Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Использование новых подходов к оценке типовой принадлежности и функциональных особенностей мускариновых рецепторов различных отделов головного мозга

Актуальность проблемы

Парасимпатический отдел нервной системы принимает участие в регуляции функции различных органов и систем, оказывая модулирующее влияние на деятельность других нейромедиаторных образований организма (Eglen R. М. et. al., 1994). Деятельность указанного отдела нервной системы опосредована функцией мускариновых рецепторов, популяция которых в организме животных и человека не является гомогенной и представлена пятью генетически обусловленными подтипами (Kubo Т. et. al., 1986а; Bonner Т. I. et. al, 1987; Dorje F. et. al., 1991; Caulfield M. P., 1993). Отдельные подтипы мускариновых рецепторов различаются своим строением, локализацией, функциональным назначением, связью с различными вторичными мессенджерными системами, сродством к избирательным лигандам (Forray С., El-Fakahany Е. Е., 1989; Hosey М. М., 1992; Levine R. R., Birdsall N. J. М, 1997; Caulfield М. P., Birdsall N. J. M„ 1998).

Нарушение функции холинергической регуляции нервной системы лежит в основе или сопутствует возникновению многих патологических состояний, к которым можно отнести отравления антихолинэстеразными ядами, болезнь Альцгеймера, паркинсонизм различной этиологии, некоторые нарушения сердечной деятельности, язвенную болезнь и другие (Mash D. С, Flynn D. D., Potter L. Т., 1985; Kasa F., 1986; Ehlert F. J., 1994; Kühl D. E. et. al., 1994; Roeske M. R, Yamamura H. J., 1994). В связи с этим холинергические лиганды находят широкое применение в качестве лекарственных средств (Mutschier Е. et. al., 1990). Однако, их использование зачастую ограничивается побочными явлениями, которые возникают вследствие недостаточной избирательности действия.

Избирательное фармакологическое воздействие на функцию мускариновых рецепторов в терапевтических целях предполагает наличие информации об их типовой принадлежности, локализации, функциональных особенностях. Для мускариновых рецепторов центральной нервной системы млекопитающих эта информация ограничена, что связано с недостатком соответствующих методических подходов.

Цель исследования

В связи с вышеизложенным целью настоящего исследования явилась разработка нового комплексного методического подхода in vitro и in vivo для определения типовой принадлежности, нейрональной локализации и некоторых особенностей функционирования мускариновых рецепторов различных отделов головного мозга млекопитающих. В соответствии с целью исследования были сформулированы основные задачи:

Задачи исследования

1. Отобрать наиболее селективные Мг, М2- и М3-холиноблокаторы среди известных избирательных холинергических лигандов и определить в экспериментах in vitro константы их сродства к тест-тканям, содержащим цреимущественно М]-, М2- и М3-холинорецепторы для дальнейшего использования в определении типовой принадлежности неизвестных пре-и постсинаптических М-холинорецепторов.

2. Используя оригинальный подход и полученные значения констант связывания тест-лигандов, показать разрешающие возможности метода на примере определения типовой принадлежности пре- и постсинаптических М-холинорецепторов больших полушарий, стволового отдела и стриатума головного мозга крыс.

3. Провести изучение М-холиноблокирующей активности некоторых мускариновых антагонистов в ряде фармакологических тестов in vivo с целью выбора фармакологических моделей для оценки функции отдельных подтипов М-холинорецепторов в условиях целостного организма.

4. Изучить влияние М-холиноблокаторов на секрецию ацетилхолина in vivo с целью установления типовой принадлежности пресинаптических мускариновых аутохолинорецепторов различных отделов головного мозга крыс.

5. Провести оценку влияния модуляции функции вторичных посредников на секрецию ацетилхолина in vivo.

Научная новизна

В исследовании разработан комплекс новых методических подходов in vitro и in vivo, предназначенных для оценки типовой принадлежности и функциональной значимости мускариновых рецепторов различных отделов головного мозга млекопитающих.

Методом радиолигандного анализа in vitro путем сравнения констант и количества мест связывания лиганда в гомогенате и синаптосомах соответствующего отдела мозга определена типовая принадлежность пре- и постсинаптических мускариновых рецепторов больших полушарий, ствола и стриатума головного мозга крыс. Метод радиолигандного анализа был разработан несколькими группами исследователей (Atkins G. L., 1973; Yamamura Н. I., Snyder Н. S., 1974; Birdsall N. J. M., Burgen A. S. V., Hulme E. C., 1978). Синаптосомальные препараты (Hebb С. O., Whittaker V. P., 1958) использовались Raiteri М. и соавт. (1984, 1990) для исследования эффектов агонистов и антагонистов на вызванное выделение ацетилхолина в коре и гиппокампе, а также Rama Sastry В. V. и соавт. (1995) — для изучения связи подтипов мускариновых рецепторов с обменом Са2+ в пресинаптической холинергической нервной терминали. Однако, широкий спектр рассмотренных литературных источников не обнаружил данных по определению типовой принадлежности пре- и постсинаптических мускариновых рецепторов с использованием синапто-сомальных фракций в различных отделах мозга млекопитающих. Наш подход достаточно прост и позволяет путем сравнительного анализа констант и количества мест связывания лигандов в гомогенатах и синаптосомах определять содержание и типовую принадлежность рецепторов в пре- и постсинаптических фракциях соответствующего отдела мозга.

В большинстве исследований, рассмотренных нами в литературном обзоре (James М. К., Cuppedu L. X., 1983; Raiten М. et. al., 1984, 1990; Dolezal V., Tucek S., 1993; Rama Sastry В. V. et. al., 1995; D'Agostino G. et. al., 1993,. 1997) анализ типовой принадлежности и функциональной роли пресинаптических М-холинорецепторов основывается на результатах, полученных в экспериментах in vitro. Эксперименты in vitro, главным образом, заключаются в изучении влияния избирательных мускариновых лигандов на уровень вызванной секреции медиатора в различных тканях, изолированных органах или тканевых фракциях. Наряду с достоинствами указанный подход обладает некоторыми недостатками: опыты ставятся на гомогенизированных тканях или полосках тканей, которые инкубируются в искусственных средах. Преимуществом настоящего исследования является сочетание методических подходов, основанных на экспериментах in vivo, позволяющих проводить оценку типовой принадлежности пресинаптических аутохолинорецепторов, регулирующих секрецию ацетилхолина в различных отделах головного мозга млекопитающих, в условиях целостного организма. В работе доказана правомерность принципиально нового использования известных фармакологических тестов in vivo: пилокарпинового тремора, ареколинового тремора и пилокарпиновой саливации, позволяющего в условиях целостного организма охарактеризовать преимущественно функции Мг, М2- и М3-подтипов рецепторов, соответственно. Фармакологическое воздействие холиномиметиков — ареколина и пилокарпина — на центральную нервную систему млекопитающих изучалось Голиковым С. Н. и

Селивановой А. Т. (Голиков С. Н., 1956; Селиванова А. Т., Голиков С. Н., 1975). Затем в лаборатории биохимии Института токсикологии Космаче-вым А. Б. и соавт. (Космачев А. Б., Янхонтова М. Б., Космачева И. М., 1992; Космачев А. Б. и соавт., 1999) был разработан новый методический подход: фармакологические реакции, вызванные введением различных доз холиномиметиков: ареколина, пилокарпина и ДДВФ, были связаны с возбуждением определенных подтипов М-холинорецепторов. В нашей работе проведен выбор фармакологических моделей, позволяющих оценивать функции отдельных подтипов мускариновых рецепторов в условиях целостного организма. Этот выбор основывается на сопоставлении рецепторной селективности ряда мускариновых антагонистов с избирательностью их действия в фармакологических реакциях, возбуждающих определенные подтипы М-холинорецепторов в условиях целостного организма. Далее в нашем исследовании этот методический подход применен для определения типовой принадлежности пресинаптических аутохолинорецепторов, регулирующих секрецию ацетилхолина в больших полушариях и стволе мозга крыс.

Оригинальность следующего методического подхода заключается в использовании результатов собственных экспериментов, полученных описанными выше методами и литературных данных о том, что нечетные подтипы М-холинорецепторов сопряжены с фосфоинозитидной системой, а четные подтипы — с аденилатциклазной системой вторичных посредников (Боггау С., ЕГБакаЬапу Е. Е., 1989; Нозеу М. М., 1992; Сапс1ига 8. М. е! а1., 1995). С целью уточнения типовой принадлежности и функциональной роли пресинаптических аутохолинорецепторов в различных отделах мозга крыс изучено влияние модуляции функций вторичных мессенджеров на секрецию ацетилхолина. Подобный методический подход не описан в рассмотренной нами литературе.

В работе продемонстрирована высокая разрешающая способность предложенного методического подхода. Идентифицированы муска-риновые рецепторы, ответственные за регуляцию секреции ацетилхолина и получены косвенные данные относительно сопряженных с ними систем вторичных мессенджеров. Полученные результаты существенно дополняют представления о функциональной роли гетерогенных подтипов пре- и постсинаптических М-холинорецепторов центральной нервной системы млекопитающих.

Практическая значимость

Работа посвящена разработке теоретических представлений, связанных с типовой принадлежностью, нейрональной локализацией и функциональными особенностями мускариновых рецепторов различных отделов головного мозга млекопитающих. Полученные в ходе исследования данные могут служить предпосылкой для выбора высокоизбирательных фармакологических средств, оказывающих влияние на уровень секреции ацетилхолина в больших полушариях и стволовом отделе головного мозга. Разработанные методические подходы можно рекомендовать для дальнейшего изучения типовой принадлежности, морфологической локализации, а также функциональной значимости мускариновых рецепторов различных морфо-функционалъных образований головного мозгя млекопитающих.

Положения, выносимые на защиту:

1. Предложенный комплекс методических подходов in vitro и in vivo позволяет проводить оценку типовой принадлежности, нейрональной локализации и функциональных особенностей мускариновых рецепторов головного мозга млекопитающих.

2. В популяции постсинаптических рецепторов больших полушарий головного мозга крыс преобладают М-холинорецепторы M¡ -подтипа и присутствуют холинорецепторы подтипа М2. В популяции пресинаптических рецепторов данного отдела мозга преобладает М3-подтип и присутствует М2-подтип холинорецепторов. Регуляция секреции ацетилхолина в больших полушариях мозга осуществляется при участии пресинаптических аутохолинорецепторов, сопряженных с аденилатциклазной системой вторичных мессенджеров и принадлежащих к подтипу М2.

3. В стволовом отделе головного мозга крыс в популяции постсинаптических рецепторов преобладает М2-подтип, присутствует Мг подтип холинорецепторов, а также рецепторы, не принадлежащие к Мг, М2- и Мз-подтипам. В популяции пресинаптических рецепторов обнаружен М] -подтип. Регуляция секреции ацетилхолина в этом отделе мозга осуществляется пресинаптическими аутохолинорецепторами, сопряженными с аденилатциклазной системой вторичных мессенджеров, и, вероятно, принадлежащими к подтипу М4.

4. В популяции постсинаптических рецепторов стриатума выявлены М]-подтип, а также рецепторы, не принадлежащие к Мг, М2- и Мз-подтипам. В популяции пресинаптических рецепторов также присутствуют М|- и Мз-холинорецепторы.

Апробация работы

Результаты работы заслушивались на научном совещании лаборатории (1996 г., 1998 г.), на межлабораторном совещании Института токсикологии (2001 г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц и 2 рисунка. Работа включает введение, обзор литературы, описание методов исследования, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список цитируемых литературных источников, из них 17 отечественных и 140 зарубежных авторов.

3. Выводы

1. Для оценки содержания пре- и постсинаптических рецепторов различных отделов головного мозга in vitro использован методический подход, основанный на сопоставлении числа мест связывания селективных мускариновых антагонистов с гомогенатами и синаптосомами соответствующих отделов головного мозга крыс.

2. В отделах головного мозга крыс в экспериментах in vitro обнаружены следующие мускариновые рецепторы: в больших полушариях — пре- и постсинаптические Мг. М2- и Мгхоли-норецепторы, пресинаптические М-холинорецепторы, не относящиеся к подтипам Mi, М2 и М3; в стволовом отделе — постсинаптические М2-холинорецепторы, пре- и постсинаптические Мрхолинорецепторы, а также пре- и постсинаптические рецепторы, не принадлежащие к подтипам Мь М2 и М3; в стриатуме — пресинаптические М3-холинорецепторы, пре- и постсинаптические Мрхолинорецепторы, а также постсинаптические рецепторы, не принадлежащие к подтипам М,. М2 и М3.

3. Для оценки типовой принадлежности пресинаптических рецепторов отделов головного мозга в условиях целостного организма использован методический подход, основанный на сопоставлении степени блокады холинорецепторов определенной типовой принадлежности с обусловленным ею уровнем секреции ацетил-холина в синаптическую щель.

4. Введение различных М-холиноблокаторов в равноэффективных дозах по предупреждению ареколинового тремора, связанного с функцией М2-холинорецепторов. обеспечивает одинаковый уровень секреции медиатора в синапсах коры головного мозга, что свидетельствует о том, что пресинаптические рецепторы указанного отдела мозга принадлежат к подтипу М2.

5. Использование различных М-холиноблокаторов в равно-эффективных дозах по предупреждению ареколинового тремора, пилокарпинового тремора и пилокарпиновой саливации — фармакологических реакций, связанных с функцией Мг, М2- и М3-холино-рецепторов, соответственно, не обеспечивает одинакового уровня секреции ацетилхолина в синапсах ствола головного мозга крыс, что свидетельствует о том, что пресинаптические аутохолинорецепторы данного отдела мозга не принадлежат к указанным подтипам рецепторов.

6. Для оценки функциональных особенностей мускариновых рецепторов отделов головного мозга животных в условиях целостного организма использован методический подход, учитывающий существование различий в сопряжении рецепторов с различными системами вторичных посредников и основанный на изучении влияния модуляции функций вторичных мессенджерных систем путем введения кофеина и 1лС1 на уровень секреции ацетилхолина в синаптическую щель.

7. Повышение содержания цАМФ под действием кофеина увеличивает секрецию ацетилхолина в синаптическую щель в больших полушариях и стволовом отделе головного мозга крыс, что свидетельствует о сопряжении ауторецепторов указанных отделов мозга с аденилатциклазной системой вторичных посредников.

8. Накопление вторичных посредников, принадлежащих к фосфо-инозитидной системе, под влиянием Ьл+ увеличивает уровень секреции ацетилхолина в синаптическую щель в больших полушариях и не изменяет секрецию медиатора в стволовом отделе головного мозга крыс, что свидетельствует об участии в регуляции механизмов секреции ацетилхолина в этих отделах мозга разных систем вторичных мессенджеров.

2. 2. 4. Заключение

Предложенный в исследовании комплекс методических подходов in vitro и in vivo позволил провести оценку типовой принадлежности, нейрональной локализации и некоторых функциональных особенностей мускариновых рецепторов в больших полушариях, стволовом отделе и стриатуме головного мозга крыс.

В экспериментах по оценке типовой принадлежности мускариновых рецепторов in vitro путем сравнения полученных методом радиолигандного анализа параметров связывания ряда селективных холиноблокаторов с гомогенатом и синаптосомальными фракциями различных отделов головного мозга крыс было установлено, что в больших полушариях головного мозга имеются пре- и постсинаптические Mr, Mi- и М3-холинорецепторы, а также пресинаптические мускариновые рецепторы, не принадлежащие ни к одному из указанных подтипов. В стволе головного мозга обнаружены постсинаптические Мг и М2-холинорецепторы, пресинаптические Мг, и, возможно, М2- и Мз-холино-рецепторы, а также пре- и постсинаптические М-холинорецепторы, не принадлежащие ни к одному из названных подтипов. В стриатуме головного мозга крыс обнаружены пресинаптические Мг и М3-холино-рецепторы и постсинаптические — Мг и М-холинорецепторы. не принадлежащие ни к одному из указанных подтипов.

В экспериментах in vivo при оценке изменения секреции ацетилхолина в холинергических синапсах на фоне модуляции активности вторичных мессенджерных систем было установлено, что в больших полушариях головного мозга крыс повышение уровня секреции медиатора опосредовано функцией мускариновых рецепторов, сопряженных с фосфоинозитидной системой вторичных посредников. Как известно, уровень секреции медиатора в синаптическую щель определяется активностью нейрона и регулируется рецепторами, которые имеют пост- и пресинаптическую локализацию. Согласно литературным данным стимуляция секреции ацетилхолина осуществляется путем возбуждения постсинаптических М-холинорецепторов на теле нейрона, что на внутриклеточном уровне может реализовываться посредством активации фосфоинозитидной или ингибирования аденилатциклазной систем вторичных мессенджеров или путем блокады пресинаптических аутохолинорецепторов по механизму отрицательной обратной связи. В наших экспериментах активация с помощью LiCl фосфоинозитидной системы рассматривается как внутриклеточный эквивалент возбуждения М-холинорецепторов, сопряженных с данной системой вторичных посредников, а стабилизация с помощью кофеина аденилатциклазной системы как эквивалент блокады М-холинорецепторов соответствующих подтипов. Поскольку наблюдается прямая связь между активацией фосфоинозитидной системы с помощью Li и увеличением секреции медиатора, можно предположить, что речь идет о постсинаптических холинорецепторах.

Учитывая вышеприведенные собственные данные о типовой принадлежности рецепторов больших полушарий, которые совпадают с данными литературы (Raiteri М. et. al. 1984: Mash D. С. et. al. 1985: Ehlert F. J. et. al. 1991). а также принимая во внимание сведения о том. что фосфоинозитидная система преимущественно является вторичным посредником нечетных подтипов рецепторов (Forray С. El-Fakahany Е. Е., 1989) можно предположить, что регуляция секреции ацетилхолина в больших полушариях головного мозга крыс, в частности, осуществляется с помощью постсинаптических Мгхолинорецепторов.

Однако, регуляция секреции ацетилхолина в больших полушариях не исчерпывается функцией постсинаптических Мгхолинорецепторов, о чем свидетельствует изучение этого процесса на фоне модуляции активности аденилатциклазной системы. Так, повышение содержания в ткани больших полушарий цАМФ при введении кофеина, который стабилизирует уровень указанного вторичного посредника, вызывает увеличение секреции медиатора, о чем свидетельствует снижение содержания "связанного" ацетилхолина. Этот результат позволяет говорить о том, что в указанном отделе головного мозга крыс регуляция секреции ацетилхолина находится под контролем рецепторов, сопряженных с аденилатциклазной системой вторичных мессенджеров. То обстоятельство, что повышение секреции медиатора происходит в ответ на увеличение уровня цАМФ может свидетельствовать о том, что регуляция высвобождения ацетилхолина в данном случае контролируется по механизму отрицательной обратной связи. Следовательно, речь идет о пресинаптических мускариновых рецепторах, сопряженных с аденилатциклазной системой вторичных посредников.

При использовании оригинального подхода к оценке типовой принадлежности пресинаптических аугорецепторов в условиях целостного организма, основанного на сопоставлении уровня секреции медиатора с блокадой различных подтипов М-холинорецепторов, было установлено, что пресинаптические ауторецепторы больших полушарий головного мозга крыс представлены подтипом М2. Этот вывод согласуется с данными литературы о том. что вторичной мессенджерной системой jYb-холино-рецепторов преимущественно является аденилатцнклазная (Ashkenazi А. et. al., 1987; Peralta Е. G. et. al. 1988). Кроме того, в литературе приводятся данные исследований секреции ацетилхолина in vitro, в которых типовая принадлежность пресинаптических мускариновых ауторецепторов в больших полушариях головного мозга крыс также оценивается как М2 на основании их низкой чувствительности к действию пирензепина (Яакеп М. е1. а!., 1984).

Таким образом, можно сделать вывод, что пресинаптические ауторецепторы больших полушарий головного мозга крыс относятся к подтипу М2.

