Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Роль микросомального и митохондрального окисления в механизме стеатогенного действия тетрациклина

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАуК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГИИ

На правах рукописи

МАКАРЕНКО Татьяна Николаевна

РОЛЬ МИКРОСОМАЛЬНОГО И МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ В МЕХАНИЗМЕ СТЕАТОГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ ТЕТРАЦИКЛИНА

14.00.25 — фармакология 03.00.04 — биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1994

Работа выполнена в лаборатории биоэнергетики НИИ фармакологии Российской АМН (руководитель лаборатории — чл.-корр. Российской АМН, доктор биологических наук, профессор Л. Д.Лукьянова).

Научный руководитель:

член-корреспондент Российской АМН, доктор биологических наук, профессор Л. Д. Лукьянова

Официальные оппоненты:

член-корреспондент Российской АМН, доктор медицин-• ских наук Л. Ф. Панченко

доктор медицинских наук В. П. Жердев

Ведущая организация — Всероссийский научный центр по безопасности биологически активныхвеществ.

Защита состоится « ■»с&кЛ&еЬ^ 1994 года на заседании специализированного ученого совета Д 001.25.01 при НИИ фармакологии Российской АМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Ученой части НИИ фармакологии Российской АМН.

Автореферат разослан « » 1994 года.

СхУ

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

А. Н. Яворский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОКГО.Ы. Заболевания печени и желчевыводяших путей занимают во всем мире одно из первых мест ^о частоте встречаемости. Ведущей причиной развития гепатобилиарной патологии на современном этапе развития общества становится воздействие на печень токсических химических соединений. К их числу относятся вещества, загрязняющие окрутаюшую среду, пищевые добавки, моющие и косметические средства, а также лекарственные препараты. Опасность для здоровья и социальная значимость заболеваний печени токсической этиологии определяют необходимость углубленного изучения их патогенеза и разработки аффективных, патогенетически обоснованных методов фармакопрофилактики и терапии.

В последнее время значительно возросло число медикаментозных поражений печени, особенно в странах с высоким уровнем развития здравоохранения (H.Rubin 1980). Одним из первых проявлений токсического поражения печени является жировая дистрофия различной степени выраженности. Среди лекарственных препаратов, вызывающих даровой гепатоз, известны цитостатики, антидепрессанты, антиаритмические, гормональные средства и др. особое место в этой группе препаратов занимает тетрациклин, который, несмотря на выраженные стеатогенные свойства, продолжает использоваться в терапии (М. Д. Маяковский 1987).

Тригерные механизмы развития жирового гепатоза неизвестны, также как и способы защиты клетки при этой патологии (Ю. И. Губский 1972; Э. С. Горштейн и соавт. 1987). Однако, учитывая, что узловым юментом в патогенезе »правого гепатсза является нарушение баланса давду скоростью образования нейтральных триглицеридов и их катаболизмом (П. Мэйее 1993), т.е. реакциями, протекающими в разных ком-тартментах клеток печени, в том числе в митохондриях и шкросомах,-можно предпологать, что нарушения в этих системах могут играть определенную роль в развитии патологического процесса. Действительно, в литературе имеются указания на разобщающее процессы окислительного фосфорилирования действие тетрациклина (W. F. Loornis 1950; Г. Ю. Мальцев, М. Ф. Несгерин 1978). Данные же о состоянии монооксиге-назной системы при этой патологии противоречивы. С одноИ стороны описано угнетение, либо отсутствие изменений активности фермейтов

при жировом гепатозе (Е. Hagel et al., Н. П. Скакун, А. КОлейник 1984). С другой стороны ряд фармакологических препаратов, обладающих способностью индуцировать систему микроеомального окисления, успешно используют при лечении жировой дистрофии печени в клинике и эксперименте (А. Кирай ig84; А. И. Венгеровский 1991). Параллельное изучение функционального состояния этих субклеточных структур, позволяющее выявить характерные патогенетические особенности токсических поражений печени и определить тригерные механизмы развития жирового гепатоза, дало бы возможность теоретически обосновать принципы фармакологической коррекции этой патологии, основанные на возможности модуляции клеточного метаболизма

Вышеизложенное определило ЦЕЛЬ работы, которая состоит в установлении регуляторной роли митохондриального и микроеомального окисления в стеатогенном действии тетрациклина.

В соответствии с поставленной целью определены следующие

ЗАДАЧИ исследования:

1. Выбор и апробация модели экспериментального теграциклинового жирового гепатоза.

2. Исследование влияния тетрациклина гидрохлорида на функции митохондриальной и микросомальной систем печени.

3. Поиск биохимических предикторов стеагогенкого действия тетрациклина на печень.

