Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Роль матриксных металлопротеиназ 2 и 9 в патогенезе экспериментального синдрома острого повреждения легких

На правах рукописи

Сепп Андрей Валентинович

РОЛЬ МАТРИКСНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ 2 И 9 В ПАТОГЕНЕЗЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО СИНДРОМА ОСТРОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ЛЕГКИХ

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

11 МАР 2015

Чита-2015

005560460

005560460

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Читинская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Цыбиков Намжил Нанзатович Официальные оппоненты:

Аитов Курбан Аитович - доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Иркутский государственный медицинский университет" Министерства образования и науки Российской Федерации, профессор кафедры инфекционных болезней.

Гергесова Екатерина Евгеньевна - кандидат медицинских наук, государственное учреждение здравоохранения "Краевой детский консультативно-диагностический центр" Министерства здравоохранения Забайкальского края, врач клинической лабораторной диагностики.

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова" Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Москва.

Защита состоится " 17 " апреля 2015 года в _на заседании

диссертационного совета Д 208.118.01 при ГБОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации (672000, г. Чита, ул. Горького, 39 а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации (672090, г. Чита, ул. Горького, 39а) и на сайте: http:/ /chitgma.ru/nauka/zashchita-dissertatsij?task=item. view&id=17

Автореферат разослан_

дата

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.118.01 д.м.н., профессор

И.Н. Гаймоленко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Синдром острого повреждеш1я легких (ОПЛ) и его наиболее тяжелая форма - острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) являются частым компонентом синдрома полиорганной недостаточности, развивающиеся у больных в критических состояниях. Исследования последних лет по изучению ОПЛ/ ОРДС выявили рост его частоты с 1,5 до 75 случаев на 100000 населения в год, причем в 40-60% случаев он приводил к летальному исходу. Предполагается, что частота ОПЛУОРДС будет повышаться и далее (Согласительная конференция Американо-Европейской конференции по ARDS (США, 1994; 2003); протокол X Съезда анестезиологов и реаниматологов РФ (2006)). Это связывают, прежде всего, с увеличением числа пациентов, перенесших не только агонию и клиническую смерть, но и тяжелые стадии шока различной этиологии, обширные хирургические вмешательства с применением искусственного кровообращения, а также с развитием новых технологий протезирования органов, трансплантологии. В настоящее время в пульмонологии, ОПЛ/ОРДС, как и рак легких, считается наиболее частой причиной смерти (А.Г. Чучалин, 2010).

Степень разработанности темы.

Несмотря на интенсивное изучение ОПЛ/ОРДС в последние годы, механизмы легочного повреждения при нем изучены недостаточно, что, безусловно, отражается на диагностике этого состояния (В. Л. Кассиль, М. А. Выжи-гина, C.B. Свиридов, 2007,2009; Б.Р. Гельфанд, 2010). В настоящее время ОПЛ/ ОРДС диагностируется на основании ряда клинических, лабораторных и инструментальных данных: острое начало, шкала J.F. Murray (учитывается рентгенографическая картина легких, степень гипоксемии, растяжимость легочной ткани), отсутствие признаков левопредсердной гипертензии и др. Однако такой подход не удовлетворяет тем фактам, что исследуются группы, гетерогенные по своему нозологическому составу Кроме того, оценка тяжести и прогноз возможны только при уже развившемся ОПЛ/ОРДС; чувствительных и специфичных предикторов развития этого состояния и его исходов не существует (В.Л. Кассиль, Б.Р. Гельфанд, 2007,2012; N.D. Ferguson, 2012).

Ключевым звеном развития ОПЛ/ОРДС является аккумуляция нейтрофи-лов в капиллярах и ткани легких, ведущих к их повреждению (А.П. Зильбер, 2007; В.Л. Кассиль, 2007). Не вызывает сомнения факт, что полиморфноядер-ные лейкоциты играют основную роль в повреждении альвеолярно-капилляр-ной мембраны при ОПЛ/ОРДС (А.Л. Черняев и др., 2005, 2007). Непосредственным же повреждающим "агентом" считаются активные формы кислорода, продукты перекисного окисления лнпндов, эластаза и другие протеазы, про-воспалительные цитохины. Но при этом не ясно, почему, несмотря па образование нейтрофильных агрегатов в легочных капиллярах при шоках и других со-

ч

стояниях, ОПЛЮРДС развивается далеко не во всех случаях (A.A. Суханов, 2006; В.Л. Кассиль, Б.Р. Гельфанд, 2007; A.A. Фурсов, 2008; Я.Н. Шойхег, 2010; В. Б. Беоюбородов, 2010; В.В. Мороз, 2010; A. Dushianthan, 2010; V.M. Ranieri и др., 2012).

В последние годы пристальное внимание обращено на изучение семейства матриксных металлопротеиназ. Они играют важную роль как в физиологических процессах (эмбриональное развитие, морфогенез, репродукция, ре-моделирование тканей), а также при патологии: злокачественном росте, сердечнососудистых заболеваниях. На наш взгляд существует возможность их участия в механизмах повреждения и репарации альвеолярно-капиллярной мембраны при ОПЛ/ОРДС, но более объективную информацию о роли про-теаз можно получить, изучая изменения их содержания не только в системном кровотоке, но и в Б АЛЖ, а также непосредственно в ткани легких.

В связи с этим нами была предложена гипотеза о возможности экспериментального моделирования синдрома путем создания высокой концентрации биологически активных веществ нейтрофилов в альвеолах.

Цель исследования: Оценить роль матриксных металлопротеиназ 2, 9 и ингибитора матриксной металлопротеиназы 2 в развитии острого респираторного дистресс-синдрома в эксперименте. Задачи исследования:

1. Создать экспериментальную модель острого респираторного дистресс-синдрома вследствие прямого альтерирующего воздействия на орган.

2. Изучить морфологию поражения легких при экспериментальном остром повреждении легких и сопоставить патоморфологические особенности поражения с изменениями у бальных тяжелыми формами гриппа A/H1N1 развившихся во время эпидемии в 2009-2010 гг. в Забайкальском крае.

3. Определить соотношение металлопротеиназ 2, 9 и ингибитора металлопротеиназы 2 в плазме, БАЛЖ и тканях легкого при экспериментальном остром респираторном дистресс-синдроме.

4. Оценить характер корреляционных взаимоотношений между содержанием металлопротеиназ 2, 9, ингибитора металлопротеинаы 2 и поражения аэрогематического барьера.

