Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Роль каннабиноидных рецепторов в регуляции устойчивости миокарда к действию ишемии-реперфузии

На правах рукописи

Ласукова Ольга Владимировна

РОЛЬ КАННАБИНОИДНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В РЕГУЛЯЦИИ УСТОЙЧИВОСТИ МИОКАРДА К ДЕЙСТВИЮ ИШЕМИИ-РЕПЕРФУЗИИ

14.03.03 - патологическая физиология 14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 0КК3 2ЭИ

Томск - 2010

4842710

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук научно-исследовательском институте кардиологии Сибирского отделения РАМН

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Маслов Леонид Николаевич

доктор медицинских наук Рыжкова Дарья Викторовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Плотников Марк Борисович

доктор медицинских наук, профессор Капилевич Леонид Владимирович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Сибирский государственный

медицинский университет»

Защита состоится «_»_2011 г. в_часов на заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук научно-исследовательском институте фармакологии Сибирского отделения РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук научно-исследовательского института фармакологии Сибирского отделения РАМН.

Автореферат разослан «_» декабря 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Е. Н. Амосова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Актуальной проблемой современной кардиологии, патофизиологии и фармакологии является защита сердца от ишемических и ре-перфузионных повреждений, поскольку главной причиной смерти при ИБС является острый инфаркт миокарда (ОИМ) [Калинина A.M. и др., 1996; Сыркин A.C., 2003]. Такое положение дел связано с тем, что меры профилактики и лечения этой патологии несовершенны. Единственным эффективным методом лечения ОИМ является возобновление коронарного кровотока ишемизирован-ного участка сердца (тромболизис, стентирование, коронарное шунтирование), которое, к сожалению, приводит к развитию реперфузионного синдрома. Лекарственных средств, способных радикально повысить устойчивость кардио-миоцитов к действию ишемии-реперфузии, в настоящее время не существует. Причиной подобного положения дел является ограниченность наших знаний о внутриклеточных сигнальных механизмах, регулирующих устойчивость кар-диомиоцитов к патогенному действию ишемии-реперфузии. В связи с этим, весьма актуален поиск новых кардиопротекторных препаратов, способных эффективно предупреждать развитие ишемических и реперфузионных повреждений. После открытия феномена ишемического прекондиционирования [Jennings R.B., 1997; Murry С.Е. et al., 1986; 1990], в кардиологии получило развитие новое направление, суть которого заключается в стимуляции эндогенных защитных механизмов при ишемии и реперфузии сердца. Суть названного феномена заключается в повышении толерантности сердца к патогенному действию длительной ишемии после нескольких предварительных сеансов кратковременной ишемии и реперфузии. Основными проявлениями ишемического прекондиционирования (ИП) являются: а) ограничение зоны инфаркта [Гурин A.B. и др., 1997; Каган-Пономарев М.Я., 1998; Кузнецов В.А., и Тодосийчук В.В., 1998; Литвиц-кий П.Ф., 1994; Сидоренко Г.И. и др., 1997; Хаткевич А.Н. и др. 1998; Bains С.Р. et al., 1999; Downey J.M. и Cohen V., 1995; Jennings R.B. и Reimer K.A., 1997; Kloner R.A. и Jennings R.B., 2001; Post H. и Heusch G., 2002; Schultz J.E.J, et al., 2001; Van Winkle D.W. et al., 2001]; б) быстрое восстановление сократимости при реперфузии [Коркина О.В. и др. 2001; Писаренко О.И. и др., 1997; Cave A.C. 1992; Laurikka J. et al., 2002; Pantos C.I. et al., 1999; Takano H. et al., 2000; Tang X.L., 2002]; в) снижение выраженности ишемических и реперфузионных нарушений ритма сердца [Edwards R.J. et al., 2002; Kolar Ей Parratt J.R., 1997; Lawson C.S. et al., 1993; Okruhlicova L., 1999; 2000; Sakamoto J. et al., 1999; Zhu J. Zhu и Ferrier G. R„ 1998].

Известно, что ишемическое прекондиционирование связано с активацией G¡,„-белок-сопряженных рецепторов GPCR (G-protein coupled receptor) [Baines C.P. et al., 1999; Downey J. и Cohen M.V., 1997; Post H. и Heusch G., 2002; Schulz J. E. J. et al, 2001]. Наиболее известными медиаторами ИП считают аденозин, бради-кинин, опиоиды [Liu Y. et al., 1991; Goto M. et al., 1995; Chien G. L. et al., 1999; Miki T. et al., 1998; Schultz J.E. J. et al., 1997]. Недавно были получены доказательства того, что феномен ИП способны имитировать экзогенные каннабиноиды [Кры-латов A.B. и др. 2002; Угдыжекова Д.С. и др. 2002; Маслов Л.Н. и др., 2003; Ласуко-

ва O.B. и др., 2008; Bouchard J.F. et al., 2003; Ribuot C. et al., 2004]. Кроме того, данные литературы и наши ранее полученные результаты позволяли надеяться, что в развитии кардиопротекции важная роль принадлежит каннабиноидным (СВ, cannabinoide) рецепторам. Данные литературы и нашей лаборатории свидетельствуют о наличии кардиопротекторного эффекта у агонистов СВ-рецепторов [Уг-дыжекова Д.С. и др. 2002; Крылатов A.B. и др. 2002; Lepicier P. et al., 2003]. Вместе с тем, оставалось неизвестным, активация каких субтипов каннабиноидных рецепторов обеспечивает цитопротекторное действие каннабиноидов и где расположены эти рецепторы. Все вышесказанное послужило основанием для исследования кардиопротекторных свойств лигандов известных субтипов СВ-рецепторов и выявления рецепторной специфики полученных эффектов. Каннабиноиды способны влиять на силу и частоту сокращений сердца при системном введении [Мас-лов Л.Н. и др., 2006; Ford et al, 2002; Smiley et al, 1976; Vidrio et al., 1996]. Однако до настоящего времени нет единого мнения о роли этих соединений в регуляции инотропной функции сердца при ишемии/реперфузии. Учитывая ранее полученные нами данные о способности каннабиноидов повышать устойчивость сердца к ишемии/реперфузии in vivo и к аритмогенному действию адреналина, аконитина [Угдыжекова Д.С. и др. 2000, 2001-, Крылатов A.B. и др. 2001, 2002], мы сочли целесообразным продолжить исследование антиаритмических свойств этих соединений в условиях ишемии/реперфузии изолированного сердца.

В настоящее время в научной литературе имеется лишь одна работа, посвященная изучению сигнальных путей, опосредующих кардиопротекторные эффекты каннабиноидов при ишемии и реперфузии [Lepicier P. et al., 2003]. В большинстве клеток каннабиноиды ингибируют аденилатциклазу за счёт активации Gi/o-белков [Felder С.С. et al., 1993; Hillard C.J. et al, 1990; Howlett A.C. et al., 1986; Sagan S. et al., 1999; Schlicker E. et al., 1997]. Относительно роли СВ-рецепторов в регуляции уровня цАМФ в кардиомиоцитах не было полной ясности. Между тем, этот внутриклеточный мессенджер играет важную роль в арит-могенезе [Lübbe W.F., et al., 1992]. Другими возможными посредниками в сигнальном каскаде каннабиноидов могли являться протеинкиназа С, NO-синтаза. Данное предположение стало возможным благодаря имеющимся в литературе данным, доказывающим участие вышеназванных энзимов в механизме влияния каннабиноидов на миокард [Lepicier P. et al., 2003; 2004; Razavi Н.М. et al., 2005]. Относительно взаимодействия кардиальных СВ-рецепторов с АТФ-чув-ствительными К*-каналами (КАТФ-каналы) в литературе нет данных. Однако известно, что эти каналы играют важную роль в кардиопротекторном эффекте ишемического прекондиционирования [Yellon D.M. и Downey J., 2003].

Учитывая все вышесказанное, нам представлялось целесообразным выяснить локализацию каннабиноидных рецепторов, регулирующих устойчивость сердца к ишемии-реперфузии, рецепторную специфичность и внутриклеточные сигнальные механизмы, обеспечивающие кардиопротекторный эффект каннабиноидов при ишемии и реперфузии.

Цель исследования: исследовать роль кардиальных каннабиноидных рецепторов в регуляции устойчивости сердца к действию ишемии и реперфузии in vitro.

Задачи:

1. Исследовать роль каннабиноидных рецепторов в формировании устойчивости изолированного сердца к патогенному действию ишемии-реперфузии.

2. Изучить влияние агонистов и антагонистов каннабиноидных рецепторов на сократимость изолированного сердца крыс в условиях нормоксии и постише-мической реперфузии.

3. Выявить рецепторную специфичность кардиоваскулярных эффектов аго-ниста каннабиноидных рецепторов HU-210.

4. Исследовать влияние агонистов и антагонистов СВ-рецепторов на частоту возникновения аритмий и коронарный проток в условиях тотальной ишемии и реперфузии изолированного сердца.

5. Оценить значение внутриклеточных сигнальных систем: цАМФ и цГМФ, протеинкиназы С, NO-синтазы и КАТФ - каналов в реализации эффектов, связанных со стимуляцией каннабиноидных рецепторов.

Научная новизна

В результате проведенных исследований впервые определена роль СВ1 и СВ2 рецепторов в формировании устойчивости сердца к действию ишемии и реперфузии.

Приоритетными являются данные о влиянии агонистов каннабиноидных рецепторов на сократимость сердца, подвергнутого действию ишемии и реперфузии.

Новизна работы состоит в том, что в ней впервые проведено сравнительное исследование кардиопротекторных свойств селективных агонистов каннабиноидных рецепторов и выяснена рецепторная специфика полученных эффектов.

Впервые оценена роль эндогенных синтезируемых в миокарде агонистов СВ1 и СВ2 каннабиноидных рецепторов в формировании устойчивости сердца к повреждениям, вызванным действием ишемии и реперфузии.

Несомненную новизну представляют приоритетные данные о роли протеинкиназы С и Клтф-каналов в реализации кардиоваскулярных эффектов канна-биноидов.

Научно-практическая значимость

Настоящая работа вносит вклад в развитие фундаментальных представлений о механизмах каннабиноидергической регуляции сократительной функции в условиях нормальной перфузии и в условиях моделирования ишемических и ре-перфузионных повреждений сердца. Результаты работы расширяют представления о взаимодействии каннабиноидных рецепторов сердца с ионными каналами и внутриклеточными сигнальными системами в кардиомиоцитах.

Основные положения работы могут быть использованы в качестве теоретической основы для прикладных исследований в области создания принципиально новых фармакологических препаратов, обладающих кардиопротекторным действием.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Предварительная стимуляция СВ1-рецепторов миокарда обеспечивает значительное замедление процессов формирования необратимых повреждений мембран кардиомиоцитов в условиях тотальной ишемии и реперфузии in vitro.

2. В реализации каннабиноид-индуцированного повышения устойчивости сердца к повреждениям, вызванным действием тотальной нормотермической ишемией с последующей реперфузией, определяющую роль играет протеинкиназа С и КАТФ-каналы.

3. Синтезируемые в миокарде эндогенные агонисты СВ1- и СВ2- рецепторов не играют существенной роли в регуляции устойчивости изолированного сердца интактных крыс к действию ишемии и реперфузии.

4. Стимуляция кардиальных СВ1-рецепторов индуцирует снижение насосной функции сердца в условиях нормоксии и постишемической реперфузии.

Апробация работы: Материалы диссертации представлены на конференциях: Всероссийской 63-й Итоговой научной студенческой конференции им. Н.И. Пирогова (Томск 2004); V молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» (Новосибирск 2004); 5 конгрессе молодых ученых Сибирского государственного медицинского университета «Науки о человеке» (Томск 2004); на конференции «Актуальные вопросы хирургии №1» Красноярской государственной медицинской академии» (Красноярск 2005), 11 всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Наука и образование» Томского государственного педагогического университета (Томск 2007); «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» Санкт-Петербургской академии последипломного образования (Санкт-Петербург 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ, из них 10 - в журналах, рекомендованных «Перечнем ...» ВАК Российской Федерации, 5 - в материалах международных, российских и региональных конференций.

Гранты.

-Государственный контракт № 02.740.11.0714 с Федеральным агентством по науке и инновациям на выполнение научно-исследовательских работ по лоту «Проведение научных исследований коллективами научно-образовательных центров в области фундаментальной медицины и физиологии» шифр «2010-1.1-143044» по теме: «Рецепторная природа и сигнальный механизм феномена посткондиционирования, индуцированного каннабиноидами» (шифр заявки «2010-1.1143-044-005» 2010-2012 гг.

- Грант Министерства образования и науки РФ Регистрационный № 2.1.1/530 «Вклад каннабиноидных рецепторов в регуляцию устойчивости сердца к ишемическим и реперфузионным повреждениям» 2009-2010 гг.

-Государственный контракт № 02.512.11.2163 с Федеральным агентством по науке и инновациям на выполнение научно-исследовательских работ по лоту «Проведение проблемно-ориентированных поисковых исследований с участием иностранных научных организаций в области живых систем» шифр «2007-2-1.200-02-013» по теме: «Разработка на основе каннабиноидов нового лекарственного средства, увеличивающего устойчивость сердца к ишемии и реперфузии».

Объем и структура диссертации

Работа состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 390 литературных источников, из них 330 иностранные.

Диссертация изложена на 261 страницах машинописного текста, содержит 26 таблиц, 44 рисунка.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные исследования выполнены на крысах линии Вистар массой 250-300 г. Общее число животных 570. Использованные в эксперименте животные содержались в обычных условиях вивария. Опыты проводили, соблюдая принципы гуманного обращения с животными, регламентированные приказами МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г.; № 701 от 27.07.1978 г. и №1179 от 10.10.1983 г.

Характеристика используемых методов исследования:

1. Определение активности креатинфосфокиназы

Кардиопротекторный эффект каннабиноидов оценивали по уровню маркера повреждения кардиомиоцитов креатинфосфокиназы (КФК). Активность КФК в оттекающем от сердца перфузате определяли с использованием коммерческих энзиматических наборов фирмы «Biocon CK-Nac» (Marienhagen, Германия). Оптическую плотность образцов регистрировали на спектрофотометре Smart Spec Plus фирмы «Bio-Rad» (Philadelphia, США) при длине волны 340 нм.

2. Определение содержания циклических нуклеотидов (цАМФ и цГМФ) в экстрактах ткани миокарда

Для определения уровня цАМФ и цГМФ проводили предварительную экстракцию последних из ткани сердца этиловым спиртом [Maslov L.N. Lishmanov Yu.B., 1995]. Методика проведения радиоконкурентного анализа описана в инструкциях фирм-изготовителей для каждого РИА-комплекта. В своей работе мы использовали следующие наборы для проведения РИА-исследований: «RIA АМРс/сАМР» и «RIA сСМР»(компания «Immunotech», Марсель, Франция).

3. Моделирование тотальной ишемии изолированного перфузируемого по методу Лангендорфа сердца с последующим восстановлением перфузии

Изолированные сердца перфузировали в изоволюмическом режиме по методу Лангендорфа оксигенированным раствором Кребса-Хензелайта по схеме: 20 мин. адаптации + 10 мин. перфузии фармакологическим агентом + 10 мин без фармакологического агента («отмывка» от препарата) + 45 мин. тотальной ишемии + 30 минут реперфузии. Сократительную функцию сердца регистрировали в изоволюмическом режиме с помощью введенного в полость левого желудочка латексного баллончика, соединенного с датчиком давления SS13L (Biopac System Inc., Goleta, Калифорния, США), встроенного в аппарат для физиологических исследований МР35 компании «Biopac Systems Inc» (Goleta, California, США). В ходе экспериментов проводили запись кривой внутрижелудочкового давления и электрокардиограммы (ЭКГ). Баллончик заполняли дистиллированной водой и устанавливали конечное диастолическое давление на уровне 10-25 мм рт. ст. [Корки-на О.В. с соавт., 2001; Лакомкин В.Л. с соавт., 2002]. Для регистрации ЭКГ электроды располагали на ушке правого предсердия и верхушке сердца. Дальнейший расчет параметров сократимости изолированного сердца (ЧСС - частота сердечных сокращений (ударов/мин); ДРЛЖ - давление, развиваемое левым желудочком (мм рт.ст.); КДД - конечное диастолическое давление (мм рт. ст.); МСС -

максимальная скорость сокращения (мм рт.ст./с); МСР - максимальная скорость расслабления (мм рт.ст./с)) осуществляли с помощью оригинальной прикладной программы BSL PRO 3.7.3 компании «Biopac Systems Inc» (Goleta, California, США). Раствор Кребса-Хензелайта и все реактивы готовились на дистиллированной воде, которая подвергалась дополнительной очистке на установке «Simplicity» компании Millipore (Millipore, США). Используемые в эксперименте препараты растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) и после стабилизационного периода добавляли в перфузионный раствор.

4. Измерение коронарного протока

Измерение коронарного протока проводилось путем подсчета количества пер-фузата, протекающего через сердце за 1 минуту на 20-й, 30-й и 40-й минуте эксперимента. В течение всего реперфузионного периода проводился сбор пер-фузата и рассчитывалось его количество, протекающего через сердце за 1 минуту.

5. Оценка аритмий

В эксперименте нами оценивались желудочковые нарушения ритма: единичные и множественные желудочковые экстрасистолы (ЖЭ), желудочковые тахикардии (ЖТ) и желудочковые фибрилляции (ЖФ). Количественную оценку желудочковых аритмий осуществляли по бальной шкале, предложенной Lambeth Convention. При этом единичные ЖЭ оценивались в 1 балл, множественные ЖЭ в 2 балла, желудочковые тахикардии (ЖТ) в 3 балла, обратимые желудочковые фибрилляции (ЖФ) - в 5 баллов. При оценке тяжести аритмий у каждой крысы принималось во внимание самое тяжелое нарушение сердечного ритма.

Агонисты каннабиноидных рецепторов:

1. Селективный агонист СВ1- и СВ2-рецепторов HU-210 (6aR)-trans-3-(l,l-Di-methylheptyl)-6a,7,10,10a-tetrahydro-l-hydroxy-6,6-dimethyl-6H-dibenzo[b,d]pyran-9-methanol) [Mechoulam R. et al., 1988] добавляли в перфузионный раствор в конечной концентрации 0,1 и 1 мкМ/л [Ласукова О.В. и соавт., 2008].

2. Селективный агонист CBl-рецепторов АСРА (arachidonilcyclopropilamid/ N- (cyclopropil)-5Z,8Z,llZ,14Z-eicosatetraenamide) [Pertwee R. et al., 1999] добавляли в перфузионный раствор в конечной концентрации 0,1 и 1 мкМ/л.

3. Агонист каннабиноидных-рецепторов анандамид (арахидонилэтаноламид) [Pertwee R. et al., 1999] добавляли в перфузионный раствор в конечной концентрации 1 мкМ/л [Bonz A. et al., 2003].

4. Селективный агонист CBl-рецепторов метанандамид (R)-N-(2-Hydroxy-l-methylethyl)-5Z,8Z,llZ,14Z-eicosatetraenamide [Abadji V. et al., 1999] добавляли в перфузионный раствор в конечной концентрации 1 мкМ/л [Ford W. R. et al., 2002].

5. Селективный агонист СВ2-рецепторов JWH 133 [Pertwee R.G. et al., 1999], добавляли в перфузионный раствор в конечной концентрации 0,1 мкМ/л [Ласукова О.В. и соавт., 2008 г].

6. Селективный агонист СВ1- и СВ2-рецепторов CP 55,940 ((-)-cis-3-[2-Hy-droxy-4-(l,l-dymethylheptyl)phenyl]-trns-4-(hydroxipropyl)cyclohexanol) [Devane G. et al., 1988] добавляли в перфузионный раствор в конечной концентрации 0,1 и 1 мкМ/л [Ласукова О.В. и соавт., 2008].

Антагонисты каннабиноидных рецепторов:

1. Селективный антагонист CBl-рецепторов SR141716 (N-[piperidin-l-yl]-l-[l,2-dichIorophenyl]-4-methyl-lH-pyrazole-3-caboxamid HCl) [Mansbach R.S et al., 1996] добавляли в перфузионный раствор в конечной концентрации 0,1 и 1 мкМ/л [White R. и Hiley C.R., 1997; Joyeux M. et al., 2002].

2. Селективный антагонист CB2 рецепторов SR144528 (N-(lS)-endo-l,3,3-trimethylbicyclo[2.2.1]hepta-2-yl]-5-(4-chloro-3-methylphenyl)-l-(4-methylbenzyl)-pyrazole-3-carboxamide) [Bouaboula M. et al., 1999] добавляли в перфузионный раствор в конечной концентрации 0,1 и 1 мкМ/л [(White R. и Hiley C.R., 1997; Joyeux M. et al., 2002].

Фармакологические агенты для изучения сигнальных систем:

1. Стимулятор аденилатциклазы, селективный агонист ßr и (32-адренорецепторов изопротеренол [Гоффман Б. и Тэйлор П., 2006] добавляли в перфузионный раствор в конечной концентрации 100 нМ/л.

2. Блокатор протеинкиназы С хелеритрин [Herbert et al., 1990] добавляли в перфузионный раствор в конечной концентрации 2 мкМ/л [Bugge Е. и Ytrehus К., 1995].

3. Блокатор сарколеммальных и митохондриальных КАТР-каналов глибенкла-мид [Kim J.A. et al., 1999] добавляли в перфузионный раствор в конечной концентрации 1,0 мкМ/л [McCullough J.R. et al., 1991].

4. Ингибитор NO-синтазы L-NAME (NG-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) [Rees D.D. et al., 1990] добавляли в перфузионный раствор в конечной концентрации 100 мкМ/л [Andelova Е. et al., 2005; Depre С. et al., 1998; Pabla R. и Curtis M.J., 1996].

Статистическая обработка результатов. Анализ данных производился с помощью пакетов программы STATISTICA 6.0. Для проверки гипотезы о равенстве законов распределений использовали критерий Манна-Уитни. Статистически значимыми считались различия при р <0,05. Результаты всех экспериментов приведены в таблицах в виде X ± б, где X - среднее, ô - стандартная ошибка среднего, п - объем анализируемой подгруппы, р - достигнутый уровень значимости. Параметры сократительной функции миокарда выражали в абсолютных значениях (мм рт. ст., мм рт.ст./с, уд/мин). Конечное диастолическое давление (КДД) выражали в процентах относительно исходного уровня, принятого за 100%. Статистическую обработку качественных признаков (частота возникновения аритмий) осуществляли с помощью критерия х2-

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1.1. Сравнительный анализ кардиопротекторного эффекта агонистов каннабиноидных рецепторов

На первом этапе нашей работы для выявления наиболее мощного фармакологического агента мы провели сравнительный анализ агонистов и антагонистов СВ-рецепторов на предмет кардиопротекторного эффекта. С этой целью мы исследовали селективные агонисты (HU-210, АСРА, JWH133, анандамид, мета-нандамид, СР55940) каннабиноидных рецепторов. В результате оказалось, что

наиболее сильным кардиопротекторным эффектом обладал агонист каннаби-ноидных рецепторов Ни-210 в концентрациях 0,1 и 1 мкМ/л, поскольку снижение уровня КФК в среднем составило 43,3 %. В дальнейшем мы исследовали рецепторную природу и механизм кардиопротекторного эффекта на примере селективного агониста СВ1- и СВ2-рецепторов ни-210.

мкМ/г х мин

ph гЬ Т -

■п *

1 гч 1 Г4! I4! * nh —

123456789 10

Рис. 1. Сравнительный анализ кардиопротекторного эффекта агонистов канна-биноидных рецепторов. 1 - контроль, 2 - анандамид (1 мкМ/л), 3 - метананандамид (1 мкМ/л), 4 - АСРА (0,1 мкМ/л), 5 - АСРА (1 мкМ/л), б - JWH133 (0,1 мкМ/л), 7 -СР55940 (0,1 мкМ/л), 8 - СР55940 (1 мкМ/л), 9 - HU-210 (0,1 мкМ/л), 10 - HU-210 (1 мкМ/л). Примечание-. * - Р<0,05 по сравнению с контролем

1.2. Исследование роли СВ1 и СВ2 каннабиноидных рецепторов в реализации кардиопротекторного действия HU-210

С целью определения рецепторной природы кардиопротекторного эффекта препарата были проведены серии экспериментов с применением селективных блокаторов СВ1 и СВ2 рецепторов: SR141716 и SR144528.

Оказалось, что кардиопротекторный эффект каннабиноида HU-210 не проявляется в случае предварительной блокады СВ1-рецепторов с помощью SR141716 (рис. 2). Как показано на рисунке 2, после перфузии изолированных сердец раствором, содержащим SR141716 (0,1 мкМ/л) и HU 210 (0,1 мкМ/л), ре-перфузионный выброс креатинкиназы практически не отличался от соответствующих значений контрольной серии.

В то же время, применение блокатора СВ2-рецепторов SR144528 не приводило к устранению кардиопротекторного эффекта HU-210 (рис. 2). При этом сами антагонисты никак не повлияли на уровень КФК в перфузате (рис. 2). Таким образом, исходя из полученных нами данных, можно констатировать, что кардиопротекторный эффект HU-210 связан с активацией СВ1-рецепторов.

1.3 Роль эндогенных агонистов каннабиноидных рецепторов миокарда в формировании устойчивости сердца к действию ишемии и реперфузии

Задачей второго этапа нашей работы было изучение влияния блокады СВ1- и СВ2-рецепторов на устойчивость миокарда к действию ишемии и реперфузии.

10

Рис. 2. Уровень КФК в перфузате до ишемии и во время реперфузии в сериях с применением агониста СВ1- и СВ2-рецепторов HU-210 (0,1 мкМ/л.), антагониста СВ1-рецепторов SR141716 (ОД мкМ/л.), антагониста СВ2 рецепторов SR141716 (0,1 мкМ/л.). 1 - контроль, 2 - HU-210, 3 - SR141716, 4 - SR144528, 5 - SR141716 + HU210, 6 - SR144528 + HU-210. Примечание: * - Р<0,05 по сравнению с контролем

С учетом этого нами были выполнены отдельные серии экспериментов с использованием селективных блокаторов каннабиноидных рецепторов 1-го и 2-го типов: SR 141716 и SR144528 в конечной концентрации ОД мкМ/л, способной полностью заблокировать соответствующий тип СВ-рецепторов [Gebremedhin D. et al., 1999]. Исследуемые антагонисты СВ-рецепторов добавляли в перфузи-онный раствор и проводили эксперимент по той же схеме, что и все предыдущие серии.

В случае предварительной блокады СВ1-рецепторов миокарда с помощью SR 141716 и блокады СВ2-рецепторов с помощью SR144528 каких-либо существенных изменений активности креатинфосфокиназы в доишемическом и ре-перфузионном периоде нами отмечено не было. Изменение уровня КФК в оттекающем от сердца растворе оставалось практически идентичным в контрольной и опытной сериях на всех сроках наблюдения.

Таким образом, полученные нами результаты давали все основания считать, что эндогенные агонисты каннабиноидных рецепторов не играют существенной роли в регуляции устойчивости сердца неадаптированных крыс к действию ишемии и реперфузии. К сказанному следует добавить, что сходные данные были получены нами ранее в экспериментах in vivo.

1.4. Влияние агониста СВ1 и СВ2 каннабиноидных рецепторов HU-210 на частоту сердечных сокращений

В контрольной серии частота сердечных сокращений (ЧСС) с момента воспроизведения тотальной ишемии непрерывно падала и к 10-й минуте происходила полная остановка сердца. В начале реперфузии мы наблюдали снижение данного показателя в 1,2 раза по отношению к исходным значениям (Р<0,01). К 30-й минуте реперфузионного периода среднестатистические значения ЧСС

11

незначительно возрастали и составляли уже 48% от исходного доишемического уровня (рис. 3).

В опытных сериях изолированные сердца перфузировали раствором Кребса-Хензелайта, в который добавляли селективный агонист каннабиноидных рецепторов Ни-210 в конечных концентрациях 0,1 мкМ/л и 1 мкМ/л После 10-минутной перфузии изолированного сердца раствором Кребса-Хензелайта, содержащим Ни-210 в концентрации 0,1 мкМ/л частота сердечных сокращений миокарда статистически достоверно не изменялась, хотя имелась тенденция к снижению этого показателя (рис. 3). В то же время, применение Ни-210 в указанной концентрации способствовало двукратному снижению частоты сердечных сокращений в постишемическом периоде по отношению к аналогичным величинам контрольной группы (рис. 3). Динамика ЧСС при использовании Ни-210 в большей концентрации (1 мкМ/л) оказалась идентичной изменениям данного показателя в предыдущей серии экспериментов (рис. 3). В период реперфузии нами также была зафиксирована выраженная брадикардия в сравнении с показателями в контрольной серии (рис. 3).

уд/мин

##

# ##*

т -л м-

ишемия

ИЗ 20 40 перфузия, мин 5 15 реперфузия 30 мин

контроль —о— Ни-210 (0,1 мкМ/л) -Д- НУ-210 (1 мкМ/л) |

Рис. 3, Влияние агониста каннабиноидных рецепторов НУ-210 (0,1 мкМ/л и 1 мкМ/л) на частоту сердечных сокращений изолированного сердца до ишемии и во время реперфузии. Примечание: # - Р<0,01 по сравнению с исходными значениями; ## - Р<0,05 по отношению к контролю; * - Р<0,05 по сравнению с контролем

Таким образом, агонист каннабиноидных рецепторов ни-210 в обеих используемых концентрациях не оказывал статистически значимого эффекта на ЧСС в доишемическом периоде и снижал этот показатель во время реперфузии.

1.5. Влияние агониста СВ1- и СВ2-рецепторов Ни-210 на силу сокращений

В контрольной серии давление, развиваемое левым желудочком (ДРЛЖ), непрерывно падало с момента воспроизведения тотальной ишемии, и к 10-й минуте ишемического воздействия происходила полная остановка сердца. Сразу по-

12

еле возобновления коронарной перфузии мы наблюдали снижение данного показателя в 2,6 раза по отношению к исходным значениям (р<0,01). К 30-й минуте реоксигенации ДРЛЖ оставалось в 1,4 раза ниже исходных доишемических значений (рис. 4). Как показано на рисунке 4, Ни-210 приводил к снижению силы сокращений в среднем на 68,4 % по сравнению с контролем (Р<0,05) (рис. 4). Отрицательный инотропный эффект препарата сохранялся и после десятиминутной «отмывки» сердца от препарата, во время которой наблюдалось дальнейшее снижение силы сокращения изолированного сердца по отношению к контролю (Р<0,05) (рис. 4). Отмеченный эффект не зависел от применяемой нами концентрации препарата.

перфузия, мин реперфузия.мин

контроль -о— ни-210 (1 мкМ/л) —А— HU-210 (0,1 мкМ/лТ]

Рис. 4. Влияние агониста HU-210 на давление, развиваемое левым желудочком до ишемии и во время реперфузии. Примечание: * - Р<0,05 по сравнению с контролем; # - Р<0,05 по сравнению с исходными значениями; ## - Р<0,01 по сравнению с исходными значениями

Несколько иная картина наблюдалась в постишемический период. Отрицательный инотропный эффект HU-210, добавляемого в конечной концентрации 0,1 мкМ/л, в реперфузионном периоде уже не проявлялся и изменения ДРЛЖ в этой серии экспериментов не отличались от соответствующих показателей контрольной группы на всех сроках реоксигенации (рис. 4).

МЕХАНИЗМЫ РЕАЛИЗАЦИИ КАРДИОТРОПНЫХ ЭФФЕКТОВ АГОНИСТОВ КАННАБИНОИДНЫХ РЕЦЕПТОРОВ

2.1. Роль циклического АМФ в реализации кардиотропных эффектов агониста каннабиноидных рецепторов HU-210

Основываясь на данных работ А. Howlett и А. Felder, выполненных на ней-рональных клетках [Felder A.C., 1992] или на клонированных каннабиноидных рецепторах [Howlett А., 1990] о том, что активация СВ-рецепторов, сопряженных с аденилатциклазой через Gi/(1-6enKM приводит к угнетению синтеза цАМФ, мы

13

предположили, что изменение уровня цАМФ может иметь прямое отношение к механизму инотропного и кардиопротекторного эффектов СВ-агониста Ни-210. Для проверки этой гипотезы мы провели серии экспериментов, в которых оценивали влияние Ни-210 на базальный и изопротеренол-стимулированный уровень цАМФ в миокарде, на 10-й минуте от начала стимуляции каннабиноидных рецепторов (рис. 5).

Результаты опытов показали, что после стимуляции каннабиноидных рецепторов с помощью Ни-210 на 10-й мин наблюдается снижение уровня цАМФ в миокарде на 29%. При этом изопротеренол вызывал повышение содержания цАМФ на 35% (рис. 5).

нМ/г

14 -

*

12 . т

1

10 .

8 . т

6 , * ---X— - 1

4 щ

2 |

0 ] шя

контроль ни-210 изопро- Н11-210 + теренол изопротеренол

Рис. 5. Влияние Н11-210, изопротеренола и их совместного применения на содержание цАМФ в миокарде. Примечание: * - Р<0,05 по отношению к контролю

Как видно из рисунка 5, после совместного применения ни-210 и изопротеренола уровень цАМФ в миокарде был статистически достоверно неотличим от соответствующих значений контрольной серии. Таким образом, агонист СВ-рецепторов Ни-210 ингибировал изопротеренол-индуцированное увеличение уровня цАМФ в миокарде (рис. 5).

На основании полученных данных о цАМФ-ингибирующем действии канна-биноида Ни-210 мы предположили, что отрицательный инотропный и хроно-тропный эффекты этого препарата могли быть следствием снижения уровня цАМФ в миокарде. Для подтверждения сказанного мы провели корреляционный анализ. Однако, вопреки ожиданиям, достоверной корреляции между ЧСС, ДРЛЖ, МСС, МСР и содержанием цАМФ выявлено не было, а коэффициент линейной корреляции г во всех случаях не превысил 0,4.

Таким образом, цитопротекторный и отрицательный инотропный эффекты, наблюдаемые при активации кардиальных каннабиноидных рецепторов, не были связаны с изменением внутриклеточного содержания цАМФ.

2.2. Роль ЫО-индуцированного сигнального механизма в реализации кар-диопротекторных и инотропных эффектов агониста каннабиноидных рецепторов Н11-210

Учитывая данные литературы о том, что каннабиноиды могут активировать синтез оксида азота [В1Шп§ег Т.У., е! а1„ 1998; Нппат С. е1 а1„ 1999а; 1999Ь; У1ш5гас1е К. е1 а!., 2009], который играет важную роль в повышении устойчивости миокарда к ишемическим воздействиям, мы предположили, что обнаруженные нами защитные эффекты каннабиноидов являются результатом стимуляции N0-синтазы. Поэтому мы предположили, что кардиопротекторный эффект каннабиноидов является результатом усиления синтеза N0 и, как следствие, повышения уровня цГМФ в миокарде. С этой целью были проведены эксперименты, в которых определяли уровень цГМФ в ткани миокарда на 10-й мин перфузии изолированного сердца раствором, содержащим СВ-агонист Н1Т-210 (0,1 мкМ/л). Кроме того, в тех же условиях мы определяли уровень цГМФ на 15-й мин ишемии, а также на 5-й и 30-й мин реперфузии. Однако нам не удалось обнаружить статистически значимых изменений уровня цГМФ в миокарде в ответ на стимуляцию СВ-рецепторов. Следовательно, защитный эффект Ни-210 развивался независимо от цГМФ, т.е. без участия гуанилатциклазы. Оставалось установить роль других >Ю-индуцированных механизмов в реализации кардиопротекторных и инотропных эффектов агониста каннабиноидных рецепторов Ни-210. С этой целью были проведены эксперименты с использованием блокатора ЫО-синтазы Ь-ЫАМЕ, который добавляли в перфузионный раствор в конечной концентрации 100 мкМ непосредственно перед стимуляцией СВ-рецепторов.

Во время реперфузии в контрольной серии экспериментов активность креа-тинкиназы в перфузате, оттекающем от сердца, возрастала в 4,6 раза по сравнению с исходными доишемическими значениями (рис. 6). В серии с применением Ни-210 в концентрации 0,1 мкМ/л реперфузионный выброс креатинкиназы был достоверно ниже, чем в контроле (рис. б).

мкМ/г х МИН 35 30 25 20 15 10 5 0

Рис. 6. Влияние блокатора ИО-синтазы Ь-ЫАМЕ (100 мкМ/л) и агониста каннабиноидных рецепторов ни-210 (0,1 мкМ/л) на активность креатинфосфокина-зы в перфузионном растворе до ишемии и во время реперфузии. 1 - контроль, 2 - Ни-210, 3 - Ь-ЫАМЕ, 4 - ЬЫАМЕ + Ни-210. Примечание: * - Р<0,05 по сравнению с контролем; ## - Р<0,01 по сравнению с исходными значениями

##

*

—1—

* *

—

Т 1 Г 1 Г

р-ЩШ 4| ^ 1

1 2 3 4 1 2 3 4

Исходные значения до ишемии Во время реперфузии

Однако в случае предварительной блокады NO-синтазы с помощью L-NAME кардиопротекторный эффект каннабиноида HU-210 сохранялся (рис. 6). При этом блокатор NO-синтазы L-NAME не оказывал достоверного влияния на уровень КФК. Следовательно, кардиопротекторный эффект HU-210 не был связан с активацией индуцированных NO-синтазой сигнальных механизмов.

Перфузия изолированного сердца раствором, содержащим L-NAME, вызывала брадикардию, которая даже усиливалась во время «отмывки» от препарата. Совместное применение L-NAME и СВ-агониста HU-210 сопровождалось усилением отрицательного хронотропного эффекта в период нормоксической перфузии и на 5-й и 15-й минутах реперфузии.

Сходные изменения наблюдались в случае исследования давления, развиваемого левым желудочком. Отрицательный инотропный эффект HU-210 не устраняется блокатором NO-синтазы L-NAME. Применение этого препарата оказывает отрицательный инотропный и хронотропный эффекты, которые еще более усиливаются при совместном использовании его с HU-210. Таким образом, применение препарата L-NAME оказывает отрицательный инотропный и хронотропный эффекты, которые еще более усиливаются при использовании его с HU-210.

2.3. Роль протеинкиназы С в реализации кардиотропных эффектов аго-ниста каннабиноидных рецепторов HU-210

Известно, что протеинкиназа С (ПКС) катализирует фосфорилирование ряда белков, обеспечивающих повышенную устойчивость сердца к ишемическим и реперфузионным воздействиям [Yellon D.M. et al., 2003]. Результаты проведенных экспериментов показали, после блокады протеинкиназы С кардиопротекторный эффект СВ-агониста HU-210 не проявляется (рис. 7). Применение одного хеле-ритрина сопровождалось снижением реперфузионного выброса креатинкиназы по сравнению с контролем, но эти изменения носили недостоверный характер (рис. 7). Таким образом, протеинкиназа С участвует в формировании кардиопро-текторного эффекта агониста каннабиноидных рецепторов HU-210. Полученные результаты в полной мере согласуются с данными P. Lepicier с соавторами, исследующих кардиопротекторные эффекты каннабиноидов [Lepicier P. et ai., 2003]. Мишенями ПКС, которые участвуют в формировании адаптивной реакции сердца в ответ на ишемическое прекондиционирование являются КАТФ-каналы [Fryer R.M. et al., 2001], а также тирозинкиназы [Baines С.Р. et al., 1998,1999].

Для того, чтобы выяснить значение протеинкиназы С в реализации хроно-тропных эффектов каннабиноидных рецепторов, мы применяли блокатор этого фермента хелеритрин, который добавляли в перфузионный раствор перед стимуляцией СВ-рецепторов в конечной концентрации 2 мкМ/л Применение блокато-ра ПКС хелеритрина не повлияло на отрицательный хронотропный эффект агониста СВ-рецепторов HU-210. При этом сам по себе хелеритрин также не оказывал статистически достоверного влияния на ЧСС.

Перфузия сердец хелеритрином приводила к снижению ДРЛЖ в среднем на 58 % по сравнению с контролем (Р<0,05). В серии с совместным применением СВ-аго-

мкМ/гх мин

12 3 4 Исходные значения до ишемии

12 3 4 Во время реперфузии

Рис. 7. Влияние блокатора протеинкиназы С хелеритрина (2 мкМ/л.) и агонис-та каннабиноидных рецепторов HU-210 (0,1 мкМ/л.) на активность креатинфос-фокиказы в перфузионном растворе до ишемии и во время реперфузии. 1 - контроль, 2 - HU-210, 3 - хелеритрин, 4 - хелеритрин + HU-210. Примечание: * -Р<0,05 по сравнению с контролем

ниста и хелеритрина мы также наблюдали снижение силы сокращений изолированного сердца, которое почти не проявлялось во время «отмывки» от препаратов.

Таким образом, применение блокатора протеинкиназы С позволило заключить, что ПКС не участвует в реализации отрицательного хронотропного действия СВ-агониста. Ингибирование ПКС хелеритрином сопровождалось снижением параметров сократимости изолированного сердца, что не позволяет рассматривать ПКС в качестве одного из звеньев каннабиноидергической регуляции инотропной функции миокарда.

Таким образом, ПКС играет ведущую роль в реализации кардиопротек-торного эффекта СВ-агониста HU-210. Механизм, с помощью которого проте-инкиназа С опосредует своё цитопротекторное действие HU-210, до настоящего времени не изучен.

2.4. Роль КАтф-каналов в механизмах реализации кардиотропных эффектов агониста каннабиноидных рецепторов HU-210

Существует ряд публикаций о том, что активация КДТФ-каналов обеспечивает повышение толерантности кардиомиоцитов к патогенному действию ишемии-ре-перфузии [O'Rourke В., 2004; Patel H.H. et al., 2005]. Мы предположили, что в основе защитного эффекта каннабиноидов может лежать активация КАтф-каналов и провели эксперименты с использованием блокатора КАТФ-каналов глибенкламида.

Применение HU-210 в концентрации 0,1 мкМ/л сопровождалось снижением реперфузионного выброса КФК по сравнению с контролем. Предварительное применение глибенкламида не оказывало достоверного влияния на уровень КФК в растворе, оттекающем от сердца в реперфузионный период (рис. 8). Стимуляция СВ-рецепгоров с помощью агониста HU-210 на фоне блокады КАТФ-каналов глибенкламидом приводило к устранению кардиопротекторного эффекта СВ-агониста (рис. 8). Полученные результаты свидетельствуют о том, что КАТФ-кана-лы участвуют в реализации цитопротекторного эффекта СВ-агониста HU-210.

мкМ/г х мин 25 т-

## ^ #f

20

10

15

0

5

12 3 4 Исходные значения до ишемии

12 3 4 Во время реперфузии

Рис. 8. Влияние блокатора Клтф-каналов глибенкламида (1 мкМ/л) и агониста каннабиноидных рецепторов HU-210 (0,1 мкМ/л) на активность креатинфос-фокиназы в перфузионном растворе до ишемии и во время реперфузии. 1 - контроль, 2 - HU-210, 3 - Глиб., 4 - Глиб. + HU-210. Примечание: * - Р<0,05 по сравнению с контролем; ## - Р<0,01 по сравнению с исходными значениями. Глиб. -глибенкламид

Для того, чтобы выяснить значение КАТФ-каналов в реализации инотропных и хронотропных эффектов HU-210, мы применяли глибенкламид, который добавляли в перфузионный раствор перед стимуляцией СВ-рецепторов в конечной концентрации 1 мкМ/л После 10-минутной перфузии изолированного сердца раствором Кребса-Хензелайта, содержащим блокатор глибенкламид, мы наблюдали выраженное снижение ЧСС, которое проявлялось и в серии с совместным использованием глибенкламида и HU-210. После применения глибенкламида мы также наблюдали достоверное снижение ДРЛЖ в 1,5 раза, которое сохранялось во время 10-минутной перфузии без препарата. Применение HU-210 на фоне глибенкламида сопровождалось существенно менее выраженным снижением ДРЛЖ.

Таким образом, Клтф-каналы принимают участие в реализации кардиопротек-торного эффекта СВ-агониста HU-210. Активация Клтф-каналов не играет существенного значения в реализации хронотропного действия СВ-агониста. Ингибирование КАТФ-каналов сопровождается снижением параметров сократимости изолированного сердца, что не позволяет рассматривать значение этого сигнального пути в механизме каннабиноидергической регуляции инотропной функции миокарда.

2.5. Влияние агонистов и антагонистов СВ1- и СВ2-рецепторов на коронарный проток изолированного перфузируемого сердца

В контрольной серии коронарный проток в процессе 40-й минутной нор-моксической перфузии изолированного сердца несколько снижался. В пости-шемическом периоде наблюдалось снижение данного показателя по отношению к исходным значениям, что является типичным проявлением реперфузионной эндотелиальной дисфункции. Изолированные сердца перфузировали раствором Кребса-Хензелайта, в который добавляли СВ-агонисты HU-210, CP 55.940, АСРА,

JWH 133, анандамид, метанандамид и блокаторы СВ1- и СВ2-рецепторов SR141 и SR144. Оказалось, что ни один из названных лигандов не влиял на коронарный проток до и после ишемии. Следовательно, каннабиноиды не участвуют в регуляции тонуса коронарных сосудов в норме и в условиях ишемии-реперфузии.

2.6. Влияние лигандов каннабиноидных рецепторов на устойчивость изолированного сердца к аритмогенному воздействию ишемии и реперфузии

Для исследования роли СВ1- и СВ2-рецепторов в возникновении реперфу-зионных аритмий нами было изучены антиаритмические эффекты СВ-агонистов (HU-210, CP 55.940, АСРА, JWH 133, анандамид, метанандамид) и СВ-антагони-стов (SR144 и SR141). В группе контроля в реперфузионном периоде были зарегистрированы следующие типы аритмий: множественные экстрасистолы, желудочковая тахикардия и желудочковая фибрилляция. Применение лигандов СВ1 и СВ2-рецепторов никак не повлияло на характер и частоту возникновения аритмий в реперфузионном периоде по сравнению с контролем. Таким образом, каннабиноиды не участвуют в регуляции устойчивости сердца к аритмогенному влиянию реперфузии in vitro.

Анализ всех приведенных результатов позволил нам сформулировать рабочую гипотезу возможного сигнального механизма кардиопротекторного эффекта каннабиноидов, схема которой приведена на рисунке 9. В наших экспериментах было показано, что в развитии кардиопротекторного эффекта HU-210 участвует протеинкиназа С (ПКС), поскольку блокада этого энзима хелеритри-ном способствовала устранениию кардиопротекторного эффекта СВ-агониста. Возможным внутриклеточным механизмом, ведущим к активации ПКС, может быть следующее: взаимодействие СВ-агониста с СВ-рецептором, сопряженным через Gi-белок с фосфолипазой С (ФЛС). Активация ФЛС стимулирует синтез диацилглицерола (ДАГ). Последний активирует ПКС, которая, в свою очередь, стимулирует МАР-киназный каскад и приводит к ингибированию апоптоза [Lepicier P. et al., 2003]. Другим сигнальным путем, участвующим в кардиопротек-торном эффекте HU-210 может являться активация КАТФ-каналов. В эксперименте было показано, что названные ионные каналы участвуют в реализации кардиопротекторного эффекта HU-210, поскольку глибенкламид, используемый на фоне HU-210, устранял кардиопротекторный эффект HU-210. Нами было установлено, что в реализации инотропного и кардиопротекторного эффектов HU-210 не принимает участие цАМФ, хотя активация СБ 1-рецептора приводит к снижению уровня цАМФ в кардиомиоцитах.

ВЫВОДЫ

1. Активация кардиальных каннабиноидных рецепторов предупреждает некроз кардиомиоцитов в условиях глобальной ишемии и реперфузии изолированного сердца.

2. Эндогенные агонисты каннабиноидных рецепторов не играют существенной роли в регуляции устойчивости изолированного сердца интактных животных к действию ишемии и реперфузии.

Рис. 9. Предполагаемый сигнальный механизм кардиопротекторного эффекта агониста СВ-рецепторов HU-210

3. Стимуляция каннабиноидных рецепторов способствует снижению частоты и силы сокращений изолированного сердца в условиях нормоксии и по-стишемической реперфузии.

4. Кардиопротекторный эффект агониста каннабиноидных рецепторов HU-210 опосредуется через активацию каннабиноидных рецепторов первого типа.

5. Активация каннабиноидных рецепторов миокарда не влияет на частоту возникновения реперфузионных аритмий и на коронарный проток.

6. Кардиопротекторный эффект агониста СВ1- и СВ2-рецепторов HU-210 реализуется за счет активации протеинкиназы С и КЛТФ-каналов, не будучи связанным с изменением активности NO-синтазы и уровня циклических нуклеотидов.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Маслов Л.Н., Ласукова О.В., Крылатов A.B., Лишманов Ю.Б., Пертви Р. Изменение инотропной функции сердца и степени повреждения кардио-миоцитов при активации каннабиноидных рецепторов в условиях ишемии и реперфузии // Рос. физиол. жур. 2003. Т. 89, № 9; С. 1108-1116.

2. Маслов Л.Н., Ласукова О.В., Крылатов A.B., Ужаченко Р.В., Пертви Р. Дж. Селективный агонист каннабиноидных рецепторов HU-210 снижает насосную функцию изолированного перфузируемого сердца: роль цАМФ и цГМФ // Бюлл. экспер. биол. мед. - 2004. - Т. 138, № 12. - С. 622-625.

20

3. Крылатов A.B., Маслов Л.Н., Ласукова О.В., Пертви Р. Дж. Антагонисты кан-набиноидных рецепторов проявляют свойства парциальных агонистов в экспериментах на изолированном перфузируемом сердце крысы // Бюлл. экспер. биол. мед. - 2005. - Т. 139, № 5. - С. 512-516.

4. Ласукова О.В. Влияние лигандов каннабиноидных рецепторов на сократимость изолированного сердца крысы и уровень циклических нуклеотидов в миокарде // Сб. статей 6-го ежегодного семинара «Актуальные проблемы диагностики, фармакотерапии и хирургического лечения заболеваний сердечнососудистой системы». - Томск. 2005. - С. 60-62.

5. Ласукова О.В. Влияние лигандов каннабиноидных рецепторов на сократимость изолированного сердца и содержание циклонуклеотидов в миокарде / Тез. докл. 1-го съезда кардиологов Сибирского федерального округа. - Томск, 8-9 июня 2005 г. с.128.

6. Крылатов A.B., Маслов Л.Н., Ермаков С.Ю., Барзах Е.И., Ласукова О.В., Кро-уфорд Д., Гэдесси Р., Серебров В.Ю. Отрицательный хронотропный эффект каннабиноидов и их водорастворимой эмульсии связан с активацией кардиаль-ных СВ1-рецепторов // Бюлл. экспер. биол. и мед. 2006; Т.142 № 10. С. 433-436.

7. Крылатов А. В., Маслов Л. Н„ Ермаков С. Ю., Ласукова О. В., Барзах Е. И., Кроуфорд Д., Пертви Р. Дж. Значение кардиальных каннабиноидных рецепторов в регуляции сердечного ритма, сократимости миокарда и электрофизиологических процессов в сердце // Изв. РАН. 2006. № 6. С. 7-16.

8. Маслов Л.Н., Ласукова О.В., Крылатов A.B., Ханус Л.О., Пертви Р., Иван-чук И.И., Кроуфорд Д. Роль каннабиноидных рецепторов в регуляции сократимости сердца при ишемии/реперфузии // Бюлл. экспер. биол. и мед. -2006. - Т. 142, №11. - С. 500-504.

9. Маслов Л.Н., Ермаков С.Ю., Ласукова О.В., Барзах Е.И., Крылатов A.B., Кроуфорд Д., Серебров В.Ю. Об участии каннабиноидных рецепторов в регуляции сердечного ритма и сократимости сердца // Росс, физиол. жур. - 2006. - Т. 92, № 4. - С. 429-439.

10. Ласукова О.В. Участие СВ-1 и СВ-2 каннабиноидных рецепторов в регуляции устойчивости миокарда к действию ишемии и реперфузии / Сб. статей 8-го ежегодного семинара «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной кардиологии». - Томск. -2007. - С. 15-16.

11. Ласукова О.В., Маслов Л.Н., Ермаков С.Ю., Крауфорд Д., Барт Ф., Крылатов A.B., Хануш Л.О. Роль каннабиноидных рецепторов в регуляции толерантности сердца к действию ишемии и реперфузии // Известия РАН. 2008; 35(4): С. 471-478.

12. Маслов Л.Н., Ласукова О.В., Ермаков С.Ю. Рецепторная специфичность и механизм кардиопротекторного действия каннабиноидов. Российско-норвежский симпозиум «Защита миокарда: молекулярные, патофизиологические и клинические аспекты». Тез. докл. Региональное кровообращение и микроциркуляция. 2008.

13. Ласукова О.В., Ермаков С. Ю. Профилактика ишемических и реперфузион-ных повреждений сердца с помощью агониста каннабиноидных рецепторов

HU-210 // Сб. тезисов научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины». СПб., 2009. - С. 44-45.

14. Маслов Л.Н., Крылатов A.B., Ласукова О.В. Каннабиноидергическая регуляция сократимости сердца при ишемии/реперфузии // Вестник ТГПУ. - 2009. -Т. 81,№3,-С.25-31.

15. Маслов Л.Н., Крылатов A.B., Ласукова О.В., Халиулин И.Г. Отрицательный хронотропный эффект каннабиноидов связан с активацией кардиальных СВ1 рецепторов // Вестник ТГПУ. - 2009. Т. 81, №3. - С. 36-42.

Список сокращений

АТФ - аденозинтрифосфат

ДРЛЖ - давление, развиваемое левым желудочком

КАТФ-каналы - АТФ-зависимые калиевые каналы

кдд - конечное диастолическое давление

MCP - максимальная скорость расслабления

МСС - максимальная скорость сокращения

МАРК - киназы (mitogen activated kinase) - митогенактивируемые киназы

СВ - каннабиноидные рецепторы

ПКС - протеинкиназа С

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат

ФЛС - фосфолипаза С

ЧСС - частота сердечных сокращений

ЭКГ - электрокардиограмма

DMSO - диметилсульфоксид

Подписано в печать: 01.12.2010 г. Бумага: офсетная Тираж: 100 экз. Печать: трафаретная

Формат: 60x84/16 Усл. печ. л.: 1,39

Заказ: 555/Н

Издательство

Томского государственного педагогического университета

г. Томск, ул. Герцена, 49. Тел. (3822) 52-12-93 Щц

e-mail: publish@tspu.edu.ru таштш

Актуальность. Согласно статистическим данным, в России сред лиц трудоспособного возраста от' сердечно-сосудистых заболеваний^ умирает 34% мужчин и 39% женщин [Оганов Р.Г. и др., 1994]. В структуре смертности от заболеваний, связанных с атеросклерозом, на долю ишемической болезни сердца (ИБС) у мужчин приходится 60% летальных исходов, а у женщин — 41% [Оганов Р.Г. и др., 1994]. Главной причиной смерти при ИБС является острый инфаркт миокарда (ОИМ) [Калинина A.M. и др., 1996; Сыркин A.C., 2003]. Такое положение дел связано с тем, что меры профилактики и лечения этой патологии несовершенны. Единственным эффективным методом лечения ОИМ является возобновление коронарного кровотока ишемизированного участка сердца (тромболизис, стентирование, коронарное шунтирование), которое, к сожалению, приводит к развитию реперфузионного синдрома. Лекарственных средств, способных радикально повысить устойчивость кардиомиоцитов к действию ишемии-реперфузии, в настоящее время не существует. Применяемые при лечении ОИМ фармакологические препараты (лидокаин, ß-адреноблокаторы, нитраты, антагонисты кальция) неспособны эффективно предотвратить ишемические и реперфузионные повреждения сердца, обладают узким спектром действия и приводят к развитию побочных эффектов [Марков В.А. и др., 1996; Преображенский Д.В. и др., 1998; Шалаев, C.B. и др., 2002; Moukarbel G.V. et al., 2004]. Причиной подобного положения дел является-ограниченность наших знаний о внутриклеточных сигнальных механизмах, регулирующих устойчивость кардиомиоцитов к патогенному действию ишемии-реперфузии. Таким образом, приходится констатировать, что до настоящего времени не созданы эффективные препараты, способные увеличить выживаемость кардиомиоцитов при инфаркте миокарда и обладающие минимумом нежелательных эффектов. В связи с этим, весьма актуален поиск новых кардиопротекторных препаратов, способных эффективно предупреждать развитие ишемических и реперфузионных повреждений.

После открытия феномена ишемического прекондиционирования [Jennings R.B:, 1997; Murry С.Е. et al., 1986, 1990], в кардиологии получило развитие новое направление, суть которого заключается, в стимуляции эндогенных защитных механизмов при ишемии и реперфузии сердца. Суть названного феномена заключается в повышении толерантности сердца к патогенному действию длительной» ишемии после нескольких предварительных сеансов кратковременной > ишемии- и реперфузии. Основными проявлениями ишемического прекондиционирования (ИП) являются: а) ограничение зоны инфаркта [Гурин A.B. и др., 1997; Каган-Пономарев М.Я., 1998; Кузнецов В.А. и Тодосийчук В:В., 1998; Литвицкий П.Ф., 1994; Сидоренко Г.И. и др:, 1997; Хаткевич А.Н. и др., 1998; Bains С.Р. et al., 1999; Downey J.M. и Cohen V., 1995; Jennings R.B. и Reimer K.A., 1997; Kloner R.A. и Jennings R.B., 2001; Post H. и Heusch G., 2002; Schultz J.E.J, et al., 2001; Van, Winkle D.W. et ah, 2001]; 6) быстрое восстановление сократимости при реперфузии [Коркина О.В1 и др., 2001; Писаренко O.Ht и др., 1997; Cave A.C. 1992; Laurikka J. et al., 2002; Pantos C.I. et al., 1999; Takano H. et al., 2000; Tang X.L., 2002]; в) снижение выраженности ишемических и реперфузионных нарушений ритма сердца [Edwards R.J. et al., 2002; Kolar F. и Parratt J.R., 1997; Lawson C.S. et al., 1993; OkruhlicovaL., 1999; 2000; Sakamoto J. et al., 1999; Zhu J. Zhu и Ferrier G. R'., 1998]. Следовательно, феномен ишемического прекондиционирования представляет собой¡ настолько эффективный способ защиты миокарда, что логично» было предположить - раскрытие механизмов, его развития позволит создать новые лекарственные препараты, способные предотвратить повреждения^ сердечной мышцы при ишемии-реперфузии.

Известно, что ишемическое прекондиционирование связано с активацией G-белок-сопряженных рецепторов GPCR (G-protein coupled receptor) [Вaines С.Р. et al., 1999; Downey J. и Cohen M.V., 1997; Post H. и Heusch G., 2002; Schulz J. E. J. et al, 2001]. Наиболее известными медиаторами ИП считают аденозин, брадикинин, опиоиды [Liu Y. et al., 1991; Goto M. et al., 1995; Chien G. L. et al.,

1999; Miki Т. et al., 1998; Schultz J.E. J. et al., 1997]. Однако аденозин может усугублять течение кардиогенного шока за счет выраженного гипотензивного эффекта [Easton* A. R. et al., 2005], а опиоиды могут вызывать формирование опиатной'Зависимости-[Пятницкая И.Н. и др., 1994]. Недавно были получены доказательства того, что феномен ИИ способны воспроизводить каннабиноиды [Крылатов А.В: и др., 2002; Угдыжекова Д.С. и др., 2002; Маслов JT.H; и др., 2003; Ласукова О.В. и др., 2008; Bouchard JiF. et al., 2003; Ribuot С. et al., 2004]. Кроме того, данные литературы и ранее полученные нами результаты позволяли надеяться, что в развитии кардиопротекции важная роль принадлежит каннабиноидным (СВ) рецепторам. Группой канадских ученых под руководством P. Lepicier показано снижение реперфузионного выброса креатинкиназы и лактатдегидрогеназы из миокарда под влиянием эндогенных каннабиноидов'2-арахидонилглицерола и пальмитоилэтаноламида [Lepicier Р. et al., 2003]. Ранее нами было показано, что селективный агонист каннабиноидных рецепторов HU-210 при профилактическом применении может оказывать кардиопротекторный эффект, ограничивая размер инфаркта миокарда при коронароокклюзии-реперфузии, то есть имитирует феномен прекондициони-рования [Угдыжекова Д.С. и др., 2002а; Крылатов A.B. и др., 20026]. Вместе с тем, оставалось неизвестным, активация каких субтипов каннабиноидных рецепторов обеспечивает цитопротекторное действие HU-210 и где расположены эти рецепторы. Все вышесказанное послужило основой для исследования кардиопротекторных свойств лигандов* известных субтипов СВ-рецепторов и выявления рецепторной специфики полученных эффектов.

Наряду с повреждением целостности мембран кардиомиоцитов, ишемическое воздействие сопровождается развитием сократительной дисфункции миокарда во время ишемии и реперфузии [Ostadal В. и Kolar F., 1999]. В этой связи следует отметить, что каннабиноиды способны влиять на силу и частоту сокращений сердца при системном введении [Маслов JI.H. и др., 2006; Ford et al., 2002; Smiley et al., 1976; Vidrio et al., 1996] и в экспериментах на изолированном перфузируемом сердце [Маслов JI.H. и др., 2006]. Однако до настоящего времени нет единого мнения о роли этих соединений в регуляции инотропной функции сердца при ишемии/реперфузии.

Одним из опасных осложнений реперфузии, приводящих к серьезным нарушениям работы сердца, является возникновение желудочковых аритмий [Ostadal В*, и Kolar F., 1999]: Учитывая ранее полученные нами данные о способности, каннабиноидов повышать > устойчивость сердца к аритмогенному действию адреналина и аконитина [Угдыжекова и др., 2000, 2001; Крылатов и др. 2001, 2002], мы сочли целесообразным продолжить исследование антиаритмических свойств этих соединений в условиях ишемии/реперфузии изолированного сердца.

Характерным проявлением ишемических и реперфуз ионных повреждений миокарда является дисфункция эндотелия коронарных артерий, которая приводит к феномену неполного восстановления* коронарной перфузии (по-reflow phenomenon) [Ostadal В; и Kolar F., 1999]. В 2003 году J.F. Bouchard и соавт. обнаружили [Bouchard J.F. et al., 2003], что ишемическое прекондиционирование предупреждает нарушение эндотелий-зависимой вазодилатации, вызванное ишемией и реперфузией изолированного сердца. Прекондиционирование воспроизводили с помощью 5-минутной ишемии за 5 мин до глобальной ишемии изолированного сердца. Защитный эффект прекондиционирования не проявлялся в условиях блокады как СВ Г-рецепторов, так и после ингибирования СВ2-рецепторов [Bouchard J.F. et al., 2003]. Эндогенные каннабиноиды пал ьмитоилэтаноламид и 2-арахидонилглицерол (2-АГ) имитировали* вазопротекторный эффект прекондиционирования [Bouchard J.F. et al., 2003]. Представленные факты говорят о том, что* эндогенные каннабиноиды предупреждают повреждение эндотелия коронарных сосудов, вызванное ишемией-реперфузией изолированного сердца'. Однако было неясно, могут ли экзогенные каннабиноиды защищать эндотелий от действия ишемии-реперфузии. Эти факты послужили основанием для проведения нами фраг

§ J мента исследований, в котором оценивали влияние активации СВ-рецепторов на скорость коронарной перфузии в условиях постишемической реоксигенации.

В настоящее время в научной литературе имеются лишь единичные работы, посвященные изучению сигнальных путей, опосредующих кардиопротекторные эффекты каннабиноидов [Lepicier P. et al., 2003]. В i, большинстве клеток каннабиноиды ингибируют аденилатциклазу за счёт активации 01/о-белков [Felder С.С. et al., 1993; Hillard С J. et al., 1990; Howlett A.C. et al., 1986; Sagan S. et al., 1999; Schlicker E. et al., 1997]. В тех клетках, где 1 СВ-рецепторы сопряжены с G^-белками, каннабиноиды стимулируют синтез цАМФ [Bonhaus D.W. et al., 1998; Glass M. и Felder С.С., 1997]. Относительно v роли СВ-рецепторов в регуляции уровня цАМФ в кардиомиоцитах не было полной ясности. Между тем, этот внутриклеточный мессенджер играет важную роль в аритмогенезе [Lübbe W.F., et al., 1992]. Другими возможными посредниками в сигнальном каскаде каннабиноидов могли являться протеинкиназа С, NO-синтаза. Данное предположение стало возможным благодаря имеющимся в литературе данным, доказывающим участие вышеназванных вторичных мессенджеров в механизме влияния каннабиноидов на миокард [Lepicier P. et al., 2003; 2004; Razavi Н.М. et al., 2005]. Относительно взаимодействия кардиальных СВ-рецепторов с АТФ-чувствительными К+-каналами (КАтф-каналы) в литературе нет данных. Однако i известно, что эти1 каналы играют важную роль в кардиопротекторном эффекте ишемического прекондиционирования [Yellon D.M. и Downey J., 2003].

Учитывая все вышесказанное, нам представлялось целесообразным выяснить локализацию каннабиноидных рецепторов, регулирующих устойчивость сердца к ишемии-реперфузии, рецепторную специфичность и г внутриклеточные сигнальные механизмы, обеспечивающие кардиопротекторный эффект каннабиноидов при ишемии и реперфузии.

Цель исследования: исследовать роль кардиальных каннабиноидных рецепторов в регуляции устойчивости сердца к действию ишемии и реперфузии. Задачи:

1. Исследовать роль каннабиноидных рецепторов в формировании устойчивости изолированного сердца к патогенному действию ишемии-реперфузии.

2. Изучить влияние агонистов и антагонистов каннабиноидных рецепторов на сократимость изолированного сердца крыс в условиях нормоксии и постишемической реперфузии.

3. Выявить рецепторную специфичность кардиоваскулярных эффектов агониста каннабиноидных рецепторов Ни-210.

4. Исследовать влияние агонистов и антагонистов СВ-рецепторов на частоту возникновения аритмий и коронарный проток в условиях тотальной ишемии и реперфузии изолированного сердца,

5. Оценить значение внутриклеточных сигнальных систем! цАМФ и цГМФ, протеинкиназы С, 1\Ю-синтазы и КАтФ-каналов в реализации эффектов, связанных со стимуляцией каннабиноидных рецепторов.

Научная новизна

В результате проведенных исследований впервые определена роль СВ1- и СВ2-каннабиноидных рецепторов в формировании устойчивости сердца к действию ишемии и реперфузии.

Приоритетными являются данные о влиянии агонистов каннабиноидных рецепторов на сократимость сердца, подвергнутого действию ишемии и реперфузии.

Новизна работы состоит в том, что в ней впервые проведено сравнительное исследование кардиопротекторных свойств селективных агонистов каннабиноидных рецепторов и выяснена рецепторная специфика полученных эффектов.

Впервые оценена роль эндогенных синтезируемых в миокарде агонистов СВ1- и СВ2-каннабиноидных рецепторов в формировании устойчивости сердца к повреждениям, вызванным ¡действием ишемии ифеперфузии.

Несомненную новизну представляют приоритетные данные о роли протеинкиназы С и КАтФ-каналов в реализации кардиоваскулярных эффектов каннабиноидов.

Научно-практическая значимость

Настоящая работа вносит вклад в развитие фундаментальных представлений о механизмах каннабиноидергической • регуляции сократительной, функции в условиях нормальной перфузии и в условиях моделирования ишемических и реперфузионных повреждений сердца. Результаты работы расширят представления о взаимодействии каннабиноидных рецепторов сердца с ионными каналами и внутриклеточными сигнальными системами в кардиомиоцитах.

Основные положения работы могут быть использованы, в качестве теоретической основы для прикладных исследований в области создания принципиально новых фармакологических препаратов, обладающих кардиопротекторным действием. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Предварительная стимуляция СВ1-рецепторов миокарда обеспечивает значительное замедление процессов формирования необратимых повреждений мембран кардиомиоцитов в условиях тотальной ишемии и реперфузии in vitro.

2. В реализации каннабиноид-индуцированного повышения устойчивости сердца к повреждениям, вызванным действием тотальной нормотермической ишемии с последующей реперфузией, определяющую роль играет протеинкиназа С и КА1Ф-каналы.

3. Синтезируемые в миокарде эндогенные агонисты СВ1- и СВ2-рецепторов не играют существенной роли в регуляции устойчивости изолированного сердца интактных крыс к действию ишемии и реперфузии.

4. Стимуляция кардиальных СВ1-рецепторов индуцирует снижение насосной функции сердца в условиях нормоксии и постишемической реперфузии.

Апробация работы: Материалы диссертации представлены на конференциях: Всероссийской 63-й Итоговой научной студенческой конференции им. Н.И. Пирогова (Томск, 2004); V молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» (Новосибирск, 2004); 5 конгрессе молодых ученых Сибирского государственного медицинского университета «Науки о человеке» (Томск, 2004); на конференции «Актуальные вопросы хирургии №1» Красноярской государственной медицинской академии» (Красноярск, 2005); 11 всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Наука и образование» Томского государственного педагогического университета (Томск, 2007); всероссийской конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» Санкт-Петербургской академии последипломного образования (Санкт-Петербург, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, из них - 10 в центральных журналах, 5 - в материалах международных, российских и региональных конференций.

Гранты.

• Государственный контакт № 02.740.11.0714 с Федеральным агентством по науке и инновациям на выполнение научно-исследовательских работ по лоту «Проведение научных исследований коллективами научно-образовательных центров в области фундаментальной медицины и физиологии» шифр «2010-1.1-143-044» по теме: «Рецепторная природа и сигнальный механизм феномена посткондиционирования, индуцированного каннабиноидами» (шифр заявки «2010-1.1-143-044005» 2010-2012 гг.

• Грант Министерства образования и науки РФ Регистрационный № 2.1.1/530 «Вклад каннабиноидных рецепторов в регуляцию устойчивости сердца к ишемическим и реперфузионным повреждениям» 2009-2010 гг.

• Государственный контакт № 02.512.11.2163 с Федеральным агентством по науке и инновациям на выполнение научно-исследовательских работ лот «Проведение проблемно-ориентированных поисковых исследований с участием иностранных научных организаций в области живых систем» шифр «2007-2-1.2-00-02-013» по теме: «Разработка на основе каннабиноидов нового лекарственного средства, увеличивающего устойчивость сердца к ишемии и реперфузии».

Автор выражает глубокую благодарность своим научным руководителям профессору Л.Н. Маслову и д.м.н. Д.В. Рыжковой, а также член-корр. РАМН проф. Лишманову Ю.Б. за неоценимую помощь при работе над диссертационной работой.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проблема повышения устойчивости сердца к повреждающему действию ишемии и реперфузии является одной из наиболее важных задач современной кардиологии. Долгое время было неизвестно, можно ли вообще повысить устойчивость сердца к действию ишемии и реперфузии. Однако после открытия в 1986 г С. Murry и соавт. феномена ишемического прекондиционирования появилась надежда на разработку нового высокоэффективного метода профилактики повреждений кардиомиоцитов, возникающих при инфаркте миокарда [Murry С. et al., 1986]. Установлено, что фармакологическими агентами, имитирующими прекондиционирование помимо аденозина, брадикинина, опиоидов, могут являться и каннабиноиды [Joyeux-Faure М. et al., 2003; Lépicier P.et al., 2003]. Однако роль конкретных типов СВ-рецепторов в формировании повышенной устойчивости сердца к действию ишемии и реперфузии была изучена недостаточно, а также неизвестна локализация каннабиноидных рецепторов и внутриклеточные механизмы, опосредующие каннабиноидергическую устойчивость миокарда к повреждающему действию ишемии-реперфузии. В связи с этим, настоящая работа была разделена на следующие этапы:

• скрининг каннабиноидов на кардиопротекторную активностью;

• изучение инотропных и хронотропных эффектов каннабиноидов;

• выяснение рецепторной природы исследуемых эффектов агонистов каннабиноидных рецепторов;

• исследование роли каннабиноидов в регуляции коронарного протока и формировании аритмий;

• изучение сигнальных механизмов кардиотропных эффектов каннабиноидов.

Первоначальной задачей было определение значимости СВ-рецепторов в формировании устойчивости кардиомиоцитов к повреждающему действию ишемии и реперфузии. С этой целью в экспериментах на изолированном сердце мы изучили влияние агонистов СВ1- и СВ2-рецепторов на активность креатинкиназы, известного маркера повреждения мембран кардиомиоцитов, в перфузате за период реперфузии. В результате были получены данные о том, что целый ряд каннабиноидов, независимо от структуры их молекул, оказывают заметное цитопропротекторное действие в условиях ишемии и реперфузии миокарда. Антинекротический эффект проявлялся снижением реперфузионного выброса КФК в перфузат, оттекающий от сердца. По степени выраженности кардиопротекции исследуемые каннабиноиды располагались следующим образом: HU-210 > СР 55,940 > АСРА. Эти факты позволили нам предположить, что защитный эффект агонистов СВ-рецепторов был связан с активацией каннабиноидных рецепторов, так как наибольшее сродство к каннабиноидным рецепторам проявляет HU-210 [Pertwee R. et al., 1999].

Поскольку кардиопротекторный эффект проявлял селективный агонист СВ1-рецепторов АСРА, то можно было полагать, что цитопротекторный эффект каннабиноидов связан с активацией СВ1-рецепторов. Однако по кардиопротекторной активности этот СВ1-агонист значительно уступал HU-210. Кроме того, антинекротический эффект АСРА отмечался только при использовании препарата в концентрации 1 мкМ/л, в которой он может активировать и СВ2-рецепторы [Pertwee R. et al., 1999]. Исходя из сказанного, нельзя было исключить возможность того, что кардиопротекторный эффект каннабиноидов связан с активацией СВ2-рецепторов. Однако агонист СВ2-рецепторов JWH 133 не проявил кардиопротекторных свойств на модели тотальной ишемии и реперфузии изолированного сердца. Следовательно, для окончательного решения вопроса о рецепторной природе кардиопротекторного действия каннабиноидов необходимо было проведение дополнительных экспериментов с использованием высокоселективных антагонистов СВ-рецепторов. Эксперименты с использованием антагонистов каннабиноидных рецепторов показали, что кардиопротекторный эффект HU-210 in vitro связан с активацией СВ1-рецепторов.

Учитывая данные литературы об участии эндогенных каннабиноидов в патогенезе инфаркта миокарда [Bätkai S. и Pacher Р. et al., 2009; Rosenson R.S. et al., 2009] и способности эндогенных каннабиноидов синтезироваться из мембранных фосфолипидов в сердце и сосудах [Hiley C.R. et al., 2009], были выполнены эксперименты с использованием селективных блокаторов каннабиноидных рецепторов 1-го и 2-го типов. Однако в результате оказалось, что эндогенные агонисты каннабиноидных рецепторов не играют существенной роли в регуляции устойчивости сердца интактных животных к действию ишемии и реперфузии.

Наряду с повреждением целостности мембран кардиомиоцитов, ишемическое воздействие приводит к развитию сократительной дисфункции миокарда и нарушению сердечного ритма во время реперфузии. В связи с этим, в дальнейшем мы изучили значение кардиальных каннабиноидных рецепторов в регуляции сердечного ритма и сократимости миокарда в условиях реперфузии. Было установлено, что все исследуемые каннабиноиды вызывают снижение ЧСС, причем максимальным отрицательным хронотропным действием обладает HU-210. Отрицательный хронотропный эффект HU-210 исчезал после блокады СВ1-рецепторов препаратом SR141716A и сохранялся после селективного ингибирования СВ2-рецепторов с помощью СВ2-антагониста SR144528 (рис. 31). Сами ингибиторы каннабиноидных рецепторов не влияли на ЧСС (рис. 31). Полученные факты свидетельствуют о том, что каннабиноидергическая брадикардия вызвана активацией СВ1-рецепторов, а синтезируемые в миокарде эндогенные агонисты этих рецепторов не участвуют в регуляции ЧСС интактных животных. Сходные данные были получены нами ранее в экспериментах in vivo, в которых агонисты каннабиноидных рецепторов оказывали отрицательный хронотропный эффект при их внутривенном введении [Маслов JI.H. и др., 2006]. Полученные результаты не противоречат данным других исследователей. Так, Н. Vidrio и соавт. было обнаружено, что отрицательный хронотропный эффект HU-210 сохраняется в условиях ваготомии, а химическая симпатэктомия даже усиливает HU-210-индуцированную брадикардию. [Vidrio Н. et al., 1996]. Согласно полученным нами ранее данным, отрицательный хронотропный эффект HU-210 сохраняется в условиях блокады симпатических и парасимпатических ганглиев гексаметонием, что служит веским доказательством прямого действии каннабиноидов на синусовый узел [Маслов JI.H. и соавт., 2006]. Следовательно, результаты проведенных экспериментов на изолированном сердце дают основания утверждать, что отрицательный хронотропный эффект каннабиноидов связан с активацией именно кардиальных СВ-рецепторов.

Все изученные нами каннабиноиды оказывали отрицательный инотропный эффект, максимально выраженный у агониста СВ1- и СВ2-рецепторов HU-210. Ранее К.А. Smiley и соавт. также сообщали об отрицательном инотропном эффекте каннабиноидов [Smiley et al., 1976]. Однако эти исследователи использовали неселективные каннабиноиды в очень высоких концентрациях в диапазоне от 0,3 до 31 мг/л [Smiley et al., 1976], что существенно повышало вероятность неспецифического действия этих соединений на сердечную мышцу. Мы применяли HU-210, который по сродству к СВ-рецепторам в несколько тысяч раз превосходит каннабиноиды [Pertwee, 1999], использованные К.A. Smiley и соавт. [Smiley et al., 1976] в концентрации 100 нМ/л, обеспечивающей взаимодействие этого агониста только с указанным типом рецепторов. В другой работе, выполненной A. Bonz и соавт. [Bonz A. et al., 2003], зафиксировано снижение силы сокращений изолированных трабекул, выделенных из предсердия человека, после добавления в перфузионный раствор HU-210 в конечной концентрации 1 мкМ/л. Исходя из вышеизложенных фактов, мы считаем, что отрицательное инотропное действие каннабиноидов является результатом активации кардиальных каннабиноидных рецепторов.

Другой факт, который необходимо подчеркнуть — это отсутствие достоверных изменений конечного диастолического давления после применения каннабиноидов. Общеизвестно, что увеличение конечного диастолического давления является косвенным признаком перегрузки кардиомиоцитов ионами кальция. Подобное увеличение КДД и кальциевая перегрузка могут быть следствием избыточной мобилизации Са" из саркоплазматического ретикулума (СПР) [Thandroyen F.T. et al., 1988] или результатом нарушения аккумуляции Са2+ в СПР [Du Toit, Opie et al., 1994]. Следовательно, активация каннабиноидных рецепторов препятствует развитию перегрузки кардиомиоцитов ионами кальция. Подобный эффект каннабиноидов

Л I может быть связан: (1) с уменьшением выброса Са в СПР; (2) с усилением работы Са -насосов, удаляющих кальций из миоплазмы. К сожалению, ни литературные данные, ни результаты собственных исследований не позволяют нам с уверенностью говорить, какой именно из двух названных механизмов включается в ответ на оккупацию СВ-рецепторов каннабиноидами. По всей видимости, активация каннабиноидных рецепторов ведет к ограничению

04- О > мобилизации Са из СПР, так как усиление работы Са -насосов привело бы к увеличению скорости расслабления миокарда. Мы же, напротив, наблюдали замедление релаксации миокарда в ответ на добавление в перфузат НЦ-210.

Наиболее трудным для обсуждения остается вопрос о рецепторной природе инотропного эффекта каннабиноидов. Выраженный отрицательный инотропный эффект оказывал только Ни-210, который обладает наибольшим сродством к каннабиноидным рецепторам, что говорит в пользу участия этих рецепторов в отрицательном инотропном эффекте каннабиноидов. Тот факт, что блокатор СВ-рецепторов 8Ш41716 устранял эффект НХ1-210 на ДЛРЖ, а БШ44528 не влиял на отрицательный инотропный эффект названного каннабиноида, говорит в пользу участия СВ1 -рецепторов в реализации отрицательного инотропного эффекта каннабиноидов. В пользу этого утверждения говорят и результаты экспериментов с агонистом СВ1-рецепторов метанандамидом, который также оказывал отрицательный инотропный эффект. Отсутствие изменений в сократимости сердца после добавления в перфузат селективного СВ2-агониста 1^¥Н133 является аргументом против участия названных рецепторов в механизме каннабиноид-индуцированного отрицательного инотропного эффекта.

Одним из опасных осложнений ишемии и реперфузии является возникновение желудочковых аритмий. Согласно данным литературы и результатам ранее проведенных нами исследований, было известно, что каннабиноиды способны повышать устойчивость сердца к аритмогенному действию адреналина и аконитина [Угдыжекова и др. 2000, 2001; Крылатов и др. 2001, 2002]. В связи с этим, следующий раздел наших исследований был связан с изучением антиаритмического действия каннабиноидов. Однако полученные результаты указывают на то, что эндогенные каннабиноиды и экзогенные агониеты СВ1- и СВ2-рецепторов не участвуют в регуляции устойчивости сердца к аритмогенному влиянию реперфузии.

Наряду с такими проявлениями ишемических и реперфузионных повреждений миокарда, как некроз и апоптоз кардиомиоцитов, сократительная дисфункция сердца, аритмии, это патологическое воздействие сопровождается дисфункцией эндотелия коронарных артерий, которая приводит к феномену неполного восстановления коронарной перфузии (no-reflow phenomenon). В наших экспериментах наблюдалось отсутствие вазодилатирующего эффекта у всех исследуемых каннабиноидов. Поскольку литературные данные все же свидетельствовали об участии эндоканнабиноидов в регуляции функционального состояния сердца и сосудов [Ford W.R. et al., 2002; Pacher P. et al., 2005; Wagner J. et al., 1998], можно полагать, что сосудорасширяющее действие каннабиноидов реализуется путем активации СВЗ-рецепторов или анандамидовых рецепторов, на которые не действуют использованные нами каннабиноиды.

В итоге на данном этапе исследований были получены результаты, доказывающие, что активация каннабиноидных рецепторов способствует повышению устойчивости изолированного сердца к повреждениям, вызванным тотальной ишемией и реперфузией. При этом максимально выраженным кардиопротекторным и инотропным эффектом обладал СВ-агонист HU-210. Оставалось выяснить внутриклеточные сигнальные механизмы кардиопротропного действия каннабиноидов на миокард в условиях in vitro. Мы предположили, что в роли сигнальных посредников молекулярного механизма кардиопротекторного эффекта каннабиноидов могут выступать циклические нуклеотиды, КАТФ-зависимые каналы, ПКС и NO-синтаза.

Нам удалось установить, что в развитии цитопротекторного эффекта HU-210 участвует протеинкиназа С (ПКС), поскольку блокада этого энзима хелеритрином устраняла кардиопротекцию. С другой стороны, применение блокатора ПКС не влияло на отрицательный хронотропный эффект СВагониста HU-210. Кроме того, хелеритрин сам по себе снижал параметры сократимости изолированного сердца, что не позволило нам рассматривать значение этого сигнального мессенджера в качестве одного из звеньев каннабиноидергической регуляции инотропной функции миокарда. Сходные результаты получили I. Khaliulin и соавт. [Khaliulin I. et al., 2007], которые в опытах на изолированном перфузируемом сердце обнаружили, что хелеритрин устраняет антинекротический эффект ишемического прекондиционирования, но не влияет на положительный инотропный эффект прекондиционирования.

Механизм кардиопротекции с участием протеинкиназы С пока неизвестен. Это связано, прежде всего, с огромным количеством внутриклеточных белков, которые фосфорилирует данный фермент [Dempsey Е.С. etal., 2000]. Однако в настоящее время можно выделить несколько мишеней ПКС, которые участвуют в формировании адаптивной реакции сердца в ответ на чередование коротких циклов ишемии и реперфузии: это, прежде всего, АТФ-зависимые К+-каналы (Катф- каналы) [Fryer R.M. et al., 2001], а также тирозинкиназы [Baines С.Р. et al., 1998, 1999]. В связи с этим, мы попытались выяснить вклад Ка1ф-каналов в формирование устойчивости сердца к повреждающему действию коронароокклюзии-реперфузии.

В наших экспериментах было показано, что КАТФ-каналы также задействованы в реализации кардиопротекторного действия этого каннабиноида, поскольку блокатор КАТФ- каналов глибенкламид, используемый на фоне HU-210, способствовал устранению защитного эффекта HU-210. При этом применение блокатора КАтф-каналов позволило установить, что эти ионные каналы не играют существенного значения в реализации хронотропного действия СВ-агониста. Более того, ингибирование КАТФ-каналов сопровождается снижением параметров сократимости изолированного сердца, что не позволяет рассматривать значение этого сигнального пути в механизме каннабиноидергической регуляции инотропной функции миокарда.

Учитывая данные литературы о том, что каннабиноиды могут активировать синтез оксида азота [Bilfinger T.V. et al., 1998; Fimiani С. et al., 1999a; 1999b; Yusifzade K. et al., 2009], который играет важную роль в повышении устойчивости миокарда к ишемическим воздействиям [Yellon D.M. et al., Downey J.M. et al., 2003], мы предположили, что обнаруженные нами защитные эффекты каннабиноидов могут быть результатом стимуляции NO-синтазы. Существует три основных сигнальных механизма, через активацию которых реализуется действие NO* на клетку: (1) стимуляция гуанилатциклазы, (2) синтез пероксинитрита, (3) S-нитрозилирование [Зенков Н.К. и др., 2001; Otani Н. et al., 2004; Crow J.P. и Beckman J.S., 2005]. Наиболее изученным является сигнальный путь, связанный с активацией растворимой гуанилатциклазы. Так, связывание NO" с гемом гуанилатциклазы приводит к увеличению активности этого фермента в 400 раз и, соответственно, к усилению синтеза цГМФ [Зенков Н.К. и др., 2001].

Однако статистически значимых изменений уровня цГМФ в миокарде в ответ на стимуляцию СВ-рецепторов нам обнаружить не удалось (рис. 36). Следовательно, защитный эффект HU-210 развивался независимо от цГМФ, т.е. без участия гуанилатциклазной сигнальной цепи. Оставалось установить роль других NO-индуцированных механизмов в реализации кардиопротекторных и инотропных эффектов HU-210. Однако в случае предварительной блокады NO-синтазы с помощью L-NAME отмеченный кардиопротекторный эффект каннабиноида HU-210 сохранялся (рис. 36). Применение L-NAME оказывало отрицательный инотропный и хронотропный эффекты, которые еще более усиливались при использовании его с HU-210. Следовательно, наблюдаемые нами кардиотропные эффекты HU-210 не были связаны с активацией индуцированных NO-синтазой сигнальных механизмов.

В дальнейшем мы предположили, что в реализации инотропного и кардиопротекторного эффектов HU-210 принимает участие цАМФ. Это предположение было основано на известных литературных данных о способности каннабиноидов ингибировать синтез цАМФ [Howlett A.C. et al., 1990]. В проведенных экспериментах нами было зафиксировано снижение уровня цАМФ в миокарде при активации СВ-рецепторов. Однако снижение параметров сократимости и реперфузионный выброс КФК, происходящие под влиянием активации СВ рецепторов, в наших опытах не коррелировали с изменения внутриклеточной концентрации цАМФ. Значит, в реализации инотропного эффекта СВ-агониста задействованы другие сигнальные пути и в роли вторичного мессенджера могут выступать, возможно, инозитолтрифосфат или диацилглицерол.

Суммируя все полученные нами данные, можно заключить, что в реализации каннабиноид-индуцированного повышения устойчивости сердца к повреждениям, вызванным действием тотальной нормотермической ишемии с последующей реперфузией миокарда, важную роль играет протеинкиназа С и КдтФ-каналы. Замедление формирования необратимых повреждений мембран кардиомиоцитов, наблюдаемое при активации СВ-рецепторов, реализуется без участия аденилатциклазы и гуанилатциклазы. NO-синтаза также не участвует в развитии кардиопротекторного эффекта HU-210. Механизм, с помощью которого активация СВ-рецепторов обеспечивает отрицательный инотропный и хронотропный эффекты, остается пока неизвестным.