4. Изучение влияния индукции монооксигеназной системы микросо мального окисления на развитие тетрацикддаового жирового гепатоза

НАУЧНАЯ НОВИЗНА исследования. Впервые проведено комплексное изучение функционально-метаболического состояния системы Оиотранс-формации печени и энергообравукдей системы митохондрий печени'крыс при остром тетрациклиновом жировом гепатозе. Установлено слабо* разобщающее действие тетрациклина на процессы окислительного фос-форилирования в митохондриях без достоверного влияния на их эффективность. При этом выявлено Са-зависимое снижение активности первого ферментного комплекса электронтранспортной цепи митохондрий, о чем свидетельствуют изменения редокс-цикла пирвдиннуклеотидо] при фосфорилировании АДФ, уменьшение степени восстановления пири-

диннуклеотидов при . окислении НАД-зависимых субстратов, снижение обратного переноса электронов при окислении с угадан ат а, а также более выраженное подавление Са-транспортной функции митохондрий при окислении глутамата с манатом.

Установлено сильное дозозависимое ингибирующее действие тетрациклина на ферменты кюнооксигеназной системы микросомального окисления, коррелирующее со степенью накопления общих липидов и триг-лицеридов в клетках печени и позволяющее рассматривать эту систему как одну из мишеней токсического эффекта данного антибиотика

Впервые проведенное исследование влияния индукции системы микросомального окисления на ее функциональное состояние, процессы окислительного фосфорилирования , состояние различных участков дыхательной цепи и лшидный обмен при тетрациклиновом жировом гепа-тозе показало, что в этих условиях сохраняется как стеатогенный эффект тетрациклина, так и его повреждающее действие на систему микросомального окисления. Однако а атом случае монооксигеназная система после ингибирукщего действия тетрациклина имеет более высокую функциональную активность сравнительно с неиндуцированныш животными.

Впервые проведена оценка и установлены различия биохимического статуса крови у животных с нормальной и индуцированной системой монооксигеназного окисления микросомальной системы при тетрациклиновом жировом гепатоэе.

НАУЧНО- ПРАКТИЧЕСКАЯ значимость работы. Сравнительный анализ различных функционально-метаболических параметров при тетрациклиновом жировом гепагозе позволил определить наиболее информативные предикторы этой патологии. Для ткани печени - это триацилглицериды и в меньшей степени общие липиды, для крови животных с нормальной исходной активностью монооксигеназной системы микросомального окисления - это содержание холестерина и коэффициент де Ритиса, для животных с предварительно индуцированной активностью этой системы - билирубин, отношение С билирубин] Л мочевая кислота1 и коэффициент де Ритиса

Доказано, что оценка влияния тетрациклинового жирового гепатоза на состояние проницаемости плазматических мембран, определяемая по активности трансаминаз, не является достаточно чувствительным тес-

том. Более информативным является коэффициент де Ритиса ([активность АсАТ] /[активность АлАТ]).

Выявлено, что предикторами исходной активности системы микросо-ыального окисления у животных с теграциклиновым жировым гепатозом являются содержание холестерина и отношение [содержание билирубина] Л содержание мочевой кислоты], определяемые в плазме крови.

Впервые показано, что при тетрациклиновом жировом гепатозе происходит значимое снижение активности монооксигенааной системы мик-росомального окисления у животных с различным исходным ее уровнем.

Установлено, что предварительная индукция системы микросомаль-нод'о окисления фенобарбиталом не может рассматриваться как способ, корригирующий интенсивность тетрациклинового жирового гепатоза и не может быть рекомендован для клинической практики.

Излученные данные обосновывают перспективность комплексного изучения функционального состояния митохондриальной и микросомаль-ной систем окисления печени при жировом гепатозе для понимания тонких механизмов этой патологии.

СВЯЗЬ ЗАДАЧ ИССЛЕДОВАНИЯ С ПРОБЛЕМНЫМ ПЛАНОМ МЕДИЦИНСКИХ НАУК.

Работа выполнена в рамках ГНТП "Создание лекарственных средств методами химического и биологического синтеза", направление 05 "Яармакокинетические и биофармацевгические принципы совершенствования лекарственных препаратов", тема "Создание новых лекарственных препаратов на основе изучения взаимодействия химической структуры, биотрансформации, фармакокинетики и фармакологической активности".

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты настоящего диссертационного исследования докладывались на Второй международной конференции " Биологические основы индивидуальной чувствительности к действию психотропных средств" (Москва, 1993), на Российской научной конференции " Антигипоксанты и актопрогекторы: итоги и перспективы" (Санкт -Петербург, 1994), а также апробированы на мемабораторном семинаре Института фармакологии Российской АМН 14 июня 1994. г.

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 3 работы и сдано в печать 3 статьи.- - . • - ; .

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация содержит следующие разделы : Введение, Обзор литературы, Материалы и методы исследо-

вания, Экспериментальная часть, состоящая из четырех глав, Общее заключение, Выводы и Библиографический указатель, включающий работы на русском (116) и иностранном (112) языках. Диссертация изломана на -/У,Гстр., иллюстрирована39 таблицами и<? рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили на беспородных крысах-самцах массой 250300 г , содержавшихся на стандартном рационе вивария.

В работе были использованы дье модели тетрациклинового жирового гепатоза:

1. внутрижелудочное (в/ж) введение в течение 5 дней 500 мг/кг раствора тетрациклина (ТЦ) ( Порохняк JL А. 1988) и

2. внутрибрюшинное (в/б) введение ТЦ в дозе 125 мг/кг на 24 ч до исследования.

Субклеточные фракции печени получали препаративным центрифугированием-. митохондрии (Мх) по методу Hogeboom J. Е. and al. (1948) и микросомы по методу (К И. Карузина.А. И. Арчаков 1977).

Индукцию системы монооксигеназ проводили с помощью фенобарбитала ( в/б введение в дозе 80 мг/кг в течение 5 дней).

Получение дивотных с различной чувствительностью к гипоксии проводили по методу, принятому в нашей лаборатории (Г. R Чернобае-ва, JL Д. Лукьянова 1989).

Изучение функционального состояния Мх проводили полярографические Chance В., Williams , G.R. 1956); исследование окислительно-восстановительных превращений дыхательных переносчиков в Мх -фдуориметрическим методом (Карнаухов ЕЕ 1978).

Разность потенциалов на Мх мембране определяли потенциометри-ческим методом с помощью ионселективного электрода (Kato N. et al. 1979) в модификации А. Т. У го лева (1986).

Измерение Са - потоков проводили с помощь» ион-селективного Са-злектрода фирмы "Нико" (Carafoli E.J. 1988).

Степень развития жирового гепатоза оценивали морфологически и биохимически. Морфологические исследования проводили с полюдью красителя Fet rot; степень развития мирового гепатоза оценивали визуально по объему жира в гепатоцитах и выражали в условных единицах (Меркулов Г.А. 1959). Биохимические исследования проводили в

гомогенате печени с помощью стандартных наборов "LaChema" ЧЗФР. Содержание общих липидов (Chromy V. et al. 1975) и триацилглицери-дов (Chromy V. et al. 1977) оценивали спектрофотометрически.

Биохимические исследования проводили на изолированных микросомах И fife, гомогенате печени (1:10 на физиологическом растворе) и плазме крови.

Активность аланинаминотрансфераэы определяли в плазме крови и гомогенате печени (Bergmeyer H.U. 1974).

Содержание цитохрома Р-450 определяли в гомогенате печени и в микросомах печени (Jones D. Р. et al., 1980).

Содержание цитохрома Ь5 определяли в шкроеомах печени (Оти-га Т., Sato R. 1964).

В микросомах печени определяли активности ферментов анилингид-роксилазы (И. К Карузина, А. И. Арчаков 1977), р-нитроанизол-0-демети-лазы (К. J. Netter 1964), аминопириндеметилааы (И. И.Карузина, А. И. Арчаков 1977).

Содержание Мх цитохромов b, c+cj и а определяли в гомогенате печени (МоховаЕ.а, Жигачева И.Е 1977).

Содержание АТФ в ткани печени определяли люциферин-люциферазным методом (Атауллаханов Ф. И:, Пичугин A.R 1981).

.Взаимодействие тетрациклина с микросомальным гемопротеином Р-450 исследовали по Remmer Н. et'al. (1966).

В плазме крови в одной пробе на центрифужном спектрофотометри-ческом анализаторе "Centrifichem - 600" фирмы " Baker" (США) с помощью монотестов фирм "Baker", "ßoehrihg-er Mannheim" (ФРГ) и "Randox" (Сев.Ирл.) определяли содержание глюкозы (ммоль/л), кальция (ммоль/л), билирубина (мкмоль/л), мочевой кислоты (шмоль/л), холестерина (ммоль/л), триацилглицеридов (ммоль/л), общих белков (г/л) , альбуминов (г/л), активности ферментов (в международных единицах) сорбитдегидрогеназы, щелочной, фосфатазы, зспартаташяот-рансферазы и аданинаминотрансферааы.

Содержание белка в плазме крови, гомогенате печени, митохондриях и микросомах печени определяли микробиуретовым методов (Col owl ck. S. P., Nathan 0.- k. 1957).