Научная новизна исследования

Предложен способ экспериментального моделирования этой патологии легкого (Патент РФ № 2456677, МПК G09B 23/28) путем создания высокой концентрации биологически активных веществ полиморфно-ядерных лейкоцитов в альвеолах, для изучения патогенеза, патоморфоза, разработки способов диагностики, лечения и профилактики ОПЛ. Впервые на оригинальной экспериментальной модели продемонстрирована возможность развития ОПЛ посредством повреждения аэрогематического барьера биологически активными веществами нейтрофилов со стороны альвеол.

Впервые исследован уровень синтеза матриксных металлопротеиназ 2 и 9, их ингибитора в клетках ткани легкого (альвеол оцитах, фибробластах, тканевых макрофагах), а так же эндотелиальных клетках и нейтрофилах, и сопоставлен с динамикой этих соединений в биологических жидкостях - плазме крови и БАЛЖ при экспериментальном ОПЛ.

Во всех клинических наблюдениях погибших от гриппа во время эпидемии в 2009-2010 гг. в Забайкальском крае выявлены разной степени выраженности патоморфологические маркеры синдрома острого повреждения легких.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты исследования дополняют информацию по патогенетическим механизмам синдрома острого повреждения легких, демонстрируя роль матриксной металлопротеиназы 2 и 9, ингибитора матриксной метал-лопротеиназы 2. В ходе работы была создана простая и хорошо воспроизводимая модель, которая позволяет изучить интимные механизмы патогенеза и патоморфоза ОПЛ/ОРДС, проводить поиск и разработку диагностических маркеров и критериев, разрабатывать новые способы профилактики и лечения этого синдрома.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный способ моделирования синдрома острого повреждения легких адекватно отражает морфо-функциональные Сдвиги в легочной Ткани экспериментальных животных вследствие альтерации альвеолярно-капил-лярной мембраны аэрогематического барьера.

2. Особенностью поражения легких при гриппе А(Н1К1) являлось развитие у больных диффузного альвеолярного повреждения, с признаками ДВС-синдрома и выраженного некардиогенного отека легких, что сопоставимо с разработанной экспериментальной моделью синдрома острого повреждения легких.

3. Динамика изменения концентрации матриксных металлопротеиназ 2 и 9, ингибитора матриксной металлопротеиназы 2 в периферической крови и БАЛЖ отражает стадийность развития острого повреждения легких в эксперименте.

4. При развитии экспериментального острого повреждения легких, основными продуцентами матриксных металлопротеиназ 2 и 9 в легочной паренхиме являются нейтрофилы, фибробласты, эндотелий и макрофаги, а их концентрация зависит от стадии патологического процесса.

Внедренне результатов исследования в практику

Полученные в процессе исследований результаты внедрены в учебный процесс (на практических занятиях и лекциях) на кафедрах патологической физиологии и патологической анатомии ГБОУ ВПО ЧГМА.

Результаты исследований легли в основу изобретения "Способ моделирования острого повреждения легкого", защищенного патентом РФ № 2456677.

Апробация работы

Основные положения работы доложены на IV Съезде врачей-пульмонологов Сибири и Дальнего Востока (Благовещенск, 2011), на международной научной конференции "Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины" (Таиланд, Паттайя, 2012), на IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Вопросы патогенеза типовых патологических процессов" (Новосибирск, 2012), на межрегиональной научно-практической конференции с международным участием "Болезни органов дыхания: от ребенка к взрослому" (Чита, 2012), на VII Сибирском съезде физиологов с международным участием (Красноярск, 2012), на 14-й Всероссийской конференции с международным участием "Жизнеобеспечение при критических состояниях" (Москва, 2012).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 работ: из них 5 статей в изданиях, определенных ВАК для публикации результатов диссертационных исследований; патент Российской Федерации; коллективная монография издательства "Наука" г. Новосибирск.

Структура и объем диссертации

Диссертация написана на русском языке, изложена на 169 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и списка литературы: 193 отечественных и 226 иностранных источников; иллюстрирована 37 таблицами и 27 рисунками, включающими макро- и микрофотографии.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Экспериментальное исследование проводилось на нелинейных крысах, в соответствии с требованиями "Европейской конвенции о защите позвоночных животных используемых в исследовательских и других научных целях" (Strasburg, 1986). Исследование одобрено Локальным этическим комитетом ГБОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия" (протокол №6, от09.02.2010).

Всего в работе использовано 319 животных и секционный материал 35 умерших больных гриппом A/H1N1 во время эпидемии в Забайкальском крае в 2009/2010 гг. Использовались половозрелые крысы-самцы, массой 150-160 грамм. Животные получали стандартное питание (ГОСТ Р 5025892). Умерщвление крыс проводили путем передозировки золетила. Объектами изучения служили плазма, бронхо-альвеолярная лаважная жидкость (БАЛЖ), ткани легких животных, ткани легких больных гриппом.

Приготовление лизата нейтрофилов крысы

Клетки выделяли из крови на ступенчатом градиенте плотности фиколл-верографина: 1,13/1,12/1,06 г/мл по стацдартной методике. Чистота фракции

нейтрофилов - 92-94%. Выделенные гранулоциты разделяли на аликвшы по 50±5 тысяч клегок в 0,15 - 0,20 мл физиологического раствора и путем замораживания-оттаивания из них получали лизаты.

Приготовление лпзата фнбробластов крысы

Эмбриональные фибробласты животных (из 7-10 дневных фетусов) культивировали по стандартной методике: на среде Игла MEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 50 мкг/мл пенициллина, 50 мкг/ мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина. Использовалась культура 3-го пассажа, которая разделялась на аликвоты по 50±5 тысяч клеток в 0,15 - 0,20 мл жидкости. Лизат клеток также получали путем замораживания-оттаивания.

Методы определение концентрации исследуемых веществ в биожидкостях подопытных животных

Уровень искомых веществ в биожидкостях (плазме крови, БАЛЖ) определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа коммерческими наборами для определения концентрации матриксных метаплопротеиназ 2 и 9, ингибитора матриксной металлопротеиназы 2 (Quantikine, США).

