Автореферат и диссертация по медицине (14.01.17) на тему:АНТИМЕДИАТОРНАЯ ТЕРАПИЯ ПАНКРЕОНЕКРОЗА (экспериментально-клиническое исследование)

На правах рукописи

005531212

АГАПОВ МИХАИЛ АНДРЕЕВИЧ

АНТИМЕДИАТОРНАЯ ТЕРАПИЯ ПАНКРЕОНЕКРОЗА (экспериментально-клиническое исследование) 14.01.17. - хирургия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва 2013

005531212

Работа выполнена на кафедре экспериментальной и клинической хирургии медико-биологического факультета Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

Горский

Виктор Александрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой хирургии послевузовского профессионального образования врачей Первого московского медицинского университета им. И.М. Сеченова

Глабай

Владимир Петрович

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой госпитальной хирургии №2 РНИМУ им. Н.И.Пирогова

Шаповальянц Сергей Георгиевич

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой факультетской хирургии Российского университета дружбы народов

Ведущее учреждение:

Климов

Алексей Евгеньевич

ФГБУ «Институт хирургии им. А.В.Вишневского» Минздравсоцразвития России

Защита состоится «¿_»_ 03 2013 г. в </ я часов на заседании диссертационного совета Д.212.203.09 при Российском университет? дружбы народов. Адрес: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РУДН (Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6)

Автореферат разослан

ГГ. 0/

2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

М.ЮЛерсов

Список сокращений

ГС - гепаран-сульфат;

ДНК—дезоксирибонуклеиновая кислота;

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт;

ЗПФ - забрюшинная панкреатогенная флегмона;

ИВЛ - искусственная вентиляция легких;

ИЛ - интерлейкин;

КТ - компьютерная томография;

ЛПС - липополисахарид;

ЛС - лапароскопия;

МНК - мононуклеарные клетки;

мРНК — матричная рибонуклеиновая кислота;

ОДН - острая дыхательная недостаточность;

ОЖСК - острое жидкостное скопление;

ОП - острый панкреатит;

ОПН - острая почечная недостаточность;

ОССН - острая сердечно-сосудистая недостаточность;

ПА — панкреатогенный абсцесс;

ПГ - пептидогликан;

ПЖ - поджелудочная железа;

ПН - панкреонекроз;

ПОН - полиорганная недостаточность;

ССВР - синдром системной воспалительной реакции;

ФНО — фактор некроза опухоли;

ЦОГ - циклооксигеназа;

TLR (Toll-like receptor) - То11-подобный рецептор;

Актуальность проблемы

Острый панкреатит (ОП) остаётся одной из самых актуальных проблем современной ургентной хирургии. Проведенные эпидемиологические исследования свидетельствуют о том, что заболеваемость ОП составляет от 48 до 238 случаев на миллион населения, из них панкреонекроз (ПН) составляет 10-25%, а общая летальность - 9-20% [А.С.Ермолов,2001; С.Ф.Багненко,2004; H.G.Beger,2007], При этом тяжесть течения ОП определяется, прежде всего, распространенностью деструктивного процесса в поджелудочной железе и парапанкреатической клетчатке, возникновением синдрома системной воспалительной реакции (ССВР) и полиорганной недостаточности (ПОН), инфицированием некротических тканей [А.Д.Толстой,2003; В.С.СавельевДООЗ; M.W.Buchler, 2001].

Из большого количества теорий патогенеза ПН, наибольшее распространение в России получила фазная теория В.С.Савельева и соавт. (1983;2008). Однако, многое в патогенезе ПН остается неясным и механизмы, определяющие тяжесть течения данного заболевания, еще детально не изучены [М.П.КоролевДО 12; А.Д.ТолстойД000; Y.Sakai, 2003]. В настоящее время стали появляться работы, посвященные изучению уровня цитокинов как возможных маркеров течения заболевания и мишеней терапевтического воздействия при ПН [H.G.Beger,2000]. Установлено, что именно их гиперпродукция («цитокиновый шторм») на первой неделе заболевания во многом обуславливает тяжесть состояния и является причиной развития ССВР и ПОН [R.Makhija,2002; J. Granger, 2005]. Только после открытия толл-рецепторов (TLR) появилась возможность понять сложные субклеточные механизмы регуляции цитокиногенеза и объяснить развитие фатальной по своей направленности воспалительной реакции при данной нозологии [R.Medzhitov,1997].

При ПН в результате гибели большого количества собственных клеток организма происходит высвобождение значительных концентраций эндогенных лиганд, что приводит к активации сигнальных путей TLR и запускает выработку провоспалительных цитокинов. Эволюция представлений о патогенезе ПН послужила пусковым механизмом появления целого направления в лечении, а именно антицитокиновой терапии. К сожалению, большинство экспериментальных и клинических исследований препаратов, обладающих цитокинингибирующей активностью, были изначально обречены на неудачу и не показали эффективности [C.J.Fisher, 1994; J.Norman, 1996; C.J.McKay,1997; J.Deviere,2001; C.D. Johnson,2001; N. Oruc, 2004]. Это можно объяснить плейотропностыо эффектов, оказываемых цитокинами. То есть ликвидация всего одного звена из целого каскада, изначально не может быть эффективна. Имеющиеся в арсенале хирурга средства не в состоянии обеспечить контроль над сильнейшей воспалительной реакцией, характеризующей течение ПН. Поэтому необходим поиск терапевтических возможностей коррекции повышенния активности рецепторов врожденного иммунитета и новых маркеров,

определяющих прогноз заболевания, а это невозможно без глубокого изучения субклеточных механизмов течения ПН.

Целью настоящего исследования явилось: экспериментально и клинически доказать необходимость внедрения антимедиаторной терапии в комплекс консервативного лечения больных панкреонекрозом. В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Оценить существующие модели панкреонекроза у крыс, основанные на внутрибрюшинном введении церулеина и комбинации выпаивания алкоголя с внутрибрюшинным введением церулеина.

2. Создать механическую модель панкреонекроза у крыс, сопровождающуюся массивным выбросом цитокинов в периферический кровоток и апробировать эффективность антимедиаторной терапии НПВС на данной модели.

3. Исследовать ингибирующее влияние антимедиаторной терапии лорноксикамом на стимулированную секрецию цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови здоровых доноров «in vitro».

4. Оценить воздействие антимедиаторной терапии на поверхностную и внутриклеточную экспрессию TLR 2 и TLR4 у больных панкреонекрозом в зависимости от тяжести исходного состояния.

5. Изучить влияние антимедиаторной терапии на секрецию цитокинов мононуклеарными клетками крови больных панкреонекрозом.

6. Проанализировать влияние антимедиаторной терапии на особенности течения панкреонекроза в фазу панкреатогенной токсемии.

7. Провести анализ воздействия антимедиаторной терапии на частоту развития гнойно-деструктивных осложнений панкреонекроза и определить прогностическую значимость системы TLR в данную фазу заболевания.

Научная новизна Церулеиновая и алкогольная модели у крыс приводят к развитию острого отечного панкреатита, а не панкреонекроза.

Разработана модель панкреонкроза у крыс, основатгая на частичной перевязке желчевыводящего протока, характеризующаяся наличием некротических изменений в поджелудочной железе и массивным выбросом цитокинов в периферический кровоток.

Получен профиль спонтанной и индуцированной лигандами TLR2 и TLR4 продукции провоспалительных (ФНОа, ИЛ-6, ИЛ-8) и противовоспалительных (ИЛ-10) цитокинов в культуре мононуклеарных клеток периферической крови больных панкреонекрозом в динамике заболевания, установлена его связь с течением заболевания.

Оценена поверхностная и внутриклеточная экспрессия TLR2 и TLR4 у больных панкреонекрозом в динамике заболевания; установлена связь между функциональной активностью системы TLR и развитием осложнений панкреонекроза.

В опытах in vitro доказано, что нестероидное противовоспалительное средство лорноксикам подавляет индуцированную лигандами TLR продукцию исследуемых цитокинов.

Показана клиническая эффективность антимедиаторной терапии у больных панкреонекрозом - лорноксикам значимо снижает экспрессию мРНК TLR2 и спонтанную продукцию провоспалительных цитокинов.

На основании анализа функциональной активности системы TLR показана возможность прогнозирования осложнений панкреонекроза.

Практическая значимость Модель панкреонекроза у крыс, созданная оперативным путем посредствам частичной окклюзии желчевыводящего протока, может быть рекомендована для оценки эффективности препаратов, обладающих цитокин-ингибирующей активностью.

Установлена частота развития системных осложнений фазы панкреатогенной токсемии и её зависимость от функциональной активности системы TLR. Проведение антимедиаторной терапии в комплексе лечебных мероприятий у больных панкреонекрозом позволяет снизить риск развития осложнений панкреатогенной токсемии и, таким образом, уменьшить летальность в данную фазу заболевания.

Выявленные изменения функциональной активности TLR на разных сроках заболевания у больных панкреонекрозом могут служить прогностическими критериями течения заболевания и развития осложнений. Так, с помощью этих показателей уже в начальном периоде можно прогнозировать развитие гнойно-деструктивных осложнений.

Внедрение в практику Разработанный метод лечения панкреонекроза внедрен в клиническую практику хирургических отделений городских клинических больниц № 55 и клиническом госпитале МСЧ МВД РФ по г. Москве. Полученные в ходе исследования данные применяются в научно-педагогической деятельности на кафедре экспериментальной и клинической хирургии РНИМУ им. Н.И.Пирогова.

Апробация работы

Основные положения и результаты проведенного исследования доложены на съездах гепатологов России и стран СНГ (Екатеринбург 2008, Уфа 2009, Москва 2010), 11 съезде хирургов Российской Федерации (Волгоград, 2011), 2 съезде хирургов гастроэнтерологов Российской Федерации (Геленджик 2012), научно-практических конференциях в Москве, Анапе, Пятигорске, Северодвинске, Твери, Бухаре (2008-2012), международных конференциях в Магдебурге 2011, Праге 2012. Материалы диссертации детально рассмотрены на научной конференции кафедры экспериментальной и клинической хирургии медико-биологического факультета Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова 22 февраля 2013 года.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 24 научных работы, из них 16 - в ведущих рецензируемых научных журналах.

Основные положения, выносимые на защиту

Церулеиновая и алкогольная модели острого панкреатита, оцененные в эксперименте, не вызывают некротических изменений ткани поджелудочной железы и не сопровождаются повышенной секрецией цитокинов. Оптимальной следует считать модель панкреонекроза, созданную у крыс посредствам частичной окклюзии желчевыводящего протока.

Поверхностная и внутриклеточная экспрессия TLR на мононуклеарах, а так же цитокиновый профиль являются существенными компонентами патогенеза панкреонекроза и во многом определяют клиническое течение заболевания.

Антимедиаторная терапия является патогенетически обусловленной составляющей лечебной тактики панкреонекроза и позволяет осуществлять коррекцию функциональной активности TLR, что благоприятно влияет на течение заболевания.

Структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 187 страницах машинописного текста и состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 108 источников (8 отечественных и 100 зарубежных). Диссертация иллюстрирована 41 таблицей и 51 рисунком.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Исследование включало экспериментальную и клиническую части. Экспериментальную часть выполняли в лаборатории биологических испытаний государственного естественно - научного института (г. Пущино Московской области).

В эксперименте использовали 90 самцов аутбредных крыс CD категории SPF в возрасте 12-14 недель. Основные правила содержания и ухода соответствовали нормативам, указанным в руководстве Guidefor Careand Use of Laboratory Animals. (ILAR publication, 1996, National Academy Press).

Для оценки эффективности антимедиаторной терапии подбирали адекватную модель ПН. Были апробированы церулеиновая, алкогольная и создана механическая модель.

Церулеиновую модель создавали путем внутрибрюшинного введения раствора церулеина в дозах 20, 40, 50, 60, 80 мкг/кг массы животного. Для получения алкогольной модели производили длительное (от 14 дней до 2,5 месяцев) выпаивание животным 10% раствора этилового спирта вместо питьевой воды. Трем животным для потенцирования эффекта алкоголя вводили раствор церулеина в дозе 40 мкг/кг.

Механическую модель создавали путем формирования неполного стеноза общего желчного протока. Девяти крысам в качестве дополнительного фактора агрессии вводили раствор церулеина в дозе 40 мкг/кг.

Методика создания собственной механической модели ПН

Крысу наркотизировали внутримышечной инъекцией смеси 5% кетамина и 2% ксилазина, фиксировали в спинном положении. Лапаротомию проводили в области правого подреберья. Осторожно извлекали двенадцатиперстную кишку с прилегающей соединительной тканью, на просвет находили общий желчный проток и накладывали на него лигатуру непосредственно вблизи стенки двенадцатиперстной кишки. Степень затягивания узла лигатуры контролировали при помощи инъекционных игл различного диаметра. Таким образом, достигался неполный механический стеноз общего желчного протока, что приводило к поступлению желчи в панкреатический проток и, как следствие, развитию ПН. При этом пассаж желчи сохранялся. Механической желтухи не возникало, что облегчает интерпретацию полученных результатов.

Антимедиаторную терапию у животных проводили НПВС «Лорноксикам» и «Кеторолак». Препараты вводили из расчета 1,6 мг/кг/сут.

Эвтаназию экспериментальных животных осуществляли помещением их в С02-камеру с последующим обескровливанием. Кровь забирали для исследования уровней а-амилазы, ACT, АЛТ и цитокинов. Определяли провоспалительные интерлейкины ИЛ-6, ФНО-а и противовоспалительный -ИЛ-10. После этого осуществляли забор внутренних органов для морфологического исследования. Поджелудочную железу извлекали целиком и фиксировали в 10% нейтральном формалине. Срезы окрашивали гематоксилином-эозином и исследовали методом световой микроскопии.

Методы исследования в эксперименте

Уровень амилазы измеряли в сыворотке крови стандартными реагентами Biolabo Reagents (Франция) на биохимическом анализаторе Ellipse AMS.

Активность аспартатаминотрансферазы (ACT) измеряли методом Karmenandal., в модификации Henryandal.

Активность аланинаминотрансферазы (АЛТ) измеряли методом Wrobleskiand La Due, оптимизированному Henryand Bergmeyer.

Определение цитокинов. Кровь для получения сыворотки набирали в пробирки с активатором свертывания (S1O2). После центрифугирования и полной ретракции сгустка, сыворотку собирали и хранили в течение 2-3 месяцев при температуре -70°С. Концентрацию цитокинов определяли методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих наборов фирмы e-Biosciences.

Анализ микропрепаратов проводили на микроскопе проходящего света DMLA Leica Германия.

Клиническую часть исследования выполняли в клинике кафедры экспериментальной и клинической хирургии медико-биологического факультета РНИМУ им. Н.И.Пирогова, располагающейся на базе городской клинической больницы № 55.

В рандомизированное проспективное исследование включены 334 пациента ПН в возрасте от 25 до 68 лет. Мужчин было 211 (63,2 %), женщин 123(36,8%).

Больные были разделены на две группы. У 246 больных группы сравнения проводилась только стандартная консервативная терапия ПН. 88 пациентов основной группы дополнительно в качестве антимедиаторной терапии получали препарат лорноксикам. Последний вводили внутривенно капелыю 2 раза в день в течение пяти суток от момента поступления в дозировке 32, 32,24,16 и 16 мг.

В соответствии с количеством баллов по шкале APACHE II пациенты каждой группы были разделены на 4 подгруппы (табл. 1), что соотносится с рекомендациям оценки тяжести ОП [M.S. Petrov, J.A. Windsor, 2010].

Таблица 1. Распределение больных по степени тяжести состояния (шкала APACHE II) на момент поступления___

Группы больных

Степень тяжести Всего Р

(в баллах по APACHE II) Основная (п-88) Сравнения (п-246)

Легкая (6-9 баллов) 15 (17%) 28 (11,4%) 43 (12,8%) 0,19

Средняя (10-14 баллов) 48 (54,5%) 134 (54,5%) 182 (54,5%) 0,71

Тяжелая (15-18 баллов) 11 (12,6%) 37 (15%) 48 (14,4%) 0,07

Крайне тяжелая (19-23 балла) 14 (15,9%) 47 (19,1%) 61 (18,3%) 0,44

Всего 88 (100%) 246 (100%) 334 (100%)

Пациенты сравниваемых групп были сопоставимы по полу, возрасту, длительности заболевания, выраженности сопутствующей патологии и степени тяжести состояния.

Методы обследования и лечения больных Лабораторная диагностика базировалась на общепринятых клинических и биохимических анализах, которые выполняли в лаборатории ГКБ № 55, принятыми в г. Москве и утвержденными стандартами методами.

Ультразвуковое исследование выполняли по стандартной методике на аппаратах Logiq 700 всем больным при поступлении в стационар и в динамике заболевания.

Компьютерная томография позволяла определять прямые и косвенные признаки ПН, уточнять объем некроза поджелудочной железы и парапанкреатической клетчатки, выявлять изменения характерных для гнойно-деструктивных форм. Исследование проводили на аппарате фирмы Simens.

Лапароскопия помимо основного метода инвазивной диагностики ПН, являлась и лечебным мероприятием, позволяя выполнить санацию и дренирование брюшной полости при ферментативном перитоните.

Консервативная терапия ПН включала следующие компоненты: анальгетическую, спазмолитическую терапшо, обеспечение функционального покоя ПЖ путем исключение питания через рот, аспирацию желудочного содержимого, медикаментозное подавление внешней секреции с использованием октрсотида по 100-300 мкг 3 раза в сутки, антиферментную терапию с в/в введением контрикала в суточной дозе 150-300 тыс. ЕД, инфузионную корригирующую терапию. Антибиотики назначали в качестве профилактики и для лечения гнойно-деструктивных форм ПН. Оптимальными препаратами считали: карбапенемы (тиенам, меронем), фторхинолоны (абактал), цефалоспорины IY поколения в сочетании с метронидазолом. Дозировка препаратов, длительность курса и путь введения были стандартными и определялись требованиями инструкции по применению используемых антибиотиков. Для профилактики развития грибковой суперинфекции назначали флуконазол (дифлюкан) в/венно. С целью детоксикации применялис форсированный диурез, аппаратные методы экстракорпоральной детоксикации - плазмаферез, гемодиафильтрацию.

Эндоскопическую папиллосфинсктеротомию применяли у больных билиарным ПН при вклинении конкремента в БДС. В основной группе вмешательство выполнено у 21 (23,9%) больных, в группе сравнения - у 38 (15,5%) (р=0,61).

В основной группе пункционные и дренирующие вмешательства под УЗ-контролем выполнены 3,4% больных, в группе сравнения 7,3 % (р=0,023).

Пункция и дренирование под УЗ-наведением применялась по поводу острых жидкостных скоплений, абсцессов для эвакуации содержимого, цитологического и микробиологического исследования. Использовался портативный ультразвуковой аппарат « Aloca», линейный датчик с частотой 300 МГЦ, иглы типа «Хиба» (G 16, G 18, G 20, G 22), фиксатор-направитель иглы, а также стилет-катетеры типа «Pig tail».

Санационная лапароскопия являлась самым частым вариантом оперативного пособия: 25 (28,4%) больных в основной группе, 94 (38,2%) в группе сравнения (р=0,126). Выполнялась одномоментно с диагностическим этапом исследования.

Видеоретроперитонеоскопию применили у двух пациентов с целью санации очагов некроза, секвестрэктомии и дренирования.

Открытые хирургические операции в основной группе выполнены у 5,7%, в группе сравнения у 6,5% больных (р=0,334). В качестве операционного доступа использовали люмботомию, срединную

лапаротомию различной протяженности, а также комбинацию лапаротомии и люмботомии, которые выполняли одновременно или последовательно. Оперативный прием сводился к вскрытию и санации очагов панкреатогенной деструкции - удалению свободно лежащих секвестров. В завершении операции у всех пациентов производилось дренирование забрюшинного пространства.

Методы исследования в клинике

Для определения эффективности антимедиаторной терапии оценивали следующие показатели: тяжесть течения ПН по шкале APACHE II, экспрессию мРНК - TLR2, TLR4, поверхностную экспрессию TLR2, TLR4, уровень цитокинов (ИЛ6, ИЛ8, ФНОа, ИЛ10), частоту осложнений фазы панкреатогенной токсемии и количество гнойно-деструктивных форм, общую летальность.

После забора периферической крови у здоровых доноров и больных ПН производили выделение суспензии мононуклеарных клеток (МНК) по методу Boyum. Затем МНК культивировали в полной среде RPMI 1640. В качестве лигандов TLR использовали следующие стимуляторы: липополисахарид (ЛПС), пептидогликан (ПГ). Контролем служили МНК, культивированные только в полной среде RPMI 1640. Концентрацию цитокинов, в полученных супернатантах, определяли методом ИФА с использованием коммерческих наборов для иммуноферментного анализа фирмы e-Biosciences.

Экспрессию молекул TLR2, TLR4 на поверхности клеток оценивали методом цитофлуориметрии на проточном цитометре FACSCan (Becton Dickinson, США).

Для выделения РНК из МНК периферической крови человека использовали коммерческие наборы "RNeasy Plus Mini Kit" производства фирмы QIAGEN.

При проведении реакции обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) использовали набор реагентов "High capacity RNA to cDNA Master mix", производства Applied Biosystems. Полученную кДНК использовали для проведения ПЦР. Затем производли постановку полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме реального времени (метод AACt). Анализ проводили на приборе 7500, Applied Biosystems.

Для определения всех выше описанных иммунологических параметров, забор крови производили у пациентов на 1,3,7,12 сутки стационарного лечения. У больных с гнойно-деструктивными осложнениями кровь забирали также на 21-е сутки.

Статистическую обработку результатов исследований производили в программном пакете Stat Soft Statistica 6.0 с использованием непараметрических критериев. Для сравнения групп по количественным признакам использовали U-критерий Манна-Уитни и критерий Вилкоксона. Различия показателей в группах считали статистически значимым при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Экспериментальная часть

Церулеиновая модель ОП. В результате однократного введения церулеина в дозировке 40 мкг/кг у крыс развивался интерстициальный отек паренхимы поджелудочной железы. Для изучения дозозависимого эффекта индукция ОП была осуществлена путем однократного введения церулеина в дозе 60 и 80 мкг/кг. Было обнаружено, что в этих дозах препарат не усиливает степень выраженности воспаления по сравнению с дозой 40 мкг/кг, очаги некроза не выявляли.

Для пролонгации стимуляции поджелудочной железы во времени с целью развития в ней деструктивных изменений, увеличили кратность введения церулеина. Препарат вводили в дозе 20 мкг/кг. 3-х кратно с интервалом в 1час. В результате, только у 30% крыс были зафиксированы участки некроза, при этом площадь деструкции была не более 3% по отношению ко всей паренхиме ПЖ. Дальнейшее увеличение дозировки церулеина до 40, 50, 60 мкг/кг с той же кратностью введения, также не привело к развитию некроза ПЖ. Кроме того, введение церулеина не сопровождалось статистически значимым увеличением уровня провоспалительных цитокинов (табл. 2).

Таблица 2. Сравнительные показатели уровня цитокинов у крыс после введения церулеина (20 мкг/мг, 3-х кратно)_

Группа ЮНО ИЛ6 ФНОа

Животные с введением церулеина 66,56±3* 117,88±12 13,73±7

Контроль 50,72±8* 127,27±14 19,80±6

"статистически значимые различия в показателях

Этанол-индуцированный ОП. При выпаивании животным 10% раствора этилового спирта вместо питьевой воды наблюдали гистологическую картину острого отечного панкреатита. Использование только алкоголя не сопровождалось увеличением секреции цитокинов (табл. 3).

Таблица 3. Сравнительные показатели уровня секреции цитокинов у крыс после выпаивания алкоголя и введения церулеина в дозе 40 мкг/кг

Группа ИЛ10 ИЛ6 ФНОа

Конц. Пг/мл Конц. Пг/мл Конц. Пг/мл

Алкоголь (2,5 мес.) 63,04±2 146,81±7 12,06±2

Алкоголь (14дней) + церулеин 59,15±4 142,25±7 13,63±5

Алкоголь (2,5мес.) + церулеип 68,13±8 224,24±5* 16,66±7

Контроль 50,72±8 127,27±14* 19,8±6

'статистически значимые различия в показателях

Повышение уровня ИЛ6 было отмечено только при комбинации алкоголя и церулеина.

Механическая модель ПН. Данная модель морфологически характеризовалась выраженными воспалительно-некротическими изменениями ткани ПЖ у всех животных. Дополнительное введение церулеина приводило к развитию тотального некроза. При анализе секреции цитокинов обнаружили, что механическая модель, дополненная введением церулеина, характеризуется статистически значимым увеличением секреции цитокинов по сравнению с предыдущими моделями (табл. 4).

