Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Роль основных сигнальных систем клетки в регуляции сократительной деятельности сердца

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ им. А. А. БОГОМОЛЬЦА

На правах рукописи

ЗУЕВА Наталья Алексеевна

РОЛЬ ОСНОВНЫХ СИГНАЛЬНЫХ СИСТЕМ КЛЕТКИ В РЕГУЛЯЦИИ СОКРАТИТЕЛЬНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ СЕРДЦА

(14.00.17 — нормальная физиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Киев — 1991

\

Работа выполнена в Киевском медицинском .институте имени академика А. А. Богомольца Министерства здравоохранения Украины, г. Киев.

Научный руководитель — доктор медицинских наук, профессор

В. Г. Шевчук.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук В. Ф. Сагач,

доктор медицинских наук, профессор / С. Б. Французова.

Ведущая организация — НИИ кардиологии им. Н. Д. Стражеско

Министерства здравоохранения Украины. _ у.

Защита диссертации состоится & »

в « ^ » часов на заседании специализированного совета

Д-016.15.02 при Институте физиологии им. А. А. Богомольца АН Украины по адресу: 252024, г. Кнез-24, ул. Богомольца, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института физиологии им. А. А. Богомольца АН Украины по адресу: 252024, г. Киев-24, ул. Богомольца, 4.

Автореферат разослан «.

1ВД/ г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

В. К. Березовский

> Работа выполнена в Киевском медицинском институте имени ;:.пйЦцемика А.А.Богомольца Министерства здравоохранения Украины, г.Киев.

Научный руководитель - доктор медицинских наук, профессор

В.Г.Шевчук.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук В.Ф.Сагач,

доктор медицинских наук

Ведущая организация - НИИ кардиологии им.Н.Д.Стражеско

Министерства здравоохранения Украины.

Защита диссертации состоится "_" _199_ г.

в "_" часов на заседании специализированного совета

Д-016.15.02 при Институте физиологии им.А.А.Богомольца АН Украины по адресу: 252024, г.Киев-24. ул.Богомольца, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института физиологии им.А.А.Богомольца АН Украины по адресу: 252024, г.Киев-24, ул.Богомольца, 4.

Автореферат разослан "_" _199_ г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

В.К.Березовский

Актуальность темы. Исследование клеточных основ нейро-гу-моральной регуляции органов и систем организма представляет собой одну из фундаментальных задач современной физиологии, решение которой необходимо для понимания принципов организации физиологических процессов, механизмов их нарушения и разработки новых подходов к их коррекции.

В последнее время интенсивно развиваются представления о процессах внутриклеточной передачи сигналов регуляторных воздействий на клетку /Äbael-Latif, 1986; Nishizuka, 19835 Eeridge,

1985i Taylor, Jüerrit, 1986; Kunos, Ishac; Bourne, 1989 /, в связи с чем становится актуальным вопрос о степени и характере участия мессенджерных систем клеточной сигнализации в инотро-пном действии различных кардиотоников, в том числе и кардиосте-роидов /сердечные гликозиды/. Последние используют не только для исследования инотропной функции-миокарда, но также для коррекции сердечной деятельности в клинической практике. К важнейшим мессенджерным системам внутриклеточной сигнализации в наиболее общем виде относят прежде всего аденилатциклазную и полифос-фоинозитидную /Расмуссен Г., I9S0; Berxidge, 1985; Taylor, Merrit 1986/. Как известно, в основе первой системы лежит аденилатцик-лазный механизм, который в числе прочих рецепторов активируется бета-адренергическими. Центральным звеном более сложно организованной системы второго типа является контролируемый фосфолипазой С кальциймобиликующий каскад полифосфоинозитидов. Характерными рецепторами, её активирующими, являются альфа.j-адренергическ.ие /Яуйк А.И. и соавт., 1988/. В литературе имеются лишь единичные работы, указывающие на возможность активации полифосфоинозитид-ной системы кардиостероидами / Но et al.,1987/, в том числе в миокарде /Daly et al., 1987/, а также противоречацие им данные об активации аденияатциклазного каскада /Гацура В.В., Кудрин А.Н., 1983; Генденщтейн Э.И., 1986; 1988/. Следует отметить,что эти результаты Оыли получены в биохимических исследованиях и носят узкоспециализированный характер и не могут дать достаточного представления о событиях, происходящих в живой клетке. В связи с этим представляется актуальным изучение роли ведущих cncTev внутриклеточной сигнализации в развитии инотропных эффектов кар-диостероидов в физиологическом эксперименте.

Актуальность изучения физиологических эффектов и молекулярных механизмов действия сердечных гликозидов обусловлена еще и

тем, что в последнее время значительное экспериментальное и клиническое подтверждение получило представление о существовании в организме человека и животных эндогенных кардиостероидов или ди-гиталисподобных факторов /кардиодигинов/ / Hamlyn, Blaustela, 1984; Fagoo, Codtralnd, 1985; Hallaq. et ab., 1989; Kelly, 1985» 1987; Clerico et al., 1988; de Wardener et al., 1983 и др./. He исключено, что эндогенные кардиостероиды могут иметь значение как механизм, дополняющий основные пути нервно-гуморальной регуляции.

Таким образом, учитывая важность изучения роли систем внутриклеточной сигнализации в механизмах нейро-гуморальной регуляции, а также современные представления о существенной функциональной значимости эндогенных кардиостероидов, аналогами которых являются экзогенные сердечные гликозиды / Liu et al.» 1990; Kovacs et al. ,199</, представляются актуальными исследования возможности и характера вовлечения основных сигнальных систем в развитии эффектов кардиостероидов.

Цель работы: дать сравнительную характеристику эффектов сердечных гликозидов и модуляторов мессенджерных систем на мембранном, клеточном и органном уровнях, а также выяснить характер взаимосвязи инотропных эффектов гликозидов и активаторов основных систем внутриклеточной сигнализации.

Задачи исследования:

1. Изучить характер конформационных перестроек наружной мембраны кардиомиоцитов при обработке их кардиостероидами и модуляторами сигнальных систем.

2. Используя фагоцитарную активность нейтрофилов как клеточную модель, позволяющую по функциональным признакам различить

эффекты активации аденилатциклазной и полифосфоинозитидной систем, проанализировать направленность эффектов кардиостероидов.

3. В опытах на изолированном сердце крысы сравнить характер хроно-, инотропных влияний сердечных гликозидов и активаторов основных сигнальных систем в концентрациях, вызывающих максимальный инотропный эффект.

4. Исследовать взаимодействие активаторов аденилатциклазно-го и полифосфоинозитидного каскадов с дигоксином на изолированном сердце морской свинки и роль эндогенных катехоламинов в ино-тропном действии кардиостероидов.

Научная новизна. В работе впервые получены данные о прямом действии гликозидов на структуру мембран. Показано, что это дей-

ствие аналогично эффектам активаторов полифосфоинозитидной системы. Доказана возможность прямой активации кардиостероидами этой системы в изолированных клетках - нейтрофилах, основная функция которых - фагоцитоз - положительно зависит от активности полифосфоинозитидного каскада.

Впервые проведено сравнение показателей хроно-, инотропно-го действия на изолированное сердце крысы строфантина и активаторов основных систем внутриклеточной сигнализации. При этом выявлено существенное подобие эффектов фенилэфрина и ВАУ К 8644 эффектам строфантина при значительном отличии от них эффектов из опротеренола.

Существенной новизной обладают полученные нами данные о сочетанных воздействиях на изолированное сердце морской свинки изопротеренола и дигоксина, а также фенилэфрина и дигоксина, с помощью которых был установлен характер взаимодействия сердечных гликозидов с активаторами основных путей внутриклеточной сигнализации.

Впервые показано принципиальное значение степени угнетения сократительной активности миокарда под влиянием блокатора бета-адренорецепторов пропранолола в характере изменения эффектов дигоксина - по мере увеличения токсического действия пропранолола его отрицательное влияние на эффект дигоксина сменяется положительным.

Научно-практическая значимо'сть: полученные данные расширяют существующие представления о клеточных механизмах нейро-гу-моральной регуляции сердца и, в частности, о возможной роли внутриклеточных сигнальных систем в регуляции деятельности сердца кардиостероидами. Исходя из полученных данных можно предположить, что эффективность кардиостероидов или эндогенного дигита-лисоподобного фактора в регуляции функций миокарда наивысшая в условиях снижения возможностей адренергической регуляции серд-цат наблюдаемой при развитии сердечной недостаточности различного генеза. Полученные данные о взаимосвязи эффектов активации аденилатциклазной и полифосфоинозитидной систем могут иметь значение и для клинической практики. В частности, представляется нецелесообразным сочетание гликозидов с препаратами прямо или косвенно активирующими аденилатциклазный каскад. Напротив, введение активатора фосфоинозитидного обмена мезатона, например, при шоковых состояниях, по-видимому, имеет смысл сочетать с кардиостероидами. Кроме того, эффективным может быть сочетание

гликозидов с блокаторами бета-адренорецепторов, особенно при чрезмерном угнетении функции миокарда вследствие передозировки последних.

Основные положения, вынесенные на защиту:

1. Обработка изолированных мембран кардиомиоцитов гликози-дами и активаторами полифосфоинозитидной системы приводит к сходным между собой структурным перестройкам сарколеммы, которые прямо противоположны изменениям сарколеммы под влиянием активатора аденилатциклазной и блокаторов полифосфоинозитидной системы.

