Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Роль нейротропных адамантансодержащих соединений в регуляции иммунитета

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РФ

ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ

На правах рукописи Для служебного пальзозашя Экземпляр N 36

ГАЛ У Ш И Н А Татьяна Сергеевна

роль нейротропных адамантансодержащих соединений в регуляции иммунитета

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соисканне ученой степени кандидата биологических наук

Москва • 1994

Работа выполнена в Ингтктутс ннмужьюпш Мшидравмедпрома РФ

Научный руководи гель.

Член-корреспонлснт РАКН. доктор медяинжкмх наук,

профессор Н.Г. Арцнмооич

Официальные оппоненты:

Члеи-коррссиомдент FAKii. »«лиинмских наук,

профессор U.M. Зсмсков

Докторбнаютчсскил ш»?к, профессор Н.Л. Kaucraimutoua

Ведущая opiamtiami*

Институт ф|пик№Х№мич«<;кой< медишшы Мнниравмедпрома РФ.

Защити дмссертишы* шниоо» -Д8 "ЪрКС^.Л994 Г. . час. ни lact.iaiiHHi дмсссртшииишого совета Д 074.09.01 при. Институте мммутшлипо* Млнирипмсдирома РФ ПО' адресу: 1154<7Н гЛИоскяа, KiiauipcKoe шоссе д. 24, к. 2.

С диссертацией можно ошакомнтьса в библиотеке Института иммушиюпш Мннщравмедпрома РФ.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук

J1.C. Сеславша

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Установление основных закономерностей нейро-гормональной рефляции иммунных процессов конкретизировало многое аспекты проблемы взаимосвязи нервной н иммунной систем организма и обусловило принципиально новые подходы к коррекции различных нарушений иммунитета (Корнева и др., 1978, Goadon et al., 1978, Hadden, 1986, Jancovic, Spector, 1985, Арцнмович,1993). Функциональная согласованность нервной к иммунной систем обеспечивает взаимодействие организма со средой, восприятие внутренних и внешних сигналов, обуславливает общий гомеостаз организма.

Патология, вызывающая изменение нормального функционирования нервной системы, может сопровождаться дисфункциями иммунной системы (Корнева, 1987, 1993, Абрамов, 1991, Зозуля. 1993,Чипенс. 1993). Снижение показателей клеточного и гуморального иммунитета, вызывающее необходимость применения иммунокорректоров, возникает при действии различных неблагоприятны: факторов среды обитания человека (Арнимович и др., 1989, 1992). Этн нарушения, нередко сопровождающиеся снижением физической и умственной работоспособности человека, требуют медикаментозной коррекции (Васильева, 1989, Морозов и др., 1992). Стрессорные воздействия различной этиологии в современных условиях на экологически отягощенном фоне вызывают напряжение иммунной системы, что повышает риск развития не только соматической, но и нервно-психической патологии. Одновременные иаруш-ния показателей нервной и иммунной систем отмечаются также в результате вирусной атаки организма человека (Goldstein, 1991.'Борисова, Чувиров, 1992, Корней и др., 1992).

Таким образом, нарушение нсйроиммуниого взаимодействия является причиной ряда заболеваний, как со стороны нервной, так и иммунной систем (Abouder, Lemoine, 1986, Крыжановский, Магаева, 1990, Арцимович и др., 1991, Artsimovich et al., 1992). Анализ взаимосвязи нарушений иммунной и нервной систем, возникающих при целом ряде патологических состояний, ставит проблему поиска исихонейроиммунорегуляторов в ряд важнейших задач современной фармаколожи (Besedovsky, Adriana, 1986, Чередеев. Ковальчук. 1988, Besedovsky. Rey, 1989). В этой связи, особый интерес вызывает вопрос о том, какое влияние на иммунный статус организма оказывают исйротропные препараты и посредством каких механизмов одни и те же вещества реачиэуют свою активность в отношении иммунной и нервной систем.

Иммунокоррекция с помощью препаратов, обладающих иейротропной активностью, представляется одной из актуальных проблем современной фармакологии в связи с тем, что в последнее время отмечается возрастающее количество иммунопатологических состояний, обусловленных нарушением центральной нервной системы (Корнева, 1988. 1993, Ратников, 1989, Арцимович. 1991, 1993, Чугунов и др., 1991).

Малотоксичные соединения широкого спектра фармакологической активности, включая иммуностимулирующую, противовирусную ц нейротроиную, обнаружены среди адамантансодержищнх соединений, чем н объясняется пристальный интерес химиков, биологов, медиков, фармакологов к этому ряду каркасных соединений (Индулен и др„ 1973,1977, Davies, 1974, Шмарин и др., 1980, Buss 1980, БагрнЙ. 1985, Арцимович «др., 1989,1990, 1991, 1992, Климова и др., 1989, Морозов и др., 1990,1992, 1994).

Исходя из вышеизложенного, поиск новых препаратов иейронммунотропной направленности - актуальная проблема современной нммунофармакологнн. Своевременная психонейронммунокоррекцня с помощью малотокснчных адамантансодержащнх соединений поможет избавиться от целого ряда заболеваний, снизить риск возникновения дисбаланса Цейро-нммунного гомеостаза, повысить адаптационные возможности организма человека в условиях действия разнообразных факторов окружающей среды.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Основная цель представленной работы - изучение нммуиотропной активности 6 новых нейротропных адамантансодержащнх соединений (НАС) для возможного использования их в качестве корректоров иммунной и нервной систем. В связи с этой целью были поставлены следующие задачи:

К изучить влияние 6 НАС на основные показатели клеточного н гуморального иммунного ответа;

2. изучить возможность рефляции функционанальной активности иммунной системы с помощью НАС;

3. провести сравнительный анализ нммуиотропной активности новых НАС и известного иммуностимулятора левамизола; .

4. оценить возможность применения НАС для коррекции вторичных нммунояефииитных состояний;

5. дать конкретные практические рекомендации по применению новых иейроиимунорегуляторов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Впервые показана возможность направленной коррекции главных регуляторных систем организма - нервной и иммунной. Обосновано

использование новых препаратов для активизации адаптационных физиологических механизмов организма, согласованного действия нервной и иммунной систем.

В результате исследований влияния нейротропных адамантансодержащих соединений на основные показатели иммунной системы впервые показана возможность стабилизации нейро-иммунного гомеостаза за счет повышения адаптационных физиологических возможностей организма с помощью малотоксичных препаратов многопрофильной активности.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ.

Срси 1 новых аддмшггш юодержаидк сосии (ешй вшшга ы соединения, способные рауиирсшгь функционапыфю акпшносп» гуморального м клеточ!кмжюсредованного нммушюгоответа. При этомагобраны4 наиболее пера 1ектаишх препарэта,оочетаюших в себе свойства »ка'фоиммутраупягоров, обладающих выраженной иммунслропной шсшыюстио в широком диапазоне терапевтических доа.

Впервые предложено использовать в клинической практике иммунорегулятор бромантан (АДК-709).

Обоснована юзможностъ применения имму»юкорректора ксмшггана(АДК-412) в ксжптексной терапии заболеваний, связанных с дисбалансом иммунологических и нейрогормоналшых показателей, с сопуипиуюшими вирусными осложнениями.

Даны рекомендации по созданню новых ненронммунорегуляторов на основе соединений АДК-910 и АДК-918.

Предложено истльэокпъ кемшган (АЖ-412), бромшгган (АДК-709Х АЦК-910, АДК-918 для иммунореабилитации вторичной иммунилошческой недостаточности различной этиологии.

Обосновано применение кемантана, бромантана, АДК-910, АДК-918 в качестве нейронммунорегуляторов, повышающих защитные силы организма за счет обеспечения устойчивости фшнолотчсских функций в экстремальных условиях среды, включая физические и эмоционачыше стрессовые ситуации.

Проведен сравнительный анализ нммуиотропной активности новых адамантансодержащнх соединений и известного иммуностимулятора левамнзола. При этом выявлен ряд преимуществ иммунотропных препаратов, синтезированных на основе адамантана, перед левамнзолом, заключающихся в их низкой токсичности, отсутствии нежелательных побочных влияний на кроветворение, расширении спектра фармакологической активности.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

Новые нейротропные адамантансодержащне соединения - активаторы ЦНС - можно использовать для регуляции функциональной активности гуморального и .клеточно-опосредованного иммунного ответа.

Коррекция иммунного ответа нейротропными адамантансодержащиии соединениями осуществляется путем стимуляции эффекторной и регуляции супрессорной функции Т-лимфоцнтов, стимуляции предшественников. Т-лимфоцитов в зрелые активные клетки, усиления миграции предшественников Б-лнмфоцитов в селезенку и повышения функциональной активности антнтелонродуцирующих клеток селезенки.

Механизм иммунотропной активности адама!ггансодержащнх соединений и левамнзола имеет ряд принципиальных отличий, заключающихся в их разном воздействии на гуморальный и клеточный иммунный ответ.

• Адамантансодержащне соединения перспективны для создания на их основе малотокснчных нейроиммунорегуляторов.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ НАУЧНЫХ ПОЛОЖЕНИЙ И ПРАКТИЧЕСКИХ РЕКОМЕНДАЦИЙ. Научные положения и практические рекомендации внедрены в практику Специализированной клинической больницы им. З.П.Соловьева-Клиники неврозов, а также в

некоторых ограниченных областях медицины.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты работы были доложены • на I Всесоюзном съезде иммунологов (Сочи, 1989г.), I Конгрессе иммунологов Эстонии (Тарту, 1989г.), Всесоюзной конференции "Перспективы развития хнмиии каркасных соединений и их применения в народном хозяйстве" (Куйбышев, 1989 г.). Всесоюзной конференции. "Стресс и иммунитет" (Ростов на Дону, 1989 г.), Международном симпозиуме "Проблеммы нмм)..офармаколопш" (Тбилиси, 1990г.), 5-ом Всесоюзном симпозиуме "Взаимодействие нервной и иммунной систем" (Оренбург. 1990г.). Научно-практической конференции "Реконструктивная хирургия" (Ростов на Дону. 1990г.), 1-ом Международном конгрессе "Химические нейронммуномодуляторы" (Флоренция. 1990г.), Всесоюзной конференции хирургов "Сосудистая и общая хирургия" (Ростов на Дону, 1991г.), I Съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992г.), 8-й Международной конференции иммунологов (Будапешт, 1992г.), Симпозиуме с международный участием "Текущие проблемы клинической и экспериментальной психонейроиммунологни* (Томск, 1992г.), Российской научной конференции " Антигипоксанты н актопротекторы. Итоги н перспективы" (Санкт-Петербург, 1994г.). совместных научно-практических конференциях лаборатории иммунокоррекщш Института нммунолопш МЗ РФ, лаборатории клинической нммуиолопш к лаборатории ненрогормоноа городской клинической больницы N 8 (Клиники неврозов), кафедры нервных болезней Государственного медицинского Университета, секции N 2 Ученого совета Института нммунолопш МЗ РФ.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 28 работ. Имеется 4 авторских свидетельства на изобретение. 1 патент

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Работа выполнена на 138 страницах машинописного текста, состоит из следующих разделов: Введение; Обзор литературы; Материалы и методы; Результаты исследований; Обсуждение результатов; Заключение; Основные выводы; Практические рекомендации. Список литературы включает 156 отечественных и 163 иностранных публикаций. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 1 рисунком. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Работа выполнена в рамках совместных исследований Института иммунологии МЗ РФ и НИИ фармакологии РАМН. Среди первично обследованных 150 соединений выявлены бб, обладающие иммунотропной активностью. 10 из 66 проявляют одновременно нейро-нммунотропную активность. По данным НИИ фармакологии, у 6 соединений нейротропная активность наиболее выражена. Изучение иммунотропной активности этих соединений является объектом исследования представленной работы.

материалы и методы. Изучено иммунотропнос действие следующих 6 иейротропных производных адамантана:

1. 1-окснадамантан-4-он (АДК-412 или кемантан). ЛД50 для мышей при внугрибргошннном введении >4000 мг/кг .

2. (Атча] гг-2-тХпарабромфс1 ш )амш i чАДК-709 или бромагган). ЛД50 >4500 мйкг.

3. 2-[Ы-(пара-хлорбензоил)амино] адамантаи (АДК-910). ЛД50 >3500 мг/кг.

4. 2-(Ы-(пара-бромбензоил)амицо] адамантаи (АДК-918). ЛД50 >3500 мг/кг.

5. 2-(орто-гцдроксифенилен)амшюапамантан (АДК-963). ЛД50 >900 мг/кг.

6. Хлорпщрат-М-(2-адамантил)-п-фтораннлнн (АДК-613). ЛД50 >1000 мг/кг.

В качестве препарата-эталона использовали левамнзол.

ЛД50 при подкожном введении 12 мг/кг, per os - 285 мг/кг (Лазарева, Алехин, 1985).

Эксперименты выполнены на 1900 мышах линии СВА, 400 мышах линии C57BU6J, 500 мышах гибридах (СВА х C57BL/6J)FI самцах, возрастом 2-4 месяца.

Количество антителообразующих клеток (АОК) селезенки определяли методом прямого локального гемолиза (Jeme, Nordin 1963, Jerne el al., 1963). Ha 5-е сутки после иммунизации подсчитывали количество АОК на 1 млн. спленоцитов. Антиэритроцнтарные антитела определяли на 7-е сутки после иммунизации при помощи реакции гемагглютинацин (РГА) (Dietrich. 1966, Мальберг, 1987). Исследуемые соединения вводили виутрибрюшинно трижды с суточным интервалом. Мышей иммунизировали тимус-зависимым антигеном - бараньими эритроцитами • 200 млн.в 0,5 мл физ.р-ра.

Для создания вторичного иммунодефнцитного состояния мышам СВА вводили внутрибрюшинно циклофосфан (ЦФ) в дозе 200 мг/кг однократно, за сутки до иммунизации (Арцимович и др., 1977). Мышам опытных групп, с индуцированной иммунологической недостаточностью вводили исследуемые соединения трижды: сразу после иммунизации и в последующие двое суток.

Индукцию антигенспецифических Т-сулрессоров (Т-с) вызывали иммунизацией доноров - мышей линии СВА. гипериммунной дозой ЭБ (5 млрд.). Через 2 недели спленоциты (10 млн.). обогащенные Т-с, от гипериммунных доноров переносили сингенным реципиентам вместе с 200 млн. ЭБ (Whisler, Slobo. 1976. Писарев, 1980). Исследуемые соединения вводили трехкратно или донорам, или реципиентам, о зависимости от целей опытов.

В качестве модели ГЗТ нами был использован стандартный тест оценки изменения веса стопы у мышей СВА, сенсибилизированных эритроцитами барана. Для выявления сенсибилизации на 5 сутки после иммунизации мышам вводили в подушечку задней конечности разрешающую дозу ЭБ -100 млн. в 0,05 мл фнз. р-ра. Местную воспалительную реакцию оценивали через 24 часа по разнице массы опытной (Ро) и контрольной лап (PK)(Kitamura, 1980). Индекс реакции (ИР) вычисляли по формуле: ИР=[(Ро-Рк):Рк]х100%. Препараты вводили опытным мышам сразу после сенсибилизации и в последующие двое суток.

Применяли, метод количественной оценки РТПХ, основанный на сравнении увеличения массы лимфатических узлов, в которых протекает РТПХ с аналогичными им контралатеральными узлами, в которых реакции нет. Мышам-гибридам (CBAxC57BL/6J)Fl в подушечку правой задней лапы подкожно вводили 10 млн. клеток селезенки родительской линии C57BL/6J в 0,05 мл физ. р-ра, в левую - такое же количество сингенных клеток. Индекс реакции, отражающий отношение массы "опытного" и "контрольного" узлов высчитывали для каждого животного отдельно. Исследуемые соединения вводили реципиентам трижды, начиная со дня трансплантации.

Миграцию стволовых кроветворных клеток изучали по методике,

*

разработанной Петровым Р.В, и Хантовым P.M. (1972). Мышей облучали дозой 750 р. 1/2 голени защищали от облучения свинцовым экраном. Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) подсчитывали на поверхности селезенки через 7 суток после облучения. Адамантансодержащие соединения вводили четырехкратно, с сугочным интервалом, начиная в день облучения. Результаты выражали в абсолютном количестве КОЕ на каждую селезенку.

Тимэктомию мышей производили стандартным методом (Luckey, 1951). "При постановке in vitro, теста восстановления чувствительности фоновых розеткообразующих клеток селезенки (фРОК) тимэктомированных мышей к ингибируюшему действию азатионрина (Аз) использовали мышей линии C57BL/6J через 3-5 недель после тимэктомини. Результаты экспериментов выражали в количестве фРОК на 10тыс. ядросодержащих клеток, а также в процентах восстановления чувствительности к Аз. (Bach, Dardenne 1972, Bach, Carnaud, 1976). Активными считали концентрации адайантансодержащих соединений, вызывающие восстановление чувствительности фРОК к Аз на 50% и более.

Полученные экспериментальные данные статистически обрабатывали с использованием метода средней арифметической и ста! шргной ошибки (М 4/- ш). Досговерносп, pivi1 u mini средних величин в оньпных и котратьиых ipynnaxouctuiBamt по параметр! вескому крнгерню Craoaeirra (Плошюкий. 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Цель представленных исследований - поиск путей контроля функциональной активности Т- и В- лимфоцитов с помощью низкотоксичных производных адамантана, па основе экспериментальной оценки их иммунотропнон активности.

Фармакологическая активность химических препаратов в значительной степени определяется дозой и схемой их применения. Исходя из этого, испытуемые соединения вводили мышам в широком диапазоне доз от 10 до 200мг/кг. Наши данные показывают, что наиболее выражен иммунотронный эффект при введении соединений в дозах 50 и 100 мг/кг. Левамизол вводили в .терапевтических дозах 2,5 и 4 мг/кг (Лазарева, Алехин, 1985).

При изучении влияния производных адамантана на интенсивность антнтелогенеза все соединения вводили мышам до или после иммунизации, в зависимости от целен экспериментов. Эксперименты выполнены на мышах двух линий - СБА и С57ВЬ/61, с учетом генетической обусловленности, существующих межлинейных, различий антнтелогенеза у ннбредных мышеи .(Петров и др.. 1966,).

Оказалось, что среди 6 производных адамантана 4 соединения способны усиливать гуморальный ответ при их применении после антигена у мышей линии СВА. Т.е. введение бромантана (АДК-709), АДК-910, АДК-918 и АДК-963 после иммунизации приводит к увеличению количества ^М-образующих клеток селезенки. Эффективность применения АДК-910 значительно выше, чем при использованнии других соединений. Так, при введении АДК-910 в дозе 50 мг/кг количество АОК увеличивается до 347,5+/ -22,4 от исходного контрольного уровня 114,7+/-18,3 АОК. Остальные соединения - бромаитан. АДК-918 и АДК-963 в этой же дозе увеличивают контрольные показатели в 1,5-1,6 раз.

При введении 6 производных адамантана до антигена у мышей СВА, иммунотронную активность проявляют следующие 3 соединения: АДК-910, АДК-963 и кемантан (АДК-412). Применяя АДК-910 (в дозах 50 и 100 мг/ кг) до антигена, можно увеличить количество АОК до 360,8+/-22,4 и 426,4+/ -23,0 от контро.п.ного уровня - 164,2+/-16,1 АОК. В результате действия кемантана и АДК-613 наблюдается меньшая стимуляция АОК - в 1,5 раза.

Соединения - бромаитан (АДК-709), АДК-910, АДК-918 и АДК-963 -активные при их применении после антигена у мышей линии СВА, вводили по этой же схеме мышам линии С57ВЬ/61. При этом наблюдается увеличение

количества АОК с 60,347-7,2 в контроле до 95,8+7-6^ после применения броматана в дозе 50мгЛсг, и до 107,4+7-10,4 в результате действия АДК-910, в этой же дозе. АДК-918 иАДК-%Зтеряшс1кх-об11остьст1вогафОвагп.атпшзгенез,еашвместо СБА использован. мышей С57В1761.

Активность кемантана (АДК-412) а АДК-910 не зависит от генетических особенностей экспериментальных мышей и сохраняется при введении до иммунизации мышам линии С57ВЬ/6.1. Максимальная, полутократная стимуляция количества АОК наблюдается в результате действия АДК-910 в дозе 100 мг/кг. АДК-963 и АДК-613 утрачивают активность при их введении мышам линии С57В1У6Л.

Уровень антит ел к периферической крови так же, как и функциональная активность антителоиродуцирующнх клеток селезенки, зависит от введенного соединения, сроков его применения и линии мышей.

Таким образом, негфотропные адамшгпи (содержащие соединения стимулируют 1уморалы1ый иммунный огвет. Об этап свидетельствуют итоговые результаты серии экспериментов, приведенные в таблице 1. Эффективность примешаю АДК-910 -наиболее актни югосп эмулятора штггелогенеза, незаииситог временишгтактастпмус-зависимыманпненом и га 1еп 1ческих особеш юсгеи орпи 1нзма Иммугюстимушфуюицш эффект кемантана (АДК-412) и брома»ггана (АДК-709) не зависит от генотипа, а определяется только схемой их применения по опюшснню ко времени ко)пакта организма с здггигеном. Активность АДК-918. АДК-%3 и АДК-613 зависит как от времени их применения, так и сгг генетических особенностей мышей. Наши результаты согласуются с данными других исследователей в том, чго внугрибрюшшшое введение левамизола в дозах 2,5 и 4 мг/кг не приводит к изменению гуморального иммунитета.

Табгашз 1. Рать нейратрогпмх прогаюаяых ааамшгпаи в раутации шпнгетогенеза

N преп. СВА ~~ С57Виб1 СВА С57ВШ

п/п после иммунизации до иммунизации

1 ддК.4,2 ~ н С С

2 АДК-709 С С н и

3 АДК-613 н н С н 4' АДК-910 С С С С

5 АДК-918 С н н и

6 АДК-963 С и С н

Примечания:"С" - стимуляция,"!«" - нет влияния на количество АОК. - С целыо изучения возможности применения неГфотропных производных

здамантана для коррекции вторичной иммунологической недостаточности

использовали экспериментальную модельную систему искусственного

иммунодефицита. У мышей под действием циклофосфана (ЦФ) наблюдается

резкое ушетенне исходного контрольного уровня АОК. Применение кемантана

(АДК-412), АДК-963, бромантана (АДК-ГЭ9), АДК-910 и АДК-918 на фоне

действия ЦФ приводит к частичной отмене его нммунодепрессивной

активное ги. Если уровень АОК у мышей лииниСВА под действием ЦФ равен

42.1+/-8.9, то введение, например, кемантана приводит к увеличению

количества АОК до 108,1+/-20,3. АДК-613 - единственный из 6 тестируемых

соединений не ачиясч на функциональную активность АОК у мышей с

индуцированным нммуиодефицнтным состоянием. Левамизол лишь частично

снижает ушетающее действие ЦФ, Стимулирующий эффект левамизола

значительно ниже, чем у 5 адамаитансодержащих соединений.

В развитии гуморального и клеточного иммунитета существенная роль

принадлежит ».уирессорной функции Т-лимфоцитов (Т-с) (Gereon, Kondo, 1970, Weigle et al., 1975, Kölsch et al„ 1975). Накопление Т-с с возрастом обуславливает падение иммунной реактивности (Segre, 1976). В этой связи возможность фармакологической коррекции функциональной активности Т-с с помощью нейро гропных ядамантансодержащих соединений представляет несомненный интерес.

С целью изучения влияния производных адамантана на индукцию и накопление антигенспецифических Т-с препараты вводили донорам Т-с. Введение Т-с контрольным мышам резко (в 4-5 раз) снижает. исходный уровень АОК. Оп» ггным мышам переносили сингенные спленоциты, обогащенные Т-с от гипериммунных доноров, обработанных адамантансодержащнми соединениями. Введение бройантана (АДК-709), АДК-910 и АДК-963 гипериммунным донорам снижает супрессорную активность Т-лимфоцитов, что приводит к увеличению количества АОК у реципиентов. Например, исходный уровень АОК, равный 124,7+/-17,0, в результате переноса сингенных Т-с снижается до 20,4+/-4,8 у контрольных реципиентов, но в результате введения донорам бромантана в дозе 100мг/кг количество АОК у реципиентов увеличивается до 70.9+/-9.4. Таким образом, под влиянием 3 из 6 тестируемых нейротропных производных адамантана происходит снижение индукции Т-с.

В отличие от результатов, полученных после применения производных адамантана, после введения левамизола донорам Т-с наблюдается дальнейшее снижение количества АОК у реципиентов, как результат усиления функциональной активности антиген-специфичных Т-лимфоцитов супрессоров. Полученные нами данные согласуются с выводами других

авторов о том, что левамнзол неспецифически стимулирует все иммунокомпетентные клетки, независимо от их роли в иммунном ответе (Symoens et al., 1979, Parr, 1980).

Для выяснения роли адамантансодержащих соединении в реализации функциональной активности Т-с, препараты вводили реципиентам после * переноса им спленоцнтов от гипернммунных доноров. Функциональная • активность Т-с, перенесенных реципиентам, снижается на фоне действия кемантана (АДК-412), бромантана (АДК-709), АДК-910, АДК-918 и АДК-963. Таким образом, 5 нейротропных адамантансодержащих соединений способны влиять па реализацию функциональной активности специфических Т-лимфоннтов супрессоров, в отличие от левамнзола.

Два соединения - бромаитан и АДК-910 - снижают индукцию и ограничивают реализацию эффекторнон активности Т-с.

Серия экспериментов была проведена для выявления возможности регуляции клеточных реакций иммунитета с помощью производных адамантана. Под нлпяплем 4 соединений - кемантана (АДК-412), бромантана (АДК-709). АДК-963 и АДК-613 местная воспалительная реакция - ГЗТ, усиливается, по сравнению с воспалительной реакцией у контрольных мышей. Это свидетельствует об усилении притока мононуклеарных фагоцитов к месту повторного контак та с антигеном вследствие активации Т-лимфоцитов к усиленной продукции медиаторов под действием введенных соединений. Сила иммуностимулирующего влияния адамантансодержащих соединений и левамнзола примерно, одинаковая. Например, индекс реакции ГЗТ у контрольных мышей составил 10,4+/-1,2, под воздействием левамнзола в дозе 4мг/кг повысился до 25,2+/-2,3, а под влиянием бромантана в дозе 50 мг/

кг - до 28,3+/-1,4. АДК-910 - наиболее активный;стимулятор гуморального иммунитета, не .лияет на интенсивность ГЗТ.

4 изучаемых соединения - кемантан (АДК-412), бромантан (АДК-709), АДК-910 и АДК-613 - усиливают иммунологический конфликт донор-реципиент реакции трансплантант против хозяина, так же как левамизол. АДК-910 не влияет на развитие ГЗТ, стальные.трн препарата стимулируют как ГЗТ. так и РТПХ.

Способность нейротропных адамантансодержащих соединений стимулировать клеточные реакции свидетельствует о вероятной возможности их применения для усиления специфичных реакций иммунологического надзора, повышать сопротивляемость организма при большинстве вирусных и некоторых бактериальных инфекциях, стимулировать йротивоопухолевый и клеточно-опосредованный иммунитет при иммунологической недостаточности за счет стимуляции функциональной активности эффекторных Т-лимфоцитов.

Для изучения влияния адамантансодержащих веществ на миграцию кроветворных стволовых клеток, исследуемые соединения вводили летально облученным мышам, с экранированием участка задней конечности. Введение облученным мышам кемантана (АДК-412), АДК-910. АДК-918, АДК-963 и АДК-613 приводит в среднем к двухкратному усилению клонирования в селезенках1 опытных животных. Так, если у контрольных мышей в селезенках на 8-е сутки после облучения насчитывается 7,3 +/-1,2 КОЕ, то в результате действия кемантана (50 мг/кг) количество колоний возрастает до 14,1+/-1,8. После введенения бромантана (АДК-709) и левамизола количество КОЕ в селезенке не изменяется. Полученные данные свидетельствуют о том, что с

помощью 5 пейрофопных соединений можно >сишпъ миграцию сгвояоеых клеток н их раооеление в пертгфернческих т 1фотшых органах. Это позволяет надеяться на возможность сознания иммунслропных препаратов, используемых как для коррекции нммушюго дисбаланса, таив качестве радиопротекторов.

Известно, что факторы, продуцируемые тимусом, контролируют созревание Т-клеток. Азатиоприи (Аз) избирательно действует на Т-лнмфоциты, подавляя функциональную активность зрелых Т-клеток, и не влияет на их предшественников (Bach. Dardenne, 1972). Количество фоновых розеткообразующих клеток (фРОК) у шггактных и у тнмэктомированных иышей одинаковое. После инкубации с Аз число фРОК снижается примерно а 5 раз в культуре клеток селезенки (КС) ннтахтных мышей, и не изменяется О культуре КС тнмэктомированных мышей. После инкубации КС тимэктомнровшшых мыигй и Аз с кемантаном (АДК-412), бромантаном (АДК-709), АДК-910, АДК-963. АДК-613 и левамизолом (конц. от 50 до 200 мхг/мл) происходит уменьшение количества фРОК по сравнению с исходным уровнем, что свидетельствует о восстановлении чувствительности фРОК к Аз. Например, в культуре КС тнмэктомированных мышей насчитываете? 10,4+/-0,6 фРОК, после инкубации с Аз количество фРОК остается на прением уровне 10.7+/-0.5. После инкубации КС с кемантаном в концентрации 100мг/кг количество фРОК снижается до 2,4+/-0,3, т.е. кемантан способствует созреванию 77,0+/-7,0% Т чимфоцитов.

Адамантансодержащие соединения - кемантан, брома! ли, АДК-910, АДК-963, АДК-613 оказывают in vitro иммунотропный эффект подобный тому, который в естественных условиях оказывают тимические гормоны -способствуют созреванию Т-лимфоцитов.

Представленные результаты свидетельствуют о том, что с помощью нейротропных -щамантансодержащнх соединений можно регулировать функциональную активность Т- и В- лимфоцитов: стимулировать В-лимфоциты к повышенной антителопродукцни, снижать иммунодепрессивное влияние цихлофосфана и Т-с, стимулировать созревание предшественников Т-лимфоцнтов, управлять активное) ьюТ-чнмфоцигов эффекторов и супрессоров, ускорять миграцию кроветворных стволовых клеток, контролируя, таким образом, процессы гуморального и клеточно-опосредованного иммунного ответа (таблица N2).

Механизм имму! .отропной активности адамантансодЬржащих соединеш:'} и левамизола имеет ряд принципиальных отличий, заключающихся в' их разном воздействии на процессы гуморального и клеточного иммунного ответа (таблица N2).

Таблица 2. Роль нейротропных проювсдлых ааамагпаш в регуляции иммунитета

АДК: 412 709 910 918 963 613 ЛЕВ

антителогенез + + + 4- + + 0

корр.втор. ИД + + + + + 0 +

индукция Т-с 0 - 6 • 0 + . . . .

эффект.Т-с ■ - - - 0 0

гзт + + 0 0 4- +

РТПХ + + + 0 0 +

миграция КОЕ + 0 + + + о

созрев.Т-лимф. + + + 0 + + • +

Примечание:"+" -усиление активности,снижаие активности, "О" - активность не выявлена Производные адамшпана ужоряют миграцию стволовых клеток, спгмулир)тот

гуморшш 1ыи имму1 шет и подавлжггакгивносгъ с^тфессорныхТ-лимфощггов. Левам! тал

не влияет на миграцию, агпигелогенез и стимулирует Т-супрессоры,' то ограничивает

его применение i ipn дисфункциях, связанных с повышенной супрессорной активностью Т-лимфощггов. Наиболее nepcnei гивными стимуляторами иммунитета среди преястидленных соединений я&чяются кемшгган (АДК-412), броманган (ДЦК-709), АДК-9Ю и АДК-918. АДК-918 представляет песомиеиъгй шггерес, как возможный препарат узконаправленного иммунотропного действия. АДК-918 сп смулирует только 1уморалыпп.ш нммушшыйоют, и не влияет на процессы клегочно-. отосрсдакшного иммунного ответа.

Кемш гга цбромш rrai i, АДК-9 Юобладзют пыража а юн нмму| кхгро'п юй активностью, спасугагрунгг и 1уморальнын, и клеточный нмммуннын отггт.

По результатам многолетен совместной работы с НИИ фармакологии РАМН ссетпкнна АДК-910, АДК-918, АДК-963 и АДК-613 защищены ангорскими ШЕетап^тттшна!Осйреге1аеик2К1юше11еГфСТй^^ ггпктшгю6ретаи!е1шх[)1кспгмугафутощегосред^

уоюшю проще;! клинические нсш.гглпш и разрешен в 1987 г. Фармахолопиескнм кю.зггстом СССР к клиническое применению н промьпшенному выпуску.

По данным НИИ фармахолоиш общее пвпше представленных производных адама пала i ш да прачы iyft) i крипую ct кг ему cistíu ю со сгнмулящ ieft дофамш гэрл г iccki ix систем и выражается в юмененни спонгшшон дангахелыш активности. физической и jtsatsHHofi работоспоооб! юсп i. Cocía niei гия способны в больней или меньшей степени предупреждать разшпие трнфгазшювой каталепсии и блокировать обратный захват дофамина сннагггосомами головного мстаа (Зайцева и др., 1980, 1983, Валимая и др., 1986, Морозоз и др„ 1989, 1992). У'ппыюя способность ааамантансодержащих ооешиипи1поаашгьшще1пра1шзодх}вштанпр№пйшюиполда роль дофамина в регуляции функциональной активности иммунной системы, можно предположить, что i iMMyi kxiponi ш актаы юсп> раосшгриваемых прогаподных гцрма! mu и imaff Д1х{шош-зависимый характер.

Помимо проктаапа птых экспериметгптных данных, было гкжазшю,чгокемшпан усипиваетинц>кшгюИЛ-1 (Арцимовичидр„ 1989,1990Х чем можно объяснить наличие нейропрошюй активности. ИГ1-1 является одним из немногих известных в настоящее время мешшоров иммунного ответа с установленным цетралшым действием, принимакод1Мнелосре№лвгшюе\час1иевфнз11агюп1чес»^ нейрозодсжринной и иммунной систем.

Клинические результаты подтверждают экспериментальные выводы о фармаколопиеской активности кемангана(АДК-412). Препарат эффектйвену больных с бронха легочной патологией, при лечении больных с опухолью моленной железы, храмчетмафтоашмсталл1шом,реиидивир^^

системы конечностей аутоиммунного генеза. При применении кемангана не было выявлено побочных влияний на кроветворную систему, желудочно-кишечньш траст и мочевьшелигелы 1ую систему, характерные для длительного применения левамюала.

По данным НИИ фармакологии, бромантан способен повышал» умственную и физическую рабсггоспособность в условиях длительною воздействия экстремальных факторов среаы. Бромангак, как психостимулятор, эффективен при применении в условиях хронического стресса, разрешен Фармкомшетом СССР к ограниченному применению в качестве психостимулятора.

АДК-910 и АДК-918 повышают физическую выносливость в экспериментальных условиях острого стресса. Соединения оказывают защитное действие при перегревании, переохлаждении, в условиях гипобарической гипоксии, при депривации воды, об. гадают выраженным дегоксицируюшим действием.

Таким образом, представленные адаматтганссдержащие соединения сочетакэт в себе спо эбность стимулировать ЦНС и регулировать функционалы тую активность иммуг п юй системы. Эгообуошливаетжпримагеггиевкачестгепсихоимму!^^ эффективных в условиях острого или хронического психо-эмоиионального стресса, длительного нервно-мышечного перенапряжения.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Впервые изучена иммуитро'чш активность 6 новых ааамшггансадержаших ооеолненнин, обладающих ненротропной акплзк лыо.

2. Показана возможность рауляцин отдельных этапов иммунного ответа с помощью новых ненротропных производи;.« адамшггана, обладающих гонкой ттжарпюоъю к шажоспецнфнчноП иммуннтрогаюй активностью.

3. Показано, что коррекция иммунного ответа нейротропнымн адаматш кхгяержашим!1 соед) п ю ним! I осуществляется путем сп гмупяцин эффектор! юн н ре1ушщ|1н супрессорной функции Т-лнмфощггов, активации созревания прещттапипсовТ-лтфхогговв:фелыеклето1.>аетештяпр^

В-лимфоцитов в селезенку и п. вышення функциональной активности агпггежнтрсщуцнрующих клеток селезенки.

4. Впервые предложено приме! ель в клинической практике брома! пан (АДК-709) в качестве иммунокорректора, ранее испсльзовавшийся в ограниченных областях медицины. как средство, уисшиаюшее фпнческую и умспющую работоспособность.

5. Предпожаю также нспильх1втадамшггансодержашле соединения - кеманган (АДК-412), бромл)гглл (АДК-709), АДК-910 и АДК-918 - для иммутюреабиштонии шорнчшн иммунологической недастаттупюсти различной зшалопш.

6. Впервые гюказано, что аддма! ггш (содержащие соединения могут использован«! дна направленной коррекции ишвиых регугепорных систем - нервной н иммушюн • с ийлыо повышения аашггационньк осг&кшюстсн оргаппма человека в постоянно меняюится усюыих среды бгггаиня.

7. Предложено накжьэсйтъ 4 аазмантаюодержащих соединения - кемшпии (АДК-412), броманган (АДК-709), АДК-910 и АДК-918 - в качесше паш)нейрси<мму\юре1у.!мгороа, повышающих защтные силы оргашпма за сто ейеакяепт^данчт^шфишачемтеш!^^

включая физические и эмоциональные стрессовые ситушши.

8. Выявлег ряд фармакологических преимуществ иммунорегуляторов, синтезированных ш оспине адамаигана, перса левамиэалом, которые заключатся в их шгжой токсичности. отсутствии нежелательных побочных яплениий, расширении фармакологической актив! юсти

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Раюирить область применения кемантана (АДК-412), предложенного ранее в качестве стимулятора клеточного иммунитета. Использовал, кемашан для стимуляцш гуморального и клегочно-опосрелованного иммунного отвста в комгиексной терапии заболевашш, связанных с дисбалансом иммунологических и нейрогормональных показателей с сопутствующими вирусньгми осложнениям!!.

2. Использовать бромшгган (АДК-709) в качестве средства, повышающего иммугигу1оюпршикпяшостъо{ташзшприразвшт1идгппт«ош11ериго-пошгческого и физического утомления, для усиления защшных сил организма при контакте с бактериальной или вируснрй инфекцией, коррекции ягоричных нммутаефищтгък состояний различной эгтологи, включая стрессорную, для усиления функциональной активностиТ-лимфо»пггов-эффекторов, при нарушениях иммунитета, опосредованных чрезмерной активностью Т-супрессоров.

3. При подборе иммугюмсоулягороз среди аа^ангансодержшдих соелшгешй в терапии иммунологической недостаточности особое внимание необходимо }ттпъ причинам, вызывающим нарушения иммунологических показателей, и контролю психического статуса пациентов.

4. Рекомендуется созвать на основе АДК-910 и ДДК-918 новые препараты -психоиммуцорегулчторы, доя применения в условиях острого психоэмоционального стресса

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Изучение иммунотропной активности М-(2-ааамантнл) анилина на моделях клеточном и гуморального иммунитета. Хим. фа, i. ж., N 9. 1079, с. 8-11 (соавт. Арцимович Н.Г.. Шашмииова Ю.А., Фадеева Т.А., Шмарьяи М.И., Климова Н.В., Зайцева Н.МЛ

2. Хлоргидрат-1^-(2-адамаитнл)-п-фторанилин, ооладаюшнй иммуностимулирующей активностью и повышающий физическую работоспособность. A.c. N 782313. Бкшл. N ЗЗ.Открытня. Изобретения. 19X0. 6 с. (Д.С.П.) (соавт. Зайцева Н.М., Морозов И.С., Климова Н.В., Шмарьяи М.И., Лаврова Л.Н.. Курочкин И.С., Любимов Б.!' . Фалеева Т.А.. Арцимович Н.Г., Захарова Т.Е.).

3. Влияние биологически активных полисахаридов, выделенных из простейших, на некоторые показатели иммунитета. Всесоюзн. конф. "Актуальные проблемы оценки фармакологической активности химических соединений". Тез. докл. ч.2, Ногинск. М., 1981, с. 85-86 (соакт. Мондрус К.А.).

4. Иммуномодулирукшгее действие производных адамантана. I Всесоюзн. иммунол. съем. Тез. докл. Сочи., М, 1989. т.1, с. 387 (соавт. Фадеева Т.А., Климова I.B., ГЬ н Б.М., Краснова О.М.).

5. Ксмантан - новый отечественный иммуностимулятор. Тез. докл. Всесоюзн. конф.: Перспективы развития химии каркасных соединении и их применение в народном хозяйстве. Куйбышев. 1989, с. 44 (соавт.Арцимович Н.Г., Фадеева Т.А., Климова Н.В., Пятин Б.М.. Краснова О.М.).

6. Биологическая активность и зависимости "структура-действие" в ряду производных адамантана. Тез. докл. Всесоюзн.конф.: Перспективы развития химнии каркасных соединений и их применение в народном хозяйстве. Куйбышев. 1989, с. 104 ("laisr. Морозов И.С., Пятин Б.М., Ефимова Л,П., Арцимович Н.Г., Фалеева Т.А., Сергеева А.).

7. Нитробеизоидамшмадамаитши и их биолошческая активность. Тез. докл. Всесоюзн. конф.: Перспективы развития химии каркасных соединений и их применение в народном хозяйстве. Куйбышев. 1489. с. 52 (соант.Климоаа Н.В., Зайцева Н.М., Морозов И.С., Фадеева Т.А., Пятин Б.М.. Быков Н.П.).

8. Применение нового пмм\номодулятпра кемантана для коррекции иммунологической недостаточности различной этиологии. Тез. док." 1 Конф. иммунологов Эстонии, Тарту,

1989. с. б (соавт. Арцимович Н.Г., Фадеева Т.А.. Краснова О.М.).

9. Влияние стресса на исход беременности и иммунную систему потомства мышей. Всесоюзн.конф. "Стресс и иммунитет" (психонейроиммунсмогия)., Р.н.Д., 1989, с.55-57(соавт. Фадеева Т.А., Фсдорушенко А.Н.).

Ю.Пснхоиммуностнму.тяторы в ряду производных адамантана. 5 Всесюзн. симп.: Взаимодействие нерпной и иммунной систем, Оренбург. 1990. с.65 (соавт. Арцимович Н.Г., Фадеева Т.Д., Морозов И.С.).

11 .Реабилитация иммунологической недостаточности с помощью нового иммуиомодулятора кемантана. Труды Н-го Всесозн. симп. "Реабилитация иммунной системы". Цхалтубо,

1990, с. 59 (соавт. Фцдеена Т.А., Арцимович Н.Г.).

12. Применение нового иммуностимулятора кемантана в клинической npssmuce. Труды научно-практнч. конф.: Реконо руктнвная хнрургня, Р.к.Д,. 1990, с. 188 (соаяг. Арцимович Н.Г.. Фадеева ТА.).

13. Применение н перспективы использования нового иммунош»зулятора кемантана. Межд. симп. "Проблемы иммунофармакшюпт*, Тбилиси, 1990, с. 37 (соавт.Аршшовнч Н.Г., Фадеева Т.А.).

14. Экспериментальное изучение иммунотропной активности нового лекарственной! препарата кемантана. Иммунопопм, 1990. N6, с. 21-23 (соавт. Арцимович Н.Г., Фадеева Т.А., Климова Н.В., Пиши Б.М.. Краснова О.М.).

15.2-1 N •iwpMGjÄ^tfWtvwM.'^l Ti N -пара! xnopfcinowi)} аминоадамантаны. пов! гшакшше

резистентность рганизма к действию факторов срелы обитания и обладающие иммуностимулирующей активностью. А.с. N 1646256. 1990 (Д.С.П.) (соавт. Морозов И.С., Арцимович Н.Г., Фалеева Т.А., Климова Н.В., Пятин Б.М., ЗайцеваН.М., Сереаенин С.Б., Иванова И.А.).

16 Chemical neuroimmunomodulators. Abstr. of 1st. Inter. Congress ISNIM (4th Intern. Workshop on Neuroimmunomodulation). Italy, Florence, 1990. p. 552 (соавт. Fadeeva T.A., Artsimovich N.G., Morozov I.S.).

17. Адамаптансодержащие соединения при лечении сосудистой патологии. Всесоюзн. конф. Неотложные состояния в антологии, Р.н.Д., 1991, с. 193 (соавт. Арцимович Н.Г., Фадеева Т.А.).

18.Immunomodulatory activity of kei„antan. Abstr. of XIV Intern. Congr. of Allergo). and Clin. Immunol. Japan. Kyoto, 1991, p.129, (соавт. "adeeva T.A., Artsimovich N.G.). 19. Новые химические нейроиммуномодуляторы. I Съезд иммунологов России, Новосибирск,' 1992. с. 24-25 (соавт.Арцимович Н.Г., Фадеева Т.А.).

20.2-(о-гидроксифенилен) - амииоацамантан, обладающий иммуно- и психостимулирующей активное ю. А. с. N 1820606. 1992, (Д.С.П.) (соавт. Арцимович Н.Г., Фадеева Т.А., Морозов И.С., Пушкарь Г.В., Климова Н.В., Пятин Б.М.).

21. Изучение иммунотропной активности двух новых адамантансодержащих соединений, перспективных для клинического применения. 1-ый Респ. <р>езд "Аллергология и иммунология". Материалы съезда. Баку, 1992, с.22-23 (соавт. Фадеева Т.А., Арцимович Н.Г.).

22. Изучение влияния некоторых психотропных препаратов на показатели клеточного иммунитета.1 Республ. съезд: Аллергология и иммунология. Баку, 1992, с. 77-78 (coatrr. Матвиенко М.А., Арцимович Н.Г., Фадеева Т.А.).

23. Иммунотропная активность новых нейроиммуномодуляторов. Мат. симп. с межд. участием: "Текущие проблемыклиннческойн экспериментальной психоиейроиммунологии". Томск, 1992, с. 149-151 (соавт. Фадеева Т. А., Матвиенко М.А., Морозов И.С., Арцимович Н.Г.).

24. 4-оксагомоадамантан-1-ол-5-он, используемый в качестве иммуностимулирующего средства. Положительное решение о выдаче патента N 1826071 по заявке N 42051 от февраля 1993 г. (соавт. Петров Р.В., Арцимович Н.Г., Багрий Е.И., Фадеева Т.А., Аккерман С.Б., Матвиенко М.А.).

25. Иммуностимулиру )шое средство "Бромантаи". Патент СССР N 1826906. Бюл. N25. Открытия. Изобретения. 1992. 10с. (соавт. Морозов И.С., Арцимович Н.Г., Фадеева Т.А., Климова Н.В., Матвиенко М.А., Пятин Б.М., Зайцева Н.М., Середенин С.Б., Любимов Б.И., Авдонина Н.И., Кисляк Н.А., Иванова И.А.).

26. Adamantan derivated neuroimmunomodulators. 8-th Int. Conf. of Immunol. Hungary, Budapest, 1992, v. 112, p. 700 (соавт. Artsimovich N.G.. Fadeeva T.A., Matvienko M.A.). • 27.in anune effect of some newneuroii"munomodulators. Abstr. of Symp.: Current problem of clinical and experimmenta! psychoneuroimmunology. Tomsk, 1992, p. 82. (соавт. Fadeeva Т., Matvienko M., Artsimovich N.),

28. Изучение иммуностимулирующей активности бромантана при стрессе. Тез. докл. Российск. науч. конф.: Антигипоксанты и актопротекторы. Итога и перспективы. С.-П., 1994. вып. 4, с. 267 ( соавт. Морозов И.С., Иванова И.А., Карпова Т.В., Фадеева Т.А.).

УЧАСТОК МНОЖИТЕЛЬНОЙ ТЕХНИКИ B0HU АМН ССС?

ПОДП. К ПЕЧАТИ 26.л •

ЗАКАЗ 476 ТИРАЖЮО зкз.