Таблица 4. Сравнительные показатели уровня секреции цитокинов у крыс с ПН до и после проведения антимедиаторной терапии _

Группа ИЛ10 ИЛ6 ФНОа

Операция 67,28±5 320,28±11 32,37±14

Операция + церулеин (через 3 дня после операции) 72,39±11* 457,19±25* 34,62±9*

Операция + церулеин+ Кеторолак (3 дня) 60,52±7** 89,09±11 15,3±13**

Операция + церулеин + Лорноксикам (3 дня) 47,6б±7** 115,45±4 7,27±4**

Контроль 50,72±8* 127,27±14* 19,8±6*

♦статистически значимые различия отдельных цитокинов по отношению к контролю

** статистически значимые различия отдельных цитокинов при введении кеторолака и лорноксикама

Поэтому для оценки эффективности антимедиаторной терапии была использована модель ПН с частичной перевязкой общего желчного протока, дополненная введением церулеина в дозе 40 мкг/кг.

При введении животным кеторолака и лорноксикама (1 раз сутки в течении 3 дней в дозе 1,6 мг/кг/сут), оказалось, что оба препарата обладают ингибирущим эффектом на синтез цитокинов (табл. 4). Происходило снижение концентраций всех изучаемых цитокинов (ИЛ10, ИЛ6, ФНОа). Однако снижение продукции цитокинов (ИЛ10, ФНОа) при введении лорноксикама было статистически значимо более выражено, чем у кеторолака. Поэтому в клиническом разделе работы предпочтение было отдано именно лорноксикаму.

Клиническая часть

В исследовании in vitro влияния лорноксикама на продукцию цитокинов МНК периферической крови здоровых доноров под действием лигандов TLR было обнаружено, что препарат достоверно ингибирует выработку как провоспалительных цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-8, ФНОа), так и противовоспалительного цитокина ИЛ-10. Максимальный ингибирующий эффект (до 90%) препарат оказывал в дозировке 150 мкг/мл (табл. 5).

Таблица 5. Результаты ингибирования выработки цитокинов in vitro препаратом «Лорноксикам»

Цптокины Лиганды Стимулированная выработка (пг/мл) Ингибирование (%)

Лорноксикам 10 мкг/мл Лорноксикам 100 мкг/мл Лорноксикам 150 мкг/мл

ФНОа ЛПС 612±2б2 не влияет 12,85±8,72 33,43±29,77

ПГ 1050±581 не влияет 29,71±13,27 70,86±19,96*

ИЛ-6 ЛПС 1736±443 9,35±6,09 4,76±3,64 29,47±7,29

ПГ 1624±615 13,09±7,09 15,05±4,18 50,22±26,11*

ИЛ-8 ЛПС 11153*4050 7,41±5,67 36,50±31,44 60,63±22,51*

ПГ 9958±4316 10,93±6,55 43,16±28,53 70,63±12,67*

ИЛ-10 ЛПС 84±61 не влияет 50,45±30,93 80,82±18,37*

ПГ 36423 13,97±8,24 18,25±14,34 8б,92±8,88*

Данные в таблице представлены в виде Ма,

* - достоверность различий с уровнем значимости а=0.05

Проанализирована эффективность антимедиаторной терапии у пациентов ПН в зависимости от тяжести исходного состояния.

У больных с легкой степенью тяжести исходного состояния (п-43) в обеих исследуемых группах заболевание протекало достаточно благоприятно. Осложнений не наблюдали. Летальных исходов не было. Статистически значимых различий в баллах по шкале АРАСНЕН, а так же в исследуемых показателях в динамике заболевания между группами больных не отмечено.

У больных средней степени тяжести исходного состояния (п=182) в показателях экспрессии мРНК ТЫ12 и ТЫН, поверхностной экспрессии Т1Л12, ТЬК4 статистически значимой разницы между группами не обнаружено. При определении секреции цитокинов наблюдали статистически значимое снижение уровня ФНОа, ИЛ6, ИЛ8 у больных, получавших антимедиаторную терапию на 3-й сутки стационарного лечения.

С ухудшением тяжести состояния увеличивалось число пациентов с осложнениями панкреатогешюй токсемии (табл. 6). В основной группе (п=48) системные осложнения панкреатогенной токсемии наблюдались у 31 (64,6%) больного, в группе сравнения (п=134) у 93 (69,4%) больных (р=0,512).

Таблица 6. Системные осложнения панкреатогенной токсемии у больных средней степени тяжести исходного состояния _

Вид осложнения панкреатогенной токсемии Основная группа (п-88) Группа сравнения (п-134)

ОССН 0 2(1,5%)

ОПН 11(12,5%) 36(26,9%)

Интоксикационные расстройства сознания 2 (2,3%) 10 (7,5%)

Недостаточность ЖКТ 18 (20,5%) 49 (36,6%)

ОДР, в том числе с лечением ИВЛ 0 1 (0,74%)

Острая печеночная недостаточность 10(11,4%) 31(23,1%)

Панкреатогенный шок 0 1 (0,74%)

Всего 31 (64,6%) . 93 (69,4%)

Гнойно-деструктивные формы ПН у больных средней степени тяжести исходного состояния в основной группе отмечены у 1 (2,1%), в группе сравнения у 7 (5,2%) больных.

В основной группе были оперированы 13 пациентов (27,1%), в группе сравнения 64 (47,8%) (р=0,012). Основными видами оперативных вмешательств в 1 и 2 группах в данной категории больных были санационные лапароскопии (25%) и (40,3%) соответственно и пункционно-дренирующие вмешательства под УЗИ-контролем - (7,5%) во 2 группе. В основной группе пункционно-дренирующие вмешательства не выполнялись. Традиционные открытые вмешательства выполнены по поводу гнойно-деструктивных осложнений у 1 (2,1%) и 3 (2,3%) больных 1 и 2 группы соответственно.

Летальных исходов в основной группе не было. В группе сравнения умерло 3 больных (2,2%). У всех пациентов средней степени тяжести исходного состояния группы сравнения, летальные исходы явились следствием системных осложнений панкреатогенной токсемии.

На 7 сутки стационарного лечения, средний балл по шкале АРАСНЕП у больных основной группы был статистически значимо ниже, чем в группе сравнения (р=0,012). Это свидетельствует о положительном влиянии антимедиаторной терапии на динамику заболевания.

У больных тяжелой степени исходного состояния (п=48) экспрессия мРНК ТЦ12 на 1-е сутки в 40 раз превышала показатели здоровых доноров. В дальнейшем происходило ее снижение, причем более интенсивно (р=0,126) в группе больных, получавших антимедиаторную терапию. Экспрессия мРНК ТЫ14 также характеризовалась повышением во все временные промежутки, но статистически значимых различий между группами не отмечено.

Единственное статистически значимое повышение поверхностной экспрессии относительно нормы наблюдали в группе сравнения на 3-й сутки для TLR2 (р=0,126).

При анализе уровня цитокинов на фоне проведения антимедиаторной терапии отмечали статистически значимое снижение секреции ФНОа, ИЛ8, ИЛ6 на 3 и 7 сутки (р=0,012).

У всех больных тяжелой степени исходного состояния в ходе лечения отмечено развитие одного или нескольких системных осложнений панкреатогенной токсемии (табл. 7). Причем, панкреатогенный шок, как самое тяжелое из них, встречался у 1 (9,1%) и 9 (24,3%) больных 1 и 2 групп соответственно (р=0,016).

Таблица 7. Системные осложнения панкреатогенной токсемии у больных тяжелой степени тяжести исходного состояния_

Вид осложнения панкреатогенной токсемии Основная группа (п-11) Группа сравнения (п-37)

ОССН 2(18,2%) 13 (35,1%)

ОПН 5 (45,5%) 21 (56,7%)

Интоксикационные расстройства сознания 2(18,2%) 8 (21,6%)

Недостаточность ЖКТ 9 (81,8%) 31(83,8%)

ОДН, в том числе с лечением ИВЛ 4(36,4%) 13 (35,1%)

Острая печеночная недостаточность 5 (45,5%) 17 (45,9%)

Панкреатогенный шок 1 (9,1%) 9 (24,3%)

У 2 больных основной группы (18,2%) развились гнойно-деструктивные осложнения. Забрюшинная панкреатогенная флегмона (ЗПФ) диагностирована у 2 (5,4%) пациентов группы сравнения.

В основной группе больных тяжелой степени было оперировано 7 (63,7%), в группе сравнения 23 (62,2%). Основным вмешательством была санационная лапароскопия, выполненная у 5 (45,5%) больных основной группы и 18 (48,6%) группы сравнения. Пункционно-дренирующие операции под контролем УЗИ произведены у 2 (18,2%) и 4 (10,8%) 1 и 2 групп соответственно. Открытые вмешательства выполнены у 2 больных (18,2%) в основной группе и у 3 пациентов (8,1%) в группе сравнения.

