Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Коррекция иммунного ответа при действии гипобарической гипоксии

гигг;;-:

■ Д-ЗЛ

стаций

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ

На правах рукописи

САРЫБАЕВА Динара Витальевна

КОРРЕКЦИЯ ИШННОГО ОТВЕТ! ПРИ ДЕЙСТВИИ ГИПОБАРИЧЕСЕОЙ ГИПОКСИИ

14.00.36 - Аллергология и яйцуколотая

Автореферат диссертация на соискание ученой стелет кандидата медицинских #иуя

Москва 1991

Работа выполнена в Институте иммунологии 113 СССР

Научные руководители: доктор биологических says,

профессор А.А.Михайлова

доктор медицинских наук А.Ы.Васгошнко

Официальные оппоненты: член-корреспондент А НРСФСР,

доктор медицинских наук, профессор А.А.Ярилкн

доктор медицинских наук, профессор И.В.Константинова

Ведущая организация: Институт биофизики ЫЗ СССР

Защита состоится L -i-cii-i 1991 года в часов на засе-

дании Специализированного Ученого совета Д 074.09.01 в Институте иммунологии ИЗ СССР (1154-78, Москва, Каширское шоссе, 24, корп.2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института иммунологии U3 СССР.

Автореферат разослан v j-Uuv 1991 года.

Ученый секретарь Специализированного совета

доктор биологических наук ¿.Б.Колобов

Актуальность проблемы. В настоящее время поиск новых способов профилактики и коррекции нарушений функционального состояния человека и повышения его физической работоспособности в экстремальных условиях становится все более актуальным. Это связано с расширением сферы деятельности человека, например, при выполнении работ в космосе, на больших глубинах под водой, при освоении высокогорных районов.

Экстремальные условия зачастую сопровождаются гипоксией, являвшейся к тому же общим патогенетическим звеном развития практически любых стрессорных нарушений функций организма и развивающихся на их основе заболеваний.

Важное значение для формирования физиологических механизмов адаптации организма к гипоксии имеет иммунная система. При гипок-сическом воздействии, в частности, в условиях гипобарической гипоксии состояние иммунной системы характеризуется существенными изо

менениями показателей гуморального и клеточного иммунитета (В.Г. Антоненко и др., 1986; Ы.В.А1-Ыщи1 ей &Х., 19оЗ; «Т.З.ОюЬап еЪ а1. 1979). Это обусловливает необходимость разработки эффективных способов восстановления нарушений иммунного статуса с учетом особенностей постгипоксической иммуносупрессии. Существующие средства коррекции иммунных сдвиго.в, индуцированных дефицитом кислорода, разработаны пока недостаточно. Поэтому данная работа направлена на обоснование вовых подходов к профилактике и коррекции иммунодефи-цитных состояний, вызванных воздействием гипобарической гипоксии, с применением препаратов, созданных на основе иммуномедиагоров эндогенного происхождения, а также безлекарственного метода - йу*-рикулярной электроакупунктуры.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла я Изучении меха*-низмов нарушения гуморального иммунного ответа при состоянии гипобарической гипоксии и в поиске новых эффективных методов их коррекции.

Для выполнения данной цели решались следувдие задачи:

I. Разработать экспериментальную модель для изучения влияния гипобарической гипоксии на гуморальный иммунный ответ и выбрать оптимальный режим гипоксического воздействия для создания иммунодефицита.

2» Изучить роль миелопептидов (Ш) в развитии иммунодефицит-ного состояния, индуцированного стрессом гипобарической гипоксии»

3. Проанализировать возможные механизмы иммуносупрессивного действия гипоксического стресса, связанные с участием опиатерги-ческой системы и с активацией неспецифических Т-клеток-супрессоро&

4. Оценить эффективность использования препаратов костного мозга и тимуса для профилактики и лечения иммунологической недостаточности, развивающейся в условиях барокамерной гипоксии.

5. Изучить возможности применения безлекарственного метода аурикулярной электроакупунктуры (АЭАП) для профилактики и коррекции иммунодефицитов, вызванных действием гипобарической гипоксии« Научная новизна. Получены ндвые данные о динамике изменения гумо- ' ральиого иммунного ответа при действии гипобарической гипоксии.

Установлены неизвестные ранее факты снижения естественной -продукции миелопептидов и/или уменьшения их.функциональной активности у животных, находящихся в условиях барокамерной гипоксии.

Показаао, что в развитии иммунодефицита при гипобарической гипоксии принимает участие опиатергическая система.

Впервые продемонстрирована возможность профилактики и коррекции иммунодвфицитных состояний, индуцированных гипоксическим стрессом, с помощью препаратов, созданных на основе медиаторов иммунной системы . - миедопида и тимозина фр.5.

Показана эффективность иммунокорригирувдего действия метода

о

АЭАП на процесс антителообразования у животных, содержащихся в условиях барокамерной гипоксии.

практическая значимость. Результаты, полученные в диссертации, расширят существующие представления о механизмах нарушений функционального состояния лимфоидной системы в условиях воздействия гипоксии, связанные с изменением продукции и/или функциональной активности Ш, повышением супрессорной активности Т-лимфоцитов, а закже с участием опиатергической системы. Эти данные представляют иртерес для изучении патогенеза стресс-индуцированных имиунодефи-дитов различного происхождения и разработки методов их профилактики и лечения. Полученные результаты об иммуномодулирующих эффектах препаратов миелопид и тимозив фр.5, а также АЭАП при иммунодефиците под влиянием гипобарической гипоксии могут быть применены для разработки рекомендаций по формированию физиологической устойчивости и сохранения общей работоспособности в условиях высокогорья.

Работа выполнена в рамках Государственной научно-технической программы 0.69.07. раздела 01.05.Н. "Разработать новые экспериментальные подходы к получению медиаторов иммунных реакций с целью их использования для иммунокоррекции". Диссертационная работа является частью научно-исследовательской тематики Института физиологии и экспериментальной патологии 1Н Республики Кыргызстан "Механизм индивидуальной устойчивости и пути прогнозирования функциональных возможностей человека в экстремальных условиях при различных видах деятельности" (гос. регистрация й 01860086749). Основные положения, выносише на защиту. I. Снижение антителопро-дукций при гипобарической гипоксии связано с угнетением продукции и/или функциональной активности костномозговых медиаторов. -миелопептидов, с активацией неспецифических Т-супрессоров и происходит с участием опиатергической системы.

2. Препараты, созданные на основе иммуномодуляторов эндогенного происхождения, такие как миелопид и тимозин фр.5 могут быть использованы в Качестве эффективных средств профилактики и коррек-

- б -

ции иммунодефицитов, развивающихся при действии гипобарической гипоксии.

3. Аурикулярная электроакупунктура, увеличивая продукцию ми-елопептидов клетками костного иозга мышей, подвергнутых воздействии барокаыерной гипоксии, является эффективным немедикаментозным средством коррекции стресо-индудированных иммунодефицитных состояний.

Апробация работы. Результаты, полученные в настоящей работе, были доложены на республиканской конференции "Актуальные проблемы практической иммунологии" (Таллинн, 1986), на Всесоюзном симпозиуме с международным участием "Иммунодефицит и аллергия" (Москва, 1986), на конференции молодых специалистов Института иммунологии МЗ СССР (Москва, 1986), на Всесоюзной конференции "Стресс и иммунитет" (Ростов- на-Дону, 1989).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ. Объем и структура .диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных данных,■обсувдения, заключения, выводов и указателя литературы. Работа изложена, на 105 страницах машинописного текста, включая 9 таблиц и 9 рисунков. Список литературы содержит 134 источника, из которых 53 работы иностранных авторов.

4 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы

Работа выполнена на мышах-гибридах цервогд поколения Е-(СВД. х С57Ш») обоих полов массой 1{3-*£2 г> Состоядае гипобарической гипоксии создавали в барокамере, куда "на'трете суток помещали животных, имитируя подъем на высоту-7000-8000 м над уровнем моря..

В качестве исследуемого 'параметра, как интегрального показателя нарушения гуморального звена иммунитета, было выбрано коли-

чество антителообразующих клеток.(¿ОН) на пике вторичного иммунного ответа. Животных иммунизировали 5^-ной суспензией эритроцитов барана подкожно в подушечки четырех конечностей по 0,1 мл. Для индукции вторичного иммунного ответа мышей иммунизировали тем же способом спустя две недели после первичной иммунизации. В некоторых экспериментах животных иммунизировали внутривенно в хвостовую вену по 0,5 мл 10%-ной суспензии эритроцитов барана. Часть экспериментальных животных помещали в барокамеру через сутки после повторной иммунизации, часть содержали в нормальных условиях.

В системе in. vivo изучали влияние различных иммуномодулято-ров на_количество антителообразующих клеток у животных, подвергнутых воздействию острой гипобарической гипоксии. В качестве таких средств использовали препарат миелопид (А.А.Михайлова, 1988) и препарат тимуса - гимозин фр.5 (Г.А.Ермолин, I9S2). Миелопид вводили животным в/в в дозе 100-200 мкг/мышь в 0,5 мл физиологического 'раствора. Тииозин вводили п/к в дозе 100 мкг/мышь в 0,5мл физиологического раствора. В работе испытывали безлекарственный метод аурикулярной злектроакупунктуры (А.М.Василенко, 1985), причем использовали различные режимы предъявления АЭАБ, каждый из которых проводили как в .нормо-, так и гипоксических условиях.

Степей' эффективности имиуномодулируящих средств оценивали по коэффициенту стимуляции антителообразования, рассчитанному как отношение количества АОК в опыте и контроле. 'Количество антителообразующих клеток определяли в лимфатических узлах подопытных животных на пятые сутки развития вторичного иммунного ответа методом локального гемолиза в геле для leG-образующих клеток (U.K.. Jeme, 1963).

Для изучения влияния гипобарической гипоксии на уровень продукции костномозговых медиаторов клетки костного мозга получали от неиммунизированных животных, подвергнутых гипоксическому стрес-

су. Клетки дважды отмывали средой 199 при 200 6 в течение 10 минут и культивировали в той se среде, в которую добавляли глутамин ° (200 мЫ), гепес-буфер (I Ы), ампициллин (0,15 мг/ыл), стрептомицин (0,10 мг/мл). Инкубация длилась 20 часов при 37°С, концентрация клеток составляла IQ х 10^ ядросодержащих (я/с) клеток на I мл среды. Культуралвную жидкость отделяли от клеток центрифугированием при 400 в в течение 15 минут с последующим "осветлением" су-пернатанта при 10 тыс. g в течение 10 минут. Фракционирование супернатантов проводили методом гель-хроматографии на сефадексе G-25 (Fine) (Р.В.Петров, А.А.Михайлова, 1987). Биологическую активность хроматографических фракций оценивали в системе in vitro. Тестируемый материал добавляли к клеткам лимфатических узлов, полученных от мышей на пике вторичного иммунного ответа к эритроцитам барана. Клетки культивировали в среде 199 (I х 10^ я/с кл./мл), содержащей 10^-ную эмбриональную телячью сыворотку, гепес-буфер (I И), глутамин (200 мМ), пенициллин (100 ед/мл), в течение 18-20 часов при 37°С и 5fo углекислого газа. По коэффициенту стимуляции антителообразоваяия оценивали биологическую активность выделенных фракций супернатанта. ,

В серии экспериментов по анализу природы супрессорных клеток, индуцированных в' лимфатических узлах или селезенке животных, под-

■ вергнутых действию гипоксии^ применяли анти-Т-супрессорную сыворо-\

тяу, любезно предоставленную профессором Н.А.Краскикой. Рабочее разведение сыворотки составляло 1:10. Клетки лимфатических узлов . или селезенки стрессированных животных (30-50 х I06/ мл) инкубировали с аати-Т-супрессорной сывороткой и комплементом морской свинки в разведении 1:20 в течение 45 минут при 37°С, дважды отмывали

л

охлажденной средой 199, осадок разводили до концентрации I х 10 кл./мл и использовали в тест-системе.

При анализе возможного участия опиатергической системы в раз-

витии иммуносупрессии, индуцированной действием гипобарической гипоксии, использовали антагонист опиатов - налоксон ( sehva Peixtbiocbeaica GabH aad Co., Heidelberg ), который вводили животным до стрессового воздействия в/б в дозах 2, 10, 20, 50, 100, 200, Ш икг/ишъ.

Полученные в работе результаты статистически обрабатывали в соответствии с критериями Стьюдента-Фишера.

Результаты и обсуждение

I. Влияние гипобарической гипоксии на процесс антителообразования

Имеющийся к настоящему времени в литературе материал по изменению процесса антителообразования в лиифоидкых органах при воздействии на организм острой гипобарической гипоксии неоднороден, что связано с целым рядом причин. В экспериментах разных авторов использовались различные сроки, в течение которых животные находились при пониженном содержании кислорода, варьировалась величина гипоксического воздействия, применялись разные схемы иммунизации. Кроме того, большое значение имеет сезон года, во время которого проводили эксперименты на животных, а также условия, сопровождающие гипоксическое воздействие. Результаты, полученные при исследованиях, проводимых в условиях барокамерной Гипоксии й естественных условиях, могут значительно отличаться друг от друга в силу того, что в высокогорье на организм действуют дополнительные факторы: радиация, влажность, температура и т.д.

В связи с этим первым этапом работы явилась разработка экспериментальной модели для изучения влияния гипобарической гипоксии на гуморальный иммунный ответ у животных, позволяющая получать стабильные результаты подавления процессов антителообразования при данном типе стрессового воздействия, йапи эксперименты пров&~

-гадились в условиях барокамерной гипоксии.

• Было испробовано несколько вариантов экспозиции в барокамере - от Г до 3-х суток при различных исследуемых высотах. В результате было показано, что выраженное угнетение антителообразования наблюдается после 3-суточного содержания мышей в барокамере в условиях, имитирующих подъем на высоту 8000 м над уровнем моря. При таком режиме животные, содержащиеся в барокамере, сохраняли 95%-ную выживаемость, а коэффициент изменения антителообразования составлял 0,33$0,18 (Р< 0,001). При подъеме ныл ей на высоту выше 8ООО м процент гибели возрастал. Пребывание животных в барокамере в течение 1-2 суток не вызывало статистически достоверного снижения количества АОК в лимфоидных органах. Коэффициент изменения антителообразования составлял 0,68+0,19 после I суток барокамерной экспозиции и 0,78^0,37 после двух суток гипоксического воздействия.

Исходя из этих результатов, в дальнейшей работе была использована 3-суточная модель барокамерной экспозиции, имитирующая подъем животных на высоту 8000 м над уровнем моря. При таких условиях развивается выраженное вторичное иммунодефицитное состояние организма. Статистически значимое снижение иммунного ответа в 2-3 раза сохранялось, по крайней мере; в течение трех последующих суток после окончания гипоксического стресса, ч

2. Изучение механизмов иммуносупрессирующего действия гипобарической гипоксии

На действие острой гипобарической гипоксии организм отвечает целым комплексом реакций. При этом происходит изменение функциональной активности различных типов иммунокомпетентных клеток. Нами были проанализированы различные аспекты возможных иммунологических нарушений, которые могут играть существенную роль в меха-

- п -

низке развития иммуяосупрессии под влиянием гипобарической гипок-* сии.

Изменение Активности и/или продукции миелопептидов • клетками костного мозга животных, подвергавшихся воздействию гипобарической гипоксии

' Клетки костного мозга вырабатывают регуляторные медиаторы -миелопептиды, представляющие собой группу низконолекулярныных пептидов, обладавших антителостимулирующей, дифференцировочной и опи-атоподобной активностью (А.А.Михайлова, 1988; Р.Б.Петров и соавт., 1986). Одной из задач работы было выяснение роди Ш в развитии им-муносупрессии, индуцированной гипобарической гипоксией.

Результаты проведенных исследований показали, что уже через сутки пребывания животных в барокамере происходит 2-3-кратное уменьшение выработки и/или активности Ш, сохраняющееся.в течение последующих двух суток действия гипоксического стресса. МП, полученные от мышей, находящихся в условиях барокамерной гипоксии, оказывали меньшее стимулирующее воздействие на антителообразование по

сравнению с Ш животных, содержащихся в нормальных условиях. Козф-фициент стимуляции антителообразования при добавлении к клеткам иммунных лимфатических узлов МП, выделенных, ох интактных животных, был равен 1,84±0,087. Коэффициент стимуляции антителообразования под влиянием МП, полученных от мышей, подвергавшихся трехсуточному воздействию барокамерной гипоксии, составлял.всего лишь 1,14±0,55. Различия в коэффициентах стимуляции антителообразования в этих двух группах экспериментов было статистически достоверным (Р<0,01). Следует подчеркнуть, что оптимальная доза проявления антителостимулирующей активности Ш не изменялась и оставалась равной 30 мкгДО^ ядросодержащих клеток иммунных лимфатических узлов, независимо ох того, выделены ли они из костного мозга нормальных или стрессиро-

ванных животных.

Таким образом,, развитие иммунодефицитного состояния при воз" действии на организм барокамерной гипоксии связано со снижением функциональной активности Ш, вырабатываемых клетками костного мозга стрессировашшх животных. Возможно, под влиянием гипоксичес-кого стресса происходит уменьшение числа клеток-продуцентов Ш1 в костном мозге в результате их миграции (П.Д.Горизонтов и соавт., 1983). Изменение пролиферативно-дифференцировочной активности по-липотентных стволовых клеток в условиях гипоксии в сторону экспрессии зритроидното направления, подавляющего дифференцировку стволовых клеток по всем остальным росткам кроветворения (В.А.Козлов и соавт., 1984), также может быть причиной уменьшения количества клеток-гпродуцентов Ш.

Положение об уменьшении функциональной активности МП у живот- кых, подвергнутых 3-суточной баронамерной гипоксии, нуждается в дальнейией прораб&гке, т.к. содержание Ш в активной фракции, полученной при гель-хроматографии супернатантов культур клеток костного мозга, оценивали по содержанию белка, определяемому методом Доури. Пока' нет точного метода количественного определения Ш, вполне вероятно, что снижение антителостимулирующей активности выделенных фракций Щ у стрессировашшх животных объясняется не снижением их функциональной активности, а снижением содержания Ш в этих фракциях.

Активация неспецифических Т-клеток-супрессоров в

условиях баронамерной гипоксии

Индукцию клеток-супрессоров под действием гипобарической гипоксии оценивали по-способности клеток селезенки или лимфатических узлов стрессированных животных подавлять антителообразование в популяции зрелых"антителообразующих клеток.

При совместном культивировании клеток лимфатических узлов

или селезенки, полученных от неиммунизированных мышей, подвергавшихся трехсуточной гипоксии, с клетками лимфатических узлов или селезенки иммунизированных животных, находившихся в нормальных условиях, количество АОК в смешанной культуре_оказалось сниженный по сравнение с монокультурой иммунных клеток. Обнаруженный эффект иммуносупрессии, по-видимому, связан с накоплением супрессорной активности в процессе развития стресс-реакции на гипоксию.

Для определения природы клеток супрессоров, образующихся в лимфоидных органах под влиянием гипобарической гипоксии, были проведены опыты с использованием анти-Т-супрессорной сыворотки. Популяцию клеток селезенки или лимфатических узлов мыией, подвергнутых гипоксическому стрессу, обрабатывали специфической антисупрессор-ной сывороткой. Из данных, представленных на рис.1 видно, что такая обработка частично отменяет эффект супрессии. В культуре клеток лимфатических узлов супрессия отменяется более, чем на 30%, а

л *

в культуре клеток селезенки - на 50%.

Рис.1. Отмена судрессирующего эффекта лимфоидных клеток стрессированннх животных после их обработки анти-Т-супрессорной сывороткой: I - клетки лимфатических узлов иммунных иьшей (контроль), 2 - клетки лимфатических узлов иммунных мышей + клетки лимфатических узлов стрессированннх мышей, 3 - клетки лимфатических узлов иммунных мышей + клетки лимфатических узлов стрессированннх' ыыией,' обработанные анти-Т-супрес-сорной сывороткой, 4 - клетки селезенки иммунных мышей (контроль)', 5 - клетки селезенки иммунных мышей + клетки селезенки отрессированных мыЬей, б - клетки селезенки иммунных мыией + клетки селезенки отрессированных мыибй^ обработанные анти-Т-супр-рессорной сывороткой. *

АОК/Ю6, я/с кл.

300

200

100

¿1

¿1

|Ь

12 3 4 5 6

Из приведенных данных следует, что снижение гуморального им-~ мунного ответа при действии острой гипобарической гипоксии части-что связано с увеличением активности Т-клеток-супрессоров.

Добавление Ш в смешанную культуру иммунных клеток селезенки и клеток селезенки, полученных от мышей, подвергнутых гипоксичес-кому стрессу, полностью отменяет снижение антителопродукции, опосредованное Т-супрессорами (рис.2, п.З). Внесение Ш в тест-культуру вместе с клетками селезенки стрессированных животных, лишенных Т-супрессоров вследствие обработки анти-Т-сывороткой, оказывает незначительный анхителостимулирующий эффект (рис.2, п.4).

АОК/Ю6 я/с кл. 300

200

100

12 3 4

Рис.2. Отмена супрессирующего эффекта клеток селезенки стрессированных животных под влиянием ыиелопида:

1 - клетки селезенки иммунных мышей,

2 - клетки селезенки иммунных мышей 1- клетки селезенки стрессированных мышей, 3 - клетки селезенки иммунных мышей + клетки селезенки стрессированных мышей + МП, 4 - клетки селезенки иммунных мышей +■ клетки селезенки стрессированных мышей, обрабо-

: танные анти-Т-сывороткой, + Ш.

Эти результаты свидетельствуют о том, что Ш препятствуют проявлении супрессовной активности Т-лимфоцитов, что соответствует литературным данным о конкурентном взаимодействии МП с Т-супрес-сорами в продуктивную фазу иммунного ответа (¿.¿.Михайлова и со-авг., 1987).

Налоксон-зависииый механизм снижения антителопродукдии т животных под влиянием гипоксического стресса

о

Стрессовые воздействия на организм вызывают сложный комплекс ответных реакций с участием всех гормонально-медиаторных систем,

включая опиоидную систему. В работе была сделана попытка устаяо-~ вить, связано ли снижение антителопродукции у животных под влиянием гипоксического стресса с участием опиатергической системы. ДлЯ изучения этого вопроса были проведены опыты с использованием специфического антагониста опиатов - налоксона, конкурирующего с лигандами за присоединение к опиатным рецепторам.

В результате проведенных экспериментов установлено, что введение налоксона до стрессового воздействия практически полностью предотвращало развитие иммуносупрессирувщего эффекта гипобаричес-кой гипоксии, что указывает на участие опиатергических механизмов в его реализации.

На рис.3 показана дозовая зависимость антителостимулирующе-го эффекта налоксона при-воздействии гипоксического стресса. Лак видно из рисунка, максимальную стимулирующую активность на фоне глубокой имыуносупрессии налоксон проявляет в дозе 10 мкг/мышь.

Доза налоксона (мкг)

Рис.3. Зависимость коэффициента стимуляции антителообра-зования в лимфатических узлах подвергнутых гипоксии животных от дозы налоксона.

Введение налоксона животным в дозах больше 20 мкг/мышь не только не отменяло супрессирующее действие барокамерной гипоксии, но и усуглублядо степень иммунодепрессии. Возможно, что при боль-

ших дозах (более 50 икг/мышь) налоксон оказывает токсический эффект. При вскрытии животных, получавших большие дозы налоксоиа, наблюдалось значительное увеличение лимфатических узлов, они становились плотными, инфильтрированными кровью.

Обработка клеток лимфатических узлов налоксоном в системе in vitro не отменяла имыуносупрессируюцее действие гилоксическо-го стресса (рис. 4). Количество АОН в культуре клеток лимфатических узлов, взятых от иммунизированных мышей, испытавших 3-суточ-ный гипоксический стресс,и обработанные налоксоном, достоверно не отличалось от количества АОК в культуре клеток лимфатических узлов, полученных от иммунных животных, подвергавшихся действию ба-рокамерной гипоксии,и необработанные налоксоном (155±13,2 и 123+ 5,2 при Р >0,05). Возможно, это связано с тем, что эффект отдоены

АОК/Ю6 я/с кл.

200

hrf

100 -

Рис.4. Влияние налоксона на количество АОК в культуре клеток лимфатических узлов, полученных от животных,о подвергнутых гипоксическому стрессу:

1 - клетки лимфатических узлов иммунных животных при нормоксии (контроль),

2 -.. клетки лимфатических узлов иммунных мышей при гипоксии, 3 - клетки лимфатических узлов ишунных мышей при гипоксии, обработанные налоксоном.

налоксоном ингибирушцего действия гипоксического стресса обуслов-. лен способностью этого вещества предотвращать индукцию Т-супрессо-ров в лимфоидных органах под влиянием гипоксии. В данной серии экспериментов налоксон вводили в тест-систему, в которой уже произошел запуск процесса подавления антителообразования под воздействием барокамерной гипоксии.

- 17 -

Таким образом, иммунологическая недостаточность организма, в частности нарушение антителообразования, развивающееся при стресс-реакции на гипоксию, - сложный многокомпонентный процесс, включающий в себя комплексный механизм иммуносупрессии, что свидетельствует о целесообразности поиска эффективных средств иммунокоррек-ции в нескольких направлениях.

3. Возможные пути иымунокоррекции иммунодефицитного

состояния у мышей, вызванного гипоксическим стрессом

К настоящему времени проведен большой объем исследований по изучению препаратов с потенциальным противогипоксическим действием. Используемые препараты относятся к разнообразным классам соединений природного и синтетического происхождения с различной фармакологической активностью. Целесообразность в их назначении возрастает в случае необходимости срочной мобилизации адаптационных возможностей человека к острому недостатку кислорода. Особо следует подчеркнуть значение иммунной системы для формирования физиологических механизмов адаптации организма к гипоксическому воздейст-о л

вию, методы медикаментозной иммунонорренция которой вазработаны пока недостаточно.^

Иммуномодулирующее действие миелопида и тимозияа

фракции 5 при гипобарической гипоксии

Представленные в предыдущих разделах данные показывают» что в использованной нами экспериментальной модели гипоксический

о

стресс вызывал дефицит продукции и/или активности миелопептидов, а также активацию Т-супрессоров. Учитывая тот факт, что стресс гипобарической гипоксии, возможно, реализуется с участием опиатерги-ческой системы, представлялось целесообразным исследовать протек-тивное действие иммуномодуляторов,, связанных с механизмами нейро-иммунного взаимодействия.

- 18 -

Таким иммуномодулятором является, в частности, ыиелотад -препарат, созданный на основе МП, обладающий иммунорегуляторной и налоксон-зависииой аналитической активностями. Миелопид успешно прошел клинические испытания и разрешен к практическому использованию в качестве имыунокорригирувщего средства при лечении ряда клинических форм вторичных имыунодефицитных состояний.

Результаты проведенных исследований показали, что введение миелопида на четвертые сутки развития вторичного иммунного ответа в условиях барокамерной гипоксии оказывает выраженный иммуностимулирующий эффект, что проявляется в увеличении количества АОК (К = 3,4). Антителостимулирующее действие миелопид оказывает и при введении препарата до воздействия гипобарической гипоксии, т.е. в индуктивную фазу иммунного ответа, предотвращая таким образом подав- 'с ление антителообразования при гипоксии (К = 3,76). Данные представлены в табл. I. °

. Таблица I

Влияние миелопида на вторичный иммунный ответ у мышей,

подвергнутых острой гипобарической гипоксии

Условия . эксперимента

Миелопид в продукт, фазе Миелопид в индукт.фазе

АОК/Ю я/с кл.

К-

I

К-)

АОК/Ю я/с кл.

Кт

«г

Контроль I

нормоксия 177+15 66

Контроль 2 „ '

гипоксия 9б±10*,. 61*

Гипоксия* __

миелопид 326±39,7** 48

191±9 0,54 119+8* 1,84 3,4 447+38**

20 18

26

0,62

2,34 3,75

Примечание: ^ и - коэффициенты стимуляции (супрессии) по отношению к контролю I и 2 соответственно; * - достоверные различия

с контролем I (Р< 0,001);

эае

достоверные различия с контролем 2

(Р<0,01); п - количество животных.

Таким образом, миелопид обладает не только иммунокорригирую-щим действием, но проявляет и выраженный профилактический эффект, предупреждая развитие стресс-вызванного иммунодефицитного состояния.

В качестве второго иммуномодулятора, использованного нами для коррекции иммунологической недостаточности, развивающейся з условиях барокамерной гипоксии, применяли препарат тимуса - ти-мозин фр.5. Введение тимозина в индуктивную фазу иммунного ответа вызвало 2-3-кратное увеличение количества АОК в лимфатических узлах иммунизированных животных, подвергнутых барокамерной гипоксии (К = 2,62), т.е. предшествующее стрессовому воздействию гипо-барической гипоксии введение тимозина также блокирует его иммуно-супрессивное действие.

Сравнительная оценка эффектов стимуляции антителообразования при введении миелопида и тимозина показала, что наиболее эффективным является использование миелопида в качестве профилактического и корригирующего средства иммунодефицитного состояния, вызванного действием барокамерной гипоксии. Применение тимозина в качестве стресс-протектора до стрессового воздействия также эффективно. Совместное введение этих препаратов (тимозин - в фазе индукции иммунного ответа, миелопид - на пике вторичного иммунного ответа) не приводит к суммации их эффектов,.но дает хороший стимулирующий эффект {К = 3,34). Коэффициент стимуляции сопоставим с коэффициентами стимуляции при раздельном применении только миелопида или только тимозина. Поэтому, очевидно, нет необходимости совместного использования этих препаратов для модуляции иммунного ответа при иммунодефицитных состояниях, вызванных злиянием гипо-барической гипоксии (рис. 5).

Следует отметить, что введение тимозина в продуктивную фазу иммунного ответа животным, находящимся в условиях барокамерной

Рис. 5. Совместное действие мие-лопида и тимозина фр.5 на вторичный иммунный ответ у животных: в условиях барокаиерной гипоксии: I - контролЬ-нормоксия, 2 - гипоксия, 3 - гипоксия+тимозин , 4 - гипоксия+миелопид,5 -гипок-сия+миелопид+тимозин.

I 2 3 4 5 гипоксии, также оказывало стимулирующее действие на антителогене.з (К = 1,5). Эффект по сравнению с введением его в индуктивную фазу иммунного отвота был слабее, однако восстановление уровня А0К«в лимфатических узлах оказалось статистически достоверным.

Полученные данные о сходной эффективности миелопида и тимозина при введении в индуктивной фазе иммунного ответа и на пике продуктивной фазы в условиях гипоксического стресса свидетельствуют о некотором перекрытии в механизмах их действия. Таким образом, применение препаратов, созданных на основе гормонов и медиаторов иммунной системы, открываю;; большие возможности для направленной о коррекции стресс-обусловленных патологических состояний, сопровождающихся нарушением процесса антителообразования.

Инмтнокорркгирующее действие аурйкуляркой электроаку-

пунктуры при воздействии гипоксического стресса

Поиск средств коррекции и профилактики ишунодефицитных состояний, вызванных гипобарической гипоксией, ориентирован главным образом на подбор соответствующих фармакологических препаратов* Альтернативным подходом может служить разработка нефармакологиче-'

ских средств иммуномодуляции при гипоксии.

АОК/Ю6 я/с кл.

400

200

А

1+1

Результаты успешного применения таких методов, как АЭАП для усиления иммунного ответа при развитии инфекционных и вирусных заболеваний (ï.M.Sinetal , 1983), при лечении тимус-зависимых им-мунодефицитных состяний и связанных с ними "заболеваний (М.В.Вог-ралик и др., 1987), а также сведения о стресс-лимитирущем действии АЭАП (Ф.З.Меерсоя, 1981; A.ieng, 1986; 1.Р.Р1шшег, 1987) дают основание предполагать, что этот метод может оказаться эффективным для повышения гипоксической устойчивости организма и нормализации нарушенных показателей гуморального иммунного ответа при стрессе острой барокамерной гипоксии.

В работе испытывали четыре различных режима предъявления АЭАП, каждый из которых использовали в нормоксических и гипокси-ческих условиях. Режим №1 - ^-разовая АЭАП, проводимая перед "подъемом" в барокамере и каждые сутки пребывания в ней; Ш -2-разовая АЭАП, проводимая до и после пребывания животных в барокамере; №3 - одноразовая АЭАП - только до "подъема"; режим N4 - одноразовая АЭАП - только после "спуска"»

Результаты доследования различных режимов АЭАП на развитие вторичного иммунного ответа у мышей, содержащихся в Условиях барокамерной гипоксии, представлены в таблице 2. Иэ приведенных данных видно, что за исключением режима №3, АЭАП является весьма действенным средством коррекции сниженного иммунного ответа под влиянием гипоксического стресса. Проведение одноразовой АЭАП до гипоксического воздействия оказалось не эффективным в отношении изменения'количества AQK: Kj =■ 0,9 - з нормоксических условиях, Kg =• 0,8 - в гипонсических условиях. Судя по коэффициентам стимуляции, наиболее зыраненное иммуностимулирующее действие оказывает двухразовая АЭАП, проводимая до- и после окончания трехсуточного пребывания животных в барокамере (Kg = 3,95). Эффективной оказалась также АЭАП, проводимая, по окончании барокамерной гипок-

Таблица 2.

Влияние различных режимов АЭАП на антителообразование в нормо- и гипоксических условиях

№ режима АЭАП АОК/Ю^ ядросодер. кл. ч АОК/Ю6 ядросодер. кл.

Контиолъ №1 (нормоксия) Нормоксия + АЭАП Контроль №2 (гипоксия) Гипоксия + АЭАП

I 132+12 235+17* 1,8 63+20 180+15* 2,86

2 275+22 519+31* 1,9 79+13 312+11* 3,95

3 260+56 239+36 0,9 82+12 68+15 0-,83

4 278+28 292+33 1,1 118+20 420±35* 3,56

Примечание: В кедадой серии экспериментов использовали одинаковое количество.животных (30+2); К^ и - коэффициенты стимуляции (супрессии) по отношению к контролю I и 2 соответственно; * -достоверные (Р< 0,05) отличия от контрольных данных.

о

сии (К^ - 3,56). Вместе с тем такая же одноразовая АЭАП, проводимая животным на пике развития вторичного иммунного ответа в нормо-ксических условиях, не приводила к значительному изменению количества АОК в лимфатических узлах (К-^ = 1,1). При проведении ежедневной процедуры АЭАП коэффициент стимуляции антителопродукции был равен соответственно 1,8 - при нормальных и 2,9 - при гипоксических условиях.

Результаты проведенных исследований показали, что эффективное восстановление гуморального иммунного.ответа происходит при проведении АЭАП в продуктивную фазу иммунного ответа. Данное обстояте-

о ' А

льство позволяет предполагать, что в развитии корригирующего эффе-\ кта АЭАП принимает участие механизм, обеспечивающий нормальное развитие регуляторных процессов на уровне зрелых антителопродуцен-тов. Учитывая результаты предыдущих исследований (А.М.Василенко и соавт., 1985) и собственные данные, можно утверждать, что таким механизмом является усиление продукции миелопептидоз, происходя-

1ее под влиянием АЭАП. А.ЗАП полностью восстанавливает вызванный таоксическим стрессом дефицит продукции Ш в.костном мозге, окапает отчетливое иммуностимулирующее действие как в нормо-, так I в гипоксических условиях.

Эффекты стимуляции антителообразования с помощью АЭАП и инъ-зкций миелопида выражаются практически одинаковыми коэффициентами. Сак искусственное экзогенное возмещение дефицита продукции МП пре-гаратом миелопид, так и акгивация их естественного синтеза под злиянием АЭАП корригируют снижение вторичного иммунного ответа при гипобарической гипоксии.

Таким образом, из представленного в настоящем разделе экспериментального материала следует, что препараты миелопид и тимозин зракция 5, а также метод 'АЭАП являются достаточно эффективными :редствами коррекции иммунологической недостаточности, развиваю-цейся в условиях гипобарической' гипоксии, и могут быть использована при различных клинических формах вторичных иыиунодефицитов, в гатогенезе которых определенную роль играет гипоксия.

. ВЫВОДЫ

1. В условиях ^действия гипобарической гипоксии у животных наедаются нарушения в формировании вторичного иммунного ответа к ¡ритроцитам барана, что. проявляется в 2.-3-кратном'снижении коли-¡ества АОК в лимфатических узлах и селезенке. Степень снижения именного ответа зависит от продолжительности влияния гипоксии.

2. Всразвитии ишунодефицитного состояния при' воздействии на >рганизм барокамерной гипоксии важную роль играет снижение продук-[ии миелопептидов клетками костного мозга .стрессированных животных [/или уменьшение их функциональной активности, а также активация >клеток супрессоров.

5. Введение животным антагониста опиатов налоксона перед по-

ыещением их в условия барокаиерной'гипоксии блокирует развитие иммунодефицитного состояния, что указывает на участие опиатерги-ческой системы в формировании иммунодефицита, индуцированного ги-поксичеоким стрессом.

4. Препарат миелопид, введенный животным до воздействия ба-рокамерной гипоксии, предупреждает снижение гуморального иммунного ответа, индуцируемое гипоксическим стрессом. Влияние миелопида на фоне развившегося иммунодефицитного состояния оказывает выраженный корригирующий эффект.

5. Тимозин фракция 5 при его введении в индуктивную фазу иммунного ответа до стрессового воздействия ве только предотвращает стресс-индуцированную иммуносупрессию, но стимулирует антителооб-разованяе по оравнешш с иммунным ответом у животных, находящихся с в шриоксичёскюс условиях.

6. Аурикулярная электроакупунктура в 2-3 раза увеличивает ° продукцию мйелопептидов клетками костного мозга мьшей, подвергнутых воздействию барокаиерной типоксми, что сопровождается подъемом сниженного иммунного ответа к эритроцитам барана. АУрикуляр-ную электроакупунктуру можно рассматривать как эффективное немедикаментозное шшунокорригирувдее средство при лечении стрёсй-ИЩу-цированных йимунодефицитных состояний.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. С.В.Сорокин, Д.В.Сарыбаева, А.¿.Михайлова. Коррекция иммунного ответа под влиянием миелопептидов при иммунодефицита^.. - Тез^\ Респ.конф. "Актульные проблемы практической иммунологии", Таллинн, 1986, с. 57-58,

2. А.А.Михайлова, С.&Сорокин, У.В.Маджидов, Д4В*Сарыбаева. Коррекция мкелопептидами'иммунодефицитоз различной агиологии. -Тез.Всесоюзного сИШШзйума с международным участием "Иммуноде-

- 25 -

фициты и аллергия", Москва, 1986, с. 168.

3. Д.В.Сарыбаева, Л.А.Захарова, А.М.Василенко, А.А.Михайлова, £. Т.Т^лебеков. Имыуномодулирующее действие миелопептидов при ги-'поксической гипоксии у животных. - Журнал "Бюллетень экспериментальной биологии и цедицины", 1988, № 12, с. 691-692.

4. А.М.Василенко, Е.А.Кирилина, Д.В.Сарыбаева. Профилактика и коррекция вызванного стрессом иммунодефицитного состояния методом аурикулярной электроакупунктуры. - Журнал "Патологическая физиология и экспериментальная терапия", 1989, К; 3, с. 21-24.

5. А.А.Михайлова, Л.А.Захарова, Е.А.Кирилина, Д.В.Сарыбаева. Механизмы снижения иммунного ответа при стрессе и его коррекция ми-елопидом. - Тез.Всесоюзной конф. "Стресс и иммунитет", Ростов-на-Дону, 1989, с. 31-32.

6. Д.В.Сарыбаева, Л.А.Захарова, А.А.Михайлова. Активация неспецифических Т-клеток супрессоров в условиях барокамерной гипоксии. - Журнал "Иммунология", 1990, № I, с. 66^68,