Полученные результаты обрабатывали общепринятыми статистическими методами с использованием критерия Стыодента Экспериментальные данные, полученные при изучении показателей плазмы крови, обрабатывали методами параметричекой статистики на ЭВМ "Арр1е-2с".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение различных способов введения тетрациклина на функционально-метаболические параметры печени

Проведенные морфологические и биохимические исследования модели жирового гепатоза, вызываемого внутрижелудочным (в/ж) пятидневным введением тетрациклина (ТЦ) показали отсутствие четкой зависимости накопления общих липидов от дозы и времени введения антибиотика. Эти данные совпадают с данными других авторов ( Навашин С. М. и др. 1977) о значительных индивидуальных колебаниях накопления липидов в печени при в/ж введении ТЦ, связанных с различной всасываемостью этого антибиотика из желудочно-кишечного тракта. Дозозави-симых изменений активности АлАТ, содержания цитохрома Р-450, мито-хондриальных цитохромов в, с+с{ и а также не выявлено. Таким образом, в/ж введение ТЦ не дает хорошей воспроизводимости результатов и не поаволяет выявлять дозозависимое влияние этого антибиотика на исследуемые параметры.

В отличие от этого, жировой гепатоа, вызываемый внутрибрюшинным (в/б) введением ТЦ, начиная с дозы 125 мг/кг, приводил через 24 ч к достоверному дозозависимому повышению в ткани печени уровня общих липидов и триацилглицеридов, а также к снижению содержания цитохрома Р-450 при относительно слабом нарушении проницаемости клеточных мембран (Рис.1). Полученные данные позволили обосновать правомочность быстрого, в течение 24 ч моделирования жирового гепатоза при в/б введении ТЦ в дозе 125 мг/кг и использовать в качестве его предикторов не только показатели липидного обмена (содержание обвдх липидов и триацилглицеридов), но и состояние системы микросомального окисления (содержание ■ цитохрома Р-450), Биохимические анализы крови показали, что предикторами развития жирового гепатоза в выбранных условиях являются также содержание холестерина и коэффициент де Ритиса

Изменения активности трансаминаз в крови, определение которых тра-, диционно используется для оценки проницаемости клеточных меибр&н, не являются виачимыми для этой модели.

Введение ТЦ выбранным способом вызывает снижение коэффициента Свес тимуса]/Свес надпочечников], свидетельствующее о развитии

S42X

2202

п

1 2

3 ¿ï 5

ЮО^

РИС.,1. Влияние внутрибрюшинного введения тетрациклина гидрохлорида (125 мг/кг, 24 ч) на некоторые биохимические показатели в гомогенате печени и плазме крови

1 - содержание обших липидов в гомогенате печени

2 - содержание триацилглицеридов в гомогенате печени

3 - активность аланинаминотрансферазы в плазме крови "

4 - активность аланинаминотрансферазы в ткани печени

5 - содержание цитохроыа Р-450 в гомогенате печени

у животных стресс-реакции, которая рассматривается в качестве возможной патогенетической причины развития жирового гепатоза.

Использование такой модели позволяет проводить исследования с минимальными затратами экспериментального материала.

. Изучение влияния тетрациклина на состояние дыхательной цепи митохондрий печени крыс

Введение животным ТЦ (125 мг/кг, в/б), приводящее через 24 ч к развитию жирового гепатоза, не вызывало значимых нарушений процессов окислительного фосфорилирования в Мх печени (Рис.2). Наблюдалась лишь тенденция к увеличению ионной проводимости Мх мембраны и 'снижению сопряженности процессов дыхания и фосфорилирования, которые проявлялись как при окислении сукцината ( Сц), так и глутамата + малат (Гл+М) (недостоверное увеличение V2 , V4 , снижение значений ДКл и ДКч). Об этом же свидетельствует и уменьшение ветчины трансмембранного потенциала Мх печени (4 V ) в различных метаболических состояниях у крыс с тетрациклиновым гепатозом. Тем не менее, эффективность работы Мх дыхательной цепи, оцениваемая•по величине Отношения АДФ/О, не менялась (Рис.2).

В то же время при изучении действия более высоких доз ТЦ, вводимого крысам в/б, на параметры окислительного фосфорилирования Мх ■печени (160, 250 и 330 мг/ кг), были выявлены его разобщающие эффекты, нарастающие с увеличением дозы препарата и максимально выраженные при введении крысам ТЦ в дозе 330 мг/кг. Скорость фосфорилирования АДФ снижалась при этом на 40 X ; значения дыхательных контролей - более чем на 70% ; 2,4-ДНФ уже не оказывал разобщающего действия (Рис.2). Кроме того, на всех субстратах окисления уменьшался вклад переносчика аденинцуклеотидов в регуляцию дыхания митохондрий, оцениваемый о помощью его специфического ингибитора -карбоксиатрактилозида (6-10"6 Ы). Разобщающее действие ТЦ на окислительное фосфорилирование сохранялось в условиях in vitro при прямом его добавлении к изолированным иктактным Мх. Оно одинаково проявлялось как на сукцинате, так и на НАД-зависимых субстратах. .

В Мх печени крыс, с тетрациюшновым жировым гепатозом исходный уровень восстановленности пиридиннуклеотидов (ПНН) был в 2-3 раза выше, чем у контрольных животных, что могло Сыть результатом обра-

tJ2?í

♦ ив*

10 *í

US*

ТЦ, (мг/кг") 12.5

1ВО

250

•ЗЗО

. РИС.2. Действие различных доз тетрациклина на парциальные параметры дыхания в митохондриях печени крыс, окисляющих глутамат с малатом (4мМ + 1 мМ) (А) или сукцинат (5 мМ) (Б) (в процентах к контролю, 100 X для всех исследуемых параметров обведены окружностью).

1 - V- ; г - V» ; 3 - У. ; 4 - Уднф; 5 - АДФ/0; 6 - ДКЛ; 7 - ДКЧ; 8 - Уф; 9 - Ьф

зования в Мх флуоресцирующего Са-ТЦ комплекса. Реакция Мх на добавку НАД-зависимых субстратов, оцениваемая по уровню восстанов-ленности ИНН, была снижена Уменьшение восстановленное™ ПНН при окислении Мх сукцината свидетельствовало об угнетении энергозависимого процесса обратного переноса электронов. Уменьшалась амплитуда редокс-цикла ПНН, наблюдаемая при фосфорилировании экзогенного АДФ.

Исследование Са-аккумулирующей способности Мх печени крыс с инициированным ТЦ жировым гепатозом (в/б, 125 мг/кг, 24 ч) показало, что она была подавлена При этом снижалась как скорость элекг-рофоретически регулируемого энергозависимого поглощения Ca и сопряженного с ним дыхания, так и,особенно, выброс Ca из. Мх, связанный с работой электронейтрального Na/Ca переносчика (Табл. 1). Изменения были выражены сильнее при окислении НАД-зависимых субстратов. Нарушения Са-транспортной функции Мх в условиях нашего эксперимента, видимо, связаны с образованием и накоплением Са-ТЦ комплекса в Мх мембране, приводящим к изменению ее состояния и, в связи с этим, к подавлению подвижности Na/Ca переносчика

Таким образом, выявленное нами разобщающее действие ТЦ на окислительное фосфорилирование, могло быть обусловлено образованием Ca -ТЦ комплекса Полученные в разделе данные свидетельствуют о прямом влиянии ТЦ на состояние Мх окисления и возможность регулятор-ного включения последнего в патогенез жирового гепатоза

Действие.тетрациклина на состояние монооксигеназной системы микросомального окисления. .

Дозозависимое снижение содержания цигохрома Р-450 под влиянием однократного введения ТЦ (в/б,125 мг/кг, 24 ч), являющееся по мнению ряда авторов следствием'^активации цитолитических процессов, установлено нами не только в гомогенате печени, но и в изолированной, микросомальной фракции (Рис.3). Наряду с этим в микросомальной фракции ( в отличие от гомогенага) происходило достоверное уменьшение содержания содержания цитохрома Ь5 и активностей анилингид-роксилазы, р-нитроанизолдеметилазы и аминопирин - N - деметилазы (Рис.3): Полученные данные позволяют предполагать непосредственное участие монооксигеназной системы микросомального окисления в меха-

л, . '■ Таблица 1.

Транспорт Са и сопряженное потребление в митохондриях" печёни крыс с тетрациклиновым жировым гепатозом

1 Условия 1 опыта Суммарное t Скорость i Скорость ! Скорость дыха-! Скорость дыха-! Молярное поглощение ¡поглощения ¡выхода Са^+,1ния при входе ¡ния при выходе!отношение Са2+ ,(мМ/мг1Саг+,(нк/с* 1 (нМ/с*мг Мх ¡Са2+,(нМ Q,/c*¡Са2+~,(нМ 0&/с*!Саг+: Мх белка) ! *мг Мх белка) I белка) ! * мг Мх белка)! *мг Мх белка) I Мэмбран- ' ный по- ! тенциал, ¡ (мВ) !

¡а) Контроль 93.44±19.011 8.11 ±1.32 1 7.32±1.21 I 2.07+0.23 ! 1.0910.41 ¡ 3.91 (100) ! (100) . 1 (100) ¡ (100) . ¡ (100) ¡ (100) 186. 2±7. 4! (100) !

1а) Тетра-1 циклин 63. 21*16.20! б. 62±1.03 (68) !• (69) 2.11+1.04 1 1.66+0.24 ! 0.76±0.18 1 3.39 ' (29) ¡ (80) ! (69) ¡ (87) 181. 0±2. 6! (97) !

!б) Контроль 139. 0±38. 2 ! 9. 43±1. 81 (100) 1 (100) 10.42+1.81 ¡ 1.45+0.25 (100) ¡ (100) 0.21+0.04 ! 6.50 (100) ! (100) 178. Ií2. 0! (100) !

! б) Тетра-1 циклин . 41.03±15.11l 2.13i0. 64 (30) . 1 (23) 1.61 ±0.44 ! 1. 55±0. 21 (15) ! (107) 0.26+0.02 ! 1.37 (124) ! (21) 170. 3+4. 7! (95) !

Примечание: в скобках указаны изменения в процентах. Субстрат окисления: а) - сукцинат; б) - глутамат+малат.

низме развития стеатоза. При исследовании прямого действия ТЦ на мжросомалъную фракцию печени установлено, что значимое снижение содержания цитохрома Р-450 наступало, начиная с концентрации ТЦ 10~4 м (Рис.4). При этом содержание цитохрома Р-420 не изменялось, т. е. деградации цитохрома Р-450 не происходило. Аналогичные результаты были получены при изучение анилингидроксилазной активности микросом'печени крыс в присутствии различных доз ТЦ. Таким образом, ТЦ оказывает прямое действие на систему микросомального окисления, .снижая содержание цитохрома Р-450 и активность анилин-гидроксилазы.

Установленные наш отсутствие изменений в содержании цитохрома Р-420 при введении нарастающих доз ТЦ в экспериментах in vitro и изменение спектра поглощения ГЦ в диапазоне волн л - 380-420 нм в присутствии микросом позволяет предположить возможность образования комплекса ТЦ с цитохромом Р-450.

Развитие жирового тетрациклинового гепатоза, в условиях предварительной индукции системы микросомального окисления фенобарбиталом

1

Учитывая, что в клинической и экспериментальной практике для лечения жирового гепатоза успешно используют препараты, индуцирук>-щие систему микросомального окисления, нами было исследовано действие предварительной индукции этой системы фенобарбиталом (ФБ) на развитие жирового тетрациклинового гепатоза

В отличие от действия ТЦ, в/б введение которого вызывало достоверное снижение весового коэффициента (ВК)' тимуса и повышение ВК надпочечников (Рис. 5) - свидетельство развития у животных стресс -реакции, пятидневное введение ФБ значимо не влияло на.ВК. Однако предварительное введение ФБ не -только не предотвращало изменения ВК под действием ТЦ, но даже увеличивало некоторые из них (Рис. 5). Таким образом, предварительная индукция микросомальной системы усиливала развитие стрессового состояния крыс, вызываемого введение ТЦ.

ФБ не вызывал значимых изменений биохимических показателей крови у животных. Однако при введении ТД на фоне ФБ, в отличие от действия одного ТЦ, предикторами жирового гепатоза являлись уже не

вз^ 1

РИС.3. Некоторые'показатели состояния монооксигеназной системы микросом при введений-'тетрациклина С в/б, 125 мг/кг „ 24 ч) (в X к контролю)

1 - содержание цитохрома Р-450

2 - содержаний цитохрома ЬБ

3 - активность анилингидроксилазн

4 - активность р-нигроаниэолдеметилазы • 5 - активнорть аминопириндеметилазы

40 о

80 60 40

го

цитохром

рА50е/.)

-11-

РИС. 4. Действие различных концентраций тетрациклина на содержание цитохрома Р-450 в микросомальной фракции печени крыс Ось абсцисс - отрицательный логарифм концентрации тетрациклина

Ось ординат - содержание цитохрома Р-450 (в % от исходного)

ВЕСОВЫЕ

КОЭФФИЦИЕНТЫ ■ 1

"'А А

лау.

ТЦ

ФБ

♦ »г,

пи*

ФБ + ТЦ

1 - вес печени

вес тела

2 - вес селезенки

вес тела

3 - вес тимуса

вес тела

4 - вес надпочечников

вес тела

5 - вес тимуса

вес надпочечников

ЛИПИДЫ

и>Х

а'/.

ТЦ

1:

ФБ

га/.

* «

Ю1;:

фв + та

общие липиды

триацилглицериды

. ФЕРМЕНТЫ / _ МИКРОСОШЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ- .. . •

> зиХ/1

ФБ + ТЦ

1 - содержание цитохрома Р-450

2 - содержание цитохрома

3 - активность_ анилингидроксилазы

4 - активность р-нитроанизол-деметилазы

5 - активность аминопириндеметилааы

РИС.5. Влияние фенобарбитала на различные функционально-металлические параметры при развитии тетрациклинового хярового гепатоза

только коэффициент де Ригиса, но и содержание содержание билирубина и отношение [содержание билирубина]/[содержание мочевой кислоты]. Дискриминантньй анализ показал, что такие биохимические показатели крови, как содержание холестерина и отношение [содержание билирубина]/[содержание мочевой кислоты], могут быть использованы в качестве предикторов исходной активности монооксигенааной системы крыс. У животных, которым вводили только ТЦ, содержание холестерина было значимо, а отношение [содержание билирубина)/[содержание мочевой кислоты! недостотоверно ниже контрольных значений. У животных, которым ТЦ вводили на фоне ФБ, содержание холестерина не отличалось, а отношение [содержание билирубина]/Ссодержание мочевой кислоту! было д.стоверно выше контрольных значений.

Введение крысам ФБ значимо не влияло на содержание обиих липи-дов в печени. Однако ФБ не предупреждал действие ТЦ на показатели липидного обмена. Следовательно, предварительное индуцирование системы микросомалького окисления не предотвращало стеатогенного эффекта тетрациклина.

Раздельные эффекты ФБ и ТЦ на ферменты микросомалького окисления были противоположными. Как уже было отмечено выше, ТЦ снижал содержание цитохрома Р-450 и подавлял активность анилингидроксила-зы, р-нитроанизодцеметилазы и аминопириндеметилазы. ФБ увеличивал все.эти показатели (Рис.5). Содержание цитохрома Р-450 было увеличен^ на 165%. Активности других исследуемых ферментов монооксиге-назной системы были выше контрольных значений, однако достоверным было повышение активности только р-нитроанизолдеметилазы. ■

При введении ТЦ на фоке ФВ имел место аддитивный эффект: стимулирующее действие ФБ на ферменты мокооксигеназной системы микросомалького окисления уменьшалось, как и ингибирующее действие ТЦ. В результате их содержание и активности, значимо не отличались от контроля (Рис. 5).

Таким образом, индукция мокооксигеназной системы микросомалького окисления фенобарбиталом не предотвращала развитие тетрациклине вог о жирового гепатоза по показателям липидного. обмена, усиливала стрессовое состояние животных, но снимала ингибирующее действие ТЦ на ферменты мокооксигеназной системы. Следовательно, низкая или высокая активность ферментов микросомального окисления, сама по себе не является ведущим компонентом патогенетического механизма

А- ■

ту. ег/. •

В

ТЦ.

■м Ха2

<}Б

ФБ 4.

I

РИС. 6. Действие тетрациклина при предварительной индукции монооксигеназной системы на параметры окислительного фосфоршшрования митохондрий печени крыс, окисляющих глутамат с малатом ( 4 мМ + 1 мМ ) (А) или сукцинат ( 5 мМ) (Б) ( в X к контролю, 100 % для всех исследуемых параметров обведены окружностью).

1 - Чг ; 2 - У3 ; 3 - У^ ; 4 - \дкф; 5 - АДФ/О; б - ДРл; 7 - ДКч; 8 - Уф; 9 - 1ф

развития жирового тепатоза. Однако, существенную роль в развитии этой патологии может играть снижение активности системы моноокси-геназ, независимо от исходного ее уровня.

Пятидневное введение ФБ приводило к резкому снижению скоростей потребления кислорода Мх печени в рааличных метаболических состояниях по Чансу (Рис.6). Так, при окислении митохондриями индуцированных ФБ крыс НАД-зависимых субстратов Уг ,У3 , У4 .V днф, а также скорость фосфорилирования АДФ уменьшались сравнительно с контролем на 40-50 в 1,6 раза возрастало 1ф. Тем не менее, эффективность работы дыхательной цепи, оцениваемая по величине отношения АДФ/0,. оставалась неизменной; а значения дыхательных контролей по Ларди и'.Чансу, ^растеризующих степень сопряженности процессов окислительного фосфорилирования в Мх, даже увеличивались ( на 27 и 15 % соответственно). Аналогичные, но более выраженные, изменения наблюдались в этом случае при окислении Мх сукцината. Эффективность ж работы дыхательной цепи и сопряженность процессов дыхания и фосфорилирования оставались такими же, как и в контроле. Низкие значения параметров окислительного фосфорилирования при индукции микросомального окисления связаны скорее всего не с нарушением электронтранспортной функции дыхательной цепи, а с уменьшением потока восстановительных эквивалентов, окисляемых ею.

Эти эффекты ФБ полностью исчезали при введении ТЦ, не защищая Мх ог разобщающего действия антибиотика Т. б; ТЦ как на фоне ФБ, так и без него, практически в одинаковой степени влиял на Ых печени, слегка, снижая их фосфорилируквдую способность. Более того, в этом случае не столько ФБ трансформировал влияние ТЦ на параметры окислительного фосфорилирования, сколько ТЦ препятствовал их изменению под влиянием ФБ. " <

Пэлученнге в данном разделе результаты свидетельствуют о том, что применение при тетрациклиновом жировом гепатозе индукции системы микросомального . окисления в качестве превентивного способа, влияющего на липидный обмен, не является эффективным.

1. Изучение двух различных способов формирования тетрациклино-вого жирового гепатоза у крыс позволяет считать методически

более обоснованным использование для этих целей внутрибрю-шинного введения тетрациклина, которое в течение 24 ч приводит к дозозависимому достоверному увеличению содержания общих липидов и триацилглицеридов в печени.

2. Тетрациклин гидрохлорид, введенный внутрибршинно; вызывает значимое снижение коэффициента Свес тимуса]/Свес надпочечников] , свидетельствующего о возникновении стрессового состояния у животных.

3. Специфическими предикторами тетрациклинового гепатоза является содержание общих липидов и триацилглицеридов в ткани печени и некоторые биохимические показатели крови: .содержание холестерина и коэффициент де Ритиса у животных с нормальной исходной активностью системы микросомалъного окисления-, коэффициент де Ритиса, содержание' билирубина и отнойе-. ние [билирубин] /Смочевая кислота! у животных с . предварительно индуцированной активностью монооксигеназ. Предикторами исходной активности монооксигеназной системы микросомаль-ного окисления у животных с тетрациклиновым жировым гепато-зом являются содержание холестерина и отношение С содержание билирубина /С содержание мочевой кислоты] в плазме крови.

4. Тетрациклин гидрохлорид при в/б введении и в условиях in vitro значимо не влияет на эффективность окислительного фос-форилирования в печени, но оказывает недостоверное дозозави-

• симое разобщающее действие на эти процессы, вызывает Са-зависимое снижнение активности 1-го ферментного комплекса митохондрий, подавляя их Са-транспортную, функцию и уменьшая вклад переносчика адениннуклеотидов в регуляцйо дыхания .митохондрий.

5. Тетрациклин гидрохлорид, не влияя на содержание цитохрома Р-420, ингибирует активность-монооксигеназной системы микро-сом.1Льного окисления печени, значимо сникая содержание цито-хромов Р-450, Ъ 5 и активности анилингидроксилазы, р-нитро-анизолдеметилазы, аминопириндеметилазы. Описанные эффекты являются дозоэависимыми.

6. Предварительная активация системы микросомального окисления фенобарбиталом не предупреждает развития жирового гепатоза, вызываемого тетрациклином, и усиливает стрессовое состояние животных.

7. Предварительная активация монооксигеназной системы не предохраняет ферменты микросомального окисления от ингибирующе-го действия тетрациклина, однако способствует сохранению ее более высокой функциональной активности сравнительно с невд-дуцированными животными.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Изучение содержания митохондриальных и микросомных цпгохро-шв в ткани печени при экспериментальном лекарственном жировом гепатозе. Бюлл. зксперим. биол. и мед. 1992 г, N. 12, с. (Соавт. А, М. Ггдченко, JL Д. Лукьянова).

2. Fatty hepatosis in random-bred mice differing in acetylation phenotype. Abstracts Second International Conference Biological Basis of Individual Sensitivity to Psychotropic Drugs. 22-26 May 1993, Moscow, 1993, p. S5. ( Coaut. T. G, Khlopushina, A. M. Dudchenko, L. B. Pyrogova).

3. Состояние систем биологического окисления при лекарственном гепатозе. Материалы Российской научной конференции " Антиги-поксанты и актопротекторы: итоги и перспективы" 1-3 марта 1994 г..,-Санкт-Петербург, 1994, в. 4, с. 261. (Соавт. Черноба-ева Г. Н. .Дудченко А. Ы., Лукьянова Л.Д.).

Оценка состояния систем микросомального и митохондриального окисления .в ткани печени крыс при .тетрациклиновом гепатозе. Бюлл. эксперта! .биол. и мед. 1994 г., NX 12 (Соавт. Г;ЕЧерно-баева, Л Д. .^.сьянова)'

5. Разработка модели острого тетрациклинового гепатоза у крыс и получение его динамических предикторов. Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1994 г., N% 12 (Соавт. Дудченко А.Ы., Л.Д.Лукьянова)

МП «Пега»