В основной группе тяжелой степени тяжести исходного состояния скончался 1(9,1%) больной. В группе сравнения умерло 15 (40,5%). Причиной смерти пациента в основной группе явился панкреатогенный шок. В группе сравнения у 9 (24,3%) пациентов - развитие ПОН, панкреатогенного шока. 2 (5,4%) больных скончались от гнойно-деструктивных осложнений ПН. А у 4 (10,8%) пациентов, несмотря на асептическое течение ПН, смерть наступила от хронической алкогольной интоксикации с поражением органов мишеней.

Данные динамики среднего балла по шкале АРАСНЕП у пациентов с тяжелой степенью исходного состояния свидетельствуют о наличии статистически значимой разницы между группами уже на 7-е сутки

стационарного лечения (р=0,025), что говорит о более благоприятном течении заболевания больных основной группы.

При анализе результатов лечения в обеих группах пациентов крайне тяжелой степени исходного состояния (п=61), обращала на себя внимание высокая летальность в ранние сроки стационарного лечения. Поэтому проследить динамику исследуемых показателей в течение всего периода наблюдений было не всегда возможно.

В 1-е сутки стационарного лечения экспрессия мРНК ТЫ12 была повышена более чем в 40 раз. В динамике заболевания наблюдалось статистически значимое снижение экспрессии мРНК ТЦ12 в основной группе. Значимых различий в экспрессии мРНК ТЬЯ4 в динамике заболевания не выявлено.

Интенсивность поверхностной экспрессии ТЬЯ2 и Т1Л14 статистически значимо в группах не различалась. Обращала внимание изначально низкая степень поверхностной экспрессии ТЬЯ2 в обеих группах больных по отношению к здоровым донорам.

При анализе уровня цитокинов отметили двукратное повышение ФНОа, ИЛ6, ИЛ8 в первые сутки заболевания в обеих группах. В дальнейшем секреция ИЛ6 в основной группе статистически значимо снижалась на 3,7, а ФНОа и ИЛ8 и на 12-е сутки стационарного лечения.

Таблица 8. Системные осложнения панкреатогенной токсемии у больных крайне тяжелой степени исходного состояния__

Вид осложнения панкреатогенной токсемии Основная группа (п-14) Группа сравнения (п-47)

ОССН 10 (71,4%) 34 (72,3%)

ОПН 12 (85,7%) 42 (89,4%)

Интоксикационные расстройства сознания 5 (35,7%) 24 (51,1%)

Недостаточность ЖКТ 3 (21,4%) 36 (76,6%)

ОДН, в том числе с лечением ИВЛ 5 (35,7%) 14 (29,8%)

Острая печеночная недостаточность 4 (28,6%) 13 (27,7%)

Панкреатогенный шок 5 (35,7%) 20 (42,6%)

Все пациенты обеих групп крайне тяжелой степени имели комбинации 2-х или более системных осложнений панкреатогенной токсемии (табл. 8).

ПОН наблюдали у 5 (35,7%) больных основной группы и у 20 (42,6%) группы сравнения (р=0,212). Комбинация ОССН, ОДН, ОПН и недостаточности ЖКТ возникла у 3 (21,4%) больных основой группы и у 9 (19,1%) больных группы сравпения (р=0,326).

Гнойно-деструктивные формы ПН отмечены у 2 (14,3%) больных основной группы и 10 (21,3%)больных группы сравнения (р=0,126).

Из всех больных крайне тяжелой степени оперированы в основной фуппе 10 (71,4%), в группе сравнения 37 (78,7%). Пункционно-дренирующие вмешательства были выполнены у 1 (7,1%) больного основной группы и у 4 (8,5%) группы сравнения.

Общая летальность в группе пациентов, в комплексном лечении которых применялась антимедиаторная терапия, составила 35,7%. У всех 5 пациентов основной группы причиной смерти была ПОН. В группе сравнения умерло 35 (74,5%) пациентов (р=0,003). Преобладающее количество летальных исходов было связано с развитие^ системных осложнений панкреатогенной токсемии (панкреатогенный шок, ОДН, ОПН) -31 (65,9%) пациентов.

При анализе изменений среднего балла по шкале АРАСНЕП оказалось, что статистически значимая разница между группами появляется уже на 3-й сутки стационарного лечения. В дальнейшем, средний балл в группе сравнения был достоверно выше, чем в основной группе. Это свидетельствует о более благоприятном течении заболевания у больных, получавших антимедиаторную терапию.

Таким образом, в группе сравнения суммарно по всем категориям степени тяжести общая летальность составила 21,5% (53 больных). В основной группе умерло 6 больных (6,8%) (р=0,003). Основной причиной наступления летальных исходов в обеих группах были различные осложнения панкреатогенной токсемии.

При анализе показателей функциональной активности системы ТЬЫ был обнаружен ряд особенностей. Так, уровни спонтанной секреции ФНОа, ИЛ6, ИЛ8 имели значительный разброс значений внутри групп. Тоже касалось интенсивности поверхностной и внутриклеточной экспрессии Т1Л12.

Эта особенность является следствием стратификации на четыре группы тяжести исходного состояния в соответствии с интегральными шкалами. В то же время у пациентов в каждой из групп превалируют различные формы заболевания. Так, самое большое количество инфицированных форм наблюдали в группе больных крайне тяжелой степени, а в других группах преобладали различные асептические проявления.

Это наводит на мысль, что иммунологические показатели должны коррелировать не только с тяжестью состояния, но и иметь свои особенности в зависимости от формы ПН. Поэтому мы решили исследовать функциональную активность системы ТЬЯ у пациентов с различными проявлениями панкреатогенной токсемии и гнойно-деструктивными осложнениями.

Осложнения панкреатогенной токсемии развились у 172 (51,5%) из 334 пациентов (табл. 9).

Таблица 9. Частота осложнений панк| эеатогенной токсемии

Вид осложнения панкреатогенной токсемии Основная группа (п-88) Группа сравнения (п-246) Р

ОССН 12 (13,6%) 49(19,9%) 0,191

ОПН 28(31,8%) 99(40,2%) 0,163

Интоксикационные расстройства сознания 9 (10,2%) 42(17,1%) 0,126

Недостаточность ЖКТ 30 (34,1%) 116 (47,2%) 0,034

ОДН, 9 (10,2%) 28(11,4%) 0,767

Острая печеночная недостаточность 19(21,6%) 61 (24,8%) 0,546

Панкреатогенный шок 6 (6,8%) 30 (12,2%) 0,276

Всего 31 (35,2%) 141 (57,3%) 0,00034

Летальность 6 (6,8%) 47(19,1%) 0,006

При этом ОССН диагностирована у 61 пациента, ОПН у 127, интоксикационный делирий у 51, недостаточность ЖКТ, проявившаяся парезом кишечника у 146, респираторный дистресс синдром, потребовавший коррекции ИВ Л у 37, острая печеночная недостаточность у 80 больных. Общее количество больных в основной группе с наличием тех или иных осложнений панкреатогенной токсемии составило 31 (35,2%), в группе сравнения - 141 (57,3%), т.е. данный показатель различался статистически значимо между группами (р=0,00034).

У больных с осложнениями панкреатогенной токсемии мы наблюдали максимальные значения ФНОа на 1-е сутки, среди всех больных с ПН. Это соотносится с представлениями, что ФНОа является одним из основных эффекторных цитокинов, обладающих непосредственным воздействием на ткани за счет активации апоптоза. Именно избыточная концентрация данного цитокина обуславливает тяжесть системных осложнений ПН в начале заболевания. Уровень ФНОа у больных группы сравнения на 3-й сутки достигал своего максимума. То же наблюдали в отношении внутриклеточной и поверхностной экспрессии TLR2. Это можно объяснить улучшением в микроциркуляторном русле на 3 сутки и изменениями параметров гемодинамики. Кровь начинает поступать в зоны панкреатогенной деструкции, которые ранее были малодоступны для перфузии. В результате реперфузии в кровоток попадает большое количество DAMP со всеми вытекающими последствиями. Исходя из этих представлений, пятидневный курс антимедиаторной терапии является наиболее оправданным. Кроме того, данный цитокин может быть маркером выраженности ССВР, что позволяет прогнозировать высокую вероятность развития органной недостаточности. Снижение спонтанной выработки ФНОа в динамике заболевания может служить фактором благоприятного прогноза течения ПН.