2. Фагоцитарная активность нейтрофилов, изменения которой позволяют выявлять активацию одной из основных мессенджерных систем, увеличивается под влиянием кардиостероидов, что характерно для активации инозитольного ответа.

3. Характер изменений частоты сердечных сокращений и показателей сокращения и расслабления левого желудочка изолированного сердца крысы под влиянием строфантина в значительной мере совпадает с эффектами фенилэфрина и ВАУ К 8644 и по всем параметрам отличается от эффектов изопротеренола.

4. Опыты с пропранололом подтверждают возможность участия эндогенных катехоламинов в инотропном действии кардиостероидов и показывают существенную роль изменений исходной сократительной активности миокарда в значительной вариабельности влияния блокады бета-адренорецепторов на эффективность сердечных гликозидов.

5. Регуляция деятельности сердца кар-диостероидамя, по-видимому, наиболее эффективна при снижении функциональной активности сердечной мышцы и её реактивности к бета-адренергической стимуляции, а для коррекции сердечной деятельности в клинических условиях предпочтительным представляется сочетание кардиостероидов с альфа^-адреномиметиками и бе-та-адреноблокаторами.

Апробация работы.

Основные положения работы были доложены на научно-методических конференциях кафедры нормальной физиологии Киевского медицинского института /1989, 1990, 1991/; на ХШ итоговой научной конференции молодых учёных и специалистов Киевского медицинского института /1989/; на Всесоюзной конференции "Синтез, фармакология и клинические аспекты новых психотропных и сердеч-

7

но-сосудистых средств", г.Волгоград /1989/; на Всесоюзной конференции "Центральные и периферические механизмы регуляции физиологических функций", г.Москва /1990/; на Апрооационном Совете Киевского мединститута по проблемме "Теоретическая медицина" /31 мая 1991 г./.

Внедрение результатов исследования в практику.

Изложенные положения и полученные экспериментальные разработки внедрены в учебный процесс и научные исследования на кафедрах фармакологии и нормальной физиологии Киевского медицинского института, а также использованы в монографии "Химия регу-ляторных процессов" под общей редакцией Кухаря В.П., Луйка А.И., "Наукова Думка", 1991, С.368.

Объём и структура диссертации.

Диссертация изложена на 145 страницах машинописи, состоит .из введения, шести глав, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 41 работу отечественных и 164 работы иностранных авторов. Иллюстрирована 20 рисунками и 8 таблицами.

Методы исследований.

В основу исследований положены следующие методические подходы:

I. С целью изучения изменения конформации мембран под влиянием модуляторов мессенджерных систем и кардиостероидов проводили флуоресцентное зондирование сарколеммы кардиомиоцитов, выделенной из сердца крупного рогатого скота / lehev at al. ,1982/, суспендированной в 0,1 М Трис-HGX /рН 7,4/ в смеси с 0,3 М КС1 и 0,05 М Na^PgO^. Изучали действие кардиостероидов строфантина и дигоксина, модуляторов аденилатциклазной системы - изопроте-ренола, пропранолола, модуляторов полифосфоинозитидной системы -фенилэфрина, ВАУ К 8644, fíffiP , верапамила, празозина. Флуоресценцию зондов 1-анилинонафталин-8-сульфоната магниевой соли /АНС/ и пирена /оба "Serva ", ФРГ/ возбуждали на длинах волн 380 и 340 нм, соответственно; мембранных белков и донорно-акцеп-торных пар - на длине волны 280 нм, где поглощают все белковые люминофоры /Бурштейн Э.А.,1977/. Относительное положение центре тяжести /сдвиг положения максимума/ спектра белковой флуоресценции характеризовали по соотношению интенсивностей на его короткс волновом /318 нм/ и длинноволновом крыле/344 нм/.^Ассиметрию спектра характеризовали величиной ДА /áJ , где Л Л и Ah - по-

8

луширина спектра /расстояние от оси, проведенной через максимум до его коротковолнового и длинноволнового крыла на половине высоты спектральной линии/. Вероятность индуктивно-резонансного переноса энергии /ИРГО/ между донорно-акцепторными парами: белковые люминофоры-зонды определяли по изменению интенсивности флуоресценции донора в присутствии акцептора по формуле:

где I и I - интенсивность флуоресценции донора в отсутствие и в присутствии акцептора, соответственно. Полярность микроокружения мест локализации пирена /индекс полярности/ оценивали по соотношению интенсивностей первой /373 нм/ и третьей ,/384 нм/ полос в тонкой структуре спектра флуоресценции его мономеров /Glushko et al., 1981/. Степень эксимеризации - по соотношению интенсивностей флуоресценции эксимерной и мономерной формы пирена /Vender Kool et al.,1974/, фиксируемых в условиях нашего эксперимента при длинах волн 470 и 394 нм, соответственно. Концентрация мембран составляла 0,1 мг/мл по белку, который определяли методом Лоури /Loviy et el., 1957/; зондов - 5 мкМ. При выборе концентрации препаратов мы были ограничены тем, что некоторые вещества обладают высокой собственной флуоресценцией и все вещества с разными характеристиками поглощают в используемом спектральном диапазоне. В связи с этим максимальная концентрация фенилэфрина, ВАУ К 8644 и празозина составляла 10 мкМ, ве-рапамила - I мкМ,. ¿ЖР - 100 мкМ, пропранолола 10 мкМ, изопро-теренола, строфантина и дигоксина - 5 мкМ. При обработке спектральных данных учитывали собственную флуоресценцию препаратов, эффекты экранирования и реабсорбции /Бурштейн Э.А., 1977/. Флуоресцентные измерения осуществляли на спектрофлуориметре Hitachi MPF-4 /Япония/. Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре Shlmadzu Р-5000 /Япония/.

2. Исследования фагоцитарной активности нейтрофилов проводили по методу Е.Ф.Чернушенко, Л.С.Когосовой /1981/.

Определяли 3 показателя: фагоцитарное число, т.е. число микробов, поглощённых в среднем одним лейкоцитом, % фагоцитирующих лейкоцитов, т.е. количество лейкоцитов, проявивших фагоцитарную активность из 100 и фагоцитарный индекс, т.е. отношение произведения фагоцитарного числа на % фагоцитоза к 100%. Контролем служили нейтрофилы, не обработанные модуляторами. Концентрации препаратов подбирали в 2-3-х опытах для определения оптималь-

ной. По какдому препарату сделаны серии по 7-8 опытов. Концентрации препаратов в М/л: строфантин - 10" \ дигоксин - 10 ,

фенилэфрин - 5 х Ю-7, piLP 1 IG"7, ВАУ К 8644 - 5 х Ю-8, ве-

8 7 —Я

рапамил - 10" .^празозин - 10" , иэопротеренол - 10 , пропра-

нолол - 5 х 10"°. Работа проведена на I3C белых мышах обоего

пола.

3. Исследование ино-, хронотролных эффектов активаторов мессенджерных систем и кардиостероидов выполнено на изолированных сердцах белых крыс массой 200-30C г, перфузируемых по Лан-гендорфу, оксигенированным раствором следующего состава /мМ/л/ NaCl- 120; KCl - 4,8; CaCI2 - 2,0;MgS 04 - 1,2; HaHGOg - 25; KH2P04 - 1,2" глюкоза - 10 при температуре 34'-0,5°C. В левый-желудочек вводили катетер с латексным баллончиком. По изменению давления в баллончике и его первой производной, регистрируемой с помощью электромеханических преобразователей и самописца H-32I-4 /Краснодар/, судили о влиянии исследуемых воздействий на сокращение и расслабление левого желудочка. Изменения частоты сокращений сердца регистрировали визуально с помощью секундомера. Показатели отношения к давлению е левом желудочке скоростей сокращения, райслабления и частоты, а также отношение скорости сокращения к скорости расслабления были использованы для построения диаграмм зависимости параметров функциональной активности сердца от воздействия используемых препаратов.

4. Взаимосвязь инотропных эффектов дигоксина и модуляторов мессенджерных систем исследовали в опытах на изолированных сердцах морских свинок, массой 300-400 г, перфузируемых как описано выше в режиме постоянства протока, который устанавливался перед каждой реакцией на уровне, обеспечивающем перфузионное давление, равное 40 мм рт.ст. Препараты разводили в изотоническом растворе NaCI и подавали перистальтическим насосом в перфузионную канюлю непосредственно перед аортой со скоростью в 100 раз меньше? протока. Конечная концентрация фенилэфрина составляла 5xI0"5 M/j инотропный эффект достигал стационарного уровня через 5-7 минут Уа =11/. Концентрация изопротеренола /3 х 10"^ М/л/ была подобрана так, чтобы его инотропный эффект был приблизительно равен таковому фенилэфрина. Стационарный уровень эффекта достигался через 13-15 минут перфузии. Дигоксина в концентрации 3 х I0"7M/j повышал развиваемое левым желудочком давление на 73,4i5,через 10-15 микут инфузии. Концентрация дополнительно вводимого в раствор Са^+ колебалась от 1,25 до 2,5 х М/л, а его инотрог ный эффект был приблизительно равен таковым фенилэфрина и изо-

10

протеренола. Выбранные концентрации воздействий обеспечивали отчётливые, но не большие /ниже полумаксимальных/ йнотропные эффекты, при которых сократительная активность сердца поддерживалась длительно на постоянном уровне. Концентрации и продолжительность инфузии агонистов были выбраны на основании предварительных экспериментов, проведенных на 21 сердце с построением зависимостей "доза-эффект". В этой же серии экспериментов в конце опыта инфузировали раствор пропранолола в концентрации 10"^ М/л. В специальной серии экспериментов было исследовано влияние 10-15 минутной икфузии пропранолола на эффект дигоксина / а =10/. Результаты исследований обработаны методом вариационной статистики. Достоверность различий определялась по критерию Стьюдента. При обработке данных взаимодействия дигоксина и пропранолола применён линейный регрессионный анализ.

Результаты и их обсуждение.

I. Структурные эффекты модуляторов сократительной функции миокарда в сарколемме кардиомиоцитов.

Проведенные исследования показали существование ряда общих черт и отличий в характере влияний гликозидоз и модуляторов основных сигнальных систем на структуру сарколеммы кзрдио-миоцитов. Характерные для гликоэидов изменения структурных свойств плазматических мембран кардиомиоцитов заключались в перемещении поверхностных тирозиловых участков белковых макромолекул в их интерьер и уменьгаение уровня погружения белков р липидный матрикс. Подобные структурные изменения: наблюдались в сарколемме и при её обработке фенилэфрином, ВАУ К 8644, £М£Р и пропранололом, хотя последний по-иному влияет на липид-белковые взаимоотношения. В то же время не удалось найти совпадения между изменениями показателей структурного состояния сарколеммы кардиомиоцитов под влиянием кардиостероидов,с одной стороны, и верапамилом, празозином и изогротеренолом, с другой. Более того, обращает на себя внимание, что по признакам, общим для эффектов строфантина и дигоксина-, активатор аденилатииклазной системы оказывает противоположный эффект /тирозилы выходят на поверхность белковых макромолекул и увеличивается уровень погружения белковых макромолекул в липидный бислой/. Таким образом, результаты этой серии экспериментов свидетельствуют о том, что конформационные перестройки в сарколемме кардиомиоцитов проис-

11

ходят под влиянием всех изучаемых препаратов, характер которых при обработке мембран кардиостероидами сходен с эффектами активаторов полифосфоинозитидного каскада и противоположен характеру изменений структуры мембран, обработанных активатором адеда-латциклазы и блокаторами путей активации полифосфоинозитидной системы (табл.1).

Z, Изменение фагоцитарной активности нейтрофилов под влиянием сердечных глинозидов и модуляторов мессен-джерных систем.

Используя нейтрофильные лейкоциты, фагоцитарная функция которых положительно зависит от активации полифосфоинозитидной системы, и поэтому представляющих собой удобную клеточную модель для определения вовлечения основных путей клеточной сигнализации под'влиянием различных модуляторов. Полученные данные о влиянии изучаемых модуляторов на фагоцитоз нейтрофилов, позволяют сделать заключение о том, что он растёт под влиянием активаторов полифосфоинозитидной системы /фенилэфрина, ВАУ К 8644, fMLP / и блокатора аденилатциклазной системы /пропранолола/ и понижается под влиянием изопротеренола, верапамила и празозина, т.е. активаторов аденилатциклазной и блокаторов путей активации полифосфоинозитидной систем, соответственно. Фагоцитарная активность под влиянием кардиостероидов меняется также, как и под влиянием активаторов инозитольного ответа и блокатора аденилат-циклазы. На основании этих результатов можно сделать вывод, что гликозиды по направленности эффектов можно отнести к активаторам /прямым или косвенным/ инозитольного пути.

3. Хроно- и инотропные эффекты кардиостероидов и активаторов сигнальных систем.

В этой серии опытов исследованы параметры сократительной активности изолированного сердца крысы под влиянием кардиостимуляторов. Однако на изолированном сердце крысы мы не могли ограничиться оценкой направленности эффектов модуляторов как в опытах на нейтрофилах и сарколемме кардиомиоцитов, так как стимуляция обеих основных систем сигнализации в сердце приводит к положительному инотропному действию /Leye ,1989/. Поэтому для оценки подобия'действия сердечных гликозидов эффектам активации мессенджерных систем в миокарде был использован метод многопа-

12

Таблица

Характер влияния на структурные свойства сарколеммы кардио-миопитоп сердечных глнкозидоч и модуляторов полифосфоинози-тидчоГ' и яденилатциклазной систем

Препараты Велковьге люминофоры Физико-химические характеристики глубинных участков липидного матрикса Липид-белко-вые комплексы

Трипто-' фанилы Тиро-зилы Поляр- : ность : Микровязкость

Строфантин + + _

Дигоксин - + + + -

Фенилэфрин + + + + -

ВАУ К 8644 + + + + -

+ + + + -

Верапамил + 0 - 0 0

Празозин + 0 - 0 . 0

Изопротеренол - - 0 - +

Пропранолол + 0 + +

Примечание: Белковые люминофоры: (+) - переход во внутренние

зоны белковых макромолекул; (-) - выход на поверхность белковых макромолекул; (0) - не влияет. Физико-химические характеристики матрикса: (+) - повышение, (-) - понижение, (0) - не влияет. Липид-бел-ковые комплексы: (+) - увеличивается уровень погружения белков в липидный матрикс, (-) - уменьшается уровень погружения белков в липидный матрикс, (0) - не влияет.

раметрической характеристики инотропных эффектов исследуемых воздействий с учётом силовой и скоростных показателей сокращения и расслабления миокарда, а также изменений частоты сокращений сердца крысы. Полученные показатели были отнесены к величине изменения давления в левом желудочке под влиянием каждого модулятора. Полученные таким образом нормированные характеристики функциональных эффектов фенилэфрина и ВАУ К 8644 были сходны между собой и резко отличались от таковых для активатора аденилатциклазной системы изопротеренола, а характеристика эффектов строфантина была подобна таковой для фенилэфрина и ВАУ К 8644. Так, отношения к изменению давления в левом желудочке значения частоты сокращений сердца, а также максимума и минимума первой производной внутрижелудочкового давления при ин-фузии строфантина были равны 0,99*0,03; 1,2±0,03; 1,13*0,04, для фенилэфрина и ВАУ К 8644 эти величины составили 0,73*0,03, 1,08*0,03; 1,11*0,04 и 0,85±0,06; 1,2*0,02; 0,86±0,13, соответственно, а под влиянием изопротеренола - 1,07*0,02; 0,95*0,03; 1,53*0,02 /? 0,05/. Эти данные свидетельствуют о значительном сходстве реакций основных показателей деятельности сердца под влиянием строфантина и активаторов фосфоинозитидного обмена, а также их принципиальное отличие от эффектов активатора адени-латциклазы.(рис Л)

Таким образом, приведенные выше результаты исследований свидетельствуют в пользу предположения, что помимо общеизвест-* ного действия гликозидов через На, К^-АТФазу в реализации эффектов кардиостероидов принимает участие прямая или косвенная активация одной из основных сигнальных систем, а именно - поли-фосфоинозитидная»

4. Исследование взаимозависимости инотропных эффектов дигоксина и модуляторов основных систем клеточной сигнализации.

Независимо от того, в какой мере основные системы внутриклеточной сигнализации вовлекаются в механизм действия сердечных гликозидов, имеет важное научно-практическое значение исследование влияния активации этих систем на эффекты кардиостероидов. Это связано, во-первых, с тем, что гликозиды, вероятно,могут облегчать высвобождение "катехоламинов из симпатических тер-миналей /МагЬаа, 1986; КгапаЬоГег et а1., 1990/ и, таким образом, активировать аденилатциклазу и фосфоинозитидный обмен и

Рис. I. Диаграммы зависимости параметров функциональной

активности изолированных сердец крыс от воздействия строфантина /10М/л/ /I/, фенилэфрина /10"^ М/л/ /2/, ВАУ К 8644 /10 М/л/'' /3/ и изопротерено-ла /Ю"7 М/л/ /4/.

Д(Р+/Р)

ДО /Р)

Р - развиваемое левым желудочком давление, Р+ - максимум первой производной Р, Р— минимум первой производной Р, ) - частота сердечных сокращений; Р+/Р - показатель сократительной активности миокарда, Р-/Р - показатель расслабления, Р+/Р - показатель сопряжения сокращения с расслаблением,

/Р - показатель хронотропной реакции, нормированный по Р. Единичная окружность соответствует исходным значениям /перед введением препаратов/ показателям функциональной активности изолированного сердца.

влиять на эффективность прямого инотропного действия сердечных гликозидов. Во-вторых, исследование итого вопроса вамно для понимания принципов взаимодействия эндогенных карциостероидов и других нейроэндокринных регуляторов сократительной активности миокарда, реализующих своё действие через активацию различных систем внутриклеточной сигнализации, а также дчя понимания характера взаимодействия гликозидов и других кнрдиотоников, влияющих на уровень цАМФ в миокардиоцитах и фосфоинозитидный обмен.

В проведенных исследованиях на изолированных сердцах морских свинок установлено, что при стимуляции обеих сигнальных систем - введении дигоксина с фенилэфрином или изопротеренолом общий инотропный эффект больше, чем эффекты каждого из этих веществ в отдельности. Однако относительный инотропный эффект дигоксина снижается, если его инфузировать на фоне действия этих адреномиметиков и особенно на фоне изопротеренола, так, что эффект дигоксина уменьшался в ряду Д>Д$>Дса> Ди. где Д - собственный эффект дигоксина, Дф - эффект дигоксина на фоне фенил-эфрина, - эффект дигоксина на фоне гиперкальниевого раствора, Д - эффект дигоксина на фоне изопротеренола. Отрицательное взаимодействие дигоксина и изопротеренола было подтверждено и в обратном опыте, когда изопротеренол ипфузировали на фоне действия дигоксина (рис.1). Такой характер взаимосвязи инотропных эффектов дигоксина и бета-адреномиметиков имеет, очевидно, практическое значение, так как может служить основой для прогноза низкой эффективности сочетанного использования гликозидов и кар-диотоников, активирующих аденилатциклазную систему. Поскольку общим моментом в механизме действия фенилэфрина и изопротеренола является увеличение концентрации Се?+ в цитозоле при сокращении, было исследовано также влияние увеличения концентрации Са^+ в растворо на действие дигоксина. Оказалось, что на фоне повышенной концентрации эффект дигоксина также снижается. Если принять эффект гиперьальпиевого раствора в.качестве контрольного, то можно оценить влияние на эффект дигоксина.кальций-независимых внутриклеточных процессов, индуцируемых фенилэфрином и изопротеренолом. Для фенилэфрина такое влияние на эффект дигоксина оказалось положительным, а для изопротеренола - отрицательным. Судя по данным литературы /Курский М.Д., 1936/ к каль цийнезависимым процессам, опосредующим разнонаправленные влияния цАМФ-зависимой и фосфоинозитид-зависимэй систем регуляции функции сердечной мышцы, можно отнести процессы фосфорилирования со-

Г1

Рис, 2. Влияние дигоксина /3x10 М/л/ на давление, развиваемое левым желудочком изолированного сердца морской свинки /I/ до и на фоне инфузии фенилэфрина /бхЮ-^/л/ /2/, хлорида кальция /2хЮ~%/л/ /3/, изопротеренола /ЗхЮ~%/л/ /4/ и влияние изопроте-ренола /ЗхЮ~%/л/ /5/ на давление, развиваемое левым желудочком до и на фоне инфузии дигоксина /ЗхЮ Ш/л/ /6/.

100

50

0 J

*

£

12 3 4 5 6

кратительных белков. Так, активация протеинкиназы С увеличивает сродство тропонина к Са^+, а активация цАМФ-зависимой протеинкиназы - уменьшает его.иКроме того, известна цАМФ-зависимая активация а+,К+-АТФазы /Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., 1987/, т.е. эффект, противоположный основному механизму действия кар-диостероидов.

Существующее в литературе представление о том, что блока-торы бета-адренорецепторов уменьшают токсическое действие гли-козидов /развитие аритмии, фибрилляций, контрактур сердечной мышцы/ /ФранцузоЕа С.Б., 1977; Гацура В.В., 1983; Бударин Л.И. и соавт., 1985/ свидетельствует в пользу их сочетания и вместе с тем интересно как одно из доказательств возможности участия эндогенных катехоламинов в механизмах регуляции деятельности сердца эндогенными и экзогенными кардиостероидами. Анализ обширной и противоречивой литературы по этому вопросу затрудняется значительной вариацией использованных экспериментальных и кли нических методов исследования, выбора вида животных, фармакологических агентов и их дозировки. Особенность полученных нами данных состоит в том, что разнонаправленные влияния блокады бета-адренорецепторов на эффект дигоксина мы получили в одних и тех же условиях эксперимента на препаратах миокарда одного вида животных /морская свинка/, одного отдела сердца /левый желудочек/, при одной малой /терапевтической/ концентрации гли-козида. Это позволило обратить внимание на ещё один фактор, лежащий в основе разнообразия влияния блокады бета-адренорецепторов на эффекты кардиостероидов, степень угнетения сократительной активности миокарда, связанную, по-видимому, с различной выраженностью токсического эффекта пропранолола. Была обнаружена высокая корреляционная зависимость между степенью угнетения сократительной активности миокарда и степенью увеличения эффекта дигоксина. Поскольку токсическое действие пропранолола связывают с уменьшением входа в клетку, результаты опытов с пропранололом косвенно подтверждают значение уровня внутриклеточного Са^+ в эффективности инотропного действия гликозидов, его роли в отрицательной обратной связи молекулярных механизмов действия кардиостероидов. В этом смысле они дополняют результаты наших исследований с влиянием гиперкальцие во го раствора на эффект дигоксина. Вместе с тем, .данные опытов с пропранололом прямо указывают на возможность участия эндогенных катехоламинов в кардиотоническом действии кардиостероидов.Это,в свою очередь, означает, что наряду с "прямой активацией фосфоинозитидного об-

ена под влиянием входа дополнительных порций Са^+, индуциро-анного сердечными гликозидами, эта система внутриклеточной си-нализации может активироваться и через алы^-адренорецепторы орадреналином, выделяющимся из нервных окончаний в результате .ействия кардиостероидов на пресинаптическута мембрану. При этом роисходит и бета-адренергическая активация аденилатциклазы ардиомиоцитов. Повышение инотропного эффекта дигоксина на фоне ардиотоксического действия пропранолола указывает на целесооб-азность применения кардиостероидов при передозировке блокато-ов бета-адренорецепторов в клинике.

Выводы

' I. Обработка изолированной сарколеммы кардиомиоцитов сер-¡ечными гликозидами и фенилэфрином, ВАУ К 8644, приводит к

ходным между собой структурным перестройкам мембраны, а именно: ■меньшение степени погружения белков в липидный матрикс и пере-[ещение внутрь белковых макромолекул тирозиловых участков, что фямо противоположно изменениям сарколеммы под влиянием изолро-■еренола, прозазина и верапамила.

2. Кардиостероиды так же как активаторы полифосфоинозитид-юго каскада и пропранолол повышали фагоцитарную активность ней-"рофилов, что свидетельствует об участии полифосфоинозитидной

ю не аденилатциклазной системы во внутриклеточных механизмах фямого действия гликозидов на эффекторные клетки.

3. Изменение параметров сократительной функции миокарда

I частоты сердечных сокращений под влиянием строфантина в зна-мтельной мере совпадали с таковыми при действии фенилэфрина и ЗАУ К 8644 и по всем параметрам отличались от эффектов изопро-геренола.

4. Эффекты активации полифосфоинозитидной и аденилатциклаз--юй систем,не связанные с повышением уровня внутриклеточного каль-дия соответственно потенцируют и угнетают инотропный эффект дигоксина.

5. Блокада бета-адренорецепторов уменьшает инотропный

19

эффект дигоксина, что подтверждает участие эндогенных кате-холаминов в действии сердечных гликоэидов. Увеличение эффектов дигоксина при токсических дозах пропранолола демонстрирует обратную зависимость эффекта кардиостероидов от сократимости миокарда, о чем свидетельствует также уменьшение эффекта дигоксина в опытах с гиперкальциевым раствором и адреномиме-тиками.

6, Регуляция деятельности сердца кардиостероидами наиболее эффективна при снижении функциональной активности сердечной мышцы и её реактивности к бета-адренергической стимуляции, а также на фоне терапии альфа^адреномиметиками и бета-адрено-блокаторами.

7. Результаты исследований на мембранном, клеточном и органном уровнях указывают на возможность прямого вовлечения по-лифосфоинозитидной системы в развитие эффекта сердечных глико-зидов, а также косвенной, опосредованной эндогенными катехола-минами активации полифосфоинозитидной и аденилатциклазной систем, которые сникают эффективность сердечных гликозидов вследствие повышения уровня внутриклеточного Са^+, а также оказывают разнонаправленные Са^+-независимые влияния' на эффективность кардиостероидов - положительное и отрицательное, соответственно.

По теме диссертации опубликованы следующие работы;

1. Молекулярные механизмы изменения структурных свойств мембран кардиомиоцитов кардиоактивными средствами // Тез.докл. конф."Синтез, фармакология и клинические аспекты новых психотропных и сердечно-сосудистых средств". - Волгоград, 1989.-с.113-113-114. /Соавт. Н.А.Горчакова, О.И.Лебедь, В.В.Жирнов/

2. ЭВМ-прогнозирование профессиональных ограничений фармакотерапии // Тез.докл.Всесоюзн.конф."Экстремальная физиология, гигиена и средства индивидуальной защиты человека". -Москва, 1990, С.384. /Соавт.П.А.Ангелуца, Е.А.Щербак/.

3. Влияние сердечных гликозидов и различных модуляторов поли-фосфоинозйтидного и аденилатциклазного каскадов на фагоци-

20

тарную активность нейтрофилов in vitro и in vivo // Тез. докл.Всесоюз. У1 Съезда фармакологов СССР. - Харьков, 1990.-C.I56 /Соавт. JI.А.Метелица/.

4. Структурные эффекты в мембранах кардиомиоцитов под влиянием кардиоактивкых веществ // Тез.докл.Всесотаз.конф. "Центральные и периферические механизмы регуляции физиологических функций". - Москва, 1990.- С.48 /Соавт. О.И.Лебедь, В.В.Жирнов/.

5. Структурные эффекты в сарколемме кардиомиоцитов при действии модуляторов полифосфоинозитидной системы. // Физиологический журнал СССР. - 1990. — ?Г» 10. - с.58-61 /Соавт.О.И.Ле-бедь, В.В.Жирнов и др./.