Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Роль некоторых CC-хемокинов, лигандов CXCR3 и цитокинов, индуцирующих их продукцию, в иммунопатогенезе хронического вирусного гепатита C

На правах рукописи

АРСЕНТЬЕВА Наталья Александровна

РОЛЬ НЕКОТОРЫХ СС-ХЕМОКИНОВ, ЛИГАНДОВ СХСИЗ И ЦИТОКИНОВ, ИНДУЦИРУЮЩИХ ИХ ПРОДУКЦИЮ, В ИММУНОПАТОГЕНЕЗЕ ХРОНИЧЕСКОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА С

14.03.09 — клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

11 НОЯ 2015

005564283

Санкт-Петербург- 2015

005564283

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, член-корреспондент РАН, профессор Тотолян Арег Артемович

Официальные оппоненты:

Симбирцев Андрей Семенович - доктор медицинских наук, профессор, директор Федерального государственного унитарного предприятия «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства России

Пинегин Борис Владимирович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом иммунодиагностики и иммунокоррекции Федерального государственного бюджетного учреждения «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства России

Ведущее учреждение:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова» Российской академии наук

Защита состоится« /О » ^¿¿¿(soJ'lI 2015 года в часов на заседании диссертационного совета Д208.046.02 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10 и на сайте: http://www.gabrich.ru.

Автореферат разослан «_

М » OtCiy?(jcJ;|/ 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук

Новикова Лидия Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Вирусный гепатит С относят к числу социально-значимых инфекционных заболеваний. Интерес к этой инфекции определяют: длительная персистенция вируса в организме и высокая частота хронизации инфекционного процесса (до 80%), нарушение нормального течения иммунного ответа, прогрессирование заболевания в цирроз и рак печени. В настоящее время остаются нераскрытыми многие аспекты патогенеза хронического гепатита С. Согласно современным представлениям повреждение печеночной ткани в большей степени является результатом реализации иммунного ответа, а не цитопатического действия вируса гепатита С (Bertoletti A. et al., 2000; Ahmad A. et al., 2004).

В последнее время большое внимание уделяется роли хемокинов в иммунопатогенезе хронического гепатита С и их участию в фиброгенезе. Хемокины - семейство цитокинов, основная функция которых состоит в контроле клеточной миграции. Они участвуют в тканевом гомеостазе, развитии ткани, в частности, в продукции коллагена, ангиогенезе, процессах пролиферации и репарации (Esche С. et al., 2005). При гепатите С в печени усиленно продуцируются провоспалительные хемокины, вызывая миграцию лейкоцитов с периферии в печеночную паренхиму, и, таким образом, регулируя иммунные процессы в очаге воспаления (Оо Y.H. et al., 2010; Marra F. et al., 2014). Показано, что в иммунопатогенезе вирусного гепатита С участвуют провоспалительные цитокины - TNFa, IL-12, интерфероны (IFNa, IFNP, IFNy), IL-10 и хемокины - CCL2/MCP-1, CCL4/MIP-ip, CXCLIO/IP-IO (Жданов K.B. и др., 2007; Moura A.S. et al., 2009; Zeremski M. et al., 2009).

Естественную элиминацию вируса гепатита С связывают с успешным контролем репликации вируса иммунной системой. В этом случае формируется специфический Т-клеточный ответ (Bowen D.G. et al., 2005). Таким образом, интерес при хроническом гепатите С представляют хемокины, ответственные за привлечение эффекторных Т-клеток в очаг воспаления. Хемокиновые рецепторы CXCR3 и CCR6 присутствуют на поверхности различных субпопуляций Т-лимфоцитов, при гепатите С они определяют миграцию в разные отделы печени (Оо Y.H. et al., 2010). Лигандом рецептора CCR6 является хемокин CCL20/MIP-За, увеличение концентрации которого показано в крови больных с гепатоцеллюлярной карциномой и циррозом печени по сравнению с больными хроническим гепатитом С с фиброзом печени и здоровыми лицами (Soliman Н.Н. et al., 2012). Особое внимание уделяют роли лигандов рецептора CXCR3: CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10 и CXCL11/ITAC (Helbig K.J. et al., 2004;

Apolinario A. et al., 2005; Zeremski M. et al., 2008). Эти хемокины являются IFNy-зависимыми, также их секрецию может активировать TNFa. По мнению многих авторов, именно лиганды CXCR3 являются основными факторами, ответственными за запуск и поддержание воспалительного каскада, характерного для гепатита С (Apolinario A. et al., 2002; Butera D. et al., 2005). Обнаружено, что повышенный уровень CXCL10/IP-10 в крови является предиктором негативного исхода стандартной противовирусной терапии (пегилированный интерферон + рибавирин) при хроническом гепатите С (Romero A.I. et al., 2006; Casrouge A. et al., 2011). Тем не менее, до сих пор не ясно, почему провоспалительные хемокины приводят к прогрессированию гепатита С. Предполагается, что клеточный иммунный ответ играет решающую роль не только в элиминации вируса, но и в повреждении ткани печени при хроническом воспалении. Однако в настоящее время об изменениях экспрессии хемокиновых рецепторов CXCR3 и CCR6 на Т-клетках и других субпопуляциях лимфоцитов известно немного.

Актуальной задачей является поиск биомаркеров, отражающих стадию фиброза печени. Формирование цирроза и рака печени за непродолжительный период времени происходит приблизительно у 15-20% людей, инфицированных вирусом гепатита С, именно эти пациенты относятся к группе риска по неблагоприятному развитию заболевания. Раннее выявление и уточнение стадии фиброза позволяет своевременно начать лечение, направленное на уменьшение темпов прогрессирования фиброза и предотвращение развития цирроза и рака печени. Применение малоинвазивных лабораторных методов с использованием биомаркеров крови позволит более точно диагностировать стадию заболевания, наблюдать за темпами прогрессирования фиброза и проводить исследования в динамике лечения.

Ключевыми процессами в развитии фиброза печени являются продукция компонентов внеклеточного матрикса звездчатыми клетками и ангиогенез. Хемокины способны активировать звездчатые клетки, при этом они сами могут быть источником хемокинов (Efsen Е. et al., 2001; Schwabe R.F. et al., 2001). В то же время важной функцией хемокинов является участие в ангиогенезе. Лиганды рецептора CXCR3 (CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10 и CXCL11/ITAC) относят к ангиостатическим хемокинам, которые в норме должны обладать противофибротическими свойствами, однако в литературе описана противоположная зависимость между этими хемокинами и процессами фиброгенеза (Larrubia J.R. et al., 2007; Casrouge A. et al., 2011). Практически отсутствуют сведения об экспрессии хемокиновых рецепторов CCR6 и CXCR3

на различных субпопуляциях лимфоцитов и их связи с фиброзом печени. Мало изучена диагностическая значимость изменений цитокинов/хемокинов, которые могли бы выступать в качестве иммунологических маркеров стадий фиброза печени.

Цель исследования: изучение иммунопатогеиетической роли некоторых СС-хемокинов, лигандов СХСЯЗ и цитокинов, индуцирующих их продукцию, при различных стадиях хронического вирусного гепатита С для поиска новых биомаркеров фиброза печени.

Задачи исследования

1. Оценить содержание цитокинов №N7, ЮТ а и хемокинов: ССЬ2/МСР-1, ССЬЗ/МПМа, ССЬ4/М1Р-1Р, ССЬ5/КАЖЕ8, ССЬ8/МСР-2, ССЬ20/М1Р-За, СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10 и СХС1Л1/1ТАС в плазме крови больных хроническим вирусным гепатитом С в зависимости от генотипа вируса и стадий фиброза печени.

2. Определить количественное содержание субпопуляций лимфоцитов — Т- и В-лимфоцитов, ЫК_ и ТЫК-клеток, экспрессирующих хемокиновые рецепторы СХСЯЗ и ССЯ6 - в периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом С при различных стадиях фиброза печени.

3. Определить уровни экспрессии мРНК генов рецепторов СХСЯЗ, ССЯ6 и хемокинов СХСЬ9/МЮ, СХС1Л0/1Р-10, СХСЫ1/1ТАС, ССЬ20/ М1Р-За в тканях печени больных хроническим вирусным гепатитом С.

4. Оценить информативность определения содержания цитокинов/хемокинов в плазме крови и определения экспрессии рецепторов СХСЯЗ и ССЯ6 на субпопуляциях лимфоцитов как биомаркеров для дифференциальной диагностики стадий фиброза печени.

Научная новизна

В крови здоровых доноров установлены значения концентраций хемокинов ССЬ2-ССХ5, ССЬ8/МСР-2, ССЬ20/М1Р-За, СХСЬ9-СХСЫ1 и диапазоны содержания основных субпопуляций лимфоцитов, экспрессирующих хемокиновые рецепторы СХС113 и ССЫ6, которые могут служить референсными показателями в иммунологических исследованиях.

Разработан алгоритм дифференциальной диагностики стадий фиброза печени при хроническом вирусном гепатите С с использованием цитокинов Т№а, ССЬ20/М1Р-За и СХСЫ1/1ТАС на основе впервые проведенной оценки информативности некоторых цитокинов и хемокинов в плазме крови в качестве маркеров прогрессировали фиброза печени.

Впервые проведен сравнительный анализ экспрессии мРНК генов рецепторов хемокинов СХСЯЗ, ССЯ6 и их лигандов в тканях печени больных хроническим вирусным гепатитом С с различными стадиями фиброза печени, показана повышенная экспрессия мРНК генов ССЯ6, СХСЯЗ и СХС1Л0/1Р-10 при умеренном и тяжелым фиброзе печени по сравнению со слабо выраженным фиброзом. Впервые показано, что уровень содержания ССХ8/МСР-2 в плазме крови больных хроническим гепатитом С сопряжен с генотипом вируса.

Теоретическая и практическая значимость

Выявлена значимая роль хемокинового рецептора СХСЯЗ, его лигандов СХСЬ9-СХС1Л1, хемокинов ССЬ2/МСР-1, ССЬ20/М1Р-За и ТОБа в иммунопатогенезе хронического вирусного гепатита С. Установлена связь между стадией фиброза печени и концентрацией некоторых цитокинов/хемокннов в плазме крови больных хроническим гепатитом С: по мере прогрессировать фиброза печени возрастают концентрации ТЫРа, ССЬ2/МСР-1, СС1_20/М1Р-За, СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10, СХСЫ1/1ТАС. Показано изменение характера экспрессии хемокинового рецептора СХСЯЗ на различных субпопуляциях лимфоцитов у лиц, инфицированных вирусом гепатита С, в зависимости от стадии фиброза печени и по сравнению со здоровыми людьми.

Разработан алгоритм дифференциальной диагностики стадий фиброза печени при хроническом вирусном гепатите С. Получена приоритетная справка на изобретение «Способ лабораторной диагностики стадии фиброза печени при хроническом вирусном гепатите С» (заявка №2015103011 от 29.01.2015). Данный алгоритм поможет улучшить лабораторную диагностику фиброза печени.

Полученные значения содержания хемокинов ССЬ2/МСР-1, ССЬЗ/М1Р-1а, ССЬ4/М1Р-1р, ССЬ5/ЯАКТЕ8, ССЬ8/МСР-2, ССЬ20/М1Р-За, СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10 и СХСЫ 1/1ТАС в плазме крови практически здоровых лиц могут служить контрольными показателями при проведении иммунологического обследования.

Результат!,I диссертации используются в практическом занятии и лекции по теме «Хронические вирусные гепатиты», проводимых на кафедре инфекционных болезней взрослых и эпидемиологии ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» МЗ РФ и в учебном процессе на кафедре инфекционных болезней и эпидемиологии ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» МЗ РФ.

Методология и методы исследования

Методология настоящего исследования спланирована в соответствии с поставленной целью. Предметом исследования стали хемокины/цитокины и хемокиновые рецепторы у больных хроническим вирусным гепатитом С. Научная литература, посвященная проблеме гепатита С, была проанализирована формально-логическими методами исследования. Планирование и проведение исследований, направленных на решение поставленных задач, осуществлялось на основе общенаучных и специфических методов.

В исследование было включено 73 человека с диагнозом «хронический вирусный гепатит С» (51% мужчин, 49% женщин, средний возраст 39,0±11,2 лет), ранее не получавших противовирусную терапию. Всем пациентам была проведена пункционная биопсия или эластометрия печени, определена вирусная нагрузка и генотип вируса гепатита С. Постановка диагноза, клинический осмотр больных, биохимическое исследование крови, пункционная биопсия печени, эластометрия печени, молекулярно-генетические исследования проводились врачами кафедры инфекционных болезней взрослых и эпидемиологии ГБОУ ВПО Санкт-Петербургского государственного педиатрического медицинского университета МЗ РФ (зав. кафедрой - д.м.н., профессор Эсауленко Е.В.) и кафедры инфекционных болезней ФГЗВОУ ВПО Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова МО РФ (начальник кафедры -д.м.н., профессор Жданов К.В.). Контрольную группу составили условно здоровые лица (п=37), сопоставимые по полу и возрасту с основной группой.

Больные хроническим вирусным гепатитом С были разделены на три группы в зависимости от выраженности фиброза печени согласно стандартизированной системе «МЕТАVIR» (Poynard Т. et al., 1997): FO-1 -отсутствие/слабо выраженный фиброз, F2 — умеренный и F3-4 тяжелый фиброз/цирроз печени. В зависимости от генотипа вируса гепатита С, больных распределили в две группы: инфицированные вирусом 1 (а и Ь) и не 1 генотипа (2 и За).

Материалом исследования служили периферическая кровь (п=110) и биоптаты печени (п=26). На проведение данного исследования было получено согласие Этического комитета ФБУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера».

В плазме крови методом мультиплексного анализа определяли концентрации цитокинов/хемокинов: IFNy, TNFa, CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-la, CCL4/MIP-lß, CCL5/RANTES, CCL8/MCP-2, CCL20/MIP-3«, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10 и CXCL11/ITAC. Использовали коммерческие тест-системы

«Milliplex MAP» (Millipore, США), основанные на технологии Luminex хМАР (Luminex, США) с применением магнитных микросфер. Регистрацию и анализ данных проводили на приборе Luminex MAGPIX.

В цельной крови методом проточной цитофлюориметрии оценивали количественный состав субпопуляций лимфоцитов, несущих хемокиновые рецепторы CCR6 и CXCR3: цитометры Navios (Beckman Coulter, США) и F АС S Canto II (Becton Dickinson, США). Использовали следующие комбинации прямых моноклональных антител (Beckman Coulter, BioLegend, BD Biosciences, США): 1) CD3-FITC/CD16-PE+CD56-PE/CD45-PerCP-Cy5.5/CD4-PE-Cy7/CD19-APC; 2) CD19-FITC/CD3 -PE/CCR6-PE-Cy7/CXCR3-APC/CD4-APC-Cy7; 3) CD3-FITC/CD16-PE+CD56-PE/CCR6-PE-Cy7/CXCR3-APC/CD8-APC-Cy7. Абсолютные значения были получены в одноплатформенной (с помощью реагента FlowCount™ (Beckman Coulter, США)) и в двухплатформенной (с использованием результатов гематологического анализа Pentra 60 (HORIBA АВХ, Франция)) системах.

В биоптатах печени определяли экспрессию мРНК генов хемокинов: CCL20/MIP-3a, CXCL9/MIG, СХСЫ0ЛР-10, CXCL11/ITAC и рецепторов: CCR6 и CXCR3. Выделение РНК проводили в соответствии с протоколом методики Хомчинского и др. (Chomczynski P. et al., 2006) с нашими модификациями, с использованием набора реагентов Trizol (Invitrogen, США) с модификацией фенольной экстракции и гомогенизацией образца в ультразвуковой мойке «Ultrasonic» (Elma, Германия). Для получения кДНК на матрице РНК использовали набор реагентов «PEBEPTA-L» (ЦНИИЭ, Россия). ПЦР в режиме реального времени проводили со специфическими праймерами и зондами, с использованием технологии TaqMan. Подбор праймеров и зондов осуществляли с помощью программы Primer-BLAST. Анализ результатов проводили по методу относительного подсчета (метод дельта Ct) с нормализацией по эндогенному референс-гену (GAPDH).

Статистическую обработку данных осуществляли с помощью программ Prízm 5.0 (GraphPad Software Inc.), Statistica 8.0 (StatSoft Inc.), JMP 11.0 (SAS Institute Inc.). Использовали стандартные методы непараметрнческой статистики: критерий Манна-Уитни, ранговую корреляцию Спирмена, критерий Краскела-Уолиса. Для оценки качества предлагаемых диагностических маркеров фиброза печени проводили анализ кривых операционной характеристики (ROC), вычисляли площадь под характеристической кривой (ППК). Для нахождения оптимальной комбинации биомаркеров был применен метод построения деревьев решений.

Личное участие автора в получении результатов

Автор осуществляла планирование работы, подбор групп обследуемых, обработку биоматериала исследования. Автор самостоятельно на базе лаборатории молекулярной иммунологии и сероэпидемиологии ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера определяла концентрации цитокинов/хемокинов, проводила выделение мРНК из биоптатов печени, реакцию обратной транскрипции, определение экспрессии мРНК хемокинов и рецепторов. Совместно с сотрудником отдела иммунологии ФГБУ «НИИ экспериментальной медицины» Кудрявцевым И.В. проводила цитометрический анализ. Автором лично формировалась база данных, проводилась статистическая обработка, систематизация полученных результатов, а также подготовка публикаций.

Положения, выносимые на защиту

1. Для хронического вирусного гепатита С характерно повышенное количество СХСЮ+ Т-хелперов и В-лимфоцитов, сниженное количество СХСЮ+ цитотоксических Т-лимфоцитов, >1К- и ТЫК-клеток, а также сниженное количество ССЯ6+ ТИК-клеток, в сочетании с повышенным содержанием некоторых СС-хемокшюв (ССЬ2/МСР-1, ССЬ4/М1Р-1р, ССЬ8/МСР-2, ССЬ20/М1Р-За), лигандов СХСЯЗ (СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10, СХСЫ1/ГГАС) и ТОБа.

2. Прогрессирование фиброза печени при хроническом вирусном гепатите С взаимосвязано с увеличением числа СХСЯЗ+ В-лимфоцитов в крови, нарастанием содержания ТОТа и хемокинов (ССЬ2/МСР-1, ССЬ20/М1Р-За, СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10, СХСЫ 1/1ТАС) в плазме крови и нарастанием экспрессии мРНК генов ССЯ6, СХСЯЗ и СХСЫ0/1Р-10 в тканях печени.

3. Разработанный алгоритм, основанный на сочетанном определении содержания в плазме крови СХСЫ 1/ГГАС, ЮТа и ССЬ20/М1Р-За при хроническом вирусном гепатите С позволяет проводить дифференциальную диагностику стадий фиброза печени РО-1, ¥2 и РЗ-4.

Степень достоверности и апробация результатов исследования

О достоверности результатов работы свидетельствует достаточный объем исследований с применением современных, высокочувствительных и специфичных методов с автоматизированным учетом и оценкой результатов, адекватных методов статистической обработки полученных данных.

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ФБУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» (протокол №4 от 15 апреля 2015 г.).

Результаты исследования были доложены на Международной конференции «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 2013), научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «От эпидемиологии к диагностике инфекционных заболеваний: подходы, традиции, инновации» (Санкт-Петербург, 2014), Юбилейной научно-практической конференции «Современные проблемы иммунофармакологии, биотехнологии и цитокиновой регуляции» (Санкт-Петербург, 2014), VI Всероссийской конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактической медицины» (Ставрополь, 2014), Scientific Symposium of the Institute Pasteur International Network (Париж, 2014), Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2015), XV Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2015).

Работа была выполнена при поддержке грантов ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера «Конкурс научных работ молодых ученых» в 2011 и 2013 годах.

По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, из которых 7 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования результатов диссертаций.

Объем н структура диссертации

Работа состоит из введения, четырех глав собственных исследований, заключения, списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 110 страницах, содержит 10 таблиц и 10 рисунков. Список литературы включает 122 источника, в том числе 109 - на английском языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Содержание цитокинов/хемокинов в плазме крови обследованных лиц

Исходя из цели и задач настоящего исследования, первым разделом работы было определение содержания IFNy, TNFa, CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-la, CCL4/MIP-lp, CCL5/RANTES, CCL8/MCP-2, CCL20/MIP3a, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10 и CXCL11/ITAC в плазме крови обследованных лиц. Как видно из таблицы 1, у больных хроническим вирусным гепатитом С (ХВГС) концентрация TNFa в 1,6 раз превышала значения контроля (р<0,0001), что может свидетельствовать о развитии воспалительной реакции. Самые значительные изменения содержания хемокинов у пациентов в сравнении с контрольной группой касались лигандов рецептора CXCR3: CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10 и CXCL11/ITAC, концентрации которых возрастали более чем

в 2-3 раза (р=0,001; р<0,0001). Полученные результаты сопоставимы с данными литературы (Shields P. L., 1999; Bieche I., 2005; Larnibia J.R., 2007; Tan А.Т., 2010). Содержание IFNy в крови больных ХВГС не отличалось от контроля, что можно объяснить подавляющим действием белков HCV на выработку интерферонов (Foy Е., 2003; Li X., 2005).

Таблица 1 - Содержание цитокинов и хемокинов в плазме крови условно здоровых лиц и больных ХВГС

Цитокин/ хемокин Концентрация в плазме крови Р

Условно здоровые лица ХВГС

Me Q1-Q3 Me Q1-Q3

IFNy, пг/мл 4,90 2,51-9,52 5,46 2,75-12,21 0,617

TNFa, иг/мл 6,76 5,98-8,48 10,59 7,58-14,56 <0,0001

CCL2/MCP-1, пг/мл 137,2 98,8-176,6 188,6 151,3-281,0 0,0008

CCL3/MIP-la, пг/мл 0,00 0,00-0,56 0,00 0,00-3,13 0,086

CCL4/MIP-1P, пг/мл 22,83 17,30-32,64 28,12 23,38-38,48 0,0419

CCL5/RANTES, нг/мл 170,3 123,8-237,5 204,7 130,8-280,8 0,327

CCL8/MCP-2, пг/мл 38,68 30,19-46,41 52,24 30,16-82,53 0,0214

CCL20/MIP-3a, пг/мл 13,00 9,76-16,37 18,40 11,37-30,56 0,0216

CXCL9/MIG, пг/мл 444,1 341,9-806,9 871,1 579,4-1479,0 0,001

CXCL10/IP-10, пг/мл 149,1 112,9-251,3 445,5 347,9-708,0 <0,0001

CXCL11/ITAC, пг/мл 77,49 57,71-123,50 167,00 87,29-290,20 <0,0001

Примечание. Ме - медиана; <31-(33 — нижний и верхний квартили.

Уровень Т№а в плазме крови больных ХВГС положительно коррелировал с содержанием 1РИу (г=0,52; р<0,0001), ССЬ2/МСР-1 (г=0,40; р<0,01), ССЬ4/М1Р-1Р (г=0,38; р<0,01), СХСЬ9/МЮ (г=0,34; р<0,01), СХСЫ0/1Р-10 (г=0,43; р<0,01), СХСЫ1/1ТАС (г=0,38; р<0,01). Известно, что ТЫ Ра является активатором продукции различных молекул, в частности, хемокинов: МСРя, М1Р$ и СХС (МагПоуаш А., 1999). Выявлена слабая прямая корреляция между ПТЧу и СХСЬ9/МЮ (г=0,28; р<0,05), СХСЫ0/1Р-10 (г=0,24; р<0,05), но не с СХСЫ 1/1ТАС, выработку которого при ХВГС активируют другие факторы, например, цитокин Т№а, что подтверждают данные настоящей работы.

При всех стадиях ХВГС (Р0-1, Р2, РЗ-4) статистически значимо были повышены концентрации Т№а, ССЬ2/МСР-1 и трех лигандов рецептора схсяз по сравнению с контролем. Содержание ССЕ20/М1Р-3(х в крови больных ХВГС с РЗ-4 более чем в 2 раза превышало медианные значения в группе практически здоровых лиц (р=0,0008). Содержание Т№а и №N7 в группе больных с РЗ-4 возрастало в 1,7 раз (р=0,007) и 2,9 раз (р=0,01), соответственно,

по сравнению со стадией F2. Полученные результаты согласуются с данными литературы, свидетельствующими о том, что уровни TNFa и IFNy в крови при циррозе печени и гепатоцеллюлярпой карциноме превышают таковые при ХВГС (Huang Y.S., 1999; Kawakami Y., 2000; Moráis C.N., 2010).

В крови больных ХВГС возрастало содержание TNFa в зависимости от нарастания процесса фиброзирования (таблица 2). Известно, что внутрипеченочные Т-клетки больных ХВГС производят в 50 раз больше TNFa по сравнению со здоровыми лицами, что может приводить к TNF-зависимому апоптозу гепатоцитов (Kanto Т., 2006). TNFa активирует клетки, обладающие цитотоксическими функциями, которые также могут приводить к повреждению гепатоцитов. Следовательно, возрастание концентрации TNFa в плазме крови больных ХВГС может служить негативным признаком развития заболевания.

Таблица 2 - Корреляционная зависимость содержания цитокинов и

Цитокин/ хемокин Кэффиииент корреляции Спирмена (г) Р

IFNy 0,13 0,1916

TNFa 0,48 < 0,0001

CCL2/MCP-1 0,42 < 0,0001

CCL3/MIP-la 0,07 0,5062

CCL4/MIP-1P 0,18 0,0776

CCL5/RANTES 0,01 0,8965

CCL8/MCP-2 0,12 0,2398

CCL20/MIP-3 a 0,35 0,0004

CXCL9/MIG 0,38 0,0001

CXCLIO/IP-IO 0,70 < 0,0001

CXCL11/ITAC 0,52 < 0,0001

Наиболее сильная зависимость стадии фиброза печени от уровня цитокинов/хемокинов в плазме крови больных ХВГС была установлена для CXCL10/IP-10, CXCL11/ITAC (таблица 2). Аналогичные результаты описаны в литературе (Wasmuth Н.Е., 2009; Tacke F., 2011). Интересно отметить, что при ингибировании CXCL10/IP-10 уменьшается воспаление и повреждение печеночной ткани (Simpson K.J., 2003). Кажется противоречивым, что ангиостатические хемокины CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10 и CXCL11/ITAC, которые должны в норме тормозить развитие фибротических процессов, по данным настоящего исследования и литературы, потенцируют процесс повреждения печеночной ткани. Последние исследования показали, что хемокин CXCLI0/IP-10 в крови больных ХВГС может находиться в форме антагониста,

не способного выполнять свои функции (СаБппще А., 2011). Дефектные формы СХСЫ0/1Р-10 способствуют инфильтрации печени не специфическими клетками, приводя к повреждению печеночной паренхимы и активации процессов фиброгенеза. Выявлено, что в зависимости от стадии фиброза печени возрастает уровень хемокинов ССЬ2/МСР-1 и ССЬ20/М1Р-За (таблица 2).

Таким образом, определение СХС-хемокинов (СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10 и СХСЫ1/1ТАС) и СС-хемокинов (ССЬ2/МСР-1 и ССЬ20/М1Р-За), как суррогатных маркеров повреждения печени, может быть использовано в лабораторной диагностике ХВГС.

С целыо поиска биомаркеров для дифференциальной диагностики стадий фиброза печени был проведен ЯОС-анализ. Среди исследованных нами цитокинов/хемокинов наиболее информативным оказался уровень СХСЫ1/1ТАС в плазме крови для разделения больных ХВГС со стадиями фиброза Р0-1 и Р2: чувствительность 57,1%; специфичность 80,0%; ППК=0,71; критерий > 232,1 пг/мл; р=0,02 (рисунок 1а). При разделении стадий фиброза Р2 и РЗ-4 был выявлен один информативный показатель - содержание ТЫРа в плазме крови: чувствительность 60,3%; специфичность 80%; ППК=0,81; критерий >13,6 пг/мл; р=0,0063 (рисунок 16).

СХС1_11/ГГАС

Рисунок

1-специфичность, %

1а

1 - ЛОС-кривые,

1-специфичность, % 16

характеризующие

зависимость

чувствительности и специфичности СХСЫ1/1ТАС (1а) при сравнении групп больных ХВГС Р0-1 и Р2 и ТЫГа (16) при сравнении групп больных ХВГС Р2 и РЗ-4.

Примечание. ППК - площадь под характеристической ЛОС-кривой.

В итоге, было установлено, что ни один из выделенных показателей по отдельности не обладает высокой чувствительностью при фиксированной специфичности (80%). Это исключает возможность их применения для диагностики фиброза печени. Для оценки диагностической ценности комбинированного использования биомаркеров был использован метод

построения классификационных деревьев решений. В результате показано, что совместное определение трех цитокинов CXCL11/ITAC, TNFa и CCL20/MIP-3a является достаточным для оценки стадии фиброза печени у больных ХВГС (рисунок 2). Значения ППК для трех цитокинов составили более 0,80, что согласно экспертной шкале оценки соответствует очень хорошему качеству выбранной модели (Hanley J.A., McNeil В.J., 1982). Были получены следующие пороговые значения для дифференциальной диагностики F0-1 и F2: CXCL11/ITAC - 166,5 пг/мл, TNFa - 15,7 пг/мл, CCL20/MIP-3a - 10,6 пг/мл; для дифференциальной диагностики F2 и F3-4: TNFa - 15,7 пг/мл, CXCL11/ITAC -301,8 пг/мл, CCL20/MIP-3a - 15,5 пг/мл. Использование данного алгоритма для диагностики стадий фиброза печени позволяет повысить чувствительность метода до 70-90% при достаточной специфичности (70-90%).

[го-1иг>2 j I ггиг>з)

ГГАС/СХСЩ___TNFa

2а 26

Рисунок 2 - Классификационные деревья решений для разделения групп больных ХВГС с разными стадиями фиброза печени. 2а: дерево решений для разделения групп больных ХВГС с F0-1 и F2. 26: дерево решений для разделения групп больных с F2 и F3-4.

Положительная корреляция была обнаружена между стадией фиброза печени и уровнем вирусной нагрузки (г=0,75; р<0,0001). Корреляционный анализ выявил прямую положительную связь между концентрацией ACT и уровнем хемокина CXCL9/MIG (г=0,48; р=0,002). При повреждении печени в результате цитолиза этот фермент попадает в кровь, при возрастании уровня ACT наблюдается тенденция к увеличению концентрации хемокина CXCL9/MIG.

В плазме крови больных, инфицированных 1-м генотипом вируса гепатита С (HCV), содержание CCL8/MCP-2 статистически значимо превышало значения контрольной группы и группы больных, инфицированных другими генотипами HCV: контрольная группа - Me—38,7 пг/мл; группа больных, инфицированных

1-м генотипом НСУ - Ме=58,5 пг/мл (р=0,0003); группа больных, инфицированных не 1 генотипом НСУ Ме=34,2 пг/мл (р=0,01). Исследования, касающиеся роли ССХ8/МСР-2 в иммупопатогенезе ХВГС, малочисленны. Возможно, что повышенная выработка ССЬ8/МСР-2 является еще одним из механизмов повреждения печени, вызванного 1-м генотипом НСУ.

2. Содержание субпопуляций лимфоцитов, экспресснрующих СХСКЗ и ССШ), в периферической крови обследованных лиц

Анализируя вышеописанные данные, мы пришли к выводу, что при ХВГС наиболее значимыми хемокинами в крови являются СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/>Р-10, СХСЫ1/1ТАС и ССЬ20/М1Р-За. Специфическими рецепторами для перечисленных хемокинов служат СХСЯЗ и ССЯ6. В связи с этим методом проточной цитофлюориметрии в периферической крови было определено не только общее количество Т-, В-, МК- и ТМК-лимфошпов, но и субпопуляции этих клеток, экспрессирующие СХСЯЗ и С С116.

При ХВГС абсолютное количество лимфоцитов превышало показатели контрольной группы (р=0,0053). При этом, у больных ХВГС возрастало количество Т-клеток (р=0,0024): ТЬ-клеток: контроль - Ме=663,2><10б/л; ХВГС -Ме=846,3х10б/л (р=0,0083) и цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ): контроль -Ме=328,4хЮ6/л; ХВГС - Ме=565,6х106/л (р=0,0003). Количество В-, ИК- и "ШК-клеток не отличалось в исследованных группах. Таким образом, при ХВГС число лимфоцитов увеличивается за счет Т-клеток. Различий в соотношениях субпопуляций лимфоцитов у больных ХВГС и контрольной группы не выявлено.

Из данных, представленных в таблице 3, следует, что у больных ХВГС по сравнению с контролем статистически значимо снижалось относительное количество ССЯб'ТЫК-лнмфоцитов. Абсолютное содержание ССЯ6+ЦТЛ в 4,4 раза превышало медианные значения контроля. У больных ХВГС статистически значимо возрастало количество ТЬ-клеток и В-лимфоцитов, несущих молекулу СХСЯЗ, и снижалось количество ЦТЛ, 1ЧК и Т1МК, экспресснрующих данный рецептор, по сравнению с контрольной группой.

При проведении корреляционного анализа была обнаружена отрицательная зависимость между содержанием [рЫу в плазме крови и количеством СХСЯЗ+Т-клеток (г=-0,46; р=0,001), содержанием СХСЯЗ+ЦТЛ (г=-0,40; р=0,004), СХСЮ^К (г=-0,38; р=0,009) и СХСКЗ+ТОК-клеток (г=-0,32; р=0,02). Также была выявлена отрицательная зависимость между концентрацией Тора в плазме крови и количеством СХСЮ+Т-лимфоцитов (г=-0,36; р=0,01). Таким образом, у больных с ХВГС при возрастании уровней №N7 и ТИБа в

плазме крови наблюдается тенденция к снижению количества клеток, обладающих цитотоксической активностью, несущих на своей поверхности хемокиновый рецептор СХСЯЗ.

Таблица 3 - Количественная характеристика субпопуляций лимфоцитов,

экспрессирующих хемокиновые рецепторы ССК6 и СХСЯЗ в крови практически здоровых лиц и больных ХВГС_

Субпопуляции клеток Количество клеток Р

Контроль, Ме (01-03) ХВГС, Ме (01-03)

ССНбТ-клетки % 46,51 (40,73-50,10) 32,10(20,55-54,06) 0,0689

х106/л 506,50 (423,60-743,80) 595,10(344,40-875,00) 0,9726

СХСКЗ+Т-клеткн % 41,93 (35,84-46,66) 48,20 (41,10-53,90) 0,0087

Х106/л 424,60 (362,51-567,40) 756,90 (523,4-1154,01) <0,0001

ССК6+ТЬ % 29,59 (24,66-38,50) 35,12 (20,93-91.39) 0,2700

Х106/л 415,80(356,60-548,50) 388,10(261,90-588,60) 0,1884

схсиз+ть % 34,99 (28,41-39,73) 44,20(38,31-51,40) <0,0001

Х106/л 225,40 (199,70-343,90) 417,10 (283,00-663,80) <0,0001

ССЛб+ЦТЛ % 11,44(6,52-21,17) 9,31 (5,64-14,71) 0,6543

Х106/л 37,01 (20,96-88,50) 164,80 (89,18-254,40) <0,0001

СХСКЗ+ЦТЛ % 69,13 (60,53-75,50) 48,30 (32,90-66,89) <0,0001

х106/л 211,50(172,90-291,40) 226,50(162,70-426,50) 0,2875

СС116+В-лимфоциты % 97,60 (97,20-98,03) 95,20 (92,93-97,03) 0,0860

х10"/л 182,80(131,20-218,80) 202,90(126,30-398,3) 0,6701

СХСПЗ В-лимфоцнты % 5,20 (3,34-9,05) 18,30 (10,10-25,58) <0,0001

х106/л 8,69 (5,34-13,97) 28,78 (18,46-61,45) <0,0001

ССКб^К % 5,81 (2,24-8,79) 4,40(1,80-6,87) 0,6514

х106/л 5,72 (3,41-14,16) 6,40 (2,28-14.08) 0,5146

схскз'мс % 37,45 (29,58-55,11) 15,50 (9,25-32,62) 0,0001

х106/л 41,70 (21,40-67,43) 39,30(15,21-62,87) 0,2514

ССИ6+Т^'К О/ /о 50,36 (37,28-62,66) 26,30 (10,25-54,76) 0,0108

х106/л 20,37(9,18-57,36) 7,73 (2,07-25,59) 0,0020

схскз+т.\к % 49,81 (37,40-62,55) 36,92 (20,45-55,50) 0,0172

х!06/л 23,62 (13,51-50,97) 11,73 (3,93-27,80) 0,0026

Примечание. Ме - медиана; 01-С>3 - нижний и верхний квартили.

Значимых корреляций между стадией фиброза печени и содержанием основных субпопуляций лимфоцитов в крови больных ХВГС не выявлено. У больных ХВГС с БЗ-4 значительно снижалось абсолютное количество Т-клеток (р<0,0001) по сравнению с группой Р2. При этом снижалось количество как Па-клеток: ¥2 - Ме=1313х106/л; ГЗ-4 - Ме=666,7х10б/л (р<0,0001), так и ЦТЛ: Р2 -Ме=847,1хЮб/л; - Ме=178,3х106/л (р=0,0002). Таким образом, при ХВГС с выраженным фиброзом/циррозом печени снижается количество Т-лимфоцитов, что может являться косвенным подтверждением теории о том, что при ХВГС специфические Т-клетки могут стать неотвечающими и находиться в состоянии

истощения, в условиях постоянного присутствия антигена (Хаитов P.M., 2007; Реппа А., 2007). В результате такие клетки сохраняют жизнеспособность, но не могут осуществлять некоторые функции в ответ на антигенную стимуляцию. По-видимому, при ХВГС Т-клеточный ответ является более слабым и направлен против меньшего числа эпитопов, что позволяет предполагать «клональное истощение» и, впоследствии, нарушение функций противовирусных Т-лимфоцитов, которые могут контролировать вирусную репликацию, но не способны элиминировать вирус (Наследникова И.О. 2005; Rehermann В., 2013). При прогрессировании заболевания количество Т-клеток у больных ХВГС с тяжелым фиброзом печени/циррозом резко снижается, что может служить неблагоприятным признаком развития патологического процесса с переходом в цирроз печени.

В зависимости от стадии фиброза среди B-лимфоцитов содержание CCR6+ клеток уменьшалось только в группе больных F0-1 (р<0,05) по сравнению с контролем. Количество ССR6+TNK-клеток снижалось в крови больных ХВГС с F2 в 7,7 раз (р<0,05) и F3-4 в 4 раза (р<0,001) по сравнению с контрольной группой.

В периферической крови больных ХВГС с F0-1 и F2 статистически значимо возрастало абсолютное содержание CXCR3+T-kjictok по сравнению с условно здоровыми лицами. Среди CD4+ Т-клеток существенно увеличивалось количество CXCR3+ клеток в крови больных ХВГС с F0-1 и F2, но не отличалось содержание данной субпопуляции в группе больных ХВГС с F3-4 по сравнению с контрольной группой. Несмотря на то, что рецептор CXCR3 связывают, в основном, с Thl, он может быть представлен и на других субпопуляциях CD4+ Т-клеток, в том числе и на Th2 (Kim С.Н., 2001; Оо Y.H., 2010). Учитывая тот факт, что в крови больных ХВГС значительно возрастает количество CXCR3+ B-клеток и, по данным многих авторов, превалируют цитокины, ответственные за Th2 ответ (Никитин В.Ю., 2007; Boyer N., 2000; Zhang L., 2014), можно предположить, что среди CXCR3+CD4+ Т-клеток присутствуют Th2 клетки. Таким образом, баланс CXCR3+CD4+ Т-клеток может смещаться в сторону Th2, приводить к хроническому воспалению и развитию аутоиммунных реакций.

Содержание CXCR3 CD8 Т-клеток относительно ЦТЛ значительно снижалось в группах больных ХВГС с F2 и F3-4 по сравнению с контролем (р<0,001), при этом у больных ХВГС с F3-4 количество данных клеток уменьшалось более чем в 2 раза. Известно, что исход острого вирусного гепатита С связан не с количеством ЦТЛ в крови, а с их функциональным состоянием (Kaplan D.E., 2007). CD8+ Т-клетки больных ХВГС обладают

функциональной анергией: у них снижена продукция IFNy, нарушены механизмы цнтотоксичности, возрастает уровень экспрессии ингибиторных молекул (Bengsch В., 2010). Если рассматривать рецептор CXCR3 как активационную молекулу, то снижение экспрессии CXCR3 на С08+Т-клетках укладывается в концепцию функциональной анергии данной субпопуляции лимфоцитов.

Среди NK-клеток значительно уменьшалось количество CXCR3+ в крови больных ХВГС на всех стадиях заболевания по сравнению с контролем. По-видимому, при развитии гепатита С работает универсальный механизм подавления функций клеток, обладающих цитотоксической активностью. В литературе описаны функциональные нарушения в работе NK и TNK-клеток больных ХВГС (Crotta S., 2002), показано увеличение экспрессии ингибиторных рецепторов NKG2A/CD94 на NK-клетках по сравнению со здоровыми донорами (Jinushi М., 2004). Таким образом, подобно CD8+ Т-лимфоцитам, NK- и TNK-клетки находятся в подавленном функциональном состоянии, о чем свидетельствует, в том числе, снижение экспрессии хемокинового рецептора CXCR3 на данных субпопуляциях лимфоцитов.

Количество СХСЯЗ+В-лимфоцитов возрастало в периферической крови больных ХВГС на всех стадиях заболевания. Корреляционный анализ выявил прямую положительную связь между стадией фиброза печени, абсолютным и относительным количеством СХС113+В-лимфоцитов больных ХВГС (г=0,41; р=0,0094 и 1=0,38; р=0,0098). Таким образом, по мере фиброзирования печеночной ткани в крови больных ХВГС возрастает количество CXCR3+B-лимфоцитов. Известно, что при развитии хронической вирусной инфекции постоянная антигенная стимуляция B-клеток может привести к их истощению, что проявляется в дефекте функций клеток (Moir S., 2008). В печени больных ХВГС обнаруживается повышенное содержание В-лимфощггов, несущих на своей поверхности рецептор CXCR3 (Mizuochi Т., 2010). Возможно, воздействие антигенов HCV, приводящее к избыточной активации B-лимфоцитов без образования эффективного гуморального иммунного ответа, является одним из пусковых механизмов аутоиммунных осложнений при ХВГС. По-видимому, при ХВГС происходит подавление клеточного звена иммунитета, сопровождающееся активацией гуморального, который не способен эффективно справиться с элиминацией HCV. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что возрастание содержания СХСЯЗ*В-клеток в крови больных ХВГС служит неблагоприятным признаком развития заболевания, данная субпопуляция клеток может быть использована как дополнительный иммунологический критерий.

В нашем исследовании не обнаружено взаимосвязей между количеством субпопуляций лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы CCR6 и CXCR3, и общелабораторными показателями: вирусной нагрузкой, концентрациями AJIT, ACT и генотипом HCV.

3. Экспрессия мРНК генов CXCR3 и CCR6 и их лигандов в биоптатах печени больных ХВГС

Для того, чтобы оценить местные реакции, мы исследовали экспрессию мРНК генов хемокиновых рецепторов и их лигандов в ткани печени больных ХВГС. Больных ХВГС в зависимости от стадии фиброза печени разделили на две группы: F<2 (лица с отсутствием или слабо выраженным фиброзом печени) и F>2 (больные ХВГС с умеренным, тяжелым фиброзом печени/циррозом). При исследовании содержания мРНК генов хемокинов обнаружено, что в группе F>2 экспрессия мРНК генов хемокиновых рецепторов CCR6 и CXCR3 увеличивалась более чем в 2 и 5 раз, соответственно (р=0,0093; р=0,0401), по сравнению с группой F<2. Экспрессия мРНК гена CXCL10/IP-10 в группе F>2 возрастала более чем в 10 раз (р=0,0311) по сравнению с группой F<2 (рисунок 3).

CXCR3 CXCL10AP-10

За 36 Зв

Рисунок 3 - Внутрипеченочная экспрессия мРНК генов рецепторов хемокинов CCR6 (За), СХСЖЗ (36) и СХС1Л0/1Р-10 (Зв) в группах больных ХВГС со степенью фиброза печени Р<2 и Р>2.

Примечание. По оси ординат - Е~ла, где Е - эффективность реакции, С1 -пороговый цикл. Показаны значения медиан, нижний и верхний квартили, минимальное и максимальное значение.

Установлена положительная корреляционная зависимость между внутрипеченочной экспрессией мРНК гена СХСЫО/ГР-Ю и стадией фиброза печени (г=0,61, р=0,0067) у больных ХВГС. Следовательно, при прогрессировании ХВГС наблюдается тенденция к нарастанию экспрессии мРНК СХСЫО/ГР-Ю в печени. Полученные результаты сопоставимы с данными

М. Zeremski и соавт., которые полагают, что содержание мРНК СХС1Л0/1Р-10 в ткани печени является информативным показателем скорости прогрессирования фиброза и степени воспаления печени (гегетвИ М. е1 а1., 2008). Вероятно, что повышенная экспрессия мРНК ССЯ6, СХСЯЗ и СХСЫ0/1Р-10 клетками печени, в том числе, лимфоцитами, способствует инфильтрации печени эффекторными клетками и повреждению печеночной паренхимы.

Положительная корреляционная зависимость была обнаружена между экспрессией мРНК гена СХСЬ9/МЮ в печени и уровнем вирусной нагрузки в крови (г=0,72; р< 0,0025) у лиц с хронической инфекцией, вызванной НСУ. Таким образом, количество вируса оказывает влияние на силу секреции хемокинов в очаге воспаления. Это является еще одним доказательством непрямого, а опосредованного иммунным ответом, повреждения клеток печени в результате инфицирования вирусом гепатита С.

Для описания взаимосвязей между экспрессией мРНК генов хемокинов и хемокиновых рецепторов в ткани печени и концентрацией цитокинов /хемокинов в плазме крови был проведен корреляционный анализ, в результате которого установлено, что экспрессия мРНК гена СХСЬ9/МЮ в печеночной ткани прямо коррелирует с содержанием ТОТа в плазме крови у больных ХВГС (1=0,60, р=0,017). Таким образом, при увеличении концентрации ЮТа в плазме крови, наблюдается усиление экспрессии мРНК гена СХСЬ9/МЮ в печени больных ХВГС. Других корреляционных связей не выявлено, в том числе не выявлено взаимосвязи между экспрессией мРНК гена хемокина в тканях печени и его концентрацией в плазме крови. Статистически значимых различий в экспрессии мРНК генов ССЯб, СХСЯЗ, ССЬ20/М1Р-За, СХСЬ9/МЮ, СХСЫОЛР-Ю и СХСЫ1/1ТАС между группами больных ХВГС, инфицированных различными генотипами НСУ, не установлено.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящем исследовании были определены нормальные значения концентраций некоторых СС-хемокинов, лигандов рецептора СХСЮ и цитокинов, индуцирующих их продукцию, в плазме крови, а также установлены контрольные значения содержания субпопуляций лимфоцитов, экспрессирующих хемокиновые рецепторы ССЯб и СХСЮ, в периферической крови, полученные в ходе исследования образцов крови практически здоровых лиц.

Результаты данной работы дополняют знания об иммунопатогенезе ХВГС и говорят в пользу важной роли хемокинов и их рецепторов в развитии заболевания. Комплексное исследование профиля некоторых цитокинов/хемокинов и рецепторов хемокинов ССЯ6 и СХСЮ в крови и ткани печени при различных

стадиях ХВГС позволило выявить ряд изменений данных параметров у больных ХВГС (таблица 4).

Таблица 4 — Характеристика изменений концентраций цитокинов/хемокинов, содержания ССК6* и СХСЮ+ субпопуляций лимфоцитов в крови, внутрипеченочной экспрессии мРНК генов ССГ<6 и СХС113 и их

Цитокин/хемокин, субпопуляции клеток, мРНК Р0-1 ¥2 РЗ-4

- - ттт

ТОТа т т тт

ССЬ2/МСР-1 ! т тт

ССЬЗ/М1Р-1а

ССЬ4/М1Р-1Р - - -

ССЬ5/ЯАЫТЕ8 - - -

ССЬ8/МСР-2 - - -

ССЬ20/МТР-За т т тт

СХСЬ9/МЮ т тт тт

СХСЫ 0ЛР-10 тт ттт ттт

СХСЫ 1ЛТАС т тт тт

ССЯ6+Т-клетки -

СХСЯЗ +Т-клетки - - -

ССЯ6+ТЬ - - -

СХСРЗ'ТЬ т т -

ССЯ6+ЦТЛ -

СХСЯЗ+ЦТЛ - 1 1

ССЯб^В-лимфоциты - -

СХСЯЗТЗ-лимфоциты тт тт ттт

ССЯбЧМК-клетки

СХСЯЗ^К-клетки 1 1 1

ССЯ6+ТЫ К-клетки 1

СХСЯЗ+Т№С-клетки - -

мРНК ССЬ20/М1Р-За - -

мРНК СХСЬ9/МЮ - -

мРНКСХСЫ0ЛР-10 тт ттт

мРНК СХСЫ 1/ГГАС

мРНК СС116 т т

мРНК СХСИЗ тт ттт

Примечания. Показаны отличия от значений контрольной группы (за исключением экспрессии мРНК): "-" — показатель не отличается от значения контрольной группы; | — повышение значения показателя на 30%; Ц — повышение значения показателя на 100%; 1"["|" - повышение значения показателя более чем на 200%; 4 — уменьшение значения показателя на 30%. Различия значений экспрессии мРНК указаны при сравнении групп больных ХВГС с разными стадиями фиброза печени (стадии ¥2 и РЗ-4 сравниваются со стадией Р0-1).

По сравнению с контролем в плазме крови больных ХВГС возрастает содержание Т№а и хемокинов ССЬ2/МСР-1, ССЬ8/МСР-2, СС1_20/М1Р-За, СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10, СХСЫ1/1ТАС. Обнаружены различия в содержании субпопуляций лимфоцитов, несущих хемокиповые рецепторы ССЯ6 и СХСКЗ. В периферической крови больных ХВГС выявлено увеличение содержания СХСЮ+С04+ Т-клеток и В-лимфоцитов, снижение количества ССЯ6+ ТЫК-клеток, а также снижение количества СХСЯЗ+ субпопуляций клеток, обладающих цитотоксической активностью: СБ8+Т-лимфоцитов, ЫК. и ТЫК-клеток.

В зависимости от стадии фиброза печени при ХВГС отмечалось повышение в плазме крови хемокинов ССЬ2/МСР-1, ССЬ20/М1Р-За, СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10, СХСЫ1/1ТАС, цитокннов ТОТа и 1Шу. Содержание цитокинов ССЬ20/М1Р-За и №N7 резко возрастало при тяжелой стадии фиброза, что может служить неблагоприятным признаком развития заболевания. Для ХВГС на поздних стадиях фиброза печени характерно увеличение количества СХСЮ+В-клеток и снижение количества СХСЯЗ+ ЦТЛ и ИК-клеток в периферической крови, при этом количество СХСЯЗ+СБ4+ Т-клеток соответствует контрольным значениям. Таким образом, по мере развития хронической инфекции, вызванной НСУ, в периферической крови активируется В-клеточное звено и подавляется Т-клеточное. В частности, клетки, обладающие цитотоксической активностью - ЦТЛ и КК-клетки, теряют рецептор СХСЫЗ, что может косвенно указывать на их функциональную анергию.

Данное исследование подтверждает значимость цитокинов/хемокинов в иммунопатогенезе ХВГС, в том числе в процессах фиброгенеза, и говорит в пользу информативности их определения в динамике заболевания. Суррогатными маркерами активности фиброза печени могут служить: ЮТа, ССЬ2/МСР-1, ССЬ20/М1Р-За, СХСЬ9/МЮ, СХСЫ0/1Р-10, СХСЫ 1ЛТАС и количество В-клеток, экспрессирующих рецептор СХС113, комплексное определение которых в крови можно использовать неоднократно для мониторинга развития заболевания. В качестве лабораторного способа определения стадии фиброза печени предложен алгоритм, в основе которого лежит совместное определение трех биомаркеров ТОРа, СХСЫ 1ЛТАС и ССЬ20/М1Р-За.

выводы

1. При хроническом вирусном гепатите С в плазме крови установлены повышенные концентрации ТОТ«, ССЬ2/МСР-1, ССЬ4/М1Р-1Р, ССХ8/МСР-2, ССЬ20/М1Р-За, СХСЬ9/МЮ, СХСЫОЛР-Ю и СХСЫ1ЛТАС.

2. Для больных хроническим вирусным гепатитом С, инфицированных 1 генотипом вируса гепатита С, характерно повышение содержания ССЬ8/МСР-2 в плазме крови но сравнению с больными, инфицированными 2 и За генотипами вируса гепатита С.

3. При хроническом вирусном гепатите С в периферической крови определяется повышенное содержание СХСЯЗ+ С04+Т- и В-лимфоцитов, сниженное количество СХСЯЗ' СБ8+Т-лимфоцитов, 1ЧК- и ТЬГК-клеток и сниженное количество ССЯб: ТЫ К-клеток.

4. Установлена прямая корреляционная зависимость стадий фиброза печени от числа СХСКЗ+В-лимфоцитов в периферической крови, содержания ТОТа и хемокинов (ССЬ2/МСР-1, ССЬ20/М1Р-За, СХСЬ9/МЮ, СХСЫОЛР-Ю, СХСЫ 1/1ТАС) в плазме крови больных хроническим вирусным гепатитом С.

5. В тканях печени больных хроническим вирусным гепатитом С со стадиями фиброза Р2-4 по сравнению со стадией РО-1 повышена экспрессия мРНК генов СС116, СХСКЗ и СХСЫОЛР-Ю.

6. Применение разработанного алгоритма, основанного на определении содержания трех биомаркеров ЮТа, СХСЫ 1Л-ТАС и ССЬ20/М1Р-За в плазме крови, позволяет проводить дифференциальную диагностику стадий фиброза печени у больных хроническим вирусным гепатитом С с чувствительностью и специфичностью 70-90%.

Практические рекомендации

При хроническом вирусном гепатите С следует определять в плазме крови содержание цитокинов ТОТа, СХСЫ1ЛТАС и ССЬ20/М1Р-За, а разработанный алгоритм использовать для уточнения стадии фиброза печени.

Определенные значения нормы хемокинов ССЬ2/МСР-1, ССЬЗ/М1Р-1а, ССЬ4/М1Р-1Р, ССЬ5Л*АМТЕ5, ССЬ8/МСР-2, ССЬ20/М1РЗа, СХСЬ9/МЮ, СХСЫОЛР-Ю и СХСЫ1ЛТАС рекомендуется использовать при проведении иммунологического обследования больных гепатитами различной этиологии (вирусные гепатиты В и С, аутоиммунные гепатиты и пр.).

Перспективы дальнейшей разработки темы

Разработанный алгоритм дифференциальной диагностики стадий фиброза печени при хроническом вирусном гепатите С может стать основой для проведения дальнейших валидационных исследований на различных группах

пациентов. Предположение о том, что хемокины могут находиться в антагонистической форме, требует дальнейшего подтверждения. Учитывая полученные результаты о повышенной экспрессии рецептора CXCR3 на субпопуляциях Т- и B-лимфоцитов, необходимо изучить функциональную активность данных клеток. Также целесообразно провести подробное изучение состава субпопуляции CXCR3+Th-клеток не только в периферической крови, но и в тканях печени, с помощью иммуноцитохимических методов. Предполагается определить экспрессию CXCR3 на субпопуляциях СП4+Т-клеток: Thl, Th2, Thl7 и регуляторных Т-клетках.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Арсентьева, H.A. Роль полиморфизма генов цитокинов при вирусном гепатите С / H.A. Арсентьева. A.B. Семенов, A.A. Тотоляи // Инфекция и иммунитет. - 2012. - Т. 2. - № 4. - С. 687-698.

2. Арсентьева, H.A. Экспрессия хемокинового рецептора CXCR3 на субпопуляциях B-лимфоцитов периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом С / H.A. Арсентьева, И.В. Кудрявцев, Д.С. Елезов, A.B. Семенов, Е.В. Эсауленко, В.В. Баспна, A.A. Тотолян // Медицинская иммунология. - 2013. - Т. 15. - № 5. - С. 471-476.

3. Семенов, A.B. Особенности популяционного состава CXCR3-положительных лимфоцитов периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом С / A.B. Семенов, H.A. Арсентьева, Д.С. Елезов, И.В. Кудрявцев, Е.В. Эсауленко, A.A. Тотолян // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунологии. - 2013. — №6. - С. 69-76.

4. Елезов, Д.С. Анализ субпопуляций Т-хелперов периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом С, экспрессирующих хемокиновые рецепторы CXCR3 и CCR6 и активационные маркеры CD38 и HLA-DR / Д.С. Елезов, И.В. Кудрявцев, H.A. Арсентьева, A.B. Семенов, Е.В. Эсауленко, В.В. Басина, A.A. Тотолян // Инфекция и иммунитет. - 2013. - Т. 3. - №4. — С. 327-334.

5. Елезов, Д.С. Популяции CD4+ клеток памяти, экспрессирующие рецепторы CXCR3 и CCR6, в периферической крови больных хроническим гепатитом С / Д.С. Елезов, H.A. Арсентьева. И.В. Кудрявцев // Сборник материалов научно-практической конференции молодых ученых и специалистов. «Трансляционная медицина: от теории к практике». - СПб, 2013. - С.50-51.

6. Елезов, Д.С. Популяции CD4+ клеток памяти в периферической крови больных хроническим гепатитом С / Д.С. Елезов, H.A. Арсентьева. И.В. Кудрявцев // Инфекция и иммунитет. Сборник материалов международной конференции «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций». - СПб, 2013. - Т. 3. -№ 2. - С. 126.

7. Арсентьева, H.A. СХСЮ-положительные популяции В-лимфоцитов периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом С /

H.A. Арсентьева, Д.С. Елезов, И.В. Кудрявцев // Сборник тезисов LXXIV научно-практической конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины». - СПб, 2013. - С. 30-31.

8. Арсентьева, H.A. Особенности экспрессии хемокиновых рецепторов CXCR3, CCR5 и CCR6 на Т-лимфоцитах периферической крови больных хроническим гепатитом С / H.A. Арсентьева, Д.С. Елезов, И.В. Кудрявцев, В.В. Васина // В мире вирусных гепатитов. Сборник тезисов X Российской научно-практической конференции с международным участием «Вирусные гепатиты -эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика». - Москва, 2013. - №3. -С. 26.

9. Арсентьева, H.A. Особенности популяционного состава CXCR3- и CCR6- положительных лимфоцитов периферической крови больных с HCV-инфекцией / H.A. Арсентьева. Д.С. Елезов, И.В. Кудрявцев, A.B. Семенов // Инфекция и иммунитет. Материалы научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «От эпидемиологии к диагностике инфекционных заболеваний: подходы, традиции, инновации» - СПб, 2014. - Т 4.

- №1. - С. 53.

10. Елезов, Д.С. Популяции B-клеток памяти периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом С / Д.С. Елезов, H.A. Арсентьева. И.В. Кудрявцев, A.B. Семенов, A.A. Тотолян // Инфекция и иммунитет. Материалы научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «От эпидемиологии к диагностике инфекционных заболеваний: подходы, традиции, инновации. - СПб, 2014. - Т 4. - №1. - С. 65.

11. Арсентьева, H.A. Уровень содержания цитокинов и хемокинов в плазме крови больных хроническим вирусным гепатитом С / H.A. Арсентьева. A.B. Семенов, В.В. Васина, Н.Е. Любимова, Е.В. Эсауленко, A.A. Тотолян // Цитокины и воспаление. Материалы Юбилейной научно-практической конференции «Современные проблемы иммунофармакологии, биотехнологии и цитокиновой регуляции». - СПб, 2014. - Т. 13. - № 1. - С. 87.

12. Арсентьева, H.A. Цитокины и хемокины как дополнительные маркеры прогрессирования хронического вирусного гепатита С / H.A. Арсентьева // Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактической медицины». - Ставрополь, 2014. - С. 68.

13. Арсентьева, H.A. Содержание цитокинов и хемокинов в плазме крови больных вирусным гепатитом С / H.A. Арсентьева, A.B. Семенов, Н.Е. Любимова, В.В. Басина, Е.В. Эсауленко, К.В. Козлов, К.В. Жданов, A.A. Тотолян // Российский иммунологический журнал. - 2015. - Т. 9 (18). - № 1.

- С. 80-89.

14. Арсентьева, H.A. Цитокины/хемокины, как иммунологические биомаркеры хронического вирусного гепатита С / H.A. Арсентьева. Н.Е. Любимова, A.B. Семенов, A.A. Тотолян // Медицинская иммунология. Материалы XV Всероссийского научного Форума с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге». - СПб, 2015.-С. 145.

15. Арсентьева. H.A. Хемокиновые рецепторы CXCR3 и CCR6 и нх лпганды в печени и крови больных хроническим вирусным гепатитом С/ H.A. Арсентьева. A.B. Семенов, Н.Е. Любимова, Ю.В. Останкова, Д.С. Елезов, A.A. Тотолян // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2015. - №8. - С. 218-222.

16. Елезов, Д.С. Анализ популяций Т-хелперных клеток памяти, экспрессирующих хемокиновые рецепторы CXCR3 и CCR6, в периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом С / Д.С. Елезов, Н.В. Кудрявцев, H.A. Арсентьева. В.В. Басина, Е.В. Эсауленко, A.B. Семенов, A.A. Тотолян // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2015. - №8. - С. 204-208.

Список сокращений

АЛТ - аланинаминотрансфераза

ACT - аланинаминотрансфераза

ППК - площадь под характеристической кривой

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

ХВГС - хронический вирусный гепатит С

ЦТЛ - цитотоксический Т-лимфоцит

CCR- СС chemokine receptors (рецептор СС-хемокинов)

CD - cluster of differentiation (кластер дифференцировки)

Ct - cycle threshold (пороговый цикл)

CXCR - CXC chemokine receptor (рецептор СХС-хемокинов)

GAPDH - glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (глицеральдегид-3-фосфат-

дегидрогеназа)

HCV - hepatitis С virus (вирус гепатита С) IFN - interferon (интерферон) IL - interleukin (интерлейкин)

IP-10 - IFNy inducible protein 10 (Интерфероном-гамма индуцируемый белок-10) NK-клетка - natural killer (естественная киллерная клетка)

ROC - кривая операционной характеристики (receiver-operating-characteristic curve)

Th - Т helper (Т-хелпер)

TNFa - tumor necrosis factor а (фактор некроза опухоли a) TNK - T natural killer (естественная киллерная Т-клетка) хМар - мультиплексный анализ

Подписано в печать 15.10.2015. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 105 экз. Заказ № 361.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии ООО «Графит». 197046, Санкт-Петербург, Петроградская наб., 34. Тел./факс: (812) 635-68-24