Немаловажным является тот факт, что при введении лорноксикама не наблюдается снижения внутриклеточной и поверхностной экспрессии TLR2 до показателей, полученных у здоровых доноров. Таким образом, клетка сохраняет потенциал для возможного ответа при появлении экзогенного (микробного) фактора - при нагноении. То есть, иммунная защита находится в паритете. Т.к. чрезмерное повышение внутриклеточной и поверхностной экспрессии TLR2 опасно ввиду возможности развития чрезмерного по силе воспалительного ответа, но и недостаток может привести к формированию неполноценной защиты против экзогенных факторов.

У пациентов основной группы обнаружили значимое снижение спонтанной и индуцированной ПГ продукции ФНОа, ИЛ6, ИЛ8, а так же снижение поверхностной и внутриклеточной экспрессии Т1Л2 уже на 3-й сутки стационарного лечения. Что касается ТЫ14 рецепторов, статистически значимой разницы во внутриклеточной и поверхностной экспрессии между группами не было. Отмечено снижение мРНК ТЦ14 в динамике. Поверхностная же экспрессия Т1Л14 у этих больных была повышена, но в течение заболевания не менялась.

Кроме того, была выявлена одна особенность, указывающая на наличие собственных внутриклеточных механизмов регуляции интенсивности воспалительной реакции. Речь идет о диссонансе в уровне повышения внутриклеточной и поверхностной экспрессии в группах. Количество мРНК ТЬЮ. у больных ПН увеличивалось примерно в 40 раз по отношению к здоровым донорам, а количество Т1Ж2 на поверхности увеличивалось лишь в 2 раза. То есть клетка каким-то образом препятствует встраиванию в мембрану еще большего количества ТЫ12. Ведь теоретически, чем больше ТЫ12 на поверхности клетки, тем с большим количеством эндогенных лиганд может произойти взаимодействие и тем большим выбросом количества цитокинов это должно завершиться. В чем причина такого несоответствия повышения поверхностной и внутриклеточной экспрессии ТЬЫ2 в рамках исследования нам установить не удалось. Можно лишь предположить, что кроме ТЪЯ2, действующих на поверхности клетки, существуют еще и внутриклеточные формы ТЬЯ, которые пока для определения недоступны.

Следует признать, что повышение внутриклеточной и поверхностной экспрессия является прогностически неблагоприятным фактором

риска развития осложнений панкреатогенной токсемии. Пациенты с изначально высоким уровнем экспрессии мРНК ТЫ12 имеют более высокий риск развития системных осложнений панкреонекроза. Снижение показателя в динамике заболевания ассоциируется с более благоприятным течением ПН - у таких пациентов наблюдается быстрое купирование проявлений ССВР.

В основной группе от осложнений панкреатогенной токсемии умерло 6 больных (6,8%), во всех случаях причиной смерти явилось развитие ПОН. Во второй группе ПОН, приведшая к смерти, имела место у 47 (19,1%) пациентов. То есть, между группами выявлено статистически значимое различие (р=0,006) в частоте развития фатальной ПОН как осложнения панкреатогенной токсемии.

Таким образом, включение в комплекс консервативных мероприятий антимедиаторной терапии у больных ПН позволяет добиться снижения количества осложнений панкреатогенной токсемии и летальности.

Гнойно-деструктивные осложнения ПН отмечены у 25 (7,5%) больных. При этом в основной группе было 5 пациентов (5,7%). У 4 больных имело место развитие ЗПФ, у 1 гнойный перитонит. В группе сравнения гнойные формы ПН зафиксированы у 20 больных (8,1%).

Панкреатогенный абсцесс (ПА) был диагностирован у 13 больных (1-я группа - 1(1,1%); 2-я - 12(4,9%)), что составило 3,9 % среди всех больных ПН и 52% среди больных с гнойными осложнениями ПН.

ПА как единственное гнойно-деструктивное осложнение наблюдался у 4 (30,8%) больных, умерших среди них не было. Характерным было сочетание ПА с другими гнойно - деструктивными осложнениями, в том числе перитонитом у 5 (38,5%) больных, аррозионным кровотечением у 3 (23,1%). Умер 1 больной, у которого наблюдался прорыв ПА в брюшную полость с развитием фибринозно-гнойного перитонита.

В частоте развития гнойно-деструктивных осложнений между группами больных, статистически значимые различия отсутствовали (р=0,12б). Поэтому можно говорить о том, что проведение антимедиаторной терапии не влияло на частоту развития гнойно-деструктивных осложнений ПН.

Единственные значимые различия в показателях функциональной активности ТЫ1 наблюдали у больных с ЗПФ. Для правильной оценки параметров функциональной активности Т1Л больные с данным гнойно-деструктивным осложнением ретроспективно разделены на две группы. В первую группу вошли пациенты с неблагоприятным исходом, вторую группу составили выжившие больные (благоприятный исход). Такой способ анализа показателей нам представляется наиболее обоснованным, так как единственным критерием эффективности проводимой терапии у данной группы пациентов является исход заболевания.

Реализация эффекторных функций мононуклеарных клеток может быть осуществлена путем сложного внутриклеточного каскада, инициация которого начинается с взаимодействия ЛПС с ТЬИ. расположенным на поверхности клетки. Этот механизм противомикробной защиты является особенно важным в начальной стадии инфицирования. Так как активированные фагоцитарные клетки в тканях обеспечивают «врожденную резистентность» именно в тот период, когда еще только развивается Т-клеточный иммунитет. Поэтому можно предположить, что именно Т1Л в механизмах инфицирования зон панкреатогенной деструкции выступают в качестве «первой линии обороны». И при недостаточном уровне экспрессии не в состоянии обеспечить полноценной защиты от микробной агрессии именно в начале заболевания. Выше сказанное вполне подтверждается данными нашего исследования - у больных с гнойно-деструктивными осложнениями ПН начальный период заболевания характеризовался снижением поверхностной экспрессии ПЛ12 и ТЫ14 и относительным снижением экспрессии мРНК этих рецепторов. В то время как 21-е сутки характеризовались максимальными показателями поверхностной и внутриклеточной экспрессии Т1Д1 в группе больных с благоприятным исходом. Что позволяет говорить о том, что на данный период времени иммунная система только переходит в состояние компенсации после первичной многофакторной агрессии и иммунокомпетентные органы способны под держивать достаточный уровень защитных реакций, которые в эти сроки еще не истощились до степени развития вторичного

иммунодефицита. Кроме того в эти сроки осложнения панкреатогенной токсемии и их последствия купированы, процессы секвестрации и демаркации некрозов от окружающих тканей позволяют рассчитывать если не на полное, то на их частичное удаление секвестров. Здесь также необходимо отметить, что лучшие результаты отмечены именно у больных, оперированных к концу 3-ей недели заболевания. Таким образом, базируясь на полученных данных, следует выделять третью неделю от начала заболевания в качестве оптимального периода времени для хирургического лечения ЗПФ.

В обеих группах больных ПН с гнойно-деструктивными осложнениями показатели спонтанной продукции ФНОа в 1,3 и 7-е сутки статистически значимо не отличались от показателей, полученных в группе здоровых доноров. С одной стороны, установленным фактом является доминирующая роль ФНОа в септическом шоке, так как его системный уровень влияет на продолжительность сепсиса и ассоциируется с поражением многих органов и летальностью. С другой стороны нейтрализация или отсутствие ФНОа показывает, что защита организма от микробных патогенов нарушена. В нашем исследовании снижение стимулированной выработки ФНОа у больных с гнойными осложнениями ПН как раз указывает на неспособность иммунной системы к полноценному ответу на бактериальную агрессию, что подтверждается сниженным уровнем стимулированной ПГ продукции ФНОа, единственное относительное повышение которой зарегистрировано в группе с благоприятным исходом заболевания на 21-е сутки. ФНОа также привлекает в очаг размножения бактерий воспалительные клетки путем индукции экспрессии хемокшюв, поэтому должен играть одну из ключевых ролей в процессе формирования панкреатогенного инфильтрата и отграничения очага деструкции. У больных с забрюшинной панкреатогенной флегмоной напротив процесс ни чем не отграничен и распространяется по клетчаточным пространствам. Одной из причин запуска выше описанного механизма может также являться недостаточная продукция изучаемого цитокина. Таким образом, можно говорить, что отсутствие повышения спонтанной и стимулированной продукции ФНОа в динамике заболевания является прогностически не благоприятным фактором в отношении риска развития гнойно-деструктивных осложнений ПН.

У пациентов с ЗПФ обнаружены высокие показатели продукции МНК ИЛ6 в начале заболевания среди всех пациентов с ПН. Данные изменения указывают на возможную двоякую роль ИЛ6 в воспалительном процессе. То есть ИЛ6 в начале заболевания выступает как активатор защитных реакций, проявляя провоспалительные свойства. И в данном аспекте его биологическая активность должна быть направлена на активацию Т-лимфоцитов. Но у пациентов с панкреатогенной забрюшинной флегмоной мы видим напротив прогрсссирование гнойного воспаление, в том числе из-за нарушения формирования воспалительного лейкоцитарного вала. То есть, сверх сильная продукция ИЛб может выполнять иммунорегуляторную

функцию и по типу обратной связи заглушать воспалительный ответ. В этом и состоит двоякость ИЛ6 - обладание как про- так и противовоспалительными биологическими эффектами.

Таким образом, сверхсильная выработка ИЛ6 МНК в начальном периоде ПН может являться прогностически - неблагоприятным фактором развития в последствии неотраниченного гнойно-деструктивного процесса. Кроме того, снижения изучаемого показателя в динамике заболевания может рассматриваться как фактор благоприятного течения заболевания.

Повышение выброса ИЛ8 МНК больных ПН не может служить маркером процессов инфицирования. Ключевым в этом вопросе является дискутабельность времени инициации процессов инфицирования очагов панкреатогенной деструкции. Считается, что у больных ПН это конец 2-ой — 3-я недели заболевания. Но в экспериментальных исследованиях на животных установлено, что бактериальная транслокация начинается уже через 30 мин. после индукции ПН. Если предположить, что у больных ПН процессы транслокации бактерий из ЖКТ могут происходить уже в начальном периода заболевания то, учитывая основную функцию ИЛ8 (миграция нейтрофилов в очаг воспаления), низкий уровень ИЛ8 в начале заболевания может служить прогностически неблагоприятным фактором развития гнойно-деструктивных осложнений. С другой стороны необходимо понимать, что чрезмерный выброс ИЛ8 может привести к накоплению лейкоцитов и нейтрофильному повреждению тканей.

У больных с гнойно-деструктивными осложнениями ПН в течении всего периода наблюдения показатели секреции ИЛ 10 были ниже, чем у здоровых доноров.

Таким образом, нами были обнаружены существенные отличия в параметрах функциональной активности системы Т1Л1 между пациентами с различным клиническим течением ПН. Поэтому, можно говорить о том, что интенсивность поверхностной и внутриклеточной экспрессии ТТЛ на МНК, цитокиновый профиль, являются существенными компонентами патогенеза панкреонекроза и во многом определяют клиническое течение заболевания. Использование данных показателей возможно не только в качестве прогностических критериев течения заболевания, но и в качестве мишеней для терапевтического воздействия. Поэтому диагностическая и лечебная тактика у больных ПН должна строиться с учетом оценки функциональной активности системы Т1Л, что является эффективным не только в прогнозировании, но и в лечении данных пациентов. Антимедиаторная терапия в нашем исследовании привела к существенному улучшению результатов лечения данной категории пациентов.

Выводы

1. Внутрибрюшинное введение церулеина у крыс не приводит к развитию панкреонекроза и не сопровождается повышенной секрецией цитокинов. При этом выраженность воспалительных изменений в поджелудочной железе не зависит от дозы вводимого церулеина. При сочетании выпаивания алкоголя с внутрибрюшинным введением церулеина у крыс так же развивается острый отечный панкреатит.

2. Предложенная механическая модель приводит к развитию панкреонекроза и характеризуется массивным выбросом цитокинов в периферический кровоток. Эти изменения усугубляются при дополнительном внутрибрюшинном введении церулеина в дозе 40 мкг/кг. Внутривенное введение лорноксикама и кеторолака в эксперименте способствует статистически значимому снижению продукции цитокинов, а ингибирующее влияние лорноксикама на этот процесс выше, чем у кеторолака.

3. Лорноксикам достоверно ингибирует стимулированную секрецию цитокинов мононуклеарными клетками здоровых доноров «in vitro». Максимальный ингибирующий эффект наблюдается в концентрации 150 мкг/мл.

4. У всех больных панкреонекрозом до начала лечения наблюдали повышение экспрессии мРНК TLR2 прямо пропорционально исходной тяжести состояния. При этом у больных, получавших антимедиаторную терапию, экспрессия мРНК TLR2 снижалась уже на 3-й сутки. Экспрессия мРНК TLR4 статистически значимо не менялась.

5. Начальный период панкреонекроза характеризуется повышением секреции провоспалительных цитокинов (ИЛ6, ИЛ8, ФНОа). У больных, получавших антимедиаторную терапию, на 3-й сутки лечения отмечается статистически значимое снижение продукции провоспалительных цитокинов. Статистически значимых колебаний в секреции противовоспалительного цитокина ИЛ10 в динамике заболевания не получено.

6. В 1 сутки фазы панкреатогенной токсемии наблюдается значительное повышение спонтанной секреции ФНОа и увеличение экспрессии мРНК TLR2. При этом применение антимедиаторной терапии снижает частоту развития системных осложнений и легальность в 2,8 раза.

7. Значительное повышение спонтанной секреции ИЛ-б и снижение поверхностной экспрессии TLR2 в 1 сутки являются прогностически неблагоприятными факторами риска развития гнойных осложнений. Антимедиаторная терапия статистически значимо не влияла на частоту гнойных осложнений панкреопекроза.

Практические рекомендации

1. Модель панкреонекроза у крыс, созданная оперативным путем посредствам частичной окклюзии желчевыводящего протока, может быть

рекомендована для оценки эффективности препаратов, обладающих цитокин-ингибирующей активностью.

2. Диагностическая и лечебная тактика у больных ПН должна строиться с учетом оценки функциональной активности системы НЛ*, что является эффективным в прогнозировании и выявлении типичных осложнений данного заболевания.

3. Всем больным панкреонекрозом не позднее первых 3-х суток от начала заболевания показано проведение антимедиаторной терапии. Последняя осуществляется посредствам внутривенного введения лорноксикама 2 раза в сутки в течение 5 дней в суточной дозировке 32,32,24,16,16 мг. соответственно.

4. Значительное повышение внутриклеточной экспрессии ТЬ112 и синтеза мононуклеарами ФНОа у больных панкреонекрозом в первые сутки должно рассматриваться как ранний маркер развития тяжелых осложнений панкреатогенной токсемии.

5. Снижение экспрессии мРНК ТЫ12 в динамике указывает на более благоприятное течение панкреонекроза. В подобных случаях можно прогнозировать быстрое купирование проявлений ССВР и ПОН. Низкая экспрессия и снижение эффекторной функции ТЫ12 и ТЫ14 на 1 неделе заболевания может служить прогностическим критерием развития гнойных осложнений ПН.

6. Повышение экспрессии и эффекторной функции ТЬЯ2 с 12-х суток у больных с гнойно-деструктивными осложнениями панкреонекроза является благоприятным прогностическим критерием течения заболевания. Исходя из оценки этих параметров, третью неделю от начала заболевания следует рассматривать как оптимальный срок для хирургического лечения забрюшинной флегмоны.

7. Лечение пнкреатогенных абсцессов следует начинать с дренирования под УЗ-наведением. При неэффективном дренировании, наличии крупных секвестров - показана открытая операция.

8. Миниинвазивные вмешательства в лечении забрюшинной флегмоны не должны рассматриваться как самостоятельный метод. В подобных случаях показано вскрытие, санация, дренирование зоны деструкции и проведение санационных програмированнных релапаротомий.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. В.А.Горский, Э.Р.Ованесян, В.А.Индароков, М.А.Агапов / Обоснование включения нестероидных противовоспалительных препаратов в комплексную терапию острого деструктивного панкреатита // Consilium medicum, Хирургия. 2009,- № 1. - С. 47-51

2. Б.К.Шуркалин, В.А.Горский, М.А.Агапов / Антимедиаторная терапия в комплексном лечении острого деструктивного панкреатита // Материалы XI съезда хирургов РФ. Новые идеи и технологии в хирургии. Волгоград. 2011. -С. 410

3. МА.Агапов, В.А.Горский, МЛЗ.Хорева, Э.Р.Ованесян, А.С.Варивода / Роль цитокинов в развитии острого панкреатита // Анналы хирургической гепатологии М. 2009.- Т.14. № 3.- С.80-85

4. В.А.Горский, М.ААгапов, А.В.Воленко / Эффективность применения антимедиаторной терапии в комплексном лечении острого деструктивного панкреатита // III Съезд хирургов северо-запада России. Северодвинск. 2011 .С. 6

5. М.В.Хорева, ЛЛЗ.Ковальчук, А.С.Варивода, В.В.Греченко, М.А.Агапов, В.А.Индароков, И.В.Леоненко, В.А.Горский / Влияние ингибитора циклооксигеназы на опосредованную через TLR2 и TLR 4 выработку цитокинов мононуклеарными клетками человека в норме и при остром панкреатите // Российский иммунологический журнал М. 2009. - том 3(12).- №3-4.- С. 294-302

6. В.А.Горский, ВА.Индароков, М.А.Агапов / Первый опыт применения препарата «Ксефокам» в лечении острого деструктивного панкреатита // Сборник научных трудов «Современные хирургические технологии» ЦКБ РАН, РГМУ. Москва 2009. - С. 57

7. Л.В.Ковальчук, М.В.Хорева, А.С.Варивода, В.В.Греченко, М.А.Агапов, В.А.Индароков, И.ВЛеоненко, ВА.Горский / Корригирующее действие ингибитора циклооксигеназы на функциональное состояние мононуклеарных клеток, экспрессирующих То11-подобные рецепторы // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунологии М. 2010.- № 1 - С. 45-50

8. ВА.Горский, Л.В.Ковальчук, МА.Агапов, М.В.Хорева, Э.Р.Ованесян,

A.С.Никонова / Антимедиаторная терапия в комплексном лечении острого деструктивного панкреатита // Хирургия. Журнал имени Н.И.Пирогова М. 2010.- №3. - С. 54-61

9. Б.К.Шуркалин, Л.В.Ковальчук, МААгапов, М.В.Хорева, ВА.Индароков Э.Р.Ованесян, А.С.Никонова, И.ВЛеоненко, В.В.Греченко,

B.А.Горский / Применение нестероидных противовоспалительных препаратов в лечении панкреонекроза // Хирург. М. 2010.- №3 - С. 5-13

10. Б.К.Шуркалин, В.А.Горский, М.А.Агапов, М.В.Хорева, Э.Р.Ованесян, В.А.Индароков, А.С.Никоиова, В.В.Греченко / Влияние нестероидных противовоспалительных препаратов на медиаторы воспаления у больных с панкреонекрозом // Инфекции в хирургии. М. 2010.- Том 8. №2- С. 28-32

11. В.АГорский, М. А. Агапов, Л.В.Ковальчук Э.Р.Ованесян, М.В.Хорева,А.С.Никонова, Н.В.Леоненко, В.А.Индароков В.В.Греченко / Синдром системной воспалительной реакции при панкреатите: особенности молекулярной патофизиологии и возможные пути коррекции. // Современные технологии в медицине. Н. Новгорд. 2010.- №2- С. 39-44

12. В.А.Горский, Д.В.Катин, М.В.Хорева, МА.Агапов / Результаты применения антимедиаторной терапии при панкреонекрозе // 18 Межд. Конгресс хирургов-гепатологов стран СНГ. Москва. 2010.-С.176

13. М.А.Агапов, М.В.Хорева, В.А.Горский / Возможности коррекции синдрома системной воспалительной реакции при остром деструктивном панкреатите // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. М. 2011.-№7- С.18-23

14. В.А.Ступин, Ж.В.Басарболиева, МААгапов, Б.КЛайпанов, М.А.Хоконов, Р.Ю.Тронин, А.Д.Климиашвили, Г.В.Родоман / Результаты комбинированного лечения больных с МЖДГ // Хирургия им. Н.И.Пирогова. М. 2012.- № 7 - С. 75-79

15. В. Ю. Титов, А. В. Иванова, М. А. Агапов, В. А. Петров / Содержание нитрита и И-нитрозосоединений плазмы как диагностический тест неспецифического воспаления // Клиническая лабораторная диагностика. М. 2011 -№11 -С.13-19.

16. В.А.Горский, Б.К.Шуркалин, МА.Агапов, М.В.Хорева, И.В.Леоненко / Антимедиаторная терапия при панкреонекрозе // Республиканская научная конф. «Актуальные вопросы панкреатологии». Бухара. 2011. - С. 27-28

17. МА.Агапов, ВА.Горский / Миниинвазивные вмешательства в лечении кист поджелудочной железы // Материалы пленума правления ассоциации хирургов-гепатологов России и стран СНГ. 2012.- С. 3-4

18. ВА.Горский, МААгапов, М.В.Хорева, И.ВЛеоненко / Антимедиаторная терапия при панкреонекрозе // Материалы научно-практической конференции с международным участием «Осложненная желчнокаменная болезнь», Краснодар-Анапа. 2012. - С. 186

19. ВА.Горский, МА.Агапов, М.В.Хорева, И.ВЛеоненко / Оценка возможности влияния антимедиаторной терапии на экспрессию мРНК в мононуклеарных клетках крови больных острым деструктивным панкреатитом // Вестник экспериментальной и клинической хирургии. Воронеж. 2012.- Том 5. №2 - С. 368-372

20. В.А.Горский,М.А.Агапов,М.В.Хорева,И.В.Леоненко / Влияние антимедиаторной терапии на экспрессию матричной РНК в мононуклеарных клетках крови больных острым деструктивным панкреатитом // Анналы хирургической гепатологии, М. 2012 - № ЗТ.17.- С.94-100

21. М.А.АгаповЗ-А.Горский,М.В.Хорева,Э.Р.Ованесян / Способ коррекции синдрома системной воспалительной реакции при остром панкреатите И Цитокины и воспаление. СПб. 2012 - Т. 11 №3 -С. 39-45

22. В.А.Горский, М.А.Агапов, Л.В.Ковальчук, М.В.Хорева, И.ВЛеоненко / Патогенетические аспекты применения антимедиаторной терапии в комплексном лечении панкреонекроза // Цитокины и воспаление. СПб. 2012 - Т.11 №3 - С. 67-69

23. В.А.Горский, М.В.Хорева, М.ААгапов, И.ВЛеоненко / Антимедиаторная терапия при панкреонекрозе // Вестник хирургической гастроэнтерологии. М. 2012.- С. 48-49

24. Л.В. Ковальчук, В.А.Горский, М.В.Хорева, М.А.Агапов, Н.В.Давыдова, И.ВЛеоненко / Экспрессия Т1Л*2 и 1ЪК4 в мононуклеарных клетках переферической крови больных острым деструктивным панкреатитом // Цитокины и воспаление. СПб. 2012 - Т. 11 №4 -С. 50-56

Агапов Михаил Андреевич (Россия) Антимедиаторная терапия панкрсонекроза

Диссертация посвящена актуальной теме - лечению больных панкреонекрозом. Рассмотрены принципы консервативного и оперативного лечения больных. Исследовано влияние НПВС на течение заболевания. Введено понятие «антимедиаторная терапия».

Экспериментально оценены общепринятые модели панкреонекроза, оказавшиеся неэффективными. Создана собственная механическая модель панкреонекроза, характеризующаяся массивным выбросом цитокинов в периферический кровоток. Оценена ингибирующая активность НПВС на продукцию цитокинов в эксперименте и in vitro. Показано позитивное влияние лорноксикама на все исследуемые параметры.

Выполнено проспективное рандомизированное исследование у 334 больных панкреонекрозом по оценке эффективности антимедиаторной терапии лорноксикамом. Установлено положительное влияние антимедиаторной терапии на показатели функциональной активности TLR. Получено снижение осложнений фазы панкреатогенной токсемии и уменьшение общей летальности.

Agapov Mikhail (Russia) Antimediator treatment of severe acute pancreatitis

The dissertation focuses on an important subject - the treatment of patients with severe acute pancreatitis. The principles of conservative and surgical treatment are considered. The effect of NSAIDs on the disease was studied. The concept of "antimediatornaya therapy" was introduced

Experimentally evaluated by conventional models of acute necrotizing pancreatitis, have been ineffective. Created its own mechanical model of necrotizing pancreatitis, characterized by a massive release of cytokines in peripheral blood. In experiments and in vitro the inhibitory activity of NSAIDs on cytokine production was evaluated. It has been shown the positive effect of lornoxicam on all tested parameters.

A prospective randomized study of 334 patients wilh severe acute pancreatitis on the effectiveness of antimediator therapy by lornoxicam was conducted. The positive effect of treatment on antimediator indicators of functional activity TLR was demonstrated. Decrease of complications of pancreatogenic toxemia phase and reduced overall mortality was received.

Подписано в печать:

03.06.2013

Заказ № 8578 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru