Автореферат и диссертация по медицине (14.00.02) на тему:Морфология лимфатических узлов брюшной полости в норме и при экспериментальном иммунодефиците

на правах рукописи

КОДИНА ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА

МОРФОЛОГИЯ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ БРЮШНОЙ ПОЛОСТИ В НОРМЕ И ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ИММУНОДЕФИЦИТЕ

14.00.02 анатомия человека

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ярославль - 2005

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ивановская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской Федерации»

Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор

Катаев Станислав Иванович

Официальные оппоненты.

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Козлов Валентин Иванович Левин Вячеслав Наумович

Ведущая организация

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет Министерства здравоохранения Российской Федерации»

заседании диссертационного совета К 208.119.01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ярославская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской Федерации» (150000, г. Ярославль, ул. Революционная, д.5)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ярославская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской Федерации»

Автореферат разослан » ОВЯ&'СМиЯ 200^г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Румянцева Т.А.

Защита диссертации состоится

в

часов на

Актуальность научного исследования Лимфатические узлы (ЛУ) имеют огромное функциональное значение для организма, как в норме, так и при патологических процессах (Выренков Ю Е с соавт, 1995) В связи с развитием иммунологии внимание исследователей оказалось сфокусированным на изучении ЛУ, поскольку данные органы являются эффекторным звеном иммунологических реакций, где происходит контакт генетически чужеродного материала с иммунокомпетентными клетками Изучение изменений параметров звеньев иммунологических реакций может явиться адекватным тестом в определении действия лекарственных—веществ, непосредственно влияющих на ЛУ (Дейл ММ с соавт, 1998)

Возросшее количество иммунодефицитных состояний с одной стороны, и применение методов коррекции этих состояний - с другой, ставят перед исследователями очень актуальный на сегодняшний день вопрос о реактивности лимфатической системы в целом и ее важнейшего звена - ЛУ, в частности Эндолимфатическое введение иммуностимуляторов является малоизученным методом, особенно, с точки зрения воздействия их на морфологию ЛУ, хотя иммуномодуляторы все чаще применяются при иммунодефицитных и имму-нодепрессивных состояниях Поэтому актуальной в настоящее время задачей является морфологическая оценка изменений, происходящих в ЛУ при иммунодефицитных состояниях, а также морфологическая оценка эффективности эндолимфатического введения иммуномодуляторов с целью коррекции данных состояний

Ключевая роль в патогенезе воспаления принадлежит ЛУ (Сапин М.Р с соавт, 1978, Банин В В, 1982, Куприянов В В, 1983, Бородин Ю И с соавт, 1987, Миносян Л А., 1991) Являясь главным препятствием распространению инфекции на пути от патологического очага в кровеносное русло, ЛУ претерпевают ряд изменений, которые могут быть как защитно-приспособительными, так и патологическими Оценка реакции ЛУ на инфекционные процессы, особенно на фоне все более широкого внедрения в клиническую практику эндолимфатического введения лекарственных препаратов, позволит стимулировать естественные защитные силы организма, что и является конечной целью патогенетической терапии (Покровский В И с соавт, 1994, Выренков Ю Е, Вторенко В И, 1996, Вторенко В И, 2002, Выренков Ю Е, Шевхужев 3 А, 2003, Ярема И В, Бабаев Р С, 2003)

Цель и задачи исследования Целью данной работы явилось изучение морфологии лимфатических узлов брюшной полости в норме, при экспериментальном иммунодефиците, воспалительном процессе и в условиях эндолимфатического введения лекарственных препаратов

В соответствии с целью были поставлены следующие основные задачи исследования

1. Выявить с помощью современных и адекватных морфологических и морфометрических методов изучения лимфатической системы микроанатомические параметры лимфатических узлов брюшной полости у интактных крыс.

2. Определить влияние эндолимфатического введения физиологического раствора на структурно-функциональные параметры лимфатических узлов брюшной полости.

3. Выявить морфологические особенности перестройки лимфатических узлов брюшной полости крыс при тимэктомии.

4. Определить влияние эндолимфатического введения имунофана на фоне тимэктомии на структурно-функциональные преобразования лимфатических узлов брюшной полости.

5. Выявить морфологические особенности перестройки брыжеечных лимфатических узлов при экспериментальном воспалении.

6. Определить влияние эндолимфатического введения роцефина в комплексе с имунофаном на структурные преобразования брыжеечных лимфатических узлов при экспериментальном воспалении.

Научная новизна исследования. На основе сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) выявлены закономерности организации рельефа поверхности эндотелия синусов лимфатических узлов и определена пространственная организация ретикулярной ткани в пределах лимфатических синусов. Впервые определено иммуномодулирующее влияние имунофана на ткань лимфатических узлов брюшной полости при эндолимфатическом его введении на фоне тимэктомии. Впервые выявлено стимулирующее влияние эндолимфатического введения физиологического раствора на показатели иммунологической активности лимфатических узлов брюшной полости. Впервые определены морфологические критерии эффективности влияния эндолимфатического введения роцефина в комплексе с имунофаном, на фоне экспериментального воспаления, на структурные параметры брыжеечных лимфатических узлов.

Практическая ценность полученных результатов. Созданная модель иммунодефицитного состояния в комплексе с эндолимфатическим введением имунофана дает возможность для проведения дальнейших исследований в области изучения морфологии лимфатических узлов при иммунодефицитах различного генеза. Комплекс морфологических тестов позволит достаточно быстро оценивать некоторые иммунологические функции лимфатических узлов без применения дорогостоящих методов. Эндолимфатический путь введения имунофана и роцефина можно рекомендовать для рассмотрения к применению в клинике для лечения вторичных иммунодефицитов и воспалительных заболеваний. Данные о морфологической организации компонентов лимфатических синусов и

гемомикроциркуляторного русла (ГМЦР) лимфатического узла могут быть использованы в учебном процессе при преподавании анатомии, гистологии, физиологии и иммунологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Микроциркуляторное русло лимфатических узлов брюшной полости и ретикулярные волокна их синусов имеют локальные особенности организации.

2. Эндолимфатическое введение физиологического раствора оказывает влияние на показатели иммунологической активности лимфатических узлов брюшной полости.

3. Тимэктомия и эндолимфатическое введение имунофана на фоне экспериментального иммунодефицита приводят к изменению количественного соотношения лимфоидных элементов, показателей пролиферативной и миграционной активности в лимфатических узлах брюшной полости.

4. Экспериментальное воспаление в полости брюшины, вызванное золотистым стафилококком приводит к изменению иммунологической активности брыжеечных лимфатических узлов, показателей объемной плотности их гемомикроциркуляторного русла и лимфатических синусов, трансэндотелиального массопереноса в эндотелиоцитах лимфатических синусов.

5. Эндолимфатическое введение роцефина и имунофана на фоне экспериментального воспаления в полости брюшины оказывает влияние на структурные образования брыжеечных лимфатических узлов, обеспечивая их иммунокомпетентность.

Апробация работы и публикации Основные положения диссертации доложены на объединенной научной сессии Российской медицинской академии естественных наук (Москва, 1996); И сессии Российской медицинской академии последипломного образования, посвященной 850-летию Москвы (Москва, 1997); 7 Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2000); конгрессе лимфологов России (Москва, 2000); всероссийской научной конференции «Молодые женщины в науке» (Иваново, 2004); международной научной конференции «Проблемы лимфологии и интерстициального массопереноса» (Новосибирск, 2004); межкафедральной конференции ГОУ ВПО ИвГМА Минздрава России (2004).

По материалам исследования опубликовано 11 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 163 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследования, результатов исследования (8 разделов), их обсуждения, заключения и выводов. Список использованной литературы состоит из 200 источников, из них 127 отечественных и 73 иностранных. Работа содержит 54 рисунка и 16 таблиц.

Материал и методы исследования. Материалом исследования явились 114 половозрелых нелинейных крыс (самцов), массой 190-220 грамм Животные были разбиты на шесть групп 1 группа - контрольная, 6 интактных животных 2 группа (12 крыс) -животные с эндолимфатическим введением физиологического раствора, в дозе 0,5 мл, сроки забора материала через 12 и 24 часа от начала эксперимента 3 группа (24 крысы) - модель иммунодефицита, в результате удаления вилочковой железы у взрослых животных (сроки забора через 30, 45, 60 и 75 суток после тимэктомии) 4 группа (24 крысы) - животные с эндолимфатическим введением имунофана на фоне модели иммунодефицита, обусловленного тимэктомией (сроки забора через 30, 45, 60 и 75 суток после тимэктомии) Имунофан вводился в дозе 0,2 мкг в 1 мл, через 20 суток после тимэктомии, 1 раз в сутки, с интервалом через день, всего 5 инфузий (Машковский М Д, 2000) 5 группа (24 крысы) -животные с созданием модели воспаления (внутрибрюшинно животным вводили по 60 млрд микробных тел в 1 мл объема культуры золотистого стафилококка (штамм 13407)), исследуемый материал забирался через 1, 3, 5 и 7 суток после инокуляции микроорганизмов 6 группа (24 крысы) - эндолимфатическое введение антибиотика роцефина и имунофана, с целью коррекции модели воспаления, возникшего в результате внутрибрюшинного введения 60 млрд микробных тел в 1 мл объема. Антибиотик вводили эндолимфатически в дозе 4 мг/100 г веса в объеме 1 мл, один раз в сутки (Машковский М Д, 2000) Через 2 часа в тот же катетер на 1-ый, 3-ий, 5-ый день от начала эндолимфатической терапии вводили имунофан в дозе 0,2 мкг в объеме 1 мл Эндолимфатическую терапию начинали через 18 часов после заражения животных и продолжали до 7 суток эксперимента

В работе были использованы следующие методы исследования

1. Световая микроскопия. Для исследования забирали брыжеечные и тазовые ЛУ -у первых четырех групп животных и брыжеечные ЛУ - у животных пятой и шестой групп Биологический материал фиксировали в 10% забуференном формалине (для приготовления парафиновых срезов толщиной 5-7 мкм, затем окрашиваемых гематоксилин-эозином и азур-эозином) и в 2,5 % растворе глютарового альдегида (для приготовления полутонких срезов толщиной 1 мкм, окрашиваемых толуидиновым синим)

2. Электронная микроскопия. Для морфологических исследований использовали 3 метода СЭМ коррозионных, нативных и импрегнированных препаратов Для получения коррозионных препаратов ГМЦР ЛУ, после перфузии сосудистого русла гепаринизированной средой 199, инъецировали предполимеризованный метилметакрилат с добавлением 2% перекиси бензоила и 2% диметиланилина. После затвердения смолы, ЛУ иссекали и подвергали мацерации в 30% растворе №ОН при температуре 60°С Затем препарат отмывали и высушивали на воздухе Для приготовления нативных препаратов

биологический материал фиксировали перфузией 2,5% раствора глютаральдегида на среде 199, дофиксировали в том же фиксаторе, обрабатывали 1% раствором осмиевой кислоты, обезвоживали в этаноле восходящей концентрации Затем образцы замораживали в жидком азоте и раскалывали После оттаивания в 96% этаноле процесс обезвоживания продолжался, препараты высушивали путем перехода через критическую точку в СО2 и напыляли золотом Для приготовления импрегнированных препаратов после перфузионной фиксации, ЛУ отмывали в течение 1 мин 5% раствором глюкозы Затем последовательно перфузировали 0,15% раствором AgN03, 5% раствором глюкозы, 3% СоВг и 1% NHBr, 5% раствором глюкозы и 2,5% раствором глутарового альдегида, после чего образцы готовили для СЭМ по описанной выше методике Анализ коррозионных, нативных и импрегнированных препаратов проводили в сканирующих электронных микроскопах Phillips PSEM-500x, Hitachi S-405A со съемкой на коммерческую широко- и узкоформатную пленку

3. Метод криофрактографии. В качестве консерванта был использован 2,5% раствор глютарового альдегида, из которого препарат помещали в криопротектант (25% раствор глицерина) После этого образец погружался во фреон-22, охлаждаемый жидким азотом и находившийся при нормальном атмосферном давлении на грани плавления-замерзания (температура- 160°С) Затем проводилось скалывание Разломанные поверхности напыляли последовательно платиной и углем Отделение реплики от тканевого материала производилось путем растворения последнего в растворителе (25%-й раствор хромпика) После этого производилось электронно-микроскопическое изучение полученной реплики и фотографирование

4. Метод морфометрии. Вычисление объемной плотности лимфоидных элементов ЛУ и объемной плотности кавеол эндотелия лимфатических синусов проводили по методу Г Г Автандилова (1972, 1973) с помощью окулярной 100-точечной сетки При этом подсчитывали количество точек, совпадающих с исследуемыми клеточными элементами. Количество точек, совпавших с клетками равно объемной плотности исследуемого объекта.

Вычисление индекса митотической активности (И мит) На одном срезе учитывали от 3 до 6 герминтативных центров, в которых подсчитывали количество лимфоидных клеток с фигурами митозов Отношение количества митозов к количеству исследованных вторичных фолликулов представляет собой индекс митотической активности данного узла (Антропова ЮГ, 1991) Этот индекс отражает пролиферативную активность лимфоидных элементов герминтативного центра, который может снижаться, иногда до нуля при иммунодепрессивных состояниях (Fossum S, 1990) и значительно повышается при антигенной стимуляции Формула для вычисления Имит

Имит=N митозов N вторичных фолликулов

Вычисление индекса миграционной активности (Имигр ) заключается в вычислении отношения суммарного количества лимфоцитов, находящихся в просвете посткапиллярных венул (ПКВ) и лимфоцитов, адгезированных к стенке ПКВ к количеству исследованных ПКВ на данном срезе При иммунодефицитах удлиняется время рециркуляции (Duyvestijn AM. et al, 1987), уменьшается количество мигрирующих лимфоцитов, что подтвч"рждается сокращением индекса миграции При антигенной стимуляции имеет место обратный процесс Формула для вычисления Имигр

Имигр = (N своб лимф + N адгезир лимф ) NnKB

Плотность ГМЦР и лимфатических синусов ЛУ определяли проецируя негативы на стандартную квадратно-узловую сетку и обводя контуры кровеносных микрососудов и лимфатических синусов разных зон ЛУ

5. Лабораторные исследования крови. Общее количество лейкоцитов в периферической крови определялось следующим образом 0,02 мл периферической крови + 0,4 мл 3%-ной уксусной кислоты (для лизиса эритроцитов), перемешивали, помещали в камеру Горясва, затем подсчитывали количество лейкоцитов в 100 больших квадратах Для вычисления относительного количества лимфоцитов готовился мазок крови с докраской по Романовскому-Гимза. В мазке вычислялось процентное содержание лимфоцитов (№лф%) по отношению к количеству лейкоцитов, далее вычислялось абсолютное количество лимфоцитов

Экспресс метод для определения степени активации ИММУННОЙ системы является модификацией метода Хаммера (Hammer Z, 1981) Выделение мононуклеарных клеток производилось с помощью центрифугирования в растворе фиколла-верографина с плотностью 1,077 г/см куб в течение 30 минут Из концентрата производился мазок, который окрашивался горячим красителем Гимза, промывался проточной водой и затем исследовался под микроскопом при увеличении 7x100 На 100 обнаруженных лимфоцитов подсчитывалось относительное количество малых, активированных и бластных форм лимфоцитов Индекс активации высчитывался по формуле И акт = (Лб + Ла 5) Лм, где Лб - количество лимфобластов, Ла - количество активированных к бластгрансформации лимфоцитов, Лм - количество малых лимфоцитов

При активации иммунной системы в крови появляются бластные и активированные формы лимфоцитов, следовательно, возрастает индекс активации иммунной системы и наоборот Следовательно, по изменению индекса активации в эксперименте, по сравнению с контролем, можно судить о стимуляции или о депрессии иммунной системы

6. Статистическая обработка результатов. Обработка полученных цифровых данных выполнена по программе на микро-ЭВМ «Электроника МК-61» и при помощи

пакетов прикладных программ «Microsoft Excel 7 0». Для каждого показателя вычисляли среднюю арифметическую и ее ошибку, достоверность отличий оценивали по t-критерию Стьюдента, При помощи корреляционного анализа определяли характер и степень связи между показателями, отражающими морфофункциональное состояние ЛУ. В работе был использован коэффициент корреляции Пирсона.

Результаты исследования

На гистологических препаратах ЛУ крыс имеется хорошо выраженная корковая зона (кортекс), содержащая основную часть фолликулов, и мозговое вещество, состоящее из мозговых тяжей и мозговых синусов. Паракортекс ЛУ крыс сосредоточен под скоплением фолликулов и имеет характер дискретных образований с размытыми очертаниями, без отчетливых границ. Большинство лимфатических фолликулов располагается в корковой зоне по периферии ЛУ, в меньшем количестве они встречаются и в более глубоких слоях паренхимы

Интраорганные кровеносные сосуды образуют очень густые сети, особенно в корковом веществе ЛУ. Капиллярные сети в виде крупнопетлистых образований плотно окутывают лимфатические фолликулы, в то время как их расположение в паракортикальной области и по ходу мозговых тяжей можно охарактеризовать как диффузное.

Как известно, иммиграция лимфоцитов осуществляется через стенки ПКВ. При исследовании с помощью СЭМ было выявлено, что внутренняя поверхность эндотелия ПКВ имеет вид "булыжной мостовой" с глубокими щелями, разделяющими клетки, и эта характерная черта является их отличительным признаком. В литературе, касающейся ПКВ, широко дискутируется вопрос о том, каким образом происходит проникновение лимфоцитов через стенку В настоящее время большинство авторов и наше исследование с помощью СЭМ убедительно подтверждает чрезклеточный путь прохождения лимфоцита, который сводится к тому, что первый контакт лимфоцита с эндотелиальной клеткой завершается преодолением клеточной мембраны и проникновением лимфоцита внутрь цитоплазмы эндотелиоцита (Farr A G, Bruyn P P H. de, 1975)

В просвете синусов находится большое количество ретикулярных волокон При изучении нативных препаратов было выявлено, что сети ретикулярных волокон имеют четкую пространственную организацию В одних случаях они имели упорядоченное направление, подобно аркадам, в других случаях они располагались хаотично, что чаще наблюдалось в маргинальном синусе, промежуточном корковом и в месте перехода последнего в мозговые синусы Данные СЭМ обьективно показывают, что тела ретикулярных клеток располагаются за стенкой синуса, а их отростки (волокна) пронизывают его просвет, проникая через щели между эндотелиальными клетками,

выстилающими лимфатические синусы В просвете синуса в значительном количестве встречаются лимфоциты и макрофаги, как свободные, так и фиксированные на поверхности ретикулярных волокон Эндотелию лимфатических синусов так же, как и другим типам сосудистого эндотелия, присущи единые закономерности пространственной организации Кроме того, следует отметить высокую органоспецифичность эндотелия синусов, в составе которого определяются отростки клеток ретикулярной ткани и макрофаги, необходимые для выполнения иммунной функции ЛУ В стенках синусов имеется множество непостоянных отверстий, через которые осуществляется эмиграция лимфоцитов из паренхимы ЛУ в лимфатическое русло Это происходит в основном в маргинальном, промежуточном корковом и проксимальном отделе промежуточного мозгового синусах

Данное исследование показало, что обе группы изученных узлов лишь незначительно отличаются друг от друга по показателям объемной плотности лимфоидных элементов И в брыжеечных, и в тазовых ЛУ объемная плотность лимфоцитов существенно выше объемной плотности лимфобластов При сравнении между собой брыжеечных и тазовых ЛУ интактных животных, в плане изучения их иммунологической активности, с учетом примененных морфометрических критериев, оказалось, что индексы митотической и миграционной активности брыжеечных ЛУ соответственно на 9 и 30% выше, чем аналогичные показатели в тазовых ЛУ (табл 1) Следовательно, можно предположить, что брыжеечный узел является более иммунологически активным, чем тазовый

Таблица 1.

Показатели митотической и миграционной активности в ЛУ при эндолимфатическом введении физраствора

Брыжеечные ЛУ Тазовые ЛУ

Имит. Имигр. Имит. Имигр.

Коитроль 12,34+0,46 3,51+0,02 11,31 ±0,56 2,71+0,04

Эндолнмфатическое введение физраствора 13,74+0,23* 3,84+0,06* 13,40+0,60* 3,11±0,06*

Примечание звездочкой (*) отмечены значения, достоверно отличающиеся от контроля (р<0,05)

Надо отметить, что подобные факты отличия структуры ЛУ различных топографических групп отмечались ранее при исследовании ЛУ человека (Трясучев П М, 1983, Бородин Ю М с соавт, 1987, 1990, Банин В В, 2000) В этих исследованиях авторы выносят на обсуждение положение о тесной взаимосвязи между расположением, объемом и антигенной насыщенностью притекающей лимфы, и морфологическими характеристиками ЛУ Так, Ю М Бородин с соавторами (1990) считают, что ЛУ человека в порядке уве-

личения напряженности иммунологических процессов можно выстроить в следующий рейтинговый ряд подмышечные, подвздошные, шейные, брыжеечные, из этого следует, что брыжеечные ЛУ человека принимают наиболее насыщенную антигенным материалом лимфу Исходя из этого, хотелось бы обратить особое внимание на то, что далеко не всегда можно экстраполировать данные, полученные на экспериментальных животных, на человека, учитывая поведенческие и физиологические особенности экспериментальных животных

У II группы экспериментальных животных после эндолимфатического введения физраствора было обнаружено возрастание объемной плотности лимфатических синусов брыжеечных и тазовых ЛУ на 14% и 23% соответственно, по сравнению с показателями контрольной группы (табл 2)

Таблица 2.

Объемная плотность ГМЦР, лимфатических синусов и кавеол эндотелия лимфатических синусов ЛУ при эндолимфатическом введении физиологического

раствора

Показатели Брыжеечные ЛУ Тазовые ЛУ

Контроль Эндолнмфати-ческое введение физраствора Контроль Эндолимфати-ческое введение физраствора

Объемная плотность ГМЦР 16,8+0,32 16,7+0,21 16,1+0,42 15,9+034

Объемная плотность лимфатических синусов 14,1+0,08 16,1+0,07* 13,7+0,09 16,9+0,06*

Объемная плотность кавеол 2,7+0,07 3,1±0,10* 2,5+0,04 2,9+0,05*

Примечание звездочкой (*) отмечены значения, достоверно отличающиеся от контроля (р<0,05)

Также определялось возрастание количества пролиферирующих клеток в лимфатических фолликулах и лимфоцитов, мигрирующих через стенки ПКВ (табл 1) Эти факты свидетельствуют о стимулирующем влиянии инфузии физиологического раствора эндолимфатическим путем на органы периферической иммунной защиты

Через сутки после эндолимфатического введения физиологического раствора исследуемые ЛУ не имели отличий от ЛУ интактных животных Таким образом, выявляемые преходящие изменения в ЛУ после эндолимфатической инфузии изотонического раствора свидетельствуют о гипергидратации паренхимы и путей интранодулярной циркуляции лимфы Поступаемые при этом в кровяное русло лимфоциты

довольно быстро мигрируют в ЛУ других областей тела, что может само по себе способствовать интенсификации обмена иммунологической информацией при наличии антигенного раздражителя

Криофрактографическое исследование показало, что после эндолимфатического введения физраствора происходило увеличение плотности кавеол эндотелия лимфатических синусов и в брыжеечных, и в тазовых ЛУ (табл 2) Эти данные свидетельствуют о возрастании интенсивности процессов трансэндотелиального массопереноса в эндотелиоцитах лимфатических синусов

После тимэктомии животные были малоподвижны, часть животных (58 % крыс) теряли в весе на 13-20%, у 33 % крыс отмечалось заметное разрежение волосяного покрова, у 67 % - незначительное разрежение, у 79 % крыс - через месяц после операции наблюдалось обильное гнойное отделяемое из глаз Данная модель также сопровождалась снижением общего количества лейкоцитов и лимфоцитов крови Общее количество лейкоцитов в целом не значительно отличалось от контрольных величин, при этом максимальное отклонение составляло всего 17%, в то же время относительное и абсолютное количество лимфоцитов было сильно снижено (на 54 и 61 % соответственно) К 75 суткам эксперимента эти показатели возрастали, но все равно были еще далеки от контрольных цифр На фоне тимэктомии происходило снижение индекса активации По истечении 1-1,5 месяцев отмечалась определенная тенденция к самокоррекции, которая, однако, не приводила к нормализации количественных показателей Применение эндолимфатической иммуностимуляции на фоне тимэктомии дало эффект значительного увеличения темпов восстановительных процессов Общее количество лейкоцитов к 75 суткам эксперимента было ниже показателей контроля всего на 0,2%, а относительное и абсолютное количество лимфоцитов - на 6% Индекс активации также был выше показателя, полученного у животных без эндолимфатического введения имунофана.

Лимфатические узлы, полученные от тимэктомированных животных, характеризовались очаговым обеднением лимфоидными элементами паракортекса, преобладанием в нем ретикулярных элементов, сокращением количества мигрирующих через ПКВ лимфоцитов Отмечалось угнетение активности герминтативных центров В ряде первичных фолликулов вообще не было обнаружено развитых герминтативных центров Плотность лимфоцитов в мозговых тяжах и синусах также снижалась Морфометрическое исследование ЛУ тимэктомированных животных показало, что удаление вилочковой железы у половозрелых животных приводит к изменениям количественных показателей лим-фоидных элементов во всех зонах изученных ЛУ (табл 3,4)

Показатели объемной плотности лимфоидных элементов различных зон брыжеечных ЛУ после тимзктомии

Зоны ЛУ Клеточные элементы Контроль Модель иммунодефицита Эндолимфатическое введение нмунофана на фоне модели иммунодефицита

30 суток 45 суток 60 суток 75 суток 30 суток 45 суток 60 суток 75 суток

Кортекс Лимфоциты 64,68+0,66 22,66+0,42» 32,20+0,69* 37,06+0,51* 42,53+0,46* 23,53+0,59* 42,33+0,51* 50,40+0,86* 53,63+0,86*

Лимфобласты 20,36+1,04 5,33+0,82* 8,00+0,85* 8,53+0,84* 9,70+0,62* 10,21+0,48* 13,96+0,46* 15,96+0,54* 17,73+1,03

Т- зоны Лимфоциты 70,65+1,07 19,13+0,56* 20,26+0,71 * 23,00+0,44* 26,67+0,75* 23,67+0,69* 41,76+0,67* 56,27+0,87« 68,13±1,05

Плазмоциты 14,76±0,53 5,00+0,78* 6,40+0,51* 10,46+0,68* 9,27+0,89* 4,93+0,87* 9,23+0,65* 14,27+0,46 14,84+1,05

Лнмфоблясты 12,24+0,88 5.13+0,79* 5,80+0,63* 8,26+0,95* 7,82+0,85* 6,40+0,72* 10,08+0,43* 14,33+0,57* 18,33+0,84*

Мозговые тяжи Лимфоциты 31,08+0,62 14,93+0,89* 12,93+0,73* 18,25+0,59* 22.13+0,82* 16.13+0,54* 22,27+0,62* 27,52+0,62* 29,64+0,98

Плазмоциты 30,21+0,86 17,61+0,61* 18,46+0,68* 21,47+0,47* 22,36+0,65* 16,94+0,44* 19,23+0,42* 28,11+0,97 29,07+1,08

Примечание: звездочкой (*) отмечены значения, достоверно отличающиеся от контроля (р<0,05).

Показатели объемной плотности лимфоидных элементов различных зон тазовых ЛУ после тимэктомии

Зоны ЛУ Клеточные элементы Контроль Модель иммунодефицита Эндолнмфатнческое введение имунофана на фоне модели иммунодефицита

30 суток 45 суток 60 суток 75 суток 30 суток 45 суток 60 суток 75 суток

Кортекс Лимфоциты 66,28+0,83 49,81+0,43* 52,73+0,55* 55.73+0,82* 62,00+1,05* 51,33+0,79* 59,00+0,62* 60,73+0,54* 66,40+1,02

Лимфобласты 20,88+0,51 12,00+0,49* 15,67+0,45* 17,73+0,71* 19,21+1,13 13,13+0,84* 19,75+1,08 18,93+1,06 20,13+1,06

Т- зоны Лимфоциты 72,60+0,75 49,06+0,74* 51,73+0,59* 55,46+0,67* 57,21+0,47* 50,67+0,73* 59,93+0,46* 66,93+0,81* 70,26+0,98

Плазмоциты 10,00+0,62 4,42+0,79* 3,42+0,67* 5,13+0,77* 4,73+0,90* 4,86+0,87* 5,67+0,85* 7,01+0,51* 7,07+1,13

Лимфобласты 13,04+0,89 6,93+0,56* 5,75+0,81* 7,23+0,98* 6,93+0,73* 7,27+0,83* 11,13+1,04 13,40+1,16 16,67+0,58*

Мозговые тяжи Лимфоциты 35,12+0,54 20,00+0,67* 19,72+0,45* 25,67+0,48* 28,00+0,42* 21,67+0,57* 27,87+0,47* 34,72+1,09 36,65+1,07

Плазмоциты 35,08+0,69 22,13+0,46* 20,66+0,73* 24,13+0,94* 28,26+0,79* 19,87+0,45* 27,21+0,70* 28,87+1,14 26,93+0,44*

Примечание, звездочкой (*) отмечены значения, достоверно отличающиеся от контроля (р<0,05)

Априори предполагалось, что удаление центрального органа дифференцировки Т-лимфоцитов существенно сказывается лишь на Т-зависимых зонах ЛУ. Однако количественные изменения объемной плотности лимфоцитов и, особенно, лимфобластов после данной операции имеют место как в Т-зависимых зонах, так и в герминтативных центрах Таким образом, элиминация центра Т-клеточной дифференцировки приводит к угнетению иммуноцитопролиферативной активности в B-зонах, те. в лимфатических фолликулах, а, следовательно, к угнетению гуморального звена иммунитета. Это понятно, учитывая регуляторное влияние Т-клеточной популяции на гуморальное звено иммунной системы. Более выражена была реакция на воздействие брыжеечных ЛУ, где отклонения от нормальных величин были наибольшие. Так, объемная плотность лимфоцитов и лимфобластов лимфатических фолликулов брыжеечных ЛУ через 30 суток после тимэктомии была снижена соответственно на 65 и 74% (по сравнению с контрольными показателями), а объемная плотность тех же лимфоидных элементов тазовых ЛУ -соответственно на 25 и 43%. Показатели объемной плотности лимфоцитов, плазмоцитов и лимфобластов паракортекса брыжеечных узлов через 30 суток после тимэктомии были снижены соответственно на 73, 66 и 58% (по сравнению с контролем), а тазовых узлов -соответственно на 33, 56 и 47% Показатели митстической и миграционной активности иммунокомпетентных клеток брыжеечных ЛУ в эти сроки эксперимента были снижены соответственно на 38 и 60% (по сравнению с контрольными показателями), а тазовых ЛУ -соответственно на 37 и 35% (табл 5)

Таблица 5.

Показатели митотическоя и миграционной активности в ЛУ при различных экспериментальных воздействиях

Группы экспериментальных животных Брыжеечные ЛУ Тазовые ЛУ

Имнт. Имигр. Имнт. Имнгр.

Контроль 12,34+0,46 3,51+0,02 11,31+0,56 2,71+0,04

Тимэктомии 30 суток 45 суток 60 суток 75 суток 7,66+0,27* 7,91+0,16* 8,12+0,23* 8,32+0,34* 1,42+0,02* 1,50+0,02* 1,54+0,03* 1,61+0,03* 7,12+0,31* 7,37+0,37* 7,64+0,27* 8,11+0,44* 1,75+0,01* 1,86+0,02* 1,99+0,04* 2,21+0,03*

эндолвмфати-ческое введение имунофаяа 30 суток 45 суток 60 суток 75 суток 7,99+0,26* 8,64+0,24* 9,82+0,41* 11,96+0,38 1,60+0,04* 2,34+0,05* 2,92+0,04* 3,34+0,02* 7,57+0,47* 8,52+0,21* 9.63+0Д4* 10,70+0,47 1,91+0,02* 2,27+0,01* 2,56+0,02* 2,69+0,01

Примечание звездочкой (*) отмечены значения, достоверно отличающиеся от контроля (р<0,05).

Сопоставление интенсивности реакции на тимэктомию изученных групп ЛУ позволяет утверждать, что наиболее активные в иммунологическом плане брыжеечные ЛУ выраженнее реагируют на тимэктомию

Динамические наблюдения дают основание придти к выводу о слабой интенсивности восстановительных процессов в ЛУ после тимэктомии Даже к 75 суткам после операции показатели объемной плотности лимфоидных элементов во всех ЛУ еще далеки от контрольных величин (исключение составляют лишь лимфоидные элементы лимфатических фолликулов тазовых ЛУ) (табл 3, 4) Это дает основание предполагать отсутствие тенденции полной нормализации количественных показателей Аналогичная картина наблюдалась в отношении показателей процессов пролиферации и миграции, которые к 75 суткам после тимэктомии были снижены, относительно контрольных данных, в брыжеечных ЛУ - соответственно на 33 и 54%, а в тазовых ЛУ - соответственно на 28 и 19% Тимэктомия вызывает наиболее выраженные изменения в Т-зависимых зонах ЛУ В то время как к 75 суткам после операции имеется тенденция к нормализации объемной плотности лимфоидных элементов лимфатических фолликулов и мозговых тяжей, в паракортикальной зоне количество лимфоцитов остается практически на исходных показателях, лишь незначительно увеличиваясь

Эндолимфатическое введение имунофана тимэктомированным животным оказывает заметное влияние на количественные показатели лимфоидных элементов Это проявляется в том, что к 75 суткам после тимэктомии отмечается возрастание показателей объемной плотности лимфоидных элементов во всех зонах ЛУ почти до контрольных величин и даже несколько выше Об этом же свидетельствует и анализ Имит и Имигр, которые превышают показатели, полученные от тимэктомированных животных, не получавших эндолимфатическую терапию Так индекс митотической активности в брыжеечных ЛУ к 75 суткам после удаления вилочковой железы, на фоне эндолимфатического введения имунофана был снижен всего на 3%, индекс миграции - на 5 % (по сравнению с контрольными величинами), а в тазовых ЛУ эти показатели были снижены соответственно на 5 и 1 %

Корреляционный анализ, проведенный в группе животных с моделью иммунодефицитного состояния, выявил шесть сильных положительных корреляционных связей между исследуемыми параметрами (рис 1) По мере возрастания срока эксперимента параллельно увеличиваются Имит, Имигр, индекс активации и объемная плотность лимфоцитов паракортекса ЛУ, следовательно, можно говорить о взаимосвязи морфометрических показателей ЛУ с данными лимфоцитограммы крови, тес данными о

количестве свободно циркулирующих активированных к бластгрансформации клеток и свободных лимфобластов крови.

Рис.1. Циклограмма корреляционных связей межу параметрами брыжеечных ЛУ у крыс после тимэктомии (А) и при эндолимфатическом введении нмунофана с

целью коррекции модели иммунодефицитного состояния (Б).

П р и м е ч а _ р е д н я я положительная корреляционная связь,

——— сильная положительная корреляционная связь. Иакт. - индекс активации, "Угаф. - объемная плотность лимфоцитов паракортекса ЛУ, "Угаб. - объемная плотность лимфобластов паракортекса ЛУ, Утал. - объемная плотность плазмоцитов паракортекса ЛУ, Ь - общее количество лейкоцитов крови, Лф кр. -лимфоциты крови.

При иммунодефиците наблюдалось угнетение иммунологических функций ЛУ, сопровождающееся снижением интенсивности иммуноцитопоэтической функции, в крови это проявлялось в уменьшении количества активированных и бластных форм. Индекс активации характеризует иммунную систему как самокоррегирующуюся, самонастраивающуюся. И его повышение в крови совпадает с увеличением объемной плотности лимфоцитов в ЛУ. И, наоборот, снижение названных показателей в ЛУ и в крови, особенно снижение индекса активации, позволяет судить об угнетении иммунной системы. У животных с эндолимфатическим введением имунофана на фоне тимэктомии сохраняются сильные положительные корреляционные связи между - Имит., Имигр., индексом активации и объемной плотностью лимфоцитов паракортекса ЛУ. В то же время возникают новые ряды параметров с сильной положительной связью (рис. 1). Исходя из этого, можно считать, что при активации иммунной системы происходит повышение митотической активности иммунокомпетентных клеток, а, следовательно, повышается объемная плотность лимфоцитов ЛУ, ускоряются процессы миграции лимфоцитов, увеличивается общее количество лейкоцитов и абсолютное количество лимфоцитов крови, и наоборот. Таким образом, из всего этого вытекает положение о тесной взаимосвязи и взаимозависимости показателей крови с морфофункциональными критериями ЛУ.

Через 1 сутки после интраперитонеального введения 60 млрд. микробных тел золотистого стафилококка отмечался выраженный отек паренхимы узлов, как в корковой, так и в мозговой зонах. Одновременно существенно расширялся просвет кровеносных сосудов, особенно венулярного звена, что подтверждалось морфометрическими данными по определению относительного объема ГМЦР органа (табл.6). Однако отек паренхимы ЛУ приводил к сдавлению путей внутриорганной циркуляции лимфы, что проявлялось снижением объема лимфатических синусов (табл.6). На гистологических препаратах и сканограммах выявлялись крупные макрофагальные клетки, содержащие обилие остатков фагоцитируемых клеток, что указывало на выраженные процессы распада клеток ЛУ.

На 3 сутки эксперимента процессы гипергидратации паренхимы ЛУ нарастали, венулы паракортекса и мозгового вещества ЛУ были расширены, полнокровны, объемная плотность ГМЦР увеличивалась в 2,3 раза, по сравнению с показателями интактных крыс. Отмечалась десквамация эндотелиоцигов в ПКВ, что, естественно, сказывалось на процессах рециркуляции лимфоцитов, как одного из звеньев иммунной реакции. В структуре ЛУ не выявлялись морфологически различимые образования, характерные для кортикальной, паракортикальной и мозговой зон Во всех зонах лимфоузлов встречались деструктивные формы лимфоцитов. Увеличение относительного объема лимфатических синусов (в 1,4 раза, по сравнению с контролем) было обусловлено, главным образом

расширением маргинального синуса, тогда как другие синусы были сдавлены отечной жидкостью

Таблица 6.

Объемная плотность ГМЦР и лимфатических синусов брыжеечных ЛУ при модели воспаления

Показатели объемной плотности Контроль Модель воспаления Эндолнмфатическое введение роцефина и имунофана на фоне модели воспаления

ГМЦР 16,8+0,32

1 сутки 24,5±0,24* 22,4+0,46*

3 сутки 38Д+0.71* 21,5+0,29*

5 сутки 34,3+0,66* 17,6+0,31

7 сутки 24,4+0,51* 16,1+0,37

лимфатических синусов 1 сутки 3 сутки 5 сутки 7 сутки 14,1+0,08 11,2+0,41* 20,4+0,61* 17,6+0,53* 16,0+0,76 16,8+0,43* 15,2+0,19* 14,7+0,46 14,2+0,31

Примечание, звездочкой (*) отмечены значения, достоверно отличающиеся от контроля (р<0,05).

Не происходило и формирования герментативных центров в кортикальной и паракортикальной зонах ЛУ бластными формами клеток. Показатели индексов пролиферативной и миграционной активности, увеличенные на 1 сутки эксперимента, снижались ниже контрольных данных (табл 7).

Таблица 7.

Показатели митотической и миграционной активности брыжеечных ЛУ при моделировании воспаления

Группы экспериментальных животных Имит. Имигр.

Контроль 12,34+0,47 3,51+0,02

Модель воспаления 1 сутки 3 сутки 5 сутки 7 сутан 13,31+0,27* 9,47+0,38* 7,64+0,42* 4,17+0,15* 3,71+0,03 2,00+0,04* 0,98+0,03* 0,47+0,02*

Эндолнмфатическое введение ропефина и имунофана на фоне модели воспаления 1 сутки 3 супси 5 супси 7 сутки 13,91+0,34 10,31+0,47** 11,67+0,41** 12,00+0,57** 3,83+0,08 3,17+0,02** 3,41+0,04** 3,47+0,01**

Примечание: звездочкой (•) отмечены значения, достоверно отличающиеся от контроля (р<0,05), двумя звездочками (**) отмечены значения, достоверно отличающиеся от модели воспаления при введении 60 млрд. микробных тел (р<0,05).

Через 5 суток после воздействия наблюдалось уменьшение объема ГМЦР ЛУ с 38,2+0,71*, наблюдаемого в предыдущий срок, до 34,3+0,66*. Одновременно снижался просвет маргинального синуса, что приводило к уменьшению относительной площади синусов с 20,4+0,61* до 17,6+0,53*. В кровеносных капиллярах лимфатических фолликулов обнаруживался Бкфе феномен. Отмечались порозность сосудистых стенок и появление эритроцитов среди лимфоидных клеток в корковых и мозговых синусах ЛУ. В мозговой зоне ЛУ появлялись группы редко расположенных светлых клеток, окруженных мелкими лимфоцитами. В то же время мозговые тяжи продолжали оставаться сдавленными отечной жидкостью, обедненными лимфоидными клетками; сохранялся отек коркового вещества.

Через 7 суток от начала эксперимента в мозговых тяжах имело место активное деление плазмобластных форм клеток. В то же время венулярный компонент ГМЦР оставался расширенным. Это увеличивало общий объем кровеносной сети и не способствовало физиологическому функционированию ГМЦР. Явления гипергидратации паренхимы и дилятации кровеносных сосудов к 3 суткам развития воспалительного состояния нарушали нормальную трофику и функционирование ЛУ за счет явлений гипоксии и уменьшения поставки необходимых пластических материалов для митотически делящихся клеток центра размножения лимфатических фолликулов. В результате стаза крови в венулярном отделе нарушался процесс миграции лимфоцитов, затруднялся обмен информацией иммунокомпстентных клеток. Эти процессы достигали апогея своего развития на 5-7 сутки эксперимента. В эти сроки Имит. становился ниже контрольных величин в 2,95 раза, а Имигр. в 7,5 раз. Таким образом, введение 60 млрд. микробных тел золотистого стафилококка приводит к ослаблению реакции ЛУ на антигенный раздражитель, при этом в ЛУ в первые дни отмечаются в основном деструктивные изменения.

Эндолимфатическая антибиотикотерапия и иммуностимуляция применяются при наличии клинических проявлений воспалительных заболеваний (Колобов СВ., Ярема И.В., Зайратьянц ОВ., 2001; Вторенко В И., 2002; Выренков Ю.Е, Шевхужев ЗА, 2003). В брыжеечных ЛУ, через 1 сутки после введения микробных тел и через 6 часов после начала эндолимфатической терапии, выявлялись поля некротически измененных лимфоцитов, отмечалось расширение венозных сосудов, наличие в их просвете конгломератов эритроцитов. Паренхима ЛУ была отечной, в ней находилось много макрофагальных клеток, содержащих микробные тела и клеточный детрит. Морфометрический анализ ГМЦР и лимфатических синусов (табл 6) свидетельствовал, что в данной экспериментальной группе относительный объем этих показателей в первые сутки увеличивался. Однако на фоне продолжающейся эндолимфатической терапии происходила быстрая нормализация этих по-

казателей, которые достигали контрольного уровня уже к 7-ым суткам, тогда как без указанного лечения объем ГМЦР и лимфатических синусов в эти сроки не нормализовался. Через 3 суток паренхима ЛУ была представлена главным образом ретикулярными клетками. В паракортикальной зоне выявлялись бластные формы лимфоцитов. Через 5 суток регистрировалась активная пролиферация лимфобластов во всех зонах ЛУ. К последнему сроку наблюдения структура и клеточный состав ЛУ приближался к интактному. Анализ пролиферативной и миграционной активности показал, что через сутки после введения микробных тел, т.е. через 6 часов после начала эндолимфатической терапии, происходило небольшое увеличение данных показателей, по сравнению с контрольными величинами Но в дальнейшем Имит. и Имигр. снижались и к 7 суткам практически не отличались от контрольных данных. Таким образом, заражение животных патогенными дозами микроорганизмов с последующим проведением эндолимфатической терапии роцефином и имунофