Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Роль молекулярных механизмов регуляции в адаптационной защите сердца

2{Ь РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ПАТОЛОГИИ И ПАТОФИЗИОЛОГИИ

На правах рукописи

КОПЫЛОВ Юрий Николаевич

ЮЛЬ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛЯЦИИ В АДАПТАЦИОННОЙ ЗАЩИТЕ СЕРДЦА

14.00.16 • патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 1992

{ ■-/ ч \ / л

Работа выполнена в лаборатории патофизиологии сердца НИИ общей патологии и патофизиологии Российской АНН.

Научный консультант - доктор медицинских наук, профессор, лауреат Государственной премии СССР, заслуженный деятель науки РСФСР Ф.З.Меерсон

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Н.К.Хитров доктор биологических наук, профессор В.А.Ткачук доктор биологических наук, профессор Р.Н.Глебов

Ведущее учреждение:

Российский университет дружбы народов

Защита диссертации состоится ¿¿/С/&Х 1992 г. в " часов на заседании Специализированного совета Д 001.03.01 при Научно-исследовательском институте обшей птаолопш и патофизиологии Российской АМН (125315 Москва, Балтийская ул., Д. 8).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан

"•// 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета,

кандидат медицинских наук Л.Н.Скуратовская

з

ССйСТЭЛН'З.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

т_у а_л_ь_н_о с_т_ь __д_§_н н_о_й_ _Р_а_б_о_т_ы определяется

тем, что она посвящена изучению молекулярных механизмов защиты сердца при адаптации к кратковременным стрессорным воздействиям и к периодической гипоксии, что является необходимой основой для разработки методов адаптационной профилактики и терапии.

В последнее десятилетие установлено, что адаптация к повторным кратковременным стрессорным воздействиям и адаптация к периодической гипоксии обладают выраженным кардиопротекторным эффектом. Этот эффект состоит в том, что адаптированные животные приобретают повышенную резистентность к ишемическим и реперфузионнын аритмиям, к нарушению сократительной функции сердца и сосудов при инфаркте миокарда . Под влиянием адаптации у них исчезали нарушения электрической стабильности при постинфарктном кардиосклерозе [Ф.З.Меерсон, М.Г.Пшенникова, 1988; Ф.З.Меерсон 1991]. Эта адаптационная защита мохет быть объяснена активацией нейро-эндокринных стресс-лимитирующих систем, блокирующих стресс-реакцию, которая сопровождает сгрессорное и ишемическое повреждение миокарда [Halles, Cohen, 1984; Fuder, 1985; Ф.З.Меерсон, М.Г.Пшенникова, 1992]. Вместе с тем установлено, что кардиопротектор-ний эффект адаптации к стрессу в полной мере сохраняется на изолированных сердцах адаптированных животных. Эти сердца обладают повышенной

2+

устойчивостью к реперфузионному и Ca парадоксу, токсическим концентрациям катехоламинов, а также к термическому повреждению [Meerson F.Z., 1991], однако степень их резистентности при этих двух видах адаптации различна. Выяснилось тахже, что элементы саркоплазматичес-кого ретикулума (СПР) и митохондрии изолированные из сердец адаптированных к стрессу животных, обладают повышенной резистентностью к. ауто-лизу, а ядра кардиоцитов отличаются высокой резистентностью к повреждающему действию экзогенной одноцепочечной ДНК, активирующей нуклео-протеазы. Комплекс этих адаптационных сдвигов был обозначен профессором Ф.З.Меерсоном как феномен адаптационной стабилизации структур (ФАСС) [Ф.З.Меерсон, 1990]. При изучении молекулярного механизма ФАСС было установлено, что его развитие сопровождается многократным увеличением содержания в миокарде хит-шок белков (HSP) с молекулярным весом 71-72 КД, [Ф.З.Меерсон, И.Ю.Малышев, 1989] обладающих, как известно, цитопротекторным действием. При адаптациия организма к периодической гипоксии также наблюдалось формирование ФАСС, но выраженность этого феномена и степень накопления HSP в миокарде были менее значительны, чем при адаптации к стрессу [Heerson F.Z. et all, 1991].

Однако, при всей значимости проблемы адаптационной защиты сердц

целый ряд вахных вопросов о молекулярных механизмах формирования кар

диопротекторного эффекта адаптации остается открытым. Так, неизвестт

обладает ли адаптация к кратковременным стрессорным воздействиям спо

собностью защищать сократительную функцию сердца и аппарат энергети

ческого обеспечения от острой тяхелой гипоксии и последующей реокси

генации и, в чем конкретно вырахается этот перекрестный защитны

эффект. Не изучено современными методами состояние рецепторного аппа

рата, в частности, количество и афинность (3-, С1-, мускариновых рецеп

„ 2+

торов, а также количество потенциал-зависимых Са каналов при адапта ции к повторным стрессорным воздействиям и периодической гипоксии. Н выяснено играет ли роль в развитии ФАСС и защитных эффектов адаптаци ИТФ-ДАГ каскад регуляции и его ключевой Фермент фосфолипаза С. Мехд тем весьма вероятно, что именно активация этого каскада через систем протеинкинаэы С приводит к генетической индукции [Hoalic J.H. et al 1909], накоплению HSP и формированию ФАСС. Наконец, до последнего вре мени не сделано сопоставление состояния рецепторного аппарата сердца ИТФ-ДАГ регуляторного каскада при обоих видах адаптации, а такхе кар диопротекторных эффектов этих видов адаптации по такому важному крите рию, как резистентность изолированного сердца к реперфузионному пара доксу. Кроме того остается неясным состояние локальных стресс лимитирующих систем сердца, в частности, системы простагландинов (ПГ при этих видах адаптации, а такхе их роль в защитных перекрестны эффектах адаптации. Данные исследования направлены на решение эти вопросов.

Ц_е л ь___р а_б о_т_ы - изучить влияние адаптации к кратковременным стрессорным воздействиям и адаптации к периодической гипокси] на молекулярные механизмы регуляции сердца, а именно, на состояни« рецепторного аппарата и связанных с ним внутриклеточных регуляторны: каскадов, а такхе оценить значение этих изменений в формировании кар-диопротекторных эффектов этих видов адаптации в условиях целого организма и на изолированном сердце.

В рамках этой общей цели решали следующие з_а_д_а_ч_и:

1. Как влияет адаптация к кратковременным стрессам и адаптация i периодической гипоксии на сократительную функцию и аппарат энергообеспечения сердца при острой аноксии и последующей реоксигенации в условиях целого организма?

2. Как меняется состояние рецепторного аппарата сердца в процесс« формирования адаптации к стрессу и адаптации к периодической гипоксии'

3. Какова динамика формирования ФАСС в сердце при адаптации i

стрессу и адаптации к периодической гипоксии?

4. Какую роль в формировании ФАСС в сердце при обоих видах адаптации играют изменения активности ИТФ-ДАГ регуляторного каскада кардиоцитов?

5. Как влияет адаптация к кратковременным стрессам и адаптация к периодической гипоксии на состояние стресс-лимитирующей системы прос-тагландинов в сердце и какова роль этой системы в перекрестных кардио-протекторних эффектах данных видов адаптации?

П_а_у_ч_н_а_я__но в_и зна__р а_б_о_т_ы. Впервые показано, что

при адаптации к кратковременным стрессорным воздействиям развивается перекрестный кардиопротекторный эффект, заключающийся в повышении устойчивости сердца к острой аноксии и последующей реоксигенации в условиях целого организма. Показано, что перекрестный кардиопротекторный эффект адаптации к кратковременным стрессорным воздействиям более выражен, чем известной кардиопротекторный эффект адаптации к периодической гипоксии.

Установлено, что"при адаптации к кратковременным стрессам в рецеп-

торном аппарате сердца развивались три сдвига, которые могут играть

существенную роль в кардиопротекторном эффекте адаптации: десенситиза-

ция а -адренорецепторов, увеличение плотности М-холинергических рецеп-

2+

торов и уменьшение числа потенциал-зависимых Са -каналов.

Впервые выявлено, что через 15 дней адаптации к кратковременным стрессорным воздействиям развивается активация фосфоинозитидного обмена в сердце, играющая важную роль в формировании ФЛСС. Исчезновение активации этого внутриклеточного каскада регуляции к 30 суткам адаптации к стрессу сопровождается значительной редукцией ФЛСС.

Показано, что через 20 дней адаптации к периодической гипоксии развивается существенное увеличение плотности М-холинорецепторов, а также Р~ и С^-адренорецепторов в сердце и повышение ответов аденилат-циклазы на стимуляцию изопротеренолом и фторидом натрия. Это объясняет известные данные о повышении адренореактивности на раннем этапе адаптации к периодической гипоксии. Некоторое снижение степени адренореактивности через 40 дней адаптации крыс к гипоксии при повышенной плотности М-холинергических рецепторов может играть важную роль в кардиопротекторном эффекте длительной адаптации к гипоксии.

Обнаружено, что на 20 день адаптации к периодической гипоксии активность инозитолфосфатного цикла регуляции внутриклеточных функций в миокарде снижена. Активация ИТФ-ДАГ касхада регуляции развивается только через 40 дней после начала адаптации к периодической гипоксии, что соответствует известному кардиопротекторному эффекту длительной

адаптации к гипоксии и доказанному наличию многих компонентов ФАСС не этом этапе адаптации.

Впервые показано, что адаптация к кратковременным стрессорним воздействиям обеспечивает увеличение содержания протекторного простаглан-дина Е в миокарде, предупреждает наблюдающееся в контроле падение при аноксии и реоксигенации отношения простациклин/тромбоксан (ПГ12/ТХА2>, а даже' напротив, вызывает значительное увеличение этого соотношения. Адаптация к периодической гипоксии активизирует стресс-лимитирующую систему вызывает накопление протекторных ПГЕ и ПИ^» а также увеличение отношения nrE/nrF2ü в плазме крови и в сердце. Показано, что активация системы ПГ играет важную роль в ограничении стресс реакции и предупреждении стрессорных и гипоксических повреждений сердца.

Т_е о_р е_т_и_ч_е_с_к_о_е__з_н а_ч_е_н_и_е__р_а_б_о_т_ы определяется тем, что в ней впервые показана роль изменений рецепторного аппарата и активации внутриклеточного инозитолтрифосфат-диацилглицерол рсн'уляторного каскада в формировании феномена адаптационной стабилизации структур и адаптационной защиты сердца. Сопоставлен характер изменений рецепторного аппарата сердца в динамике развития адаптации » двум различным факторам внешней среды, что имеет принципиально важное значение для понимания молекулярных механизмов кардиопротекторногс эффекта адаптации.

П_р а_к т_и ч_е_с_к_о_е__э_н_а_ч_е_н_и_е__р_а_б_о_т и определяете!

тем, что она обеспечивает теоретическое обоснование для разработк» наиболее адекватных и эффективных методов защиты сердца с помощы адаптации к кратковременным стрессам и периодической гипоксии.

Результаты работы внедрены в учебный процесс в 5 медицинских вузах. Материалы исследований нашли отражение в монографиях F.Z.Heerson. Adaptive Protection of the Heart: Protecting Againsl Stress and Ischemic Damage. CRC Press. - Boca Raton, 1990; Ф.З.Меерсо] "Основы адаптационной защиты сердца" Медицина, 1992г.; Ф.З.Меерсон М.Г.Пшенникова "Адаптационная защита организма: основные механизмы ] использование для профилактики и терапии." ВИНИТИ РАН, Москва,-1992.

П_о_л о* е н_и я^__в_ы_н_о_с_и_м_ы_е__н_а__э_а_щ_и_т_у:

1. При адаптации к кратковременным стрессорным воздействиям форми руется кардиопротекторный эффект, проявляющийся как в повышении устой чивости сердца к острой аноксии и последующей реоксигенации в условия целого организма, так и в резистентности изолиропанного сердца к ище мическим и реперфузионным повреждениям. Этот перекрестный эффект адап тации к стрессу более ярко выражен, чем прямой кардиопротекторны эффект адаптации к периодической гипоксии на изолированном органе и

условиях целого организма.

2. Развитие адаптационной стабилизации структур сердца при адаптации животных к кратковременным стрессорным воздействиям и к периоди-«ской гипоксии сопровохдается активацией внутриклеточного инозитол-грифосфат-диацилглицерол регуляторного каскада в сердце, что свиде-гельствует о важной роли этого молекулярного механизма внутриклеточной регуляции в формировании этого феномена. Снижение активности ИТФ-ДАГ регуляторного каскада обусловливает отсутствие ФАСС на 20 день адаптации к гипоксии и редукцию ФАСС к 30 суткам адаптации к стрессу.

3. При адаптации к кратковременным стрессорным воздействиям в сердце развивается десенситизация СХ^-адренорецепторов, увеличение плотнос-

ги М-холинергических рецепторов и уменьшение числа потенциал-зависимых , 2+

'а -каналов, что мохет играть существенную роль в кардиопротекторион эффекте адаптации.

4. Адаптация к кратковременным стрессорным воздействиям и адаптация < периодической гипоксии обеспечивают увеличение содержания ПГЕ или 1ростациклина в миокарде и предупреждают снижение соотношения 1Г12/ТХА2 или nrE/nrFjQ, т.е. простагландинов протекторного типа к ювреждающим, развивающееся обычно при острой гипоксии и стрессе, что irpaeT важную роль в ограничении стресс реакции и предупреждении ;трессорных и ишемических повреждений сердца.

А п_р_о_б_а_ц_и я_ р а б о т ы. Материалы диссертации доложены и эбсуждены на: Всесоюзной конференции "Центральные и периферические механизмы регуляции Физиологических функций" (Москва, 1990); Международном конгрессе "Aspects biochinique et physiologique de la fatigue ausculaire." (Creteil, France. 1990); 6-й Ростовской областной научно-фактической школе-семинаре "Механизмы адаптации животных и растений к экстремальным факторам" (Ростов- на-Дону, 1990); Всесоюзной конференции "Физиология и биохимия медиаторных процессов" (Москва, 1990); IV Всесоюзном симпозиуме "Кровообращение в условиях высокогорной и экспериментальной гипоксии" (Душанбе, 1990); на Международном конгрессе ттофизиологов "Constituent congress international society for patho-pysiology" (Moscow, 1991).

С_т_р_у_к_т_у_р_а__Д_и_с_с §_р_т_а_ц_и_и. Диссертационная работа

состоит из введения, обзора литературы, характеристики эксперименталь-шх моделей и методов исследования, четырех глав собственных исследо-заний с обсуждением полученных результатов, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 193 страницах, содержит 33 рисунка и 22 габлицы. Список литературы включает 342 источника, из которых 117 опубликовано в отечественных и 225 в зарубежных изданиях.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

0_б щ_и_й_____и_с_с_л_е_д_о_в_а_н_и_я - Работа выполнено

на 6С8 крысах-самцах линии Вистар массой 200-350 граммов и предусматривала 5 этапов. На_первом_этапе опыты проводили на целых животных, адаптированных к кратковременным стрессорным воздействиям в течение 1Е и 30 дней и адаптированных к периодической гипоксии в течение 20 и 4С дней. Определяли сократительную функцию сердца в состоянии относительного физиологического покоя, а также устойчивость ее к острой аноксиу и последующей реоксигенации. С целью выяснения механизма выявленных различий в степени выраженности кардиопротекторного эффекта этих дву> видов адаптации в следующей серии эксперментов была изучена устойчивость показателей энергетического метаболизма к острой аноксии и реок-сигепации. Эксперименты первого этапа в целом позволили оценить выраженность и особенности перекрестного кардиопротекторного эффекта адаптации к стрессу и прямого кардиопротекторного эффекта адаптации к гипоксии. Выявленные различии в динамике развития и степени проявлена этих эффектов позволили предположить, что они определяются особенностями механизмов нейро-гуморальной регуляции сердца при этих видаэ адаптации. Поэтому на_втором_этапе работы исследовали состояние рецеп-торного аппарата сердца, используя радиолигандные и радиоизотопные методы. На трптьемэтапе изучали динамику формирования ФАСС при обоиз видах адаптации, используя в качестве критериев выраженности этогс феномена определение устойчивости изолированного сердца к реперфузион-ному парадоксу и степень вымывания в перфузат при реперфузии внутриклеточного фермента сердца креатинфосфокиназы.

Поскольку было высказано предположение о важной роли ИТФ-ДЛГ регу-ляторного каскада в формировании ФАСС на_четвертом_этапе изучали состояние фосфоинозитидного обмена в сердце при обоих видах адаптации с помощью анализа состояния активности специфичной к фосфоинозитида» фосфолипазы С в мембранах сердца крыс и физиологического метода, позволяющего оценить активность ИТФ-ДАГ регуляторного каскада по характеру инотропной реакции сердцана действие фенилэфрина. При этом проводили сопоставление активности ИТФ-ДАГ регуляторного контура и выраженности ФАСС на различных этапах адаптационного процесса.

Б связи с тем, что активация фосфоинозитидного обмена приводит ] увеличению синтеза эйкозаноидов, на пятом_этапе мы исследовали содерх; ние простагландинов в плазме крови и ткани сердца при обоих вида: адаптации, а также их роль в перекрестных кардиопротекторных эффекта; при остром стрессе и острой гипоксии.

Экспериментальные_модели 1. Адаптации животных к периодической гипоксии осуществлялась в гипобарической барокамере ежедневно по 4 часа в день на "высоте" 4000 м по следующей схеме: 1-й день - 1000 м "высоты", 2-й день - 2000 м, 3-й день - 3000 м и так далее до "высоты" 4000 м , после чего гипокси-ческое воздействие подолжалось на-этой "высоте". Курс адаптации составлял 20 или 40 гипоксических экспозиций. Хивотных брали в опыт через сутки после последнего сеанса гипоксии.

2. Адаптацию животных к коротким неповреждающим стрессорным воздействиям проводили путем кратковременной иммобилизации животных через день в положении на спине: 1-й день - 15 мин, 2-й день - 30 мин, 3-й день - 45 мин, остальные дни 60 мин. Иммобилизация животных проводилась посредством привязывания за 4 конечности без фиксации головы. Курс адаптации составлял 15 или 30 дней. Хивотных брали в опыт через день после последнего сеанса иммобилизации.

Физ и о л_о_гич_е_с_к у,е_ нет о ды_ и с следовани_я_

1. Изучение сократительной функции сердца в условиях целого орга низма и оценка его резистентности к острой аноксии и последующей реок-сигенации проводили у наркотизированных (нембутал 50 мг/кг в/б) животных. При искусственном дыхании производили торакотомию и через облась верхушки в левый желудочек вводили, стеклянный катетер, соединенный с электорманометрическим датчиком ЕМТ-746 "31ЕМЕИЗ-Е1,ЕМЛ", Швеция. Запись кривой давления производили на приборе М1НС0СПАК-34 "31ЕМЕНЗ-ЕЬЕНА", Швеция. По кривым давления расчитывали: частоту сердечных сокращений (ЧСС), развиваемое давление, максимальные скорости сокращения и расслабления сердца, оцениваемые по скорости нарастания и падения давления в левом желудочке, интенсивность функционирования структур сердца (ИФС), как отношение произведения ЧСС на развиваемое давление к единице сырой массы левого желудочка.

Сократительную функцию сердца изучали в условиях относительного физиологического покоя, в течение 4 минут аноксии после выключения искуственного дыхания и 5 минут последующей реоксигенации после возобновления дыхания.

2. Методика перфузии изолированного сердца и оценки его сократительной функции. . Хивотных гепаринизировали, под наркозом вскрывали грудную клетку, сердце быстро извлекали и помещали в перфузионную систему по Лангендорфу. Для перфузии использовали стандартный раствор Кребса-Хензеляйта. Раствор аэрировали газовой смесью 952 О, и 5% С0„ при температуре 37°С. При этом рН устанавливал-

na

ся в диапазоне 7,3-7,4. Перфузионное давление составляло 95 кПа (9 см водного столба). Механическая активность изолированного сердц регистрировалась при помощи изотонического датчика TD-112S ("Hiho Kohden", Япония), регистрацию ЭКГ и механической активности производи ли с помощью специализированных модулей полиграфа RM-6000 ("Hiho Kohden", Япония). После 20-минутного периода стабилизации изолирован ного сердца в условиях ретроградной перфузии измеряли коронарный про ток, ЧСС и регистрировали амплитуду, скорость сокращения и расслабле ния и ЭКГ.

3. Оценка резистентности изолированного сердца к реперфузионном парадоксу. Для воспроизведения реперфузионного парадокса на изолиро ванных, перфузируемых по Лангендорфу сердцах крыс после периода стаби лизации полностью перекрывали коронарный проток на 15 мин. В опыта соблюдались условия нормотермической тотальной ишемии. Реперфузия вое производилась путем возобновления перфузии сердца раствором Кребса Холзеляйта, насыщенным газовой смесью 95% О^ + 52 СО^- Резистентност. оценивали по электро-механическим параметрам сердца, которые регистри ровались на 1-й, 5-й и 15-й минутах ишемии, а такхе на 5-й, 10-й i 15-й минутах рсперфузии. Реперфузионные повреждения сарколеммы оцени Бали по выходу креатинфосфокиназы в перфузат изолированного сердц. (см. биохимические методы).

4. Определение С^-адренореактивности изолированного сердца. Дл: изучения ответа изолированного сердца на стимуляцию селективны] а^-агонистом фенилэфрином в перфузионный раствор во время периода ста билизации деятельности сердца за 10 минут до введения фенилэфрин. "Sißoa" США в концентрации 1'10 М вводили пропранолол "Sigma" США

-7

концентрации З'Ю М. Оценивались выраженность и длительность инотроп ных ответов после введения фенилэфрина.

'Радиоизотопныел_радиоиммунологические_и_радиофермент :

Выделение плазматических мембран сердца проводили по метод; В.А.Ткачука и Г.Н.Балденкова (1978) с некоторыми модификациями

Измерение связывания (-)-[3Н]-дигидроальпренолола с ß-адрен ергическими рецепторами проводили по методу Lefkowitz и соавт (1986).

Активность АЦ мембранного препарата сердца крысы определяли m методу, описанному В.А.Ткачуком и Г.Н.Балденковым (1978) с некоторым! модификациями.

3

Связывания [ Н]-празозина с Ct^-адренорецепторами проводили m методу Lynch et all (1985) с некоторыми модификациями.

3

Связывание [ Н]-хинуклидинилбензилата (QNB) с мускариновым]

рецепторами проводили по методу Shama et Banerjee (1977).

3

Связывание [ Н]-РН-200-110 с рецепторами дигидропиридинов потен-

2+

циал-зависимого Ca -канала проводили по методу Fawzi A.B., Me Neill J.H. (1984) с некоторыми модификациями.

Определение активности специфичной к фосфоинозитидам ФЛ-С проводили в 50 мкл среды, содержащей 25 мМ Трис-малеатный буфер pH 6,0, 1 мМ Hg2+, 1,5 нМ холат На, 200 мкМ ЭГТА и СаС12 от 0 до 300 мкМ. Инкубационная среда содержала липосомы, приготовленные из грубой фракции фосфоинозитидов мозга быка "Signa", США, содержащие

3

[ Н]-фосфатидилинозитол-4,5- дифосфат (ФИФ2) "Amersham", Англия. Реакцию начинали добавлением взвеси плазматических мембран, останавливали добавлением 188 мл смеси хлороформ/метанол/ПС1 (100:200:3), тщательно перемешивали, через 10 минут добавляли 50 мкл хлороформа и 50 мкл 1,8 M KCl и еще раз тщательно перемешивали. После расслоения фаз из верхней фазы отбирали 50 мкл, помещали во флаконы с тритон-толуольным сцинтиллятором и определяли радиоактивность на сцинтилляционном счетчике Rack Beta "LKB", Швеция. Активность фосфолипазы С выражали в Z

гидролизованного за 5 мин [3Н]ФИФ„ на 50 мкг белка.

ж*

Содержание ПГЕ в миокарде и плазме крови определяли с помощью наборов RIA Kit фирмы "Dade" (США), a nrF2a, ПГ12 и ТХА2 - реагентов Института изотопов АН Венгрии.

Содержание адреналина (А), норадреналина (НА), допамина (ДА) в плазме крови определяли радиоферментним методом с помощью стандартных наборов "Катехола" (ЧССР).

Количество белка определяли по методу Peterson G.L. (1977), используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.

Биох"2<и_ческ ие_ _м.етоды_ _и_с_с л^довани_л_

Для биохимических исследований показателей энергетического мета болизма миокарда сердца крыс замораживали непосредственно в грудной клетке щипцами Волленбергера, охлажденными до температуры жидкого азота. У первой группы в состоянии относительного физиологического покоя, у второй группы в состоянии гипоксии - через 4 минуты после выключения искусственного дыхания и у третьей при реоксигенации - через 5 минут после возобновления дыхания. Замороженные сердца хранились в жидком азоте до проведения исследований.

Исследования содержания простагландинов и катехоламинов в плазме крови выполнены совместно с Пшенниковой М.Г., Кузнецовой В.А., Шимкович М.В. и Вовк В.И.

Содержание в сердце АТФ, АДФ, АМФ и лактата определяли с помощью стандартных наборов фирмы "Boechringer", ФРГ.

Активность креатинфосфокиназы в ткани сердца и в перфузате определяли с помощью стандартных наборов'фирмы "Labs7stems", Финляндия.

Для определения содержания креатинфосфата в ткани миокарда приготавливали безбелковый супернатант. Креатинфосфат определяли по разнице между общим креатином, образовавшимся в результате гидролиза и свободным креатином. Креатин определяли диацетильным' методом (Н.П.Меш-ко'ва, С.Е.Северин, 1979).

Содержание гликогена определяли по методу Hearse D.J. с соавторами (1973). После солюбилизации мышечной ткани гликоген осаждали 70Z этанолом. Гидролиз гликогена проводили Cl-амилоглюкозидазой по Keppler D. и Decker К. <1974). Количество образующейся глюкозы определяли глюкозооксидазным методом (М.И.Прохорова, 1982).

Определение общей и активной формы гликогенфосфорилазы проводили по модифицированному методу Кори (Hers, 1964), основанному^на измерении скорости освобождения неорганического фосфата из глюкозо-1-фосфата при синтезе гликогена. Определение неорганического фосфора проводили по методу Rathbun W.B., Betlach h.V. (1969). Рассчитывали активность общей фосфорилазы (А+В) и активной формы фосфорилаэы (А).

Все измерения показателей энергетического метаболизма сердца проводили на спектрофотометре "IIITACHI-557", Япония.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУХДЕНИЕ

1. ПЕРЕКРЕСТНЫЕ КАРДИОПРОТЕКТОРНЫЕ ЭФФЕКТЫ АДАПТАЦИИ К ПОВТОРНЫМ КРАТКОВРЕМЕННЫМ СТРЕССОРНЫМ ВОЗДЕЙСТВИЯМ И К ПЕРИОДИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ В УСЛОВИЯХ ЦЕЛОГО ОРГАНИЗМА.

1.1.Влияние адаптации к стрессу на сократительную функцию сердца и его резистентность к острой аноксии и последующей реоксигенации.

Эксперименты in situ показали, что в условиях относительного физиологического покоя в контроле и на 15 день адаптации большинство показателей сократительной функции сердца существенно не различались. Однако, на 30 день адаптации к стрессу у животных развивалась брадикар-дия, число сердечных сокращений снижалось с 435±18 до 367±10 ударов в минуту (Р<0,01), наблюдалось увеличение скорости расслабления миокарда более, чем в два раза "(Р<0,01) и скорости сокращения на 35Z (Р<0,05) по сравнению с величиной этого показателя у контрольных животных.

Острая аноксия вызывала депрессию основных параметров сократительной функции сердца в контроле и на 15 день адаптации примерно до одинакового уровня. Однако, на 30 день адаптации после выраженной депрес-

пз

;ии сократительной функции сердца, наблюдавшейся на первой минуте аномии, возникало существенное возрастание скоростей сокращения и расслабления миокарда. В результате, величина этих показателей на 3 минуте аноксии была соответственно в 2 и 2,3 раза . выше, чем в контроле (Р<0,01), а скорость сокращения продолжала оставаться достоверно выше, чем в контроле, на 4 минуте аноксии достигая 3687±469 мм рт.ст./сек, при 1825±306 мм рт.ст/сек в контроле (Р<0,05).

Адаптация существенно увеличивала скорость и степень восстановления сократительной функции в процессе реоксигенации. Действительно, величина развиваемого артериального давления, скорость сокращения, скорость расслабления и ИФС у адаптированных животных на 15 день адаптации восстанавливались быстрее, чем в контроле,и по всем этим показателям эффект супервосстановления выражен достоверно больше, чем в контроле. Максимальная величина развиваемого артериального давления на 15 день адаптации к стрессу была на 932 выше исходной, тогда как в контроле она увеличивалась только на 202, максимальная скорость сокращения превысила исходную более, чем в 3 раза против 812 в контроле; скорость расслабления - на 1892 против 392 в контроле и, наконец, максимальная величина ИФС была увеличена на 732 при полном отсутствии эффекта гупервосстановления в контроле.

На 30 день адаптации к стрессу при реоксигенации наблюдалось значительно более быстрое, чем в контроле восстановление скорости расслабления миокарда, которая ухе на 2 минуте превышала исходную величину на 582 и была в.2,8 раза выше, чем у контрольных животных. Скорость :окращения также восстанавливалась быстрее и на 2 минуте реоксигенации тревышала величину этого показателя в контроле на 682 (Р<0,05). Вос-:тановление других показателей сократительной функции сердца у хивот-1ых этой группы не отличалось от контроля.

Таким образом, адаптация к кратковременным стрессорным воздейст-зиям в течение 15 дней приводит к значительному повышению резистентно-:ти сократительной функции сердца к острой аноксии и последующей реок-:игенации в условиях целого организма, проявляющемуся при реоксигена-1ии ускорением восстановления уровня развиваемого артериального давле-1ия, скоростей сокращения и расслабления сердца, а также ИФС и развитием эффекта супервосстановления к 5 минуте реоксигенации по всем этим юказателям. При адаптации к стрессу в течение 30 дней развивается :омплекс изменений сократительной функции сердца, наблюдающийся уже в юстоянии относительного физиологического покоя - развитие брадикар-[ии, увеличение скоростей расслабления и сокращения миокарда. Сущест->енно повышалась устойчивость сердца к острой аноксии в условиях цело-

го организма - депрессия скоростей сокращения и расслабления миокарда била менее выражена, а при реоксигенации восстановление этих показателей развивалось значительно быстрее, чем в контроле..

I) целом, при адаптации к кратковременным стрессорным воздействиям разминается комплекс изменений сократительной функции сердца, наблюдающийся ухе в состоянии относительного физиологического покоя, а также существенное повышение резистентности сократительной функции сердца к острой аноксии и последующей реоксигенации, претерпевающее определенную динамику в течение адаптационного процесса.

Газвитию брадикардии и повышению скоростей сокращения и расслабления миокарда может способствовать повышение мощности системы энергетического метаболизма миокарда. Как известно, развитие брадикардии при адаптации к физическим нагрузкам сопровождается повышением мощности системы окислительного ресинтеза АТФ за счет роста числа митохондрий и поверхности митохондриальных мембран на единицу объема миокардиальной ткани а также повышением мощности системы гликолиза и гликогенолиза. Указанные изменения в сочетании с увеличением АТФ-азной активности сократительных белкои ( Hedugorac et all, 1975; Resine et all, 1981) приводят к значительному увеличению мощности системы энергообеспечения сократительной Функции сердца. Активация синтеза миокардиальных белков, лежащая в основе перечисленных структурных изменений, приводит также к увеличению в тренированном организме массы мембранных структур

саркоплазматического ретикулума миокарда, ответственных за транспорт 2+

Са в сердечной мышце и реализацию процесса ее расслабления (Guski П. et all 1981). Благодаря этому комплексу сердце приобретает большую максимальную скорость сокращения и расслабления и обеспечивает больший максимальный минутный объем, в экстремальных условиях и при максимальных нагрузках.

В связи с этим, одной из следующих наших задач явилось изучение некоторых параметров системы энергетического метаболизма сердца и их устойчивости к острой аноксии и последующей реоксигенации. Эти исследования мы проводили через 15 дней адаптации к стрессу, т.е. на этапе, когда наблюдалась наиболее выраженная устойчивость сократительной функции сердца к острой аноксии и реоксигенации.

1.2.Влияние адаптации к кратковременным стрессорным воздействиям на некоторые показатели энергетического метаболизма миокарда и их резистентность к острой аноксии и последующей реоксигенации.

Полученные данные свидетельствуют, что в обоих группах животных в состоянии относительного физиологического покоя большинство исследованных нами показателей энергетического метаболизма не различались.

Острая аноксия у неадаптированных хивотных вызывала хорошо известный комплекс изменений в миокарде: произошло резкое, почти десятикратное падение уровня креатинфосфата с 6,14±0,42 мкМ/г до 0,60±0,15 мкМ/г ткани (Р<0,001); содержание АТФ снизилось на 30% (Р<0,01) и соответственно возросло содержание АДФ (Р<0,05), при этом наблюдалось достоверное снижение активности креатинфосфокиназы (КФК) на 162 (Р<0,001). Одновременно происходила активация фосфорилазной системы увеличение отношения активной формы фосфорилазы к общей активности с О,18±0,02 до 0,31±0,03 (Р<0,001) и, соответственно этому, содержание гликогена в сердце снижалось с 407,5±28,9 мг/100г до 141,7±15,7 мг/ЮОг (Р<0,001), т.е. падало почти втрое, а содержание лактата увеличивалось в 2,3 раза (Р<0,001). При этом отмечалась тенденция к снижению общей активности фосфорилазы.

К концу 5 минуты реоксигенации содержание КФ и АТФ восстанавливалось неполностью и составляло 78 и 805! соответственно от контрольного /ровня (Р<0,05). Содержание гликогена и активность КФК вообще не восстанавливались, а общая активность фосфорилазы продолжала снижаться и постигала 802 от исходного уровня (Р<0,05).

У животных, адаптированных к кратковременным стрессорным воздей-;твиян в течение 15 суток, реакция на острую аноксию отличалась от контрольных тем, что не наблюдалось снижения активности КФК, тенденция к снижению общей активности фосфорилазы была меньшей и, несмотря на 1адение содержания гликогена, накопление лактата было достоверно мень-пе, чем в контроле (Р<0,05).

Значительно более определенный эффект предварительной адаптации к кратковременным стрессорным воздействиям выявился при реоксигенации. У адаптированных к стрессу животных, в отличие от контроля, активность 1ФК и общей фосфорилазы сохранялась на исходном уровне, наблюдалось юлное восстановление содержания АТФ и что особенно существенно - со-1ержание КФ через 5 минут реоксигенации оказалось почти на 50% выше, ¡ем у контрольных животных на той же стадии эксперимента. При этом збнаруживалось достоверное супервосстановление. - содержание КФ было увеличенным на 192 по сравнению с исходным уровнем до аноксии. Несмот-зя на отсутствие различий в содержании гликогена, содержание лактата у 1даптировашшх к стрессу хивотных было более чем на 50% ниже величин ;онтрольной серии.

Таким образом, при адаптации к кратковременным стрессорным воз-¡ействиям существенно возрастает устойчивость показателей энергетичес- . ;ого метаболизма к острой аноксии и реоксигенации. Это проявлялось как [ри аноксии, так и при реоксигенации сохранением активности таких важ-

них ферментов энергетического метаболизма, как КФК и гликогенфосфори-лаза, активность которых в контроле существенно снижается, значительнс меньшим накоплением лактата, а также супервосстановлением при реоксигенации содержания КФ и ЛТФ в сердце. Сохранение активности важнейших ферментов энергетического метаболизма в условиях тяжелой аноксии v последующей реоксигенации со всей очевидностью свидетельствует о более высокой устойчивости к повреждению внутриклеточных структур, а возможно и мембран кардиоцитов, которая развивается при адаптации к кратковременным строссорным воздействиям. Супервосстановление КФ по-видимому представляет собой следствие сохранения активности этих ферментов.

В целом, этот комплекс изменений энергетического метаболизма очевидно вносит свой существенный вклад в развитие перекрестного кардио-протекторного эффекта адаптации к кратковременным стрессорнын воздействиям.

1.3. Влияние адаптации к периодической гипоксии на сократитольнук функцию сердца и его резистентность к острой аноксии и последующей реоксигенации.

Физиологические эксперименты, проведенные in situ при адаптации к периодической гипоксии в различные ее сроки показали, что в условиях относительного физиологического покоя большинство определенных нами показателей сократительной функции сердца у контрольных и адаптированных животных практически не различались. Однако, при этом необходимо отмстить, что через 40 суток после начала адаптации к гипоксии наблюдалось увеличение скорости расслабления миокарда на 63% по сравнению с таковой у контрольных животных (Р<0,01).

Острая аноксия вызывала депрессию основных параметров сократительной функции сердца примерно до одинакового уровня во всех трех группах животных.

Через 20 дней адаптации к периодической гипоксии наблюдалось существенное увеличение степени восстановление сократительной функции сердца в процессе реоксигенации по ряду показателей. Так'уже на 1 минуте реоксигенации число сердечных сокращений восстанавливалось до 59% от исходного уровня, тогда как в контроле она достигала только 43% (Р<0,05). В дальнейшем в процессе реоксигенации число сердечных сокращений у адаптированных животных прогрессивно увеличивалось, составляя 68, 78, 88 и 30%, на 2,3,4 и 5 минутах реоксигенации, что достоверно выше величины этого показателя у контрольных животных, которая составляла соответственно 57, 64, 70 и 71% (Р<0,05). На 4 минуте реоксигенации значительно возрастала скорость расслабления сердца и составляла 171% от исходной, что достоверно выше (Р<0,05), чем в контроле, кото-

рая достигала 135% от исходного уровня. Это различие на 5 минуте ре-оксигенации становилось еще более существенным. На этом этапе адаптации к гипоксии наблюдался вырахенный эффект супервосстановления интенсивности функционирования структур при реоксигенации, которая ухе на 3 минуте реоксигенации достигала 104% от исходной величины и была достоверно выше уровня этого показателя в контроле (Р<0,05), достигавшего 85Х от исходного. Величина этого показателя у адаптированных животных на 4 минуте реоксигенации достигала 132%, а на 5 минуте - 1392, тогда как у контрольных хивотных она составляла соответственно 105 и 1102! (Р<0,01).

Адаптация к периодической гипоксии в течение 40 дней значительно увеличивала скорость и степень восстановления сократительной функции в процессе реоксигенации. Действительно, развиваемое артериальное давление, скорость сокращения, скорость расслабления и ИФС у адаптированных *ивотных восстанавливались быстрее, чем в контроле и по всем этим показателям эффект супервосстановления вырахен достоверно больше, чем в контроле. Такхе как и через 20 дней адаптации к гипоксии, на данном этапе адаптации число сердечных сокращений при реоксигенации восстанавливалось быстрее и было более значимым, чем в контроле. Максимальная величина развиваемого систолического давления у адаптированных к гипоксии хивотных при реоксигенации отмечалась ухе на 4 минуте и превышала исходный уровень на 512 против 20% в контроле (Р<0,01); максимальная скорость сокращения при адаптации к гипоксии превысила исход-¡ую более чем в 2,3 раза против 81% в контроле; скорость расслабления - на 90%, против 39% в контроле и, наконец, максимальная величина ИФС Зила увеличена на 415! при отсутствии достоверно значимого эффекта :упервосстановления в контроле.

Таким образом, адаптация к периодической гипоксии в течение 20 ;ней сопровохдается существенным увеличением скорости и степени постановления сократительной функции сердца при реоксигенации после >строй аноксии в условиях целого организма: быстрее и до более высоких юказателей восстанавливалось число сердечных сокращений, скорость расслабления миокарда и интенсивность функционирования структур серд-(а. При адаптации к гипоксии в течение 40 дней псе эти явления стано-шлись еще более выраженными - это проявлялось в более быстром восста-ювлении ЧСС, развиваемого систолического давления, скоростей сокраще-шя и расслабления сердца, а такхе супервосстановлении ИФС при отсут-:твии супервосстановления по этому. показателю у контрольных хивотных.

Этот последний факт весьма вахен, так как ИФС - это произведение [исла сердечных сокращений на развиваемое давление отнесенное к едини-

це массы левого желудочка - в высокой степени детерминирует энергетические потребности миокарда (В.И.Капелько, 1988). Отсутствие супервосстановления по этому показателю у контрольных животных и ярко выраженное супервосстанопление у адаптированных животных свидетельствуют, вероятно, о различиях в мощности системы энергообеспечения миокарда этих двух групп животных и ее устойчивости в условиях аноксии и последующей реоксигенации.

В связи с этим, следующей нашей задачей явилось изучение некоторых параметров энергетического метаболизма сердца и их устойчивости к острой аноксии и последующей реоксигенации. Эти исследования мы проводили через 40 дней адаптации к гипоксии, т.е. на этапе> максимально выраженной устойчивости сократительной функции к острой аноксии и реоксигенации.

1.4. Влияние адаптации к периодической гипоксии на некоторые показатели энергетического метаболизма миокарда и их резистентность к острой аноксии и последующей реоксигенации.

Полученные результаты, что в контрольной и опытной группах животных в состоянии относительного физиологического покоя большинство исследованных нами показателей энергетического метаболизма не различались, за исключением двух показателей. В миокарде животных, адаптированных п течение 40 дней к периодической гипоксии, активность креатин-фосфокиназы была на ИХ ниже, чем в контроле (Р<0,05), а содержания лактата было на 332 ниже, чем в контрольной группе (Р<0,001).

Как ухе было сказано выше, у неадаптированных животных острая ано-ксия вызывала хорошо известный комплекс изменений в миокарде: произошло резкое, почти десятикратное падение уровня креатинфосфата; на 1/3 снизилось содержание АТФ и возросло содержание АДФ, при этом наблюдалось снижение активности КФК. Почти втрое снижалось содержание гликогена в сердце, а содержание лактата увеличивалось в 2,3 раза. При этом отмечалась тенденция к снижению общей активности фосфорилазы и одновременно происходила активация фосфорилазной системы - увеличение отношения активной формы фосфорилазы к общей активности.

У животных, адаптированных к периодической гипоксии в течение 40 дней реакция на острую аноксию отличалась от контрольных животных тем, что несмотря на одинаковое падение содержания гликогена, накопление лактата было на треть меньше чем в контроле (Р<0,001).

К концу 5 минуты реоксигенации содержание КФ и АТФ в сердцах контрольных животных восстанавливалось неполностью и составляло 78 и 80% соответственно от контрольного уровня (Р<0,05). Содержание гликогена-и активность КФК вообще не восстанавливались, а общая активность фосфо-

рилазы продолжала снижаться и достигала 80% от исходного уровня (Р<0,05).

У животных, адаптированных к гипоксии, через 5 минут реоксигенации восстанавливалась активность КФК (Р<0,05) и наблюдалось полное восстановление содержания КФ и АТФ, что было на 27 и 17Z соответственно выше, чем у контрольных животных на той же стадии эксперимента. Содержание активной формы фосфорилазы существенно снижалось по сравнению с исходным (Р<0,01). Несмотря на отсутствие различий в содержании гликогена на этой стадии реоксигенации, содержание лактата у адаптированных животных было значительно ниже и составляло G0Z от величин контрольной серии (Р<0,01).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что у животных, адаптированных к периодической гипоксии, уже в аэробных условиях, а также при аноксии и реоксигенации содержание лактата снижено по сравнению с контрольными. Это само по себе может указывать на более быстрое окисление пирувата в системе митохондрий, эффективность которых при адаптации к гипоксии (0u L.C.,Тсппеу S.И.,1970), а возможно и при адаптации к стрессу увеличена. Можно отметить далее, что при реоксигенации у адаптированных к периодической гипоксии крыс количество активной формы фосфорилазы, резко возрастающее при аноксии, снижается в большой мере, чем в контроле. В целом, речь по-видимому, идет о том, что при адаптации к периодической гипоксии чрезмерная активация гликолиза в условиях аноксии и реоксигенации становится излипней в связи с возрастающей эффективностью окислительного фосфорилирования. Это обеспечивает более значительное снижение содержания лактата при реоксиге-

+ 2+

нации, уменьшает конкуренцию ионов Н с Са за пункты связывания в миофибриллах (Koretsune Y.,Marban Е.,1990). По-видимому, это является одним из моментов, объясняющим ускоренное восстановление при реоксигенации сократительной функции сердца крыс, адаптированных к гипоксии.

В целом, полученные результаты позволяют сделать заключение, что перекрестный кардиопротекторный эффект адаптации к кратковременным стрессорным воздействиям более выражен, чем прямой кардиопротекторный эффект адаптации к периодической гипоксии. Об этом свидетельствуют ¡>акты, что при адаптации к стрессу в условиях острой аноксии и после-цующей реоксигенации активность креатинфосфокиназы в сердце не снижа-этся, как это происходит в контроле, а сохраняется на постояннном уровне, при реоксигенации наблюдается быстро развивающийся и выражен-шй эффект супервосстановления содержания АТФ и креатинфосфата и сократительной функции сердца. При адаптации к гипоксии активность среатинфосфокиназы при аноксии снижается и восстанавливается только

при реоксигенации, при этом супервосстановления АТФ и креатинфосфата не происходит, а эффект ■•супервосстановления большинства показателей сократительной функции сердца выражен в меньшей степени.

2. СОСТОЯНИЕ КЛЕТОЧНЫХ МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛЯЦИИ СЕРДЦА И ИХ РОЛЬ В КАРДИОПРОТЕКТОРНОМ ЭФФЕКТЕ АДАПТАЦИИ К ПЕРИОДИЧЕСКИМ СТРЕССОРНЫМ

ВОЗДЕЙСТВИЯМ

2.1. Влияние различной длительности адаптации к стрессу на рецеп • торный аппарат и активность ключевых ферментов систем вторичных мессендхеров в плазматических мембранах сердца.

Результаты исследования состяния рецепторного аппарата сердца при адаптации к кратковременным стрессорным воздействиям, представленные в таблицах 1 и 2, свидетельствуют, что через две недели адаптации "количество Р-адренорецепторов возросло на 692 (Р<0,01), а затем, через месяц после начала адаптации снизилось, но продолжало оставаться на 212 выше, чем в контроле (Р<0,05). При этом константа диссоциации лиганда для этих рецепторов повышалась к середине курса адаптации и не отличалась от контрольного уровня к 30 дню адаптации.

Таблица 1.

Содержание бета-адренорецепторов и активность аденилатциклазы в мембранах сердца крыс при адаптации к кратковременным стрессорным воздействиям

Бета-адренергические Активность аденилатциклазы Группа рецепторы (пмоль АТФ/мг белка в мин)

животных Вмах Кд Базальная Ответ на Ответ на

(фмоль/мг ( нМ ) активность ISO HaF

белка)

Контроль 51,3+2,7 1,55+0,1 1,64+0,10 4,05+0,18 9,58+0,74 п=12 п=8

Адаптация ** * * *

к стрессу 86,9+2,7 2,18+0,1 1,70+0,09 5,59+0,27 17,10+0,98

(15 дней) п=12 п=9

Адаптация ^ ^

к стрессу 64,3+4,0 2,36+0,3 1,33+0,05 3,51+0,08 10,4+0,57 (30 дней) п=12 п=6

з

Примечание: ^ - достоверность различий Р < 0,05 - достоверность различий Р < 0,01

В ответ на стимуляцию аденилатциклазы через Р-адренорецепторы бета-селективным агонистом 1,-изопротеренолом (10 ® М) ее активность в мембранах контрольных крыс увеличивалась в 2,5 раза, а при стимуляции фторидом натрия активность возрастала в 5,8 раза.

вп

Через 15 дней после начала адаптации базальная активность АД не отличалась от таковой в контроле. При этом чувствительность аденилат-циклазьг к стимуляции Ь-изопротеренолом, а такхе к стимуляции фторидом натрия значительно возросла. Активность ее при этом увеличивалась соответственно в 3,3 (Р<0,05) и 10 раз (Р<0,05).

Ситуация существенным образом изменилась к концу курса адаптации. Базальная активность АЦ снизилась почти на 20% (Р<0,01). Ответ на стимуляцию Ь-изопротеренолом был на 15% ниже, чем у контрольных хивотных (Р<0,01). Уровень хе стимуляции фторидом натрия не отличался от такового у контрольных хивотных.

Таким образом, через две недели адаптации к кратковременным строс-сорным воздействиям наблюдалось некоторое увеличение количества Р-адренорецепторов в плазматических мембранах сердца при снижении степени их сродства к лиганду. Одновременно с этим, значительно увеличился ответ АЦ на стимуляцию селективным Р-агонистом Ь-изопротеренолом, а такхе ответ на неспецифическую стимуляцию фторидом натрия, при сохранении нормального уровня базальной активности аденилатцикллзы, т.е. при неизменной базальной активности АЦ значительно возросли ее потенциальные возможности ответа на достаточно мощную стимуляцию. Повышению потенциальных возможностей ответа системы Р-рецепторы - АД на данном этапе адаптации вероятно способствует также увеличение количества (3-рецепторов- при одновременном снижении их сродства к лиганду. На более позднем этапе адаптации к стрессу, т.е. через 30 дней, и количество Р-адренорецепторов и потенциальные возмохности максимального ответа АЦ на стимуляцию возвращались к исходному уровню, тогда как базальная активность АЦ и ответ ее на специфическую стимуляцию 1,-изопротеренолом пропорционально и достоверно снижались.

Учитывая важную роль системы Р-адренорецепторы - АЦ в регуляции и мобилизации энергетических возможностей клетки, мохно с уверенностью полагать, что повышение потенциальных возможностей этой системы через две недели адаптации к стрессу вносит определенный вклад в повышение устойчивости энергетического метаболизма и сократительной функции сердца к действию острой аноксии и последующей реоксигенации, выявленных нами на данном этапе адаптации.

Данные представленные в таблице 2, свидетельствуют, что в системе . С1^-адренорецепторов под влиянием адаптации к повторным стрессорным воздействиям в течение 15 дней произошел значительный сдвиг - развилось явление десенситизации. Через 15 дней после начала адаптации количество рецепторов уменьшалось на 252 (Р<0,01), а Кд увеличивалась до 600±17 нМ (Р<0,01), т.е. наблюдалось снижение их аффинности к

лиганду. Через 30 дней адаптации количество СС^-адренорецепторов оставалось сниженным и наблюдалось дальнейшее снижение афинности рецепторов к лиганду (Кд = 685£85 пМ, Р<0,01).

Таким образом, уже к 15 дню адаптации к кратковременному стрессу в сердце крыс развивается явление ОС^-десенситизации, которое в конце

курса адаптации становится еще более выраженным.

2+

Лльфа^-адренорецепторы являются одним из Са „-мобилизующих рецепторов, которые при участии С-белков вызывают активацию ключевого фермента фосфоинозитидного обмена - ФЛ-С и таким образом участвуют в регуляции системы вторичных мессендхеров ИТФ-ДАГ регуляторного каскада. В связи с этим следующим этапом наших исследований явилось определение активности ФЛ-С в сердце при адаптации к стрессу.

Таблица 2.

Содержание альфа.-адренорецепторов, М-холинорецепторов, и рецепторов

2+

дигидропиридиноо потенциал-зависимых Са -каналов в сердце крыс при адаптации к кратковременным стрессорным воздействиям

Группа животных

Ал ьфа1-адренерги-ческие рецепторы

М-холинергичес-кие рецепторы

Рецепторы ди^идропи-ридинов Са -каналов|

| Вмах I(фмоль/мг I_белка)

Кд | Вмах Кд (пМ) I(фмоль/мг (пМ) _I белка)_

Вмах Кд (фмоль/мг (пМ) белка)_

Контроль

134+13 п=10

400+44

413+18 п=12

136+10

259+14 п=10

220+22

Адаптация к стрессу (15 дней)

100+4 ** п = 10

640+17** 542+30 * 178+22 220*5 ** 124?6 **

п=9

п = 10

Адаптация к стрессу (30 дней)

_ *ж 100?3

п=9

685+85

**

512+31 * 165+19 206+6 ** 126+7 ** п=6 п=10

Примечание: - достоверность различий Р < 0,05

достоверность различий Р < 0,01

**

Данные, представленные на рисунке 1. отражают зависимость активнос-

2+

ти ФЛ-С от концентрации Са в инкубационной среде и позволяют сравнить эту зависимость на обоих сроках адаптации. На рисунке видно, чтс

в плазматических мембранах сердца контрольных животных ФЛ-С проявляет

2+

выраженную концентрационную зависимость от Са . На рис.1(А) показано,

% гилролизсоонного [,Н]ФИФ2

20 г

А.

аз

• 15 днзй

Контроль

100 200 300

Концентрация СаС1г (мк.М)

20 г

гияролиаозамного [*Н]?И?_

Т 30 дноп Контроль

100 200 300

Концентрация СоС12 (икМ)

Рис.1. Активность фосфолипаза С в плазматических мембранах сердца крыс при адсптаиии к кратковременным стрессорным ' воздействиям (А.- 15 дней; Б.-30 дней) (в % гидролизованного [ Н]9И<Р2/50 мкг белка/5 мин)

г-а

что в мембранах сердца животных, адаптированных к кратковременнь

стрессорным воздействиям в течение 15 дней,' форма этой зависимое!

2+

сохранялась, однако по мере увеличения концентрации Са в среде ак тивность ФЛ-С росла быстрее, чем в контроле. Так, при концентраци СаС1„ 100 мкМ активность ФЛ-С у адаптированных животных составлял

^ з

9,45±1,88% гидролизованного [ Н]ФИФ2/на 50 мкг белка за 5 минут, т.е

била в два раза выше, чем в контроле (Р<0,01). Поскольку в условия

2+

нашего эксперимента данная концентрация Са близка к физиологическо:

(5х10~ - 0х10~ М свободного Са ), данный факт представляется сущест

2+

венным. При увеличении концентрации Са активность ФЛ-С продолжал; расти быстрее, чем в контроле, составляя при 200 и 300.. мкМ СаС12 соответственно 16,01±0,622 (Р<0,01) и 22,91±1,132 гидролизованног( [3Н]ФИФ2/на 50 мкг белка за 5 минут (Р<0,01). На рис.1(Б). видно, чт<

через 30 дней после начала адаптации активность ФЛ-С также нарастал;

„ 2+

по море увеличения концентрации Са , но не отличалась от контроля.

Таким образом, через 15 дней после начала адаптаци!

Са* -зависимая активность ФЛ-С, ключевого звена НТФ-ДАГ регуляторногс

каскада оказалась существенно повышенной, несмотря на десенситизацин

2+

С^-адренорецспторов сердца, а к 30 суткам Са -зависимая активное«

этого фермента не отличалась от контроля.

Учитывая сложность регуляции активности ФЛ-С и ее зависимость не 2+

только от концентрации Са или состояния О..-адренорецепторов, но и от

2+

других рецепторов клеточной мембраны или состояния Са -каналов, далее

ми измеряли количество М-холинорецепторов и потенциал-зависимых 2+

Са -каналов в мембранах сердца при адаптации к стрессу.

Данные, представленные в таблице 2. свидетельствуют, что уже через 2 недели после начала адаптации количество М-холинергических рецепторов возросло примерно на 1/3 (Р<0,05) при практически неизменной афинности рецепторов к лиганду. К концу курса адаптации количество М-холинорецепторов оставалось достоверно увеличенным (Вмах = 512 - 31 фмоль/мг белка (Р<0,05). Это увеличение количества М-холинергических рецепторов, возникшее в процессе адаптации, может иметь защитное значение двоякого рода. Во-первых, изменяя состояние рецептор-зависимых К+-каналов, оказывать антиаритмическое действие (Соок N.8.,1989), во-вторых, увеличение количества М-рецепторов. может проявляться в снижении активности АЦ, что в свою очередь может ограничивать активирующее

„ 2+ -

влияние катехоламинов на потенциал-зависимые Са -каналы •и ограничи-2+

вать вхождение Са в кардиомиоциты (Ре1гег а11, 1990).

2+

При измерении количества потенциал-зависимых Са -каналов, оцениваемому по количеству дигидропиридиновых рецепторов этих каналов, было

выявлено, что на 15 день адаптации к стрессу их количество снижалось до 220 ± 5 фмоль/мг белка (Р<0,01),.а на 30 сутки адаптации еще более уменьшалось и достигало 206 ± 6 фмоль/мг белка (Р<0,01).

Таким образом, при адаптации к кратковременным стрессорним воздействиям помимо увеличения количества М-холинорецепторов, изучаемая нами

о 2+

адаптация может также ограничивать вхождение Са в кардиомиоциты за счет уменьшения примерно на 20Z количества потенциал-зависимых Са2+-каналов, определяемых по количеству рецепторов дигидропиридипов.

Кроме оценки состояния клеточных регуляторных механизмов, таких как состояние рецепторного аппарата или активность АЦ и ФЛ-С, т.е.ключевых ферментов, участвующих в образовании цЛМФ и активации фосфоино-зитидного обмена, определенный интерес представляет также оценка возможности активации фосфоинозитидного обмена в сердце, сопровождающегося образованием в клетке таких вторичных посредников, как ИТФ и ДЛГ.

Далее, избыток образующегося инозитолтрифосфата (ИТФ), действуя на

2+

рецепторы СПР, вызывает выход Са в саркоплазму, а диацилглицерол (ДЛГ), действуя через протеинкиназу С (ПК-С), активирует фосфорилиро-вание белков н, как следствие, может вызывать активацию различных клеточных функций (Bnrridue H.J. 1904). До недавнего времени для оценки состояния фосфоинозитидного обмена и возможности его активации п ответ

на стимуляцию могли быть использованы лишь биохимические методы, а

2+

именно: анализ состояния Са -мобилизующих рецепторов и ряда других рецепторов клеточных мембран, активности таких ферментов как АЦ и ФЛ-С и других звеньев внутриклеточной регуляции, а также непосредственное определение содержания ИТФ и ДЛГ. Однако, недавно был обоснован также физиологический метод (Otani H.et all 1988), который позволяет оценить активность ИТФ-ДАГ регуляторного каскада по реакции папиллярной мышцы левого желудочка на действие селективного агониста Ct^-адренорецепторов фенилэфрина. В процессе этой реакции величина первоначального кратковременного положительного инотропного эффекта отражает," как выяснилось, увеличение содержания ИТФ в саркоплазме, отрицательный инотроп-ный эффект отражает момент чрезмерной перегрузки кардиомиоцитов кальцием, а отставленная во времени фаза стойкого положительного инотропного эффекта отражает ДАГ-индуцированную активацию ПК-С, которая, в

свою очередь, приводит к фосфорилированию транссарколеммальных белков

2+ 2+ медленных Са -каналов и таким образом к увеличению транспорта Са

через эти каналы. Использование такого физиологического метода легло в

основу следующей серии наших исследований.

В Б

2.2. Влияние различной длительности адаптации к стрессу на I СХ^-адренореактивность изолированного сердца.

Как видно на рис.2, стимуляция (Х^-адренорецепторов изолирование перфузируемого сердца контрольных крыс проявлялась трехфазной инотрс ной реакцией. Начальное увеличение силы сокращения появлялось чер

_5

15-20 секунд после введения в перфузат 1"10 Н фенилэфрина и достиг ло максимума через 30 сек. (Фаза 1). Затем сила сокращения снижалас переходя по вторую, отрицательную фазу инотропного ответа, котор становилась наиболее выраженной через 60-80 сек. после начала стимул ции (Фаза 11). После этого сила сокращения вновь нарастала, достиг максимума к 3-4 минуте и сохранялась на высоком уровне'в течение 15-мкнут (Фаза 111). Наблюдаемый нами характер трехфазного инотропно ответа изолированного сердца на стимуляцию Ct^-адренорецепторов соо ветствует таковому, полученному H.Otani с соавторами (1988) на папи лирной мышце левого желудочка крыс, который показал, что первая пол хительная Фаза инотропного ответа соответствует транзиторному увелич нию содержания-ИТФ в мышце, который в дальнейшем, вероятно, создав.

Рис.2. Инотропный ответ изолированных сердец на стимуляцию фенилэф-рипом при адаптации к кратковременным стрессорным воздействиям По оси абсцисс - время с момента введения фенилэфрина в перфузат (в мин.); по оси ординат - сила сокращения сердца (в % по отношению к исходной);

кальциевую перегрузку клетки, вызванную чрезмерной мобилизацией

внутриклеточного кальция, способствует развитию транзиторного

отрицательного инотропного ответа (фаза 11). Стойкий положительный

инотропный эффект (фаза 111), по мнению авторов, может быть

опосредован ДЛГ через активацию протеинкиназы с, которая активирует „ 2+

медленные Са -каналы, хотя это вероятно не единственный механизм возникновения этого эффекта.

Данные, на рис.2, отражают результаты опытов на 15 контрольных

сердцах, 10 сердцах, взятых через 15 суток после начала адаптации и 10

сердцах - через 30 суток. На рисунке видно, что в сердцах контрольных

животных первоначальный кратковременный инотропный ответ, отражающий

накопление ИТФ в сердечной мышце, достигал максимума через 30 сек и

выражался в увеличении амплитуды сокращений на 12,9%. Отставленный

положительный инотропный эффект, обусловленный ДАГ-индуцированной

2+

активациеи ПК-С и накоплением внутриклеточного Са , достигал максимума к 3-4 минуте и выражался в увеличении амплитуды сокращений на 26%, которая сохранялась на таком уровне 15-20 минут.

Через 15 дней предварительной адаптации крыс к стрессу характер инотропного ответа изолированного сердца на стимуляцию фенилэфрином сохранялся, однако эти изменения были значительно более выраженными. Так амплитуда сокращения в 1 фазе ответа была на 5,7% выше, чем в контроле (Р<0,05), и уже с 4 минуты после стимуляции (111 фаза) положительный Инотропный эффект становился значительно более выраженным, чем в контроле (Р<0,01). Через 30 дней адаптации ответ сердца на стимуляцию существенным образом менялся. Это проявлялось главным образом в том, что положительная, отставленная во вренени инотропная реакция на фенилэфрин не просто снижалась по сравнению с контролем (Р<0,01), а превращалась в отрицательную - на плато амплитуда.сокращения составляла около 90%,и была достоверно ниже исходной (Р<0,01).

Таким образом, на 15 сутки адаптации наблюдалось значительное увеличение транзиторного, ИТФ-индуцированного и длительного, ДАГ-индуцированного ответов сердечной мышцы на С^-агонист. В дальнейшем, при 30-дневной адаптации, эти явления исчезли и, более того, ДАГ-индуцированный ответ из положительного ответа превратился в отрицательный.

Как уже было сказано, при адаптации к стрессу формируется комплекс адаптационных сдвигов, который был обозначен как феномен адаптационной стабилизации структур (ФАСС), и было высказано предположение, что в формировании его важную роль играет активация ИТФ-ДАГ регуляторного каскада. Одним из компонентов ФАСС является резистентность сердца к

ЕВ

реперфузионному парадоксу. Однако выраженность этого явления в процес се адаптации не была до настоящего времени изучена. В связи с этим следующей серии экспериментов было исследовано влияние различие длительности адаптации к стрессу на резистентность изолированног сердца к реперфузионному парадоксу.

2.3. Влияние различной длительности адаптации к стрессу на резис • тентность изолированного сердца к реперфузионному парадоксу.

Проведенные исследования показали, что после перекрытия коронар ного протока в сердцах животных возникают классические признаки ишеми ческого повреждения: подъем сегмента Б-Т, депрессия амплитуды сокраще ния, контрактурные проявления и аритмии; при реперфузии все эти явле ния выражены в большей степени. В количественном отношении эти наруше ния функции и ритма были выражены различно для сердец контрольных ] адаптированных к стрессу животных в различные периоды адаптации

Параметры сократительной функции изолированных сердец у контрольных и адаптированных животных в аэробных условиях до ишемии не различались. Действие тотальной 15-минутной ишемии на сердца контрольных ] опытных животных сопровождалось снижением параметров сократительно! функции сердца, однако на 5 минуте амплитуда сокращений сердец крыс ш 15 день адаптации к стрессу была более чем в 5 раз выше, чем у контрольных животных.

При реперфузионном парадоксе в период реперфузии амплитуда сокращения уменьшалась пропорционально величине контрактуры. Предварительна? адаптация к стрессу, длившаяся 15 дней, обладала выраженным антиконт-рактурным эффектом и соответственно обеспечивала гораздо более высоки? уровень, чем в контроле, амплитуды сокращения на этапе реперфузии. После 30 суток адаптации антиконтрактурный ее эффект и способност* сохранения высокой амплитуды сокращения оказались утраченными. Так, на 5, 10 и 15 минуте реперфузии амплитуда сокращений контрольных сердеь была снижена соответственно на 74, 70 и 682 по сравнению с исходной. Эта депрессия была обусловлена, главным образом, наличием контрактуры. На 15 день адаптации наблюдался выраженный защитный эффект: депрессия амплитуды сокращений на 5, 10 и 15 мин. реперфузии была меньше па сравнению с контролем в 1,8-1,9 раза, а восстановление по сравнению с исходной амплитудой сокращения (до ишемии) на 15 мин. составляло 58,72 ( при 322 в контроле). При этом величина контрактуры сердца в процессе реперфузии была ниже, чем в контроле.

На 30 день адаптации к стрессу величина депрессии сократительной функции сердца при реперфузии не отличалась от таковой у контрольных животных.

В сердцах контрольных Животных при реперфузии наблюдалось возникновение фибрилляции желудочков и желудочковой тахикардии в 862 случаев, тогда как на 15 день адаптации к стрессу такие виды аритмий отмечались только в 252, а на 30 день - в 502 случаев. Существенные различия наблюдались также и в длительности возникающих тяжелых аритмий. Так, если в контрольных сердцах суммарная длительность фибрилляций желудочков и желудочковой тахикардии за 15 мин. реперфузии составляла в среднем 89,5 сек, то на 15 день адаптации эта величина составляла всего лишь 2,4 сек (Р<0,01), а на 30 день она несколько увеличивалась и была равна 36,6 сек, оставаясь ниже контрольных цифр (Р<0,05).

Исследование выхода внутриклеточного фермента кардиоцитов КФК в перфузат показало, что в контроле и на обоих сроках адаптации до ишемии в состоянии относительного(физиологического покоя содержание КФК в перфузате существенно не различалось. На 5 минуте реоксигенации в результате реперфузионного повреждения сердца выход КФК в перфузат из контрольных сердец составил 680±42 мкМ/мин'г массы сердца. Этот показатель уменьшился через 15 дней адаптации к стрессу до 270±91 мкМ/минт массы (Р<0,05), а через 30 суток адаптации его величина не отличалась от контроля и состапляла 543±135 нкМ/минт массы сердца.

Таким образом, антиконтрактурный и антиаритмический эффект адаптации, а также уменьшение вымывания внутриклеточного фермента КФК в перфузат при реперфузии, составляющие важные проявления ФАСС, ярко выражены на 15 сутки адаптационного процесса. К 30 дню адаптационного процесса антиконтрактурный эффект исчезает, выход КФК в перфузат не отличается от контроля, а антиаритмический эффект несколько снижается, но остается выраженным.

В целом, результаты исследований показали, что через 15 дней адаптации к кратковременным стрессорным воздействиям в сердце развивается

сложный комплекс изменений клеточных регуляторных механизмов, заключа-

2+

ющийся в десенситизации С^-адренорецепторов и повышении Са -зависимой активности ФЛ-С; увеличении количества (З-адренорецепторов и повышении потенциальных возможностей ответа АЦ на специфическую и неспецифическую стимуляцию при сохранении нормальной базальной активности АЦ; увеличении плотности М-холинергических рецепторов и уменьшении числа „ 2+

потенциал-зависимых, Са -каналов-

Через 30 дней адаптации к стрессу характер изменений рецепторных

комплексов существенным образом меняется: при сохраняющейся 2+

СХ^-десенситизации Са -зависимая активность ФЛ-С возвращается к исходной; количество Р-адренорецепторов и потенциальные возможности ответа АЦ на неспецифическую стимуляцию фторидом натрия возвращаются к исход-

ним показателям, однако при этом снижаются базальная активность АЦ и ответ АЦ на специфическую стимуляцию изопротеренолом; плотность М-холинергических рецепторов остается увеличенной, а число потенциал-зависимых Са2+-каналов сниженным.

Механизм происходящих под влиянием адаптации изменений рецепторных комплексов, воспринимающих сигналы стресс-реализующих и стресс-линитирующих систем, еще недостаточно ясен и требует дальнейшего исследования. В настоящее время можно полагать, что десенситизация адренорецепторов развивается в процессе адаптации в результате повторных влияний высоких концентраций катехоламинов на эти рецепторы при стрессорных воздействиях. В соответствии с современными представлениями высокие концентрации агониста приводят к уменьшению количества действующих рецепторов главным образом за счет инактивации рецепторов, вызываемой фосфорилированием белков самого рецептора либо также и гуанинсвязывающих белков рецепторного комплекса (В.А.Ткачук, 1903).

Три факта, установленные в нашей работе при адаптации к повторным стрессорным воздействиям, свидетельствуют в пользу предположения о том, что ИТФ-ДАГ контур регуляции действительно играет роль в механизме формирования ФАСС:

1) IIa 15 сутки адаптации наблюдается кальций-зависимая активация фосфолипазы С, ключевого звена ИТФ-ДАГ регуляторного каскада. Это неизбежно должно приводить к увеличению образования ИТФ и ДАГ в клетке.

2) Увеличение ИТФ-индуцированного и ДАГ-индуцированного инотропных ответов при стимуляции фенилэфрином также свидетельствует в пользу увеличения образования ИТФ и ДАГ.

3) Оба отмеченных выше явления - увеличение активности ФЛ-С и повышение инотропных эффектов сопровождается на 15 сутки адаптации увеличением резистентности сердца к реперфузионному парадоксу, т.е. хорошо известным компонентом ФАСС. Исчезновение же к 30 суткам адаптации активации ФЛ-С и увеличенных ответов на фенилэфрин сопровождается исчезновением или уменьшением этого компонента ФАСС.

Значение увеличения образования ДАГ в кардиоцитах при адаптации к стрессу весьма велико, так как ДАГ, активируя ПК-С и таким образом синтез белков в клетке (C.J.Henrich, Р.C.Simpson,1987), выступает как медиатор, долговременной - структурно обеспеченной адаптации, а в нашем конкретном случае как вероятный медиатор накопления HSP и формирования ФАСС. Действительно, многократное накопление HSP и становление всех компонентов ФАСС наиболее ярко выражено именно через две недели после начала адаптации к коротким стрессорным воздействиям (Ф.З.Меерсон и др.,1991).

Процесс адаптации к многократному или длительному действию стрес-сорной ситуации позволяет проследить смену регуляторных механизмов, обеспечивающих защиту сердца. Действительно, при изучении адаптации к непрерывному умеренному стрессу было установлено, что на 5 день процесса у животных резко возрастает тонус блуждающего нерва и этот сдвиг нервной регуляции сердца играет важную роль в предупреждении ишемическнх и реперфузионных аритмий (В.И.Кузнецов, 1391). В дальнейшем попиленный тонус блуждающего нерва исчезает, но резистентность сердца к ииемическим и реперфузионным повреждениям сохраняется не только в условиях целого организма, но и при изоляции органа. Оно обеспечивается развитием ФЛСС и достигает максимума к 15 суткам адаптации. Именно в это время в наших экспериментах наблюдалась высокая устойчивость к реперфузионному парадоксу, а в других исследованиях, накопление II5P в цитоплазме и ядрах кардиомиоцитов, повышение резистентности яд»;р и структур CII1' к аутолизу (Ф.3.Неерсон и др.,1931). На более позднем этапе адаптации к стрессорным воздействиям, как показано выше, активации ИТФ-ДЛГ регулиторного контура исчезает и обнаруживается тенденция к редукции ФЛСС. Это, по-видимому, происходит за счет

„ 2+

увеличения функционировании Са -насосов, которые не только увеличивают скорость расслаблении, но и отключают Са^+-активацию ФЛ-С и активацию фосфоинозитидного цикла. Существенно, что механизмы, действующие на этапе редукции ФЛСС, как показали наши опыты в условиях целого организма, значительно увеличивают резистентность сердца к острой аноксии и последующей рсоксигенации . Изучение этих механизмов весьма важно, так как процесс долговременной адаптации эволюционно детерминирован отнюдь не на защиту изолированных органов, а на защиту органов, функционирующих в условиях целого организма.

3..СОСТОЯНИЕ КЛЕТ0Ч1ШХ МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛЯЦИИ СЕРДЦА И ИХ РОЛЬ В КАРДНОПРОТККТОРНОМ ЭФФЕКТЕ АДАПТАЦИИ К ПЕРИОДИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ

3.1. Влияние различной длительности адаптации к периодической гипоксии на рецепторный аппарат и активность ключевых ферментов систем вторичных мессенджеров в плазматических мембранах сердца.

Данные, представленные в таблице 3. свидетельствуют, что при адаптации крыс к периодической гипобарической гипоксии количество бета-рецепторов в плазматических мембранах миокарда через 20 дней возросло на 32Z (Р<0,01), и оставалось повышенным до конца курса адаптации (Р<0,01), при неизменной афинности этих рецепторов к использованному лиганду в течение всего курса-адаптации.

Базальная активность АЦ через 20 дней адаптации проявляла тенденцию к снижению, а к концу курса адаптации достоверно снижалась (Р<0,01).

Таблица 3.

.Содержание бета-адренорецепторов и активность аденилатциклазы в мембранах сердца крыс при адаптации к периодической гипоксии

Группа животных

Бета-адренергические рецепторы

Активность аденилатциклазы ( пмоль/мг белка мин )

Бмах (фмоль/мг белка)

Кд

( нМ )

Базальная активность

Ответ на 1Б0

Ответ на Нар

Контроль

51,3+2,0 п=12

2,20+0,1 1,54+0,03 п=9

3,53+0,05 11,12+0,34

Адаптация к гипоксии 67,9+2,8 (20 дней) п=12

**

2,08+0,2 1,43+0,05 п=9

3,79+0,00* 15,96+0,13**

Адаптация ^ _ ^ _ ^

к гипоксии 64,3+4,0 2,36+0,3 1,00+0,10 2,80+0,04 10,0+0,64 (40 дней)

п = 12

п=9

Примечание: - достоверность различий с контролем Р < 0,05 - достоверность различий с контролем Р < 0,01

Через 20 дней адаптации изопротеренол-стимулированная активность АЦ возрастала по сравнению с контрольной группой (Р<0,05), а увеличение активности АЦ в ответ на действие фторида натрия, отражающее потенциальные возможности ответа АЦ на стимулирующие воздействия, было почти в полтора раза выше, чем в контроле (Р<0,01).

Через 40 дней адаптации снижался ответ АЦ на стимуляцию селективным Р-агонистом Ь-изопротеренолом. Изопротеренол-стимулированная активность АЦ на этой стадии эксперимента составляла 792 от величины этого показателя в контрольной группе (Р<0,01), а абсолютная величина Фторид-стинулированной активности АЦ не отличалась от таковой у контрольных животных.

Таким образом, через 20 дней адаптации к гипоксии наблюдается увеличение числа |3-адренорецепторов в сердце и повышение активности аденилатциклазы в ответ на стимуляцию фенилэфрином или фторидом натрия. Этот факт соответствует наблюдениям, что на ранних этапах адаптации наблюдается адренергическая по своему происхождению гиперфункция сердца, сопровождающаяся увеличением в миокарде цйМФ, активацией гликолиза, и легко устраняемая (З-блокаторами (М.Г.Пшенникова, 1980).

В конце курса адаптации крыс к гипоксии плотность Р-рецепторов в сердце продолжала оставаться несколько повышенной, но при этом развивалось снижение базальной активности АЦ, сопровождавшееся снижением ее ответа на стимулирующее воздействие Р-агониста, т.е. развивалась де-

сенситизация системы Р-рецепторы - АД к действию специфического аго-ниста. Этот эффект наблюдался.на фоне сохранения максимальной возможности ответа АЦ, выявляемого с помощью фторида натрия. Выявленное нами снижение активности системы (3-рецепторц - ЛЦ через 40 дней адаптации к гипоксии согласуется с давними наблюдениями (F.Z.HecrGon et all,1973), которые показали, что адаптация к периодической гипоксии значительно повышает резистентность сердца к изопротереноловым повреждениям.

Через 20 дней адаптации к гипоксии наблюдалось увеличение количества а^-адренорецепторов в сердце (табл.4) на 48% (Р<0,01) и снижение Кд с 444-22 до 269±34 пМ, т.е. повышение их сродства к лиганду почти в два раза (Р<0,01). Через 40 дней количество рецепторов снижалось, приближаясь к норме, но сохраняя при этом повышенное почти в два раза сродство к лиганду.

Таким образом, в результате адаптации к периодической гипоксии развивается повышение Ct^-адренореактивности сердца. Этот факт может играть важную роль в адаптации сердца к периодической гипоксии, способствуя улучшению сократимости миокарда, поскольку кроме позитивного инотропного действия, стимуляция а^-адрснорецепторов сердца, участвует в регуляции метаболических процессов, повышая активность фосфофрукто-киназы (Clare et all, 1983), главного звена, лимитирующего скорость гликолиза, что, может способствовать поддержанию сократительной функции сердца в условиях гипоксии. Этот соответствует полученным нами данным (см. раздели 1.3, 1.4), свидетельствующим, что восстановление сократительной функции сердца и содержания креатинфосфата и АТФ в миокарде в процессе реоксигенации после острой аноксии у крыс, адаптированных к периодической гипоксии, наблюдается значительно быстрее, чем у неадаптированных животных.

Количество М-холинергических рецепторов (табл.4) уже через 20 дней адаптации к гипоксии увеличивалось на 38% (Р<0,01) и к концу курса оставалось существенно увеличенным. Константа диссоциации лиганда через 20 дней адаптации возрастала до 321±30 пМ, при 150*14 пМ в контроле (Р<0,01), а в конце курса адаптации она была равна 451Í53 пМ (Р<0,01). Это увеличение М-холинергических рецепторов может иметь защитное значение двоякого рода. Во-первых, изненяя состояние рецептор-зависимых К+-каналов, влиять на возбудимость миокарда, во-вторых, способствовать реализации ингибирующего воздействия на АЦ, активность которой, как было нами показано, к концу периода адаптации действительно снижена. Это может ограничивать активирующее влияние катехол-

2+ 2+ аминов на потенциал-зависимые Са -каналы и тормозить вхождение Са в

кардиомиоциты (Н.Heidbuchel et all,1987).

Таблица 4.

Содержание С(.^-адренорецепторов, Ы-холинорецепторов и рецепторов дигид-ропиридинов потенциал-зависимых Са2+-каналов в сердце крыс при адаптации к периодической гипоксии

Группа животных

Альфа^адренерги- М-холинергичес-

ческие рецепторы

Рецепторы дигидропи-2+

кие рецепторы ридинов Са -каналов

Вмах Кд Вмах Кд (фмоль/мг (пМ) (фмоль/мг (пМ) _белка)_белка)_

Вмах Кд (фмоль/мг (пМ) белка)_

Контроль

132+18 п-12

444+22

366+9 п=12

150+14

235+11 п=10

130+8

Адаптация к гипоксии (20 дней)

190+19** 269+34** 506+13** 321?30** 299+25** 181+21**

п = 12

п=12

п=9

Адаптация к гипоксии (40 дней)

157+30 п = 12

255+52**

— ** — _ 450+15 451+53 259+9 147+14

п = 12

п=9

Примечание:

**

- достоверность различий с контролем Р < 0,01

Как видно из таблицы 4., количество потенциал-зависимых

2+

Са -каналов в сердце, определяемых по количеству рецепторов дигидро-пиридинов, через 20 дней адаптации к гипоксии увеличивается на 27%,а к концу периода адаптации возвращается к норме, т.е. наблюдается определенное сходство в динамике изменений количества потенциал-зависимых +

Са -каналов и О^-адренорецепторов в миокарде.

Кривые на рисунке 3. отражают зависимость ФЛ-С от концентрации 2+

Са в инкубационной среде и позволяют сравнить эту зависимость на

обоих сроках адаптации. В плазматических мембранах сердца животных,

адаптированных к периодической гипоксии в течение 20 дней (рис.ЗА.),

также как и в контроле, сохранялась зависимость Фермента от количества

свободного кальция, однако по мере увеличения концентрации СаСЬ2 в

среде до 200 мкМ и выше, активность ФЛ-С становилась достоверно ниже,

чем в контроле (Р<0,05).

На рис.З(Б). видно, что через 40 дней после начала адаптации

2+

активность ФЛ-С также нарастала по мере увеличения концентрации■ Са , но была существенно выше таковой у контрольных животных. Так, уже при

^ % гидролизовонного [ Н]9И9г

1с0 200 зоо

Концентрация СаС12 (мкМ)

% гклролизоаанного [3Н]ФИФ2

40 дней

Контроль

100 200 зоо

Концентрация СаС12 (мкМ)

Рис.3. Активность <рас<ро/1ипаза С в плазматических мембрснах сердца крыс, адаптированных к периодической гипоксии. ( А. - 20 дней; Б. - 40 дней )

(в % гидролиэованного [ Н]9И92/50 мкг белка/5 мин)

концентрации СаС!^ 50 мкМ активность ФЛ-С у адаптированных хивотныз

была почти в 2 раза выше, чем в контроле (Р<0,05). Поскольку' в услови-

2+

пх.нашего эксперимента данная концентрация Са является физиологической, данный Факт представляется существенным. При дальнейшем увеличе-2+

нии концентрации Са активность ФЛ-С продолжала расти быстрее, чем в контроле. '.

3.2. Влияние различной длительности адаптации к периодической гипоксии на (Х^-адренореактивность изолированного сердца.

Кривые на рис.4, отражают результаты опытов на 15 контрольных

сердцах, 8 сердцах, взятых через 20 суток после начала адаптации и 13

сердцах - через 40 суток. На рисунке видно, что в сердцах контрольных

животных первоначальный кратковременный инотропный ответ, отражающий

накопление ИТФ в сердечной мышце, достигал максимума через 30 сек и

выражался в увеличении амплитуды сокращений на 12,92. Отставленный

положительный инотропный эффект, обусловленный ДАГ-индуцированной

150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50

%

адаптация ¡х(40 дней) — контроль

-адаптация (20 дней)

-1

8 кош.

Рис.4. Инотропный ответ изолированных сердец на стимуляцию фенилэф-рином при адаптации к периодической гипоксии

По оси абсцисс - время с момента введения ф>енилэфрина в перфузат (в мин.); по оси ординат - сила сокращения сердца (в % по Отношению к исходной);

активацией ПК-С и накоплением внутриклеточного Са , достигал максимума к 3-4 минуте и выражался в увеличении амплитуды сокращений -примерно на 122, которая сохранялась на таком уровне 15-20 минут.

Через 20 дней предварительной адаптации крыс к периодической гипоксии инотропный ответ изолированного сердца на стимуляцию фенилэфрином становился заметно меньше, чем в контроле. Так амплитуда сокращения в 1 фазе ответа била на 7,42 ниже, чем в контроле (Р<0,05), а отсроченный положительный инотропный эффект (111 фаза) в отличие от контроля был непродолжительным и менее выраженным, достигая ко 2-3 минуте 1011032, и в дальнейшем переходя в отрицательный инотропный ответ <Р<0,01).

Через 40 дней предварительной адаптации крыс х гипоксии характер ипотропного ответа изолированного сердца на стимуляцию фенилэфрином напротив становился значительно более выраженным, чем в контроле. Так амплитуда сокращения в 1 фазе ответа была на 3,62 выше, чем в контроле, отрицательный инотропный ответ был существенно меньше и составлял 70,52, при 66,32 в контроле (Р<0,05), а отсроченный положительный инотропный эффект (111 фаза) становился значительно более выраженным, чем в контроле (Р<0,05, Р<0,01), уже с первых минут его появления.

Полученные данные свидетельствуют, что через 20 дней адаптации к периодической гипоксии наблюдалось снижение инотропных ответов сердца на стимуляцию СХ^-агонистом при одновременном снижении чувствительности ФЛ-С к высоким концентрациям кальция, тогда как через 40 дней адаптации выраженность положительных инотропных ответов была достоверно

' 2+

выше, чем в контроле, при одновременном повышении Са -зависимои активности ФЛ-С при физиологических концентрациях кальция.

Таким образом, активация инозитолфосфатного цикла регуляции развивается только через 40 дней после начала адаптации к периодической

гипоксии, что проявляется усилением положительных инотропных ответов

2+

сердца на стимуляцию d^-агонистом и повышением Са -зависимой активности ФЛ-С, ключевого звена ИТФ-ДАГ регуляторного каскада

3.3. Влияние различной длительности адаптации к гипоксии на резистентность изолированного сердца к реперфузионному парадоксу.

Сократительная функция изолированных сердец у животных этих групп в аэробных условиях до ишемии не различалась, а действие тотальной 15-минутной ишемии на сердца контрольных и опытных животных сопровождалось снижением параметров сократительной функции сердца в одинаковой степени.

В период реперфузии амплитуда сокращения уменьшалась пропорционально величине контрактуры. Через 20 суток адаптации к гипоксии при

реперфузии изолированного сердца наблюдалась более выраженная контрактура, чем в контроле (Р<0,01), которая соответственно сопровождалась менее высоким, чем в контроле (Р<0,01), уровнем амплитуды сокращения на этапе реперфузии. После 40 суток адаптации к гипоксии величина контрактуры и депрессии сократительной функции сердца при реперфузии не отличалась от таковой у контрольных животных.

В сердцах контрольных животных при реперфузии наблюдалось возникновение фибрилляции желудочков и желудочковой тахикардии в 86Z случаев, через 20 дней адаптации к гипоксии такие виды аритмий отмечались только в 632, а через 40 дней - в 435! случаев. Существенные различия наблюдались также и в длительности возникающих тяжелых аритмий. Так, если в контрольных сердцах суммарная длительность фибрилляций желудочков и желудочковой тахикардии за 15 мин. реперфузии составляла в среднем 122,4^27,4 сек, то через 20 дней адаптации эта величина составляла 224,0*112,0 сек, а через 40 дней она снижалась и была равна 42,3*23,9 сек (Р<0,05). ,

Исследование выхода внутриклеточного фермента кардиоцитов КФК в перфузат показало, что в контроле и на обоих сроках адаптации до ишемии в состоянии относительного физиологического покоя содержание КФК в перфузате существенно не различалось. На 5 минуте реоксигенации в результате реперфузионного повреждения сердца выход КФК в перфузат значительно увеличился, но степень этого увеличения была одинаковой как для контрольных сердец, так и для сердец животных, адаптированных к периодической гипоксии в течение 20 и 40 дней.

Таким образом, через 20 суток адаптационного процесса антиконтрак-турный и антиаритмический эффект адаптации, а также уменьшение вымывания КФК в перфузат при реперфузии, составляющие важное проявление ФЛСС, не были выражены. Через 40 суток адаптационного процесса выход КФК в перфузат не отличался от нормы, однако при отсутствии антиконт-рактурного наблюдалось появление антиаритмического эффекта, т.е. появлялись свидетельства формирования ФЛСС на данном этапе адаптации. Этот факт согласуется с ранее полученными данными (F.Z.Heerson et all,1991), свидетельствующими о развитии ФЛСС через 40 сеансов адаптации к периодической гипоксии..

Сравнивая проявления ФАСС в поздней стадии адаптации к гипоксии и то же самое явление при адаптации к стрессу, следует отметить важное обстоятельство, которое по-видимому связано с существенными различиями в механизме этих двух адаптационных процессов. Оно состоит в том, что при адаптации к повторным стрессорным воздействиям, производимым через день, активация ИТФ-ДАГ регуляторного каскада развивается быстро и

достигает максимума на 15 сутки, а затем также быстро исчезает несмотря на продолжение стрессорных воздействий. При адаптации к гипоксии, которая происходит постепенно и не сопровождается стрессом, динамика оказалась иной: активность ИТФ-ДЛГ регуляторного каскада нарастала весьма медленно и реализовалась лишь к 40 суткам, одновременно с развитием основных проявлений ФАСС. При этом, исследования последнего времени свидетельствуют, что выраженность ФАСС при адаптации г. гипоксии меньше, чем при адаптации к стрессу (F.Z.Meerson et all,1991).

На ранних этапах адаптации наблюдается увеличение числа Р-адренорецепторов в сердце и повышение активности адеиилатциклазы- в ответ на стимуляцию селективным [3-агонистом или фторидом натрия. На 40 сутки адаптации развивается явление десенситизации системы Р-рецепторы - ЛЦ к действию Р-агониста, а сердце работает на уровне физиологической нормы.

При адаптации к гипоксии не наблюдается характерная для адаптации к стрессу дсссиситизгщип Я^-адренорецепторов. Напротив, происходит существенное (в 2 раза) повышение афинности рецепторов при трлнзитор-ном увеличении их количества. Эти изменения сопровождаются к концу адаптации активацией ИТФ-ДЛГ регуляторного каскада, проявляющейся увеличением позитивных инотропних ответов на фенилэфрин и умеренной активацией ФЛ-С, сопряженной с СХ^-лдренорецепторани. Таким образом, в результате адаптации к периодической гипоксии развивается повышение С^-адренореактинности сердца. Этот факт несомненно играет роль в показанном нами улучшении сократимости миокарда при реоксигенации. Повышение чувствительности & -адренорецепторов, кроме повышения сократитель-

2+

пых возмохностеи сердца через активацию депо Са в СПР, участвует также в активации энергообеспечения миокарда в условиях гипоксии за счет повышения активности главного фермента, лимитирующего скорость гликолиза - фосфофруктокиназы (H.G.Clare et all,1983), что в свою очередь, может составлять одно из звеньев механизма защиты сердца от ишемических и гипоксических повреждений.

В целом, сопоставление изменений рецепторных комплексов при двух изучаемых видах адаптации позволяет полагать, что различия этих изменений связаны с различиями самих факторов среды и соответственно "целей и задач", стоящих перед адаптациями. Стрессорные ситуации связаны очевидно с более активным "выбросом" стресс-гормонов и медиаторов и их повреждающим воздействием. В соответствии с этим при адаптации к таким ситуациям формируются компоненты структурного "следа", блокирующие повреждающее действие медиаторов стресс-реализующих систем на уровне рецепторов, например - десенситизация адренорецепторов, а также

а а

развивается феномен адаптационной стабилизации клеточных структур, повыщающий резистентность к поврехдающим воздействиям стресса непосредственно на уровне клетки. При действии гипоксии адаптация направлена в большей мере на мобилизацию органов и систем, обеспечивающих приспособление к недостатку кислорода на всех уровнях, т.е. на повышение резистентности клеток к этому недостатку, а такхе не повышение эффективности и экономности функционирования регуляции этих систем.

В целом, анализ изменений механизмов нейрогуморальной регуляции при адаптации к гипоксии позволяет полагать, что защитные эффекты этой адаптации при неблагоприятных воздействиях могут быть менее выраженными, чем при адаптации к стрессу, и реализуются, по-видимому, главным образом за счет ограничения стресс-реакции на уровне центров стресс-реализующих систем и высвобождения стрессорных медиаторов и гормонов, но не на уровне рецепторного аппарата органов-исполнителей.

4. РОЛЬ СТРПСС-ЛИМИТИРУЮЩЕЯ СИСТЕНЦ ПРОСТАГЛАНДИНОВ В КАРДИОПРОТЕК-ТОРНОМ ЭФФЕКТЕ АДАПТАЦИИ К СТРЕССУ И К ПЕРИОДИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ

Для понимания механизмов нейрогуморальной регуляции большое значение имеет оценка состояния так называемых модуляторных систем, функция которых состоит в ограничении или потенциировании различных звеньев нейрогуморальной регуляции органов и тканей. В связи с этим, целью наших дальнейших исследований явилось изучение состояния стресс-лимитирующей системы простагландинов в сердце при адаптации в кратковременным стрессорним воздействиям и адаптации к периодической гипоксии и ее роли в перекрестных кардиопротекторных эффектах адаптации при остром гипоксическом повреждении и остром стрессе.

4.1. Влияние адаптации к кратковременным стрессорним воздействиям на состояние системы простагландинов и ее устойчивость к острой аноксии и последующей реоксигенации

Исследования показали, что адаптация к кратковременным стрессорним воздействиям привела к значительной активации системы ПГ и ТХА2 в сердечной мышце: содержание ПГЕ возросло почти в полтора раза, содержание простагландина Г2а возросло тоже немногим более, чем в полтора раза. В результате, соотношение ПГЕ/ПГР2а практически не отличалось от контроля. Содержание ПГ^ в миокарде не отличалось от контроля, а ТХА2 увеличилось на 292 по сравнению с контролем. При этом соотношение ПГ12/ТХА2 несколько снижалось, однако это снижение было статистически недостоверно (Р>0,05).

Острая аноксия у неадаптированных животных вызывала достоверное увеличение содержания ПГЕ в миокарде (Р<0,001), при этом наблюдалась

тенденция к росту содержания ПГ?2а, ПГ12 и ТХА2, в результате чего величины ПГЕ/ПГР2а и ПГ12/ТХА2 практически не изменялись. На фоне значительной активации системы ПГ у адаптированных животных острая анок-сия не вызывала существенных изменений содержания ПГЕ и ПП2 при наличии тенденции к увеличению содержания пп?2а, что приводило к некоторому снижению соотношения ПГЕ/ПП?2а. В то же время содержание ТХА2 в миокарде снижалось (Р<0,01), что проводило к увеличению соотношения ПГ12/ТХЛ2 с 0,033 до 0,052 (Р<0,05).

При реоксигенации у контрольных животных наблюдалось значительное, более чем в два раза, увеличение содержания в миокарде ПГК2а и ТХЛ2, при этом содержание протекторных ПГЕ и. ПГ12 не отличалось от исходного. Это приводило к резкому снижению соотношений ПГЕ/ПГЕ2 и ИГ12/ТХЛ2 до 10,2 и 0,019 соответственно (Р<0,01). В отличие от контрольных животных, у адаптированных крыс через 5 минут реоксигенации после острой аноксии содержание ТХЛ2 продолжало снижаться (Р<0,01), а уровень прос-тагландинов не отличался от исходного. В результате отношение ПГ12/ТХЛ2 возрастало в два раза, достигая 0,068 (Р<0,01).

Таким образом, при адаптации к кратковременным стрессорним воздействиям развиваются выраженные изменения в системе простагландинов, обеспечивающие кардиопротекторный эффект при острой аноксии и последующей реоксигенации. Это проявляется как в увеличении продукции протекторного ПГЕ в состоянии относительного физиологического покоя, так и тем, что при реоксигенации в сердцах контрольных животных резко возрастает содержание ПГК.,а и ТХЛ2, оказывающих повреждающее действие на миокард, при неизменном содержании протекторных ПГЕ и ПГ12> а у адаптированных животных при неизменном содержании ПГЕ и ПП^ содержание ТХЛ2 снижается более чем в два раза.

4.2. Влияние адаптации к периодической гипоксии на состояние системы простагландинов и ее устойчивость к острому стрессор-ному воздействию

Полученные данные свидетельствуют,, что адаптация к гипоксии привела к значительной активации системы ПГ в сердечной мышце: содержание ПГЕ возросло более, чем в 2 раза, содержание ПГ12 на 73% и ТХЛ2 - на 87% по сравнению с контролем. При этом содержание ПГН^ не изменилось и в итоге соотношение ПГЕ/ПГН^ увеличилось на 70%, а ПГ12/ТХА2 не отличалось от контроля. Стресс у неадаптированных животных не вызывал достоверных изменений содержания ПГ и ТХА2 в миокарде. Однако наблюдалась определенная тенденция к росту содержания ПГЕ и ПГ1,,, в результате чего величины ПГЕ/ПГР2аи ПГ12/ТХА2 оказались достоверно выше, чем в контроле (Р<0,05). В результате активации системы простагландинов у

адаптированных хивотных содержание протекторных ПГ в миокарде при стрессе было существенно выше, чем у неадаптированных при таком хе стрессорном воздействии. Так содерхание ПГЕ у них после стресса увеличилось на 252 по сравнению с исходным и было в 2 раза больше, чем у неадаптированных хивотных, а содерхание ПП^ было почти на 302 вьше, чем у неадаптированных хивотных.

Адаптация к гипоксии в течение 40 дней привела к повышению по сравнению с контролем содерхания в плазме крови ПГЕ на 782, ПГЕ/ПГР2а на 402, содерхания ПГ12 на 602; уровень ТХА2 такхе возрос и поэтому достоверного сдвига отношения ПГ1/ТХА2 не наблюдалось. Таким образом, адаптация к периодическому действию гипоксии активирует систему ПГ с увеличением синтеза ПГЕ и ПГ12, т.е. ПГ, обладающих протекторным действием при стрессорных, ишемических и других поврехдениях (М.Г.Пшенни-кова, 1991). Острый стресс у неадаптированных хивотных вызывал резкое увеличение содерхания катехоламинов в плазме крови по сравнению с контролем, что отрахает стрессорную активацию адренергической системы, т.е. стресс-реакцию. Стресс-реакция сочеталась у данных .хивотных с увеличением уровня ПГ и ТХА2 в плазме крови, но при этом наблюдалось уменьшение отношений ПГЕ/ПГ]?2 и ПГ12/ТХА2. Величина этих отношений оказалась меньше по сравнению с контролем на 402 и 5Б2 соответственно. Таким образом, активация синтеза эйкозаноидов при стрессе не обеспечила у неадаптированных животных увеличения преобладания ПГЕ в крови над ПП?2 и уменьшения преобладания ТХЛ2 над ПГ12 по сравнению с контролем. Иными словами, у неадаптированных животных при стрессе наб-. людалось относительное уменьшение содерхания в пазме крови протекторных ПГ - ПГЕ и ПГ12.

У адаптированных к гипоксии крыс стресс не вызывал достоверного подъема содерхания катехоламинов в плазме по сравнению с исходным. В результате уровень катехоламинов в плазме при стрессе у этих хивотных был в 1,6 - 2,5 раза меньше, чем у неадаптированных при таком же стрессе, т.е. стресс-реакция у них была менее выражена. При этом, что весьма существенно, у адаптированных животных при стрессе содерхание ПГЕ и ПГ12 в плазме крови было выше, чем у неадаптированных при таком же стрессе, и так же почти в 2 раза больше были у них величины отношений ПГЕ/ПГЕзд и ПГ12/ТХА2- Таким образом, выяснилось, что адаптация к периодической гипоксии в течение 40 суток не только активирует систему ПГ с увеличением синтеза протекторных ПГЕ и ПГ12, но и обеспечивает их повышенный уровень при стрессе.

Таким образом полученные данные показывают, что адаптация к периодическому действию гипоксии в течение 40 дней приводит к активации

системы ПГ в сердце и в организме в целом, о чем мохно • судить по содержанию ПГ в плазме крови. При этом в стрессорной ситуации у адаптированных животных соотношение активностей адренергической системы и системы ПГ выгодно отличается от соответствующего соотношения у неадаптированных животных, а именно: у адаптированных животных при стрессе уровень катехоламинов в крови ниже, а уровень протекторных ПГЕ и ПП^ выше.

В целом, полученные результаты позволяют сделать заключение, адаптация к кратковременным стрессорним воздействиям и адаптация к периодической гипоксии активизируют стресс-лимитирующую систему ПГ и эта реакция может играть важную роль в ограничении стресс реакции и предупреждении стрессорных повреждений. В целом, полученные результаты дают основание полагать, что активация системы ПГ является одним из важных механизмов кардиопротекторного и других защитных эффектов адаптации к стрессу и гипоксии.

выводи

1. Адаптация к кратковременным стрессорним воздействиям приводит к развитию перекрестного кардиопротекторного эффекта к острой аноксии и последующей реоксигенации в условиях целого организма. Через 15 дней после начала адаптации это проявляется ярко виражешшм супервосстанов-ленисм к 5 минуте реоксигенации интенсивности функционирования структур, скоростей сокращения и расслабления сердца. При адаптации к стрессу в точение 30 дней наряду с более быстрым восстановлением этих показателей при реоксигенации развивается комплекс изменений сократительной функции сердца, наблюдающийся ухе в состоянии относительного физиологического покоя - развитие брадикардии, увеличение скоростей расслабления и сокращения миокарда.

2. При адаптации к кратковременным стрессорним воздействиям существенно возрастает устойчивость показателей энергетического метаболизма к острой аноксии и реоксигенации. Это проявляется сохранением как при аноксии, так и при реоксигенации активности креатинфосфокиназы и гли-когенфосфорилазы, активность которых в контроле существенно снижается, значительно меньшим накоплением лактата, а также супервосстановлением содержания креатинфосфата и АТФ в сердце при реоксигенации.

3. Адаптация к периодической гипоксии в течение 20 дней сопровождается формированием прямого кардиопротекторного эффекта: при реоксигенации после острой аноксии быстрее и до более высоких показателей восстанавливается число сердечных сокращений, скорость расслабления миокарда и интенсивность функционирования структур сердца. При адаптации к гипоксии в течение 40 дней все эти явления становятся еще более

выражениям - быстрее восстанавливается развиваемое систолическое давление, скорости сокращения и расслабления сердца, интенсивность функционирования структур, а к 5 минуте реоксигенации развивается супервосстановление этих показателей.

4. Адаптация к периодической гипоксии значительно повышает устойчивость показателей энергетического метаболизма миокарда к острой анок-сии и реоксиганации: обеспечивает более низкий уровень лактата" в миокарде на всех этапах эксперимента, способствует сохранению общей актив ности фосфорилазы и восстановление активности КФК при реоксигенации, что в свою очередь сопровождается восстановлением содержания КФ и АТФ к 5 минуте реоксигенации, при отсутствиии этого эффекта в контроле.

5. Перекрестный кардиопротекторный эффект адаптации к кратковременным стрессорным воздействиям более выражен, чем прямой кардиопротекторный эффект адаптации к периодической гипоксии. Об этом свидетельствуют факты, что при адаптации к стрессу в условиях острой аноксии и последующей реоксигенации активность креатинфосфокиназы в сердце не снижается, как это происходит в контроле, а сохраняется нг^ постояннном уровне, при реоксигенации наблюдается быстро развивающийся и выраженный эффект супервосстановления содержания АТФ и креатинфосфата и сократительной функции сердца. При адаптации к гипоксии активность креатинфосфокиназы при аноксии снижается и восстанавливается только при реоксигенации, при этом супервосстановления АТФ и креатинфосфата не происходит, а эффект супервосстановления большинства показателей сократительной функции сердца выражен в меньшей степени.

6. Через 15 дней адаптации к кратковременным стрессорным воздействиям наблюдается повышение резистентности изолированного сердца к ре-перфузионному парадоксу, что является наиболее ярким проявлением феномена адаптационной стабилизации структур (ФАСС). Это заключается в появлении выраженного антиконтрактурного и антиаритмического эффекта адаптации, а также уменьшении вымывания в перфузат внутриклеточного Фермента креатинфосфокиназы при реперфузии изолированного сердца. Через 30 дней адаптации к стрессу наблюдается значительная редукция этого компонента ФАСС.

7. Через 15 дней адаптации к кратковременным стрессорным воздействиям развивается активация фосфоинозитидного обмена в сердце. Об этом свидетельствует активация фосфолипазы С (ФЛ-С) ключевого звена инози-толтрифосфат-диацилглицерол (ИТФ-ДАГ) регуляторного каскада и увеличение при стимуляции селективным И^-агонистом фенилэфрином первичного кратковременного и отсроченного стойкого положительных инотропных ответов сердца, обусловленных накоплением ИТФ и ДАГ в миокарде. Исчезно-

пение к 30 суткам адаптации к стрессу активации ФЛ-С и увеличенных ответов на фенилэфрин сопровождается значительной редукцией ФДСС. Следовательно активация ИТФ-ДЛГ регуляторного каскада играет важную роль в формировании ФЛСС.

8. При адаптации к кратковременным стрессорним воздействиям в ре-

цепторном аппарате сердца развиваются три сдвига, которые могут играть

существенную роль в кардионротекторном эффекте адаптации: десенситиза-

ция (X -адренорецептороп, увеличение плотности М-холинергических ре-

2+

цепторов и уменьшение числа потенциал-зависимых Са -каналов.

9. Через 20 дней адаптации к гипоксии развивается существенное повышение адренореактивности сердца, которое проявляется увеличением числа Р-адренорецепторов в сердце и повышением активности аденилатцик-лазы в ответ на стимуляцию селективным Р-агонистом или фторидом натрия, увеличением плотности -адренорецептороп и повышением их сродства к лиганду.

10. Через 40 дней адаптации крыс к гипоксии в рецепторном аппарате сердца происходят сдвиги, которые могут играть роль в снижении адренореактивности. Это проявляется в том, что наблюдается снижение базаль-

ной активности ЛЦ, и уменьшение ее ответа на действие изопротеренола,

„ 2+

при этом количество потенциал-зависимых Са -каналов и СХ^-адренорецепторов снижается до нормы, а плотность М-холинергических рецепторов остается существенно увеличенной. Такое снижение активности аденилатцик^азы при увеличении плотности М-холинорецепторов может играть роль в известном увеличении резистентности сердца адаптированных животных к адренотоксическим повреждениям.

11. На 20 день адаптации к периодической гипоксии наблюдалось снижение активности ИТФ-ДАГ регуляторного цикла в миокарде. Активация ипозитолфосфатного цикла регуляции развивается только через 40 дней после, начала адаптации к периодической гипоксии, что проявляется усилением положительных инотропных ответов сердца на стимуляцию

2+

СХ^-агонистом и повышением Са -зависимой активности ФЛ-С, ключевого звена ИТФ-ДАГ регуляторного каскада Это соответствует известному кар-диопротекторному эффекту длительной адаптации к гипоксии и доказанному наличию многих компонентов ФАСС на этом этапе адаптации.

12. Адаптация к кратковременным стрессам обеспечивает увеличение содержания протекторного простагландина Е в миокарде, предупреждает неблагоприятное падение при аноксии и реоксигенации отношения проста-циклин/тромбоксан (ПИ2/ТХА2>,а даже напротив, вызывает значительное увеличение этого соотношения. Адаптация к периодической гипоксии активизирует стресс-лимитирующую систему, вызывает накопление протекторных

ЛБ

простагландинов ПГЕ и ПГ12> а также увеличение отношения nrE/nrF2a в сердце и плазме крови и эта реакция играет важную роль в ограничении стресс реакции и предупреждении стрессорных повреждений сердца.

13.Обнаруженные различия в динамике и механизмах адаптации и наличие перекрестных защитных эффектов адаптации к повторным стрессорным воздействиям и периодической гипоксии подтверждают целесообразность сочетаиного применения адаптации к этим факторам для защиты сердца.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВДПНЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние адаптации к кратковременным стрессорным воздействиям на устойчивость показателей энергетического метаболизма и сократи- тельной функции миокарда к острой гипоксической гипоксии и реок- сигена-ции.// Бюлл.эксперим.биол.и мед. - 1990.-N.9,- С. 244-246. (Соавт. Л.Ю.Голубева, В.А.Салтыкова, Ф.З.Меерсон)

2. Адаптация к стрессорным воздействиям сопровождается десенситиза-цией альфа-1-адренорецепторов сердца // Механизмы адаптации животных и растений к экстремальным Факторам: Тез. 6-й Ростовской областной научно-практической школы-семинара, Ростов-на-Дону,-1990,- Т.2 - С.188. (Соавт. Ф.З.Меерсон, Г.Н.Балденков)

3. Влияние адаптации к периодическому действию высотной гипоксии на содержание простагландинов и тромбоксана в миокарде. // Механизмы адаптации животных и растений к экстремальным факторам: Тез.6-й Ростовской областной научно-практической школы-семинара. Ростов- на-Дону,-1990,- Т.2 -С.18-19.(Соавт. М.Г.Пшенникова, В.И.Вовк, М.В.Шимкович)

4. Адаптация к стрессорным воздействиям предупреждает гипоксические и реоксигенационные нарушения энергетического метаболизма и сократительной функции миокарда //Центральные и периферические механизмы регуляции физиологических функций: Материалы Всесоюзной конф., Москва, -1990,- С.63-64. (Соавт. Л.Ю.Голубева, Ф.З.Меерсон)

5. The role of prostaglandin system in the cardioprotective effects of adaptation to high altitude hypoxia in stress. //Aspects biochimique et physiologique de la fatigue musculaire.: Resumes abstracts de la Colloque scietifique internationale, Creteil, France.- 1990.-P.8. (Co-autors H.G.Pshennikova, B.A.Kuznetsova V.I.Vovk, M.V.Shimkovich, F.Z.Meerson)

6. Superrestoration of the heart function of stressadapted rats after acute hypoxia. //Aspects biochimique et physiologique de la fatigue musculaire.: Resumes abstracts de la Colloque scietifique internationale, Creteil, France.- 1990.- P.7. (Co-autor L.Yu.Golubeva)

7. Изменение рецепторного аппарата сердца крыс при адаптации к пе-

>иодической гипобарической гипоксии.//Кровообращение в условиях высо-:огорной и экспериментальной гипоксии.:Тез.докл.XV Всесоюзного симпо-шума, Душанбе,-1990.- Т.1.- С.102 (Соавт.Ф.3.Меерсон, Г.Н.Балденков)

8. Предварительная адаптация к факторам внешней среди повышает устойчивость сердца к острой аноксии и последующей реоксигенации. //Кро-юобращение в условиях высокогорной и экспериментальной гипоксии : Тез. 10кл. IV Всесоюзного симпозиума, Душанбе, -1990.- Т.1.- С.78. (Соавт. 1.Ю.Голубева)

9. Адаптация к периодической высотной гипоксии увеличивает содерха-1ие простагландинов в миокарде и крови и уменьшает "выброс" катехол-îmhhob в кровь при стрессе.//Физиология и биохимия медиаторных процес-:ов.:Тез.докл.V Всесоюзной конф. Москва,- 1990,- С. 234. (Соавт. 1.Г.Пшенникова, Б.А.Кузнецова, В.И.Вовк, М.В.Шимкович, Ф.З.Меерсон)

10.Влияние адаптации к периодической гипоксии на устойчивость показателей энергетического метаболизма и сократительной функции миокарда ч острой аноксии и реоксигенации.//Бюлл. эксперим.биол. и мед. - 1991. - Н.1.- С.22-25. (Соавт Л.Ю.Голубева)

11.Альфа^десенситизация сердца при адаптации к стрессорным воздействиям.// Физиол хурн,- 1991.-т.37.-Ы 1.- С.3-6.- (Соавт. Ф.З.Меерсон, Г.Н.Балденков)

12.Повышение альфа^- адренореактивности сердца крыс при адаптации к периодической гипоксии. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. -1991. - N.6.-3.570-572., (Соавт. Ф.З.Меерсон, Г.Н.Балденков)

13.Desensitization of the alpha-l-adrenoreceptors of the heart in adaptation to stress exposure.//Proceedings International Society for ?athophysiology 1 / Abstracts Constituent Congress International Society for Pathophysiology. - Moscow, 1991.- P.254.

14.Adaptation to stress exposures and adaptation to altitude hypoxia activated prostaglandin system and attenuate adrenergic responses in acute stress. //Proceedings International Society for Pathophysiology 1 / Abstracts Constituent Congress International Society for Pathophysiology. - Moscow, 1991.- P.256.

15.Роль системы простагландинов в кардиопротекторном действии адаптации к гипоксии при стрессе //Кардиология. - 1992. - N.3.- С. (Соавт. М.Г.Пшенникова,Б.А.Кузнецова, М.В.Шимкович,В.И.Вовк, Д.В. Сапрыгин, Ф.З.Меерсон.)

16.Повышение активности кальций-зависимой активности фосфолипазы С в миокарде при адаптации животных к кратковременным стрессорным воздействиям //Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 1992. - N.2. - С. 130-132. (Соавт. Ф.З.Меерсон, П.В.Авдонин)

yÇ/foL-t*