Методы гистологической подготовки аутопенйного (человеческого и животного) материала для микроморфологического исследования

Отобранные фрагменты легочной ткани размером не более чем 1,0*1,0*0,5-1,5*1,5*0,5 см подвергались процедуре фиксации в растворе 10%-ного нейтрального формалина в течение 24-х часов, при комнатной температуре. После материал промывался в течение 1,5 часов в проточной воде. В дальнейшем достигалось обезвоживание тканей путем проведения ее через растворы этилового спирта возрастающей крепости - от 50% до 100%. Экспозиция в первых 5-и растворах достигала 3-х часов; в последних 2-х растворах 96% и абсолютного спирга - по 12 часов. После химического уплот нения путем инфильтрации и заливки в парафин, формировались в стандартные гистологические блоки. Изготовлялись срезы толщиной 4-5 мкм. Препараты окрашивали гистологическими краапелями производства Bio-Optica (Bio-Optica, Италия) - гематоксилином и эозином, и пикрофуксином по Ван-Ризону

Методы определения экспрессии веществ клетками легких иодопы г-ныхживотных методом нммунофепотипирования in situ

Уровень локального синтеза веществ клетками легких определяли путем иммунофенотипирования на парафиновых срезах легочной паренхимы био-тин-стрепгавидиновым иммунопероксидазным методом коммерческими наборами (табл. 1). Для демаскировки антигенов проводили двукратную обработку срезов в микроволновом режиме при мощности 650 Вт в течение 15 мин в цитратном буфере с рН6,0 ("Dako", Дания). Хромоген систем визуализации - 3,3-диаминобензидина тетрахлорид. Дополнителыгую окраску производили гематоксилином Гаррисона. Использовались отрицательные (без первичных антител) и положительные (ткани плаценты человека) контроли.

Таблица 1

Ииммуногистохимическое исследования антигенов

Антиген Первичные антитела Вторичные антитела и система визуализации Положительны й контроль

Матриксная метало-протеи-наза-2 (ММР-2) мышиные моноклоиаль-ные к ММР-2 человека и крысы, клоп 8В4, 'Santa Спе bbíechnotogy" (С1Ш) анти-мьпшные в составе системы ABS Staining System ("Santa Cruz biotechnology", CM) фрагмент тканей плаценты

Матриксная мстало-протеи-наза-9 (ММР-9) юзьи поликлональные к ММР-9 человека и шысы, клон С20, "Santa Спе bfotechnobgy" (CUR) анти-гозьи в составе системы ABS Staining System ("Santa Cruz biotechnology", CUR) фрагмент тканей плаценты

Ингибитор матрикеных метало-протеи-наз (TIMP) мьшиные моноклональ-ные к "ПМР человека и крысы, клон ЗА4, "Saría Cruz biotechnology" (СШ\) анта-мышиные в составе системы ABS Staining System ("Santa Cruz biotechnology", США) фрагмент тканей плаценты

Величину экспрессии искомого антигена в срезе для всех продуцирующих клеток определяли раздельно: при увеличении х400 производился подсчет не менее 100 целевых клеточных элементов в 10 случайно выбранных полях зрения. Количественную оценку экспрессии проводили в баллах: отрицательный уровень - если позитивных клеток было менее 10% в поле зрения; 1 балл - при наличии 10-25% клеток; 2 балла - 25-50% клеток; 3 балла - 50-75% клеток; 4 балла - в случае окрашивания более 75% клеток.

Моделирование синдрома острого повреждения легких

ОПЛ воспроизводили оригинальным способом (патент на изобретение РФ № 2456677 "Способ моделирования острого повреждения легких").

При разработке модели использовали следующие группы животных: Опытная группа (п=130) - крысы, которым однократно эндотрахеально вводился лизат 45-55 тысяч крысиных нейтрофилов в 0,15-0,20 мл физиологического раствора. В 1-ю контрольную группу (п~35) вошли грызуны, которым идентичным способом вводили лизат 45-55 тысяч крысиных фибробластов. 2-ю контрольную группу (п=35) составили животные, которым в трахею вводили стерильный физиологический раствор в эквивалентном объеме. Животных выводили из эксперимента через 12, 24 часа и на 3, 4, 5, 6, 7 и 8 сутки после эндотрахеальных введений. Развитие ОПЛ в ответ на введение лизата нейтрофилов во всех случаях подтверждали гистологическим исследованием.

Изучение патогенеза острого респираторного дистресс-синдрома в эксперименте

В эксперименте задействовали 3 опытные и 3 контрольные группы животных, где в опыте воспроизводился ОПЛ путем эндограхеального введения лизата нейтрофилов:

Опытная группам 1 (п=25) - живсггныес 1 (экесуцатишюй) стадией ОПД выведешше го эксперимента через 24 часа после введения лизата.

Опытная группа № 2 (п=25) - животные со 2 (пролиферативной) фазой ОПЛ, выведенные из эксперимента на 3 сутки после введения лизата.

Опытная группа № 3 (п=24) - животные с 3 (фибротической) фазой ОПЛ, выведенные из эксперимента на 6 сутки после введения лизата.

Кошрсшьные группы, по 15 крыс в каждой, составили животные, которым эндотрахеально вводился стерильный 0,9% раствор хлорида натрия и были выведены из эксперимента через 24 часа (контрольная группа № 1), 3 суток (контрольная группаМ2) и б суток (контрольнаягруппа№3).

У животных и опытных, и контрольных групп после выведения из эксперимента одновременно забирали кровь и ткань легких, а также получали Б АЛЖ. Пробы крови извлекали путем пункции яремной вены. Бронхоальвеолярнуго жидкость получали путем лаважа дыхательных путей.

Статистические методы исследования

Статистический анализ результатов проводился с использованием программ BioStat, version 2009 for Windows, 5.8.4 (AnalystSoft Inc., США) и Cross Correlation Function (vl .0.8) in Free Statistics Software (vl. 1,23-r7) (Wessa P., США).

Количественные данные непрерывного типа представлены в виде медианы (Me) и ингерквартильного (25-й и 75-й перцентили) интервала. При сравнении нескольких независимых групп по одному признаку (множественном сравнении) использовался критерий Краскела-Уоллиса, далее, при наличии значимых различий, группы сопоставлялись попарно с использованием критерия Манна-Уитни. Так же определялась взаимные корреляционные функции для выборочных одномерных парных временных рядов, вычислялся интервал задержки.

Результаты иммуногистохимических методик, представлены в виде процента полей зрения с соответствующим уровнем экспрессии антигена по отношению к исследованному числу полей в срезе. При сравнении групп использовали критерий "/-квадрат Пирсона (у2), при необходимости вводилась поправка Йетса на непрерывность.

