоперидола, что не наблюдается в случае коррекции экстрапирамидных нарушений неселективными холиноблокаторами.

5. Способность пентифина связываться с рецепторами различных медиаторных систем в экспериментах in vitro снижается в ряду: рецепторы мускариновой > адреналовой > дофаминовой систем. В экспериментах in vivo, с применением метода «открытого поля» и изучением параметров ориентировочного рефлекса, было выявлено отсутствие непосредственного влияния пентифина на дофамин-ергическую систему.

6. На основании проведенных фармакологических, тестов показано, что пентифин является избирательным блокатором мускариновых рецепторов, принадлежащих к подтипу М*.

Заключение

На базе Института Токсикологии д. х. н. профессором С. Г. Кузнецовым и д. х .н. Н. М. Либманом был синтезирован ряд химических соединений — лигандов группы ацетиленовых аминоспиртов и, к началу настоящего исследования, было известно, что некоторые соединения обладают

W гтч U холинергическои активностью. Так, детальному рассмотрению свойств одного из ряда производных ацетиленовых аминоспиртов, пентифина, было посвящено исследование, в котором показано, что этот лиганд, обладающий слабовыраженными антихолинергическими свойствами является одним из наиболее активных среди известных препаратов, противодействующих проявлениям интоксикации нейролептиками (А. В. Храброва, 2001).

Из 21 изученного соединения, в тесте фармакологической избирательности к Мгподтипу холинорецептора, было отобрано 9 наиболее активных (СЛ-17, СЛ-18, СЛ-22, СЛ-23, СЛ-26, СЛ-28, СЛ-31, СЛ-32, пентифин). Анализ их эффективности в сравнении с холиноблокаторами из других химических групп проводили на общепринятой модели нейролептического паркинсонизма (галоперидоловая каталепсия). Среди них высокая активность по предупреждению каталепсии, сравнимая с применяющимся корректором экстрапирамидных нарушений циклодолом, отмечена у 4 соединений (СЛ-22, СЛ-23, СЛ-28, пентифин). При этом, активность соединений СЛ-17, СЛ-18, СЛ-26, СЛ-31, СЛ-32 в тесте каталепсии была значительно ниже активности неселективного холиноблокатора атропина. Отсутствие в исследованной группе соединений с промежуточными значениями фармакологической активности делит их на группы высоко- и низкоактивных веществ.

Анализ химического строенения высокактивных соединений выявил их особенности, которые заключаются в наличии определенных концевых радикалов и основной углеродной цепи. Обязательным является наличие фенольного кольца в положении первого атома углерода, а у концевого — пиперидинового остатка. Менее жесткие требования относятся к длине собственно углеродной цепочки (4-5 атомов углерода) и второму радикалу первого атома углерода — он должен являтся кольцевой структурой произвольной длинны. Соблюдение вышеперечисленных условий очевидно обеспечивает строго определенную конформацию молекулы, коррелирующую с ее высокой биологической активностью. Это положение хорошо иллюстрируется при сравнении структуры соединения CJI-17 и CJI-23 (введение метильной группы в радикал циклопентил увеличивает активность почти в 20 раз).

Гипотеза о наличии у пентифина значимого непосредственного влияния на рецепторы дофамина (А. В. Храброва и др., 2001), на основании собственных исследований in vitro и in vivo, не подтвердилась.

Анализ данных литературы позволил предположить, что ключевую роль в развитии экстрапирамидных нарушений играет М^-подтип мускаринового рецептора. Для выявления Мгизбирательных свойств была разработана методика оценки фармакологической избирательности холиноблокатора к Мгподтипу рецептора. Было выявлено, что способность холинолитиков нормализовать количество ДНЧ в условиях действия пилокарпина изменяется следующим образом: пентифин > CJI-23 > глипин > амедин > атропин.

На основе анализа эффективности ряда лигандов, обладающих холинергической активностью, было высказано предположение о профиле фармакологической избирательности, которым должен обладать холиноблокатор максимально эффективный в предупреждении развития экстрапирамидных нарушений, вызванных нейролептиком. Для проверки гипотезы о значении одновременной блокады различных подтипов холинорецепторов на способность ряда холиноблокаторов предупреждать развитие двигательных расстройств, с учетом уровня блокады каждого из подтипов (М1-М4) холинорецепторов, была построена регрессионная модель:

Y=2,99+0,16 х ((X3)3/Xi) + 0,03 х ((Х4)2/Х2) с высоким уровнем значимости по критерию Фишера (Р<0,001), где за Y принималась активность холиноблокатора по способности предупреждать развитие каталепсии, вызванной введением галоперидола. Модель предполагает включение рецепторов М4- и М2-подтипов в системы с антагонистическими свойствами. Блокада Мгхолинорецепторов противодействует развитию кататонического синдрома, а блокада М2- холинорецепторов не оказывает корригирующего действия, и, возможно, потенцирует развитие каталепсии.

Таким образом, применение математического анализа позволило построить модель, описывающую связь фармакологических свойств блокатора с эффективностю коррекции двигательных нарушений, вызванных блокадой Д2-рецепторов. Из анализа модели следовало, что определяющим фактором является способность препарата максимально блокировать Mr, при минимальном влиянии на М2-подтип рецептора. Оказалось, что в ряду обследованных холиноблокаторов именно у пентифина наиболее высока избирательность по отношению к Мгхолинорецептору. В этом ряду следующими стоят официнальные препараты — циклодол и амедин.