Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Мембранная адаптация при развитии резистентности к факторам внешней среды

i ."pecíiум L ,- сии

5 с г ' И " 0J_ _ Ç<3 f/ôl

ti. - НСЗ " \т: Л ученую CT Г: " : _ РА

3//¿У-

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии

На правах рукописи

САЗОНТОВА Татьяна Геннадьевна

Мембранная адаптация при развитии резистентности к факторам внешней среды

14.00.16 - патологическая физиология 03.00.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва, 1998

Оглавление

Стр.

Список сокращений. 5

Введение. 6 Обзор литературы.

Глава 1.Структура и функция саркоплазматического ретикулума. 15

1.1.Электро-механическое сопряжение. 15

1.2.Белковый состав продольных трубочек и терминальных 18 цистерн СР.

2+

1.3. Регуляция выхода Са из СР. 21

1.4.Липидный состав СР. 27

1.5.Структура, функция и регуляция Са-насоса СР. 29

1.6.Нарушения Са-гомеостаза клетки. 36 1.7.Экспрессия и изозимы Са-насоса СР. 40

Глава 2.Современные представления о перекисном 45 окислении липидов и антиоксидантной защите клетки.

2.1 .Свободные радикалы кислорода. 45

2.2.ПОЛ и мембранно-связанные ферменты. 47

2.3.Взаимодействие и взаимоусиление процессов 51 внутриклеточной деструкции.

2.4.Антиоксидантная система клетки. 55

2.5.Сигнальная роль свободных радикалов. 66

2.6.Соотношение про- и антиоксидантных факторов клетки. 73

Глава 3. Основные принципы мембранной адаптации 75 ион-транспортирующих систем.

3.1.Концепция биохимической адаптации. 75

3.2.Стресс-реализуюшие и стресс-лимитируюшие системы. 80

3.3.«Цена» адаптации. 94

3.4.Молекулярная адаптация клетки. 104

3.5.Мембранная адаптация. 117

Глава 4.Материалы и методы исследования. 124

4.1. Физиологические модели. 126

4.2.Введение препаратов. 129

4.3.Биохимические методы. 130 4.3.1 .Подготовительные процедуры. 130 4.3.2.Основные биохимические методы. 132

4.4.Представление данных. 149

Результаты и обсуждение.

Глава 5.Повреждающий эффект острых воздействий на 150 мембранно-связанные ион-транспортирующие системы клетки и роль ПОЛ в этих процессах.

5.1. Стрессорное нарушение работы Са-насоса СР и Иа.К-АТФазы 151 плазматической мембраны.

5.1.1.Нарушение эффективности работы Са-насоса СР и его резистентности к действию эндогенных повреждающих факторов.

5.1.2.Состояние Са-транспортирутощей системы СР миокарда при ишемии и реперфузии различной длительности. 5.1.3.Оценка вклада мембранных изменений и РЦФ в нарушение транспорта Са2+ в СР миокарда при стрессе.

5.1.4.Противоположное влияние стресса на резистентность к ПОЛ тканей мозга и других органов в динамике стрессорного воздействия

5.1.5.Термодинамические нарушения Ыа,К-АТФазы сердца при стрессе и их моделирование при окислении фермента.

5.1.6.Противоположное влияние стресса на активность №,К-АТФазы мозга и других органов.

5.1.7.Сравнение повреждений Са-насоса СР миокарда при кратковременном и длительном стрессах.

5.2. Влияние острой физической нагрузки на резистентность мембранных структур миокарда, скелетных мышц, печени и мозга.

Глава 6. Эффективность защиты ион-транспортирующих 191

систем СР и плазматической мембраны миокарда в

151 154 162 165 171 175 178 181

динамике развития адаптации.

6.1. Мембранные протекторные эффекты адаптации к стрессу. 192

6.1.1.Скорость и резистентность Са-насоса СР при адаптации 192 к стрессу.

6.1.2.Термоустойчивость Са-насоса выделенной 199 фракции СР миокарда.

6.1.3.Влияние адаптации на предупреждение стресс- 204 индуцированных повреждений №,К-АТФазы сарколеммы.

6^.Сравнительный анализ динамики развития адаптационного 208

защитного эффекта на мембранном уровне при адаптации к стрессу и физическим нагрузкам.

6.2.1.Формирование повышенной резистентности Са-насоса 208 СР миокарда в динамике адаптации к стрессорным воздействиям.

6.2.2.Изменение резистентности Са-транспортирующей 214 системы СР миокарда в динамике адаптации к

физическим нагрузкам.

Глава 7.Пределы адаптируемости органов и внутриклеточных 222

структур при действии различных факторов среды.

7.1.Изменение «цены» адаптации на уровне различных органов 222 при длительной адаптации к физическим нагрузкам.

7.2.Сравнительный анализ «цены» адаптации к стрессу и к 231 гипоксии на уровне Са-насоса СР и ^.К-насоса сарколеммы.

7.3.Моделирование защитного эффекта адаптации на уровне Са- 241 насоса СР миокарда.с помощью диеты, обогащенной п-3 ПНЖК.

7.4. «Цена» адаптации при повышении интенсивности 250 гипоксической тренировки. Сравнительный анализ состояния

про- и антиоксидантных систем.

Глава 8. Мембранные защитные эффекты при действии 271

8.1. Сравнительный анализ про- и антиоксидантных сист( различных органов крыс при адаптации к периодической

нормобарической гипоксии.

8.2.Состояние Са-насоса СР миокарда при адаптации 283 к нормобарической гипоксии.

8.3. Моделирование защитного эффекта адаптации с 288 помощью периферического действия ДСИП.

Глава 9. Влияние соотношения про- и антиоксидантных 296

факторов на пределы адаптируемости у животных с различной чувствительностью к повреждающим воздействиям.

9.1.«Цена» адаптации к гипоксии у животных с различной 296

резистентностью к кислородной недостаточности. Мембранные эффекты в сердце, печени и мозге.

9.1.1.Влияние адаптации к гипоксии на устойчивость к 297 ПОЛ и состояние антиоксидантной системы ткани мозга.

9.1.2.Влияние адаптации к гипоксии на состояние про- и 302 антиоксидантных систем в печени животных с различной устойчивостью к гипоксии.

9.1.3.Изменение состояния Са-насоса СР миокарда при адаптации к 307 гипоксии у животных с различной чувствительностью к ней.

9.2.Выраженность свободнорадикальных повреждений. 312

индуцированных мутагенами, у мышей различных линий и их адаптационная зашита.

9.2.1 .Уровень антиоксидантов и чувствительность 312

ткани печени к ПОЛ у мышей линий С57В1/6 и ВАЬВ/с. 9.2.2.Соотношение про- и антиоксидантных факторов 316

при введении мутагенов мышам различных линий.

9.2.3.Эффективность антимутагенного действия 320

адаптации к стрессу.

Заключение. 323

Выводы. 342

Список литературы. 345

Список сокращений

А532 - оптическая плотность при 532 нм

ВУ- высокоустойчивые

ДАГ - диацилглицерол

ДГК - докозагексаеновая кислота

ДО - диоксидин, 1,4-ди-М-окись 2,3-бис-(ацетоксиметил)-хиноксалина ДТТ - дитиотреитол ИФз- инозитол (1,4,5)-трифосфат КЛ -кардиолипин

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота НУ - низкоустойчивые ПГ-А2- простагландин А2 ПК - протеинкиназа

ПНЖК- полиненасыщенные жирные кислоты

ПОЛ - перекисное окисление липидов

РЦФ - растворимые цитоплазматические факторы

Са-АТФаза - Са2+, Мд2+-активируемая аденозинтрифосфатаза

СОД - супероксиддисмутаза

СР - саркоплазматический ретикулум

ТБК - тиобарбитуровая кислота

ТНТС - тетранитротетразолиевый синий

Трис - гидроксиметиламинометан

ФИ-фосфатидилинозит

ЦФ - циклофосфан, Мх-бис-(р-хлорэтил)-1\Г-0-триметиленовый эфир диамида

фосфорной кислоты

ЭГТА - этиленгликольтетраацетат

ЭДТА- этилендиаминтетраацетат

ЭПК - эйкозапентаеновая кислота

ОЭН - ЗЭЭС - восстановленная и окисленная форма глутатиона НЕРЕЭ -1\1-2-гидроксиэтидпиперазин-1\Г-2-этансульфоновая кислота ЭРБ - додецилсульфат натрия

-6-ВВЕДЕНИЕ

Проблема адаптации организма имеет самостоятельное общебиологическое и практическое значение, входя как составная часть в большинство изучаемых проблем экспериментальной и практической медицины. В последнее десятилетие интенсивно развиваются представления о том, что адаптация реализуется не только на уровне организма или отдельных органов, но и на уровне внутриклеточных структур. Таким образом, поиск путей формирования немедикаментозной адаптационной защиты, являющийся важной задачей современной медико-биологической науки и практики, приобретает молекулярный аспект.

Актуальность данной работы заключается в том, что она посвящена изучению формирования адаптационной резистентности на уровне мембранных систем клетки, вскрывает молекулярные механизмы, лежащие в основе адаптационной устойчивости органов и организма в целом, а также анализирует пределы мембранной адаптации при действии различных факторов среды или при использовании животных с различной чувствительностью к ним.

Начиная с работ Ганса Селье в 40-60 годах [Селье Г., 1960], разрабатывалась общая теория адаптации и ее проявления на уровне целого организма и отдельных органов. Было показано, что несмотря на особенности каждого конкретного вида адаптации, существуют общие закономерности формирования ее защитного эффекта. Прежде всего это касается наличия обязательной первичной стресс-реакции, возникающей в организме в ответ на действие внешнего фактора и приводящей к активации стресс-реализующих систем. Длительное или чрезмерное по силе или сложности воздействие может не приводить к эффективной адаптации, более того, возможны нарушения гомеостаза и в этом случае стресс-реакция играет важную роль в патогенезе различных заболеваний, в том числе и на уровне сердца. Однако при любом воздействии, имеющем стрессорную компоненту, происходит активация не только стресс-реализующей гипоталамо-гипофизарно-симпато-адреналовой системы с выбросом катехоламинов и других гормонов, но и сопряженная с ней параллельная активация стресс-лимитирующих систем [Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г., 1988]. Эти стресс-лимитирующие системы могут ограничивать интенсивность и длительность стресс-реакции либо на центральном уровне (ГАМК-ергическая, опиоидергическая,

серотонинергическая системы) за счет ограничения возбуждения центров стресс-реализующей системы, либо уже на уровне периферических тканей (простагландиновая, аденозиновая, антиоксидантная системы и др.), что позволяет в большинстве случаев избежать развития патологии, приспособиться к новым, изменившимся условиям среды и даже повысить устойчивость к действию различных повреждающих факторов. Показано, что адаптация к стрессорным, гипоксическим и другим воздействиям эффективно увеличивает резистентность сердца в условиях целого организма - ограничивает или полностью предупреждает нарушения сократительной функции, электрической стабильности, развитие аритмий при стрессорном и ишемическом воздействиях, при инфаркте миокарда и постинфарктном кардиосклерозе [Меерсон Ф.З., 1986]. В последнее время показано, что данные принципы реализуются и на уровне отдельных органов, увеличивая устойчивость изолированного сердца к ишемическим и реперфузионным аритмиям, перегрузке Са2+ и действию токсических доз катехоламинов [Меерсон Ф.З., Малышев И.Ю., 1993]. Вероятно, адаптационное увеличение мощности периферических стресс-лимитирующих систем может приводить и к протекторному эффекту на уровне внутриклеточных структур, повышать их устойчивость к высоким концентрациям кальция, активации эндогенных протеаз, липаз и свободнорадикальных процессов, активация которых наблюдается при развитии различных патологических состояний. Таким образом, адаптация может иметь защитный эффект и на ион-транспортирующие системы клетки, среди которых важная роль в поддержании трансмембранного потенциала и Са-гомеостаза принадлежит №,К-АТФазе плазматической мембраны и Са-насосу СР.

Однако, к началу данного исследования в 1985 г. вопрос об адаптационной защите мембранно-связанных ферментов только начинал изучаться. Ничего не было известно о возможности перенесения принципов адаптации на отдельные внутриклеточные структуры. Было неясно, является ли повышение резистентности органа и организма в целом результатом лишь простого количественного увеличения мощности систем и компонентов клетки и формирования так называемого структурного «следа» адаптации или внутриклеточные структуры также изменяют свою устойчивость к эндогенным повреждающим факторам, т.е. понятие структурного «следа» может приобрести новое качественное содержание.

Кроме того, было неизвестно, как формируется адаптационный защитный эффект на уровне мембранных структур, является ли он планомерно нарастающим по мощности или имеет колебательный характер. Не было известно, каково минимальное необходимое количество повторных воздействий для инициации качественных изменений клеточных структур, являются ли начальные стадии различных видов адаптации повреждающими или они уже обладают защитным эффектом. Возможно ли одновременное увеличение резистентности и мощности ион-транспортирующих систем при адаптации к различным факторам среды и если нет, то чему отдается предпочтение в первую очередь.

Очень важным является вопрос о «цене» адаптации, которому посвящено весьма ограниченное количество работ, касающихся в основном адаптации к физическим нагрузкам. Показано, например, что при использовании слишком интенсивных физических нагрузок происходит снижение структурного резерва печени, почек и надпочечников [В1оог С. е! а1., 1968], нарушение функции органов пищеварения [БЬееЬап в., 1977], уменьшение иммунной реактивности организма [Суркина И.Д. и др., 1984, Аронов Г.Е. и др., 1985]. Важная проблема адаптации сердца к повреждающим воздействиям непосредственно связана с состоянием других органов и систем. В этом аспекте вопрос о «цене» адаптации к различным факторам среды остается открытым. Не ясно, всегда ли при адаптации происходят разнонаправленные изменения в различных органах и возможен ли такой режим адаптации, при котором отсутствуют отрицательные эффекты на отдельных органах.

Кроме того, вопрос о режиме адаптации требует дополнительной ясности, поскольку в литературе и в наших ранних работах было принято использовать такой режим адаптации, при котором происходили заметные количественные изменения внутриклеточных систем. Более того, ряд авторов считает, например, что проявление эффекта ПНЖК возможно только в случае значительного ускорения свободно-радикальных процессов, играющих сигнальную роль в активации эндогенных защитных систем клетки, а введение дополнительных антиоксидантов в диету препятствует проявлению такого защитного эффекта [Ни М.1_. е! а1., 1989; Мовсот С. е1 а1., 1984]. В этом отношении важно иметь в виду, что, как правило, речь в этих случаях идет об адаптационной защите миокарда, при этом не учитываются процессы, происходящие в других органах и тканях, которые не всегда могут быть положительными при дейст-

вии фактора большой интенсивности. Второе, что остается неучтенным - это адаптационная защита на уровне самих мембран, т.е. возможность качественного роста устойчивости к действию повреждающих факторов при отсутствии количественных изменений. Таким образом, важной нерешенной проблемой оставалось сравнение защитного эффекта принятых адаптационных моделей и более слабых воздействий, например, нормобарической гипоксии.

Наконец, несмотря на ряд работ по характеристике животных с различной резистентностью к повреждающим факторам [Лукьянова Л.Д., 1981, 1997; Бондаренко H.A. и др., 1985; Хачатурьян М.Л. и др., 1996;], остаются во многом неясными механизмы и пределы адаптируемости у этих групп животных.

Цель работы состояла в том, чтобы, во-первых, изучить возможность и особенности формирования адаптационной мембранной устойчивости к эндогенным повреждающим факторам и, во-вторых, сравнить пределы различных видов и режимов адаптации организма на уровне транспортирующей функции мембран и свободнора-дикальных процессов в различных органах и тканях.

В рамках этой общей цели решались следующие экспериментальные задачи:

1) Изучить мембранную адаптацию к физическим нагрузкам, стрессу и различным видам гипоксии на уровне ион-транспортирующих систем клетки - Ыа,К-АТФазы плазматической мембраны и Са-насоса саркоплазматического ретикулума, их устойчивость к повреждающему действию эндогенных факторов - активации ПОЛ, автоли-тическому повреждению, высокому уровню Са2+, термоинактивации.

2) Оценить степень повреждения Са-насоса CP миокарда при стрессе, ишемии и реперфузии различной длительности, а также при острой физической нагрузке. Выявить характерные особенности тканей сердца, печени и мозга по соотношению в них активности про- и антиоксидантной систем при стрессорном воздействии различной длительности. Смоделировать стрессорное повреждение ионных насосов с помощью активации свободнорадикальных процессов in vitro.

3) Провести сравнительное изучение развития адаптационного защитного эффекта на Са-насос CP миокарда в динамике адаптации к стрессу и к физическим нагрузкам. Выявить особенности стадий срочной и долговременной адаптации при действии многократных сеансов стресса и физических нагрузок и показать общие закономерности формирования устойчивого мембранного адаптационного эффекта.

-104) Исследовать состояние ион-транспортирующих систем Ыа.К-АТФазы сарколеммы и Са-насоса СР при адаптации к стрессу и к гипоксии. Сравнить эффективность защиты этих транспортных систем от стресс-индуцированных повреждений с помощью такого рода адаптаций. Проверить возмож