Вне зависимости от применяемого критерия, различия считали значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработан следующий способ воссоздания ОРДС: под местной анестезией 0,25% раствором новокаина проводили пункцию трахеи иглой "инсулинового" шприца между.3-4 кольцами с одновременным однократным введением шпата 455 5 тысяч крысиных нейгрофилов в 0,15-0,20 мл физиологического раствора. Попадание жидкости в бронхиальное дерево животных проверялось аускультахивно, что косвенно подтверждалось кратковременным апноэ и замедлением сердцебиения до 180-200 ударов в минуту в момент введения (при исходном 260-290).

В группе с вводимым лизатом нейтрофилов (опытной), развитие ОПЛ подтверждалось клинически: отмечалось беспокойство, нарастали признаки дыхательной недостаточности, регистрировался комплекс характерных аускультативных изменений (ослабление дыхания, появление влажных мелкопузырчатых хрипов по всем легочным полям).

У животных контрольных групп уже спустя 1 -2 часа, при клинической оценке состояния органов дыхания, каких-либо изменений не отмечалось.. Развитие ОРДС в опыте подтверждалось четкой гистологической картиной процесса.

При аутопсии животных контрольных групп состояние органов дыхания макроскопически соответствовало критериям нормы. В ходе гистологического исследования отмечались единичные девиации, частота встречаемости которых не имела статистической значимости.

Через 12 и 24 часа после введения лизата нейтрофилов у крыс макроскопически наблюдался резко выраженный отек легких: они выполняли практически все свободное пространство грудной клетки, не спадались, имели плотно-эластическую консистенцию, темно-красный цвет, с поверхности разрезов стекала отечная жидкость.

Гистологически уже через 12 часов выявлялись признаки 1 (экссудатив-ной, острой) стадии ОПЛ, которая характеризовалась проявлениями "острого неинфекционного диффузного десквамативно-макрофагального альвеолита", с накоплением в просвете альвеол преимущественно мононуклеарных клеток (с примесьЕО нейтрофилов и других клеточных элементов), десквамированных альвеолонитов, отечной жидкости. В просвете сосудов отмечались множественные нейтрофильно-лейкоцитарные стазы, причем не только в капиллярах межальвеолярных перегородок, но и в венах и венулах. Через 24 часа дополнительно наблюдались выход и накопление эритроцитов в просвете альвеол.

Для пролиферативной фазы, которая развивалась с 4-х по 6-е сутки от введения лизата нейтрофилов, были характерны: разрешение от отека, признаки миграции мононуклеарных клеток, пролиферации фибробластов и синтеза коллагена, а в ряде случаев - формирование гиалиновых мембранн.

Гистологические маркеры фибротической фазы ОПЛ отмечались в среднем через 7-8 суток от момента введения лизата и были преимущественно представлены увеличением объема соединительной ткани в ин-терстиции легких, изменениями в интиме артериол в виде гипертрофии мышечного слоя, иногда вплоть до их полной облитерации.

Необходимо отметить, что в разных фрагментах легочной паренхимы одного животного наблюдались изменения, соответствующие разным стадиям ОПЛ, т.е. морфологическая картина отличалась пестротой и поли-морфностью, что является патогномоничным признаком этого процесса.

Встречаемость патоморфологических маркеров ОРДС в опытной группе и девиаций в контроле представлены в таблице 2.

Воспроизводимость способа - 80% (104 случая из 130): процент гибели животных - 20 (26 животных из 130); пик - на 2-3 сутки сгг момента введения.

Таблица 2

Частота встречаемости морфологических критериев ОПЛЮРДС оригинальной модели

Структурный компонент легочной паренхимы Морфологические признаки ОПЛ Частота встречаемости признака абс. (%)

опытная группа (п=130) введение фнбро-бластов (п=35) Введение физ. раствора (п=35)

Микроцир-куняторное русло Полнокровие 121 (93%) 7 (21%) 4(11%)

Малокровие 116(89%) 2 (7%) 5 (14%)

Понтирование кровотока 102 (78,5%) 1 (3,5%) 0

Агрегаты форменных элементов крови 97 (75%) 3 (10%) 7(21%)

Тромбы 102 (78,5%) 2 (7%) 4(11%)

Нейтрофилля 125 (96,5%) 1 (3,5%) 1 (3,5%)

Мегакариоцитоз 102 (78,5%) 0 ••. 0

Альвеолы Дисателекгазы 112(86%) 5 (14%) 1 (3,5%)

Отек альвеолярный 121 (93%) 0 0

Кровоизлияния внугриальвеоляриые 107(82%) 5 (14%) 2 (7%)

Макрофаги 121 (93%) 6 (17%) 3(11%)

"Гиалиновые мембраны" 9 (7%) 0 0

Пролиферация эпителия 5 (4%) 0 0

Бронхиолы Слущишый эпителий 88 (68%) 0 1 (3,5%)

Катаральное воспаление 74(57%) 0 0

Строма Интерстицналшьш отек 121 (93%) 0 0

Кровоизлияния 42 (32%) 0 1 (3,5%)

Воспаление 88 (68%) 0 0

Фиброз 5 (4%) 0 0

Примечание: при сравнении по каждому из признаков опытной и контрольных групп р<0,001; при сравнении групп контроля р>0,05.

Морфологическая характеристика поражения дыхательной системы при гриппе А/НШ1

Макроскопически у всех исследованных умерших наблюдались стгек глотки, слизистой трахеи бронхов. На слизистой регистрировались множественные мелкоточечные очаговые и сливные кровоизлияния, придающие ей "пылающпй" вид. Легкие были резко увеличены в размерах, тяжелые, синюшно-красного цвета

с цианотичным оттенком и отпечатками ребер. У погибших на б сутки и позднее ткань легких приобретала "пестрый" вид за счет множественных очаговых кровоизлияний под плеврой. На разрезах паренхима была пестрая, резко отечная.

Таблица 3

Частота встречаемости морфологических критериев ОШ1/ОРДС

оригинальной модели

Структурный компонент легочной паренхимы Морфологические признаки ОПЛ Частота встречаемости признака абс. (%)

Паренхима легких экспериментальных животных опытная группа (п=130) Паренхима легких больных гриппом А(НШ1) <п=35)

Мн ¡фониркшя-торное русло Полнокровие 121 (93%) 31 (89%)

Малокровие 116(89%) 18 (51%)

Щнтирование кровоток! 102 (78,5%) 24 (69%)

Агрегаты форменных элементов крови 97 (75%) 34 (97%)

Тромбы 102 (78,5%) 35 (100%)

Нейтрофилия 125 (96,5%) 18 (51%)

Мегакариоцитоз 102 (78,5%) 14 (40%)

Альвеолы Дисателекгазы 112(86%) 31 (89%)

Отек альвеолярный 121 (93%) 30 (86%)

Кровоизлияния внутриальвеолярные 107 (82%) 29 (83%)

Макрофаги 121 (93%) 35 (100%)

"Гиалиновые мембраны" 9 (7%) 12 (34%)

Пролиферация эпителия 5 (4%) 19 (54%)

Бронхиолы Слувднный эпителий 88 (68%) 31 (89%)

Катаральное воспаление 74 (57%) 31 (89%)

Строма Иптерстациалънын сггек 121 (93%) 35 (100%)

Кровоизлияния 42 (32%) 35 (100%)

Воспаление 88 (68%) 35 (100%)

Фиброз 5 (4%) 14 (40%)

Примечание: при сравнении по каждому из признаков групп р£0,05, кроме дан' пых группы "Пролиферация эпителия" (р>0,05);

Микроскопические изменения в легких ум ерш их в экссудативную стадию (1-3-и сутки) в паренхиме органа развивался комплекс морфологических изменений в виде неравномерно выраженного острого диффузного десквамативно-макрофагального альвеолита, выраженного интерстициаль-ного и альвеолярного отека. На 5-7-е сутки от начала заболевания наблюдался эффект полимеризации и интроальвеолярного осаждения фибрина.

У больных с признаками пролиферативной фазы летальный исход наступал преимущественно на 9-11-е сутки заболевания. Помимо отека, у них отмечались: инфильтрация паренхимы нейтрофилами и макрофагами, одномоментные организация и лизис гиалиновых мембран. В просвете альвеол обнаруживались интроальвеолярные кровоизлияния, отечная жидкость, гиалиновые мембраны. По мере разрешения от отека и развития репаративных процессов, появлялись признаки дифференцировки больших альвеолоцигов в клетки 1-го типа.

В легочной умерших в фибротическую стадию ОПЛ (на 14-16-е сутки) наблюдались начавшиеся процессы фиброзирования с деформацией и нарушением архитектоники части ацинз'сов, формированием эмфизематозных зон, признаками модификации микроциркулярного русла, накоплением в интерстиции фибро- и миофибробластов. Воспалительный инфильтрат сокращался и приобретал лимфоцитарно-макрофагальный характер.

Все перечисленные изменения носили гетерогенный, но фазный характер, что является патогномоничным проявлением ОПЛ/ОРДС.

В таблице 3 приведены данные встречаемости патоморфологических маркеров ОПЛ/ОРДС в легких экспериментальных животных и умерших больных гриппом А(Н1М1), что отражает адекватность разработанной оригинальной модели.

Система ММР-2, -9 - Т1МР-2 при развитии экспериментального респираторного дистресс-синдрома

При воспроизведении ОРДС на животных стадийные изменения концентрации ММР-2 в плазме крови и БАЛЖ были однотипными. В 1 (экссудатив-ную) фазу содержание фермента в обеих биожидюсгях было значительно выше контроля, во 2 (пролиферативную) - сохранялось на таком же высоком уровне, а 3 (фибротическую) - снижалось до контрольных значений (табл. 4).

Таблица 4

Концентрация ММР-2 в биожидкостях крысы приэкспериментальном ОРДС (Ме (25-й; 75-й))

Биожидкость Контрольная группа (п=12) 1 стадия (экссудативная) (п=15) 2 стадия (пролиф ератиз ная) (п=15) 3 стадия (ф ибротнческая) (п=15)

Плазма крови (нг/мл) 158,7 (139,1; 164,0) 208,6(191,3; 223,5) р<0,01 * 192,4(189,0; 225,2) р=0,003* р,=0,97 146,3(130,6; 163,1) р=0,19 р,<0,01* р<0,01*

БАЛЖ (нг/мл) 3,2(1,1; 5,7) 7,0 (6,2; 7,9) р=0,016* 7,6 (6,8; 9,9) р=0,009* р,=0,65 1,9 (0.3; 2,1) р=0,18 р,<0,01* р,<),01*

р - значение различий в сравнении с контрольной группой: Р! - значение различии в сравнении с 1 (экесудативной) стадиен; р, - значение различий в сравнении со 2 (пролиферативной) стадией; * - значимые различия.

Изменения содержания ММР-9 в обеих биожидкостях подопытных животных при ОРДС носили иной характер. В 1 стадию синдрома концентрация фермента увеличивалось, в пролиферативную - становилась еще выше, в 3 (фибротическую) уменьшалась до уровня контроля (табл. 5).

Таблица 5

Концентрация ММР-9 в биожидкостях крысы при экспериментальном ОРДС (Ме (25-й; 75-й))

Биожидкость Контрольная группа (п=12) 1 стадия (экссудативная) (п=15) 2 стадия (пролиф ератнвная) (п=15) 3 стадия (фибротическая) (п=15)

Плазма крови (нг/мл) 140,2 (¡20,6; 146,5) 191,4 (172,8; 201,3) р=0,007* 281,6 (195,2; 305,0) р<0,00р р,=0,02* 128,8 (112,2; 142,4) р=0,28 р,<0,001* р^0,001*

БАЛЖ (нг/мл) 2,4 (1,8; 6,1) 11,0(8,2; 18,9) р<0,001* 17,5 (9,8; 23,9) р<0,001* р=0,01* 2,9 (0,9; 4.1) р=0,21 р.«0,001* р,<0,001*

р - значение различий в сравнении с контрольной группой; р1 - значение различий в сравнении с 1 (экссудативной) стадией; р2 - значение различий в сравнении со 2 (пролиферативной) стадией; * - значимые различия.

Концентрация Т1МР-2 в крови в 1 (экссудативную) фазу ОРДС нарастала, во 2 фазу - оставалась на уровне предыдущей, а в 3 (фибротическую) она уменьшалась, но контрольных значений не достигала. В БАЛЖ содержание ингибитора в 1 фазу синдрома также значительно увеличивалось и сохранялось на этом уровне далее (табл. 6).

При оценке уровня экспрессии ферментов непосредственно в тканях легкого, в эксперименте через 24 ч определялась острая (экссудативная) стадия синдрома, где на этом фоне наибольшая экспрессия ММР-2 и ММР-9 отмечалась в фибробластах, макрофагах, эндотелии и нейтрофилах. При этом уровень экспрессии протеаз в указанных клетках был значительно выше, чем в контроле (при всех сопоставлениях р<0,001). Наименьший уровень экспрессии был зафиксирован в альвеолоцитах 1 типа (0-1 балл).

При введении физиологического раствора экспрессия ММР-2 и 9 нейтро-филами, макрофагами, эндстгелиоцитами и фибробластами была одинаковой: 1-2 балла в 8-22 % полей зрения (р>0,05), оставаясь неизменной во всех временных точках эксперимента (р>0,05). Исключение составили: альвеолоциты 1 типа, когда спустя 24 часа уровень экспрессии ими ММР-2 был одинаковым и в опыте, и в контроле (р=0,48); и альвеолоциты 2-го типа - когда в 1-е и 3-й сутки эксперимента экспрессия ими ММР-9 была одинаковой и не отличалась от ос-

тальных клеток (р>0,05), но кб-м суткам она снижалась до 1 баллав5 %полей зрения (р=0,04). Так же у животных контроля, вне зависимости от временных промежутков эксперимента, при морфологическом исследовании в единичных случаях отмечались спорадические девиации, в виде острых нарушений МЦР, частота встречаемости которых не имела статистической значимости.

Таблица 6

Концентрация Т1МР-2 в биожидкостях крысы при экспериментальном ОРДС (Ме (25-й; 75-й))

Биожидкость Контрольная группа (п=12) I стадия (экссудатпвная) (>1=15) 2 стадия (пролиферативная) (п=15) 3 стадия (фибротическая) (п=15)

Плазма крови (нг/мл) 116,0 (96,8; 126,3) ¡78,4 (¡69.2: ¡89,6) р<о,оо1* ¡78,4(169,2; 189,6) р<0,001* ¡48,2(128,2; 151,1) р=0,04* р,=0,01* рМооз*

балж (нг/мл) 4,4 (3,7; 8,3) 12,0(9,2; 19,1) р<0,001* 15,3 (10,8; 20,5) р<0,001* р =0,64 9,9(7,9; 14,1) р=0,04* р,=«.24 р,=0,17

р - значение различий в сравнении с контрольной группой; Р! - значение различий в сравнении с 1 (экссудативной) стадией; р2 - значение различий в сравнении со 2 (пролиферативной) стадией; * - значимые различия.

На 3 сутки эксперимента экспрессия ММР-2 по-прежнему самой высокой была в фибробластах (р=0,04), а ММР-9 - в нейтрофилах (3-4 балла), но по сравнению с 1 фазой синдрома она снижалась (р=0,06). Стабильно низкой экспрессией характеризовались альвеолоциты 1 типа(р>0,05). Лейкоциты, макрофаги, эндотелий и альвеолоциты 2 типа экспрессировали ММР-2 в равной степени (2-3 балла). При сопоставлении экспрессии фермента этими клетками с уровнем первой фазы ОПЛ, оказалось, что в нейтрофилах и альвеолоцитах 2 типа она значимо не отличалась (р>0,05), а в макрофагах и эндотелии значительно снизилась (р?0,001 и р=0,003 соответственно). ММР-9 в равной степени с полиморфноядерными лейкоцитами (3-4 балла) экспрессировали эндотелиоциты и фибробласты - синтез проте-иназы в них оставался на уровне 1-й фазы ОПЛ (р=0,25 и р=0,19 соответственно). Макрофаги и альвеолоциты 2-го типа экспрессировали ММР-9 с одинаковой активностью (2-3 балла); при сопоставлении интенсивности синтеза с уровнем предыдущей фазы синдрома, оказалось, что в макрофагах он не изменился (р^0,16), а в альвеолоцитах 2-го типа - уменьшился (р-0,049).

Через 6 суток после введения лизата фиксировались морфологические маркеры развития фибротической фазы ОПЛ. В эту стадию экспрессия

ММР-2 была сопоставимой во всех клетках на уровне 1 -2 балла, кроме аль-веолоцигов 1 типа. Однако, экспрессия фермента эндотелием и фибробла-стами по-прежнему оставалась на уровне 2 фазы ОПЛ/ОРДС (р>0,05), а в нейтрофилах (р=0,002 по сравнению с 1 фазой), макрофагах (р=0,03) и альвеолодитах 2 типа (р=0,02) она уменьшалась. Наибольшая экспрессия ММР-9 отмечалась в нейтрофилах (2-4 балла), наименьшая - в альвеоло-цитах обоих типов (0-1 балл). При сравнении уровня экспрессии ММР-9 в фибротическую фазу ОРДС с контролем, синтез фермента в нейтрофилах и фибробластах, несмотря на снижение к 3-й стадии синдрома, оставался намного более высоким, чем в контроле (р<0,001 в обоих случаях). В макрофагах, эндотелии и альвеолодитах 2-го типа экспрессия металлопротеи-назы уменьшалась до уровня контроля (р=0,16, р;~0,08 и р=0,12 соответственно) (рис. 1 и 2). %

100

1

90 80 70 бО 50

I

ДО 30 20 10 О

Контроль 1(»кссудативная) 2 (пролкферативная) 3 (фибротическая)

стадия стадии стадия

и Нейтрофилы я Макрофаги ES Эндотелий

□ Фиброблэсты ■ Альвеслоцкты 1 типа В Альвеолоциты 2 типа

Рис. 1. Экспрессия ММР-2 клетками легких крысы при экспериментальном ОРДС.

Т1МР-2 синтезировали те же клетки, что и экспрессировали протеазы. однако динамика экспрессии ингибитора отличалась. Макрофаги в кош-рольной группе экспрессировали TIMP-2 на уровне 1-2 баллов во все временные периоды эксперимента (р=0,09), а при инициализации ОПЛ синтез ингибитора в них не менялся (р=0,46). В контрольной группе экспрессия ингибитора нейтрофилами во все временные точки эксперимента не менялась и была крайне низкой - 0-1 балл; при развитии ОПЛ она повышалась

Контроль Цэкссудативная) 2 (пролиферативная) 3 (фибротическая)

стадия стадия стадия

ЭНейтрофилы Я Макрофаги 3 Эндотелий

ШФкбробласты я Альвеолоцитьз 1 типа 2) Альвеолоциты 2 типа

Рис. 2. Экспрессия ММР-9 клетками легких крысы при экспериментальном ОРДС.

и достигала уровня в 1-2 балла (р=0,031), но также не зависела от фазы синдрома (р=0,06). Альвеолоциты 1 типа в контроле Т1МР-2 не экспресси-ровали; при развитии экспериментального синдрома экспрессия фермента фиксировалась на уровне 0-1 балла, но значимо не отличалась от контроля (р=0,066). Фибробласты в контрольной группе напротив экспрессировали ингибитор достаточно активно (1-4 балла). При ОПЛ экспрессия нарастала до 1-4 баллов более чем в половине исследованных полей зрения (р=0,05), но от фазы синдрома не зависела (р=0,2). Эндотелиоциты, как и фибробласты, экспрессировали Т1МР-2 достаточно активно (1-2 балла), но парадоксально отвечали на введение физиологического раствора - происходило значимое угнетение экспрессии ингибитора (до уровня 1 -2 баллов) течение 72 часов (р-=0,04). При развитии ОПЛ экспрессия эндотелием Т1МР-2 значительно повышалась и достигала уровня 1 -4 балла (р<0,001), но отфазы синдрома также не зависела (р=0,61). Альвеолоциты 2 типа, экспрессируя Т1МР-2 в контроле на уровне 1-4 балла, также реагировали угнетением синтеза энзима в ответ на введение физиологического раствора в течение 72 часов до 1-2 баллов (р-0,02 при сопоставлении с базовой экспрессией) Экспрессия Т1МР-2 в альвеолоцитах 2 типа при развитии ОПЛ/ОРДС оставалась на уровне контроля во все фазы (р=0,68) (рис. 3).

%

Контроль Цэкссудативная) 2 (прояифератизная) 3 {фибротнческая)

стадия стадия стадия

ЙНеитрофилы йЗ Макоофаги Ш Эндотелий

ЕФибробласты ■ Лльвеолоциты 1 типа Я Аяьвеолацутыг типа

Рис. 3. Экспрессия Г1МР-2 клетками легких крысы при экспериментальном ОРДС.

Сопоставление динамики ММР-2 и 9 в паренхиме легких и бножидкостях крысы при экспериментальном остром респираторном дистресс-синдроме

Стадийные изменения концентрации ММР-2 и ММР-9 в тканях легких, плазме крови и БАЛЖ, при воспроизведении ОПЛ были однотипными, т.е. в экссудативную и пролиферативную фазы отмечалось четкое нарастание концентрации исследованных ферментов, на порядок превышающие значения групп контроля, а в фибротическую - фиксировалось снижение, близкое к контрольным значениям (таб. 7, 8).

Сопоставление фазных изменений экспрессии ММР-2 и 9 в тканях и биологических жидкостях выявили следующие закономерности:

- корреляция между уровнями концентрации матриксных металлопротени-наз 2 и 9 в сыворотке крови, БАЛЖ и их синтезом в тканях легкого в один момент времени определяется в диапазоне от 0,5 до 0,7, т.е. как связь средней силы;

- во всех фазах отмечен эффект запаздывания нарастания концентрации ММР-2 и 9 в биологических жидкостях по отношению к тканям. Максимальные величины запаздывания (t¡me-iag) достигали 13 часов.

Таблица 7

Концентрация ММР-2 в парнхиме легких и биожидкостях крысы при экспериментальном ОРДС

Стадия ОПЛ/ОЩС Ошндн экспрессия целевых клеток в паренхиме легких (баллы) Плазма крови (нг/мл) БАЛЖ (нг/мл)

1 стадия (экссуазтивная) (п=15) 1,7(0,2) 178,4(169,2; 189,6) р=0,28 12,0(9,2; 19,1) р=0,1 Р,=0.12

2 стадия (пролиферативяая) (п=15) Э 1 пл\ 178,4 (169,2; 189,6) р<0,001* 15,3 (10,8; 20,5) р<0,00!* р1<0,001*

3 стадия (фибротическая) (п=15) 2,1 (0;2) 148,2(128,2; 151,1) р=0,004* 9,9(7,9; 14,1) р<0,001* Р, м*

р - значение различий в сравнении с показателями плазмы крови; Р! - значение различий в сравнении с показателями БАЛЖ; * - значимые различия.

Таблица 8

Концентрация ММР-9 в парнхиме легких и биожидкостях крысы при экспериментальном ОРДС

Стадия ОПЛ/ОЩС Обиден экспрессия целевых клеток в паренхиме легких (баллы) Плазма крови (нг/мл) БАЛЖ (нг/мл)

! стадия (экссуцативная) (п-15) 1,2 (0;2) 191,4(172,8; 201,3) р=0,21 11,0 (8,2; 18,9) р=0,17 р,=0,09

2 стадия (пролиферативная) <п=15) 2,9 (1;4) 281,6 (195,2; 305,0) р<0,001* 17,5 (9.8; 23,9) р<0,001* Р, <0,001*

3 стадия (фибротическая) (п=15) 1,5 (0;2) 128,8 (112,2; 142,4) р=0,008+ 2,9 (0,9; 4,1) р<0,001* р,<0,001*

р - значение различий в сравнении с показателями плазмы крови; р1 - значение различий в сравнении с показателями БАЛЖ: * - значимые различия.

ВЫВОДЫ:

1. Разработанный способ моделирования острого повреждения легких инициирует патологический процесс путем прямой альтерации альвеоляр-но-капиллярной мембраны аэрогематического барьера.

2. Экспериментальное острое повреждение легких, с развитием стадийных изменений в виде диффузной альвеолярной альтерации, диссеминирован-ного внутрисосуцистого свертывания крови, выраженного некардиогенно-го огека легких, является морфологическим эквивалентом острого респираторного дистресс-синдрома в клинике у умерших при гриппе A(H1N1).

3. Продуцентами матриксных металлопротеиназ 2 и 9 в легочной паренхиме являются нейтрофилы, фибробласты, эндотелий и макрофаги. Синтез ММР-2 и ММР-9 максимален в 1-ю и начало 2-й фазы развития синдрома острого повреждения легких. Тканевой ингибитор матрйксной металлопротениназы 2 в легочной паренхиме синтезируется и секрети-руется фибробластами и эндотелием с максимальной экспрессией в конце 2-й и начале 3-й фаз синдрома острого повреждения легких.

4. Выявлена прямая положительная корреляционная связь средней силы между уровнями концентрации матриксных металлопротеиназ 2 и 9 в сыворотке крови, бронхо-альвеолярной лаважной жидкости и их синтезом в тканях легкого.

5. Наличие интервала запаздывания увеличения концентрации матриксных металлопротеиназ 2 и 9 в сыворотке крови и бронхо-альвеолярной лаважной жидкости, по отношению к тканям легкого, не позволяет использовать показатели их значений, как адекватный диагностический и/или прогностический маркер синдрома острого повреждения легкого.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТЛЦИ И Публикации в ведущих научных рецензируемых журналах, определенных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации:

1. Чарторижская, H.H. Патологическая анатомия изменений внутренних органов при синдроме острого повреждения легких на фоне гриппа А/ H1N1 в Забайкальском крае/ H.H. Чарторижская, A.B. Сепп, Е В. Прут-кина //Кубанский научный медицинский вестник. - 2010. - № 8 (122). -С. 192-196.

2. Морфологическая характеристика поражения дыхательной системы при гриппе A/H1N1 в Забайкальском крас / H.H. Чарторижская [др.] //Бюллетень физиологии и патологии дыхания. - 2011. - Вып. 39. - С. 8-12. (соавт.: AB. Сепп, H.1I. Цыбиков, Е.В. Пруткина).

3. Пруткина, ЕВ. Экспрессия матриксной металлопротеиназы-2 иткане-вого ингибитора 2-го типа в легких в зависимости от стадии развития экспериментального респираторного дистресс-синдрома / Е.В. Пруткина, A.B. Сени, H.H. Цыбиков // Архив патологии. - 2012. - Т. 74, № 6. - С. 23-27.

4. Пруткина, Е.В. Особенности синтеза матриксной металлопротеиназы-9 в легких при развитии дистресс-синдрома в эксперименте / Е.В. Пруткина, A.B. Сепп, H.H. Цыбиков // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. - 2013. - № 1 (89). - С. 121-124.

5. Воспроизведение в эксперименте стадий развития респираторного дистресс-синдрома / Е.В. Пруткина [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013. - Т.155, № 6. - С. 784-787. (соавт.: A.B. Сепп, H.H. Цыбиков, Н.В. Исакова).

6. Пруткина, Е.В. Ферменты азурофильных гранул нейтрофилов и мат-риксная металлопротеиназа 2 как маркеры стадий экспериментального респираторного дистресс-синдрома / Е.В. Пруткина, A.B. Сепп, H.H. Цыбиков // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2014. -№ 1. - С. 48-52.

Публикации в прочих изданиях:

7. Пруткина, Е.В. Морфология внутренних органов при остром респираторном дистресс-синдроме на фоне гриппозной пневмонии / Е.В. Пруткина, A.B. Сепп, H.H. Чарторижская // Материалы IV Съезда врачей-пульмонологов Сибири и Дальнего Востока. - Благовещенск, 2011. - С. 67-70.

8. Пруткина, Е.В. Аутоагрессивный потенциал нейтрофильных гранулоци-тов при респираторном дистресс-синдроме легочной этиологии / Е.В. Пруткина, A.B. Сепп // Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины: материалы междунар. науч. конф. (Таиланд, Паттайя, 2012). - Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. -2012. -№ 2. - С. 112-113.

9. Пруткина, Е.В. Участие миелопероксидазы нейтрофилов в патогенезе экспериментального острого повреждения легких / Е.В. Пруткина, A.B. Сепп, Н.Н Цыбиков // Вопросы патогенеза типовых патологических процессов: труды IV Всерос. науч.-практ. конфе. с междунар. участием. -Новосибирск, 2012. - С. 240-243.

10. Пруткина, Е.В. Вклад матриксной металлопротеиназы-2 в развитие экспериментального острого повреждения легких / Е.В. Пруткина, A.B. Сепп, Н.II Цыбиков // Болезни органов дыхания: от ребенка к взрослому: материалы межрегион, науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Чита, 2012.-С. 51-52.

11. Пруткина, E.B. Динамика содержания нейтрофильной эластазы при развитии острого респираторного дистресс-синдрома в эксперименте / Е.В. Пруткина, A.B. Сепп, Н.Н Цыбиков // VII Сибирский съезд физиологов: материалы съезда физиологов с междунар. участием. - Красноярск, 2012.-С. 439-440.

12. Пруткина, Е!В. Система "матриксная металлопротеиказа-2 - ингибитор металлопртеиназы-2" при развитии респираторного дистресс-синдрома в эксперименте /Е.В. Пруткина, A.B. Сепп// Жизнеобеспечение при критических состояниях: тезисы докладов 14 Всерос. конф. с междунар. Участием. - Москва, 2012. - С. 116-117.

Патенты на изобретения и полезные модели:

13. Патент № 2456677, РФ, МПК G09B 23/28 (2006.01). Способ моделирования острого повреждения легких / Цыбиков H.H., Пруткина Е.В., Сепп A.B., Исакова Н.В.; заявитель й патентообладатель ГОУ ВПО Читинская гос.мед. академия Росздрава. - № 2010130728/14, заявка 21.07.2010; опубликован 27.01.2012, Бюл. №20. - 11 с.

Монография:

14. Патологическая анатомия гриппа A/H1N1/09 / H.H. Чарторижская, A.B. Сепп / под ред. Г.Г. Онищенко // Организация и проведение противоэпидемических мероприятий в период эпидемии гриппа A/H1N1/09 в октябре-декабре 2009гв Забайкальском крае. - Новосибирск: Наука, 2011. -С. 85-89.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

- острый респираторный дистресс синдром

- острое повреждение легких

- перекисное окисление липидов

- matrix metalloproíeinase 2 - матриксная металлонротеиназа 2

- matrix metalloproíeinase 9 - матриксная металлопротеиназа 9

- tissue inhibitors of metalloproteinase(s) - тканевой ингибитор матриксной металлопротеиназы 2

ОРДС

ОПЛ

ПОЛ

ММР-2

ММР-9

TIMP-2

Лицензия ИД №03077 от 23.10.00. Подписано в печать 17.02.2015. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman Формат 60 х 84 Чк. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100. Заказ № 24/2015.

Отпечатано в редакционно-издательском центре ЧГМА 672090, Чита, ул. Горького, 39-а.