Однако, в целом популяция пресинаптических рецепторов в больших полушариях, по-видимому, не исчерпывается мускариновыми рецепторами, принадлежащими к указанному подтипу. Так, выше указывалось, что в собственных экспериментах по оценке типовой принадлежности пресинаптических рецепторов больших полушарий мозга крыс т \ntro путем сравнения полученных методом радиолигандного анализа параметров связывания ряда селективных холиноблокаторов с гомогенатом и синаптосомальными фракциями больших полушарий было установлено, что в синаптосомах по сравнению с гомогенатом наблюдается повышение процентного содержания М3-холинорецепторов. Поскольку синаптосомальная фракция по сравнению с гомогенатом рассматривается нами как объект, обогащенный пресинаптическими рецепторами, на основании полученных данных можно заключить, что в популяции пресинаптических рецепторов больших полушарий преобладает фракция М3-холинорецепторов. Этот вывод не вступает в противоречие с ранее сделанным заключением о принадлежности пресинаптических рецепторов к подтипу М2. так как методический подход, использованный в экспериментах /'// \itro дает информацию о пресинаптических рецепторах, локализованных на терминалях как холинергнчеекнх. так и нехолинергических нейронов, то есть ауто- и гетерорецегтторах ацетилхолина. В то же время, в экспериментах на целостном организме оценивалась функция только ауторецепторов, что дает возможность заключить, что пресинаптические ауторецегггоры ацетилхолина относятся к подтипу fvb.

Рассматривая вопрос о функциональной значимости М3-холино-рецепторов в больших полушариях головного мозга следует учесть данные литературы о стимулирующем влиянии пилокарпина на секрецию ацетилхолина переживающими срезами коры теменной доли больших полушарий мозга крыс (Санковский А. А. и соавт., 1990). В связи с тем, что для пилокарпина характерен редуцированный ответ фосфоинозитидной сигнальной системы, сопряженной с Мг, М3- и М5-ре-цепторами (Подосиновикова Н. П., Долго-Сабуров В. Б., 1992), его холиноблокирующий эффект на уровне ауторецепторов этой зоны коры позволяет в принципе ставить вопрос об отнесении их к одному из данных подтипов, в частности к М3.

Совершенно очевидно. что при сопоставлении результатов, полученных in vitro и in vivo, необходимо учитывать особенности морфофункциональной организации области ЦНС, ответственной за реализацию конкретных функций холинореактивных систем и типовую принадлежность локализованных там мускариновых рецепторов, популяция которых может оказаться неоднородной. Так, в качестве примера можно привести данные о том, что популяция ауторецепторов гиппокампа крысы представлена в основном М4-подтипом с вероятным присутствием рецепторов подтипа М2 (McKinney М. et. al., 1993).

Таким образом, можно предположить, что обнаруженные нами в экспериментах in vitro пресинаптические М3-холинорецепторы. локализованные в больших полушариях головного мозга способны регулировать высвобождение ацетилхолина. В этом случае, с учетом данных литературы (Caridura S. М. et. al. 1995). следует сделать заключение, что указанные рецепторы сопряжены с фосфоинозитидной системой вторичных посредников. В экспериментах in vivo при оценке изменения секреции ацетилхолина в холинергических синапсах fia фоне модуляции вторичных мессенджерных систем было установлено, что в больших полушариях головного мозга крыс повышение уровня секреции медиатора опосредовано функцией мускариновых рецепторов, сопряженных с фосфоинозитидной системой вторичных посредников. В связи с тем, что наблюдается прямая связь между активацией фосфоинозитидной системы с помощью Lf и увеличением секреции медиатора было сделано предположение о том, что сопряженные с фосфоинозитидной системой рецепторы являются постсинаптическими. Вместе с тем, нельзя полностью исключить возможность того, что сопряженные с фосфоинозитидами рецепторы могут оказаться пресинаптическими. Однако, в этом случае надо признать, что они должны осуществлять свою функцию по механизму положительной обратной связи. Наконец, можно сделать предположение, что обнаруженные в больших полушариях пресинаптические Мз-холинорецепторы являются гетерорецепторами ацетилхолина и локализованы на окончаниях нехолинергических нервов.

При изучении роли модуляции уровня вторичных посредников в секреции ацетилхолина было установлено, что изменения содержания ацетилхолина в ткани ствола головного мозга под действием хлорида лития не происходит. Таким образом, можно сделать вывод, что пресинаптические ауторецепторы ствола головного мозга крыс не связаны с фосфоинозитидной системой вторичных посредников. Напротив, повышение содержания в тканях цАМФ при введении кофеина, который стабилизирует уровень цАМФ. вызывает увеличение секреции медиатора в стволовом отделе, о чем свидетельствует снижение содержания "связанного" ацетилхолина. Этот результат говорит о том. что в указанном отделе головного мозга крыс регуляция секреции ацетилхолина находится под контролем рецепторов, сопряженных с аденилатциклазной системой вторичных мессенджеров. Повышение секреции медиатора происходит в ответ на увеличение уровня цАМФ. То есть регуляция высвобождения ацетилхолина контролируется по механизму отрицательной обратной связи. Следовательно, этот процесс осуществляется пресинаптическими холинорецепторами, сопряженными с аденилатциклазной системой. Среди обнаруженных методом радиолигандного анализа пресинаптических рецепторов на роль ауторецепторов могут претендовать рецепторы, принадлежащие к подтипу М2, так как согласно литературным данным Мг и М3-холинорецепторы не сопряжены с аденилатциклазной системой (Forray С., El-Fakahany Е. Е.Л 989).

Для изучения типовой принадлежности пресинаптических ауторецепторов ацетилхолина, локализованных в стволовом отделе головного мозга крыс был использован, разработанный нами методический подход, основанный на сопоставлении активности мускариновых антагонистов в ряде стандартных тестов, характеризующих функцию определенных подтипов М-холинорецепторов \п vivo и их способности усиливать пресинаптическую секрецию ацетилхолина. С помощью этого подхода было установлено, что мускариновые ауторецепторы, контролирующие секрецию медиатора в стволе мозга, не принадлежат к подтипам Mi, М2 и М3. Учитывая данные литературы о том, что цАМФ является вторичным посредником М4-, а не М5-холино-рецепторов (Pinkas-Kramarski R. et. al., 1990; Tietje К. M. et. al., 1990), можно предположить, что секреция ацетилхолина в стволовом отделе головного мозга крыс контролируется пресинаптическими ауторецепторами. принадлежащими к подтипу М4. Наконец, следует остановиться на вопросе о роли постсинаптических рецепторов в регуляции секреции ацетилхолина в холинергических синапсах, расположенных в стволовом отделе головного мозга. Рассматривая механизмы секреции медиатора, следует отметить, что роль пресинаптических рецепторов заключается в модуляции процесса высвобождения ацетилхолина, который является результатом нейрональной активности, определяемой функцией постсинаптических рецепторов, расположенных на теле или дендритах нервных клеток. В связи с этим возникает вопрос о физиологических характеристиках постсинаптических мускариновы* рецепторов, расположенных в стволовом отделе мозга крыс. При изучении секреции медиатора обращает на себя внимание, что изменения в содержании связанного ацетилхолина под действием кофеина в стволовом отделе выражены в меньшей степени, чем в больших полушариях. Одна из возможных причин этого явления может заключаться в различной направленности влияния стабилизации с помощью кофеина уровня цАМФ (то есть блокады М-холинорецепторов) на регуляцию выброса медиатора, осуществляемую пресинаптическими аутохолинорецепторами и пост-синаптическими М-холинорецепторами, расположенными на теле нейрона. Это предположение имеет под собой определенную основу в связи с тем. что согласно нашим данным, а также данным литературы мускариновые рецепторы в стволе представлены, главным образом, подтипом М2 (МсКтпеу М. е!:. а!. 1989), который сопряжен с аденилатциклазной системой вторичных посредников. Таким образом, увеличение содержания цАМФ под влиянием кофеина должно приводить к снижению активности нейрона вследствие неспособности реализации возбуждения постсинаптического рецептора и таким образом снижать секрецию медиатора. Этот эффект противодействует увеличению выброса ацетилхолина в результате действия кофеина на трансдуцирующую систему пресинаптических мускариновых рецепторов.

Заканчивая обсуждение вопроса о регуляции выброса ацетилхолина в синапсах больших полушарий и стволового отдела головного мозга следует подчеркнуть, что окончательное заключение по этому поводу не может быть сделано без анализа возможного влияния на секрецию медиатора нехолинергических пресинаптических рецепторов, функция которых сопряжена с аденилатциклазной системой вторичных мессенджеров.

В заключение следует отметить, что возможность указанной в ряде случаев неодназначности трактовки полученных результатов на наш взгляд не противоречит перспективности использования предложенных методических подходов к оценке типовой принадлежности и функциональных особенностей М-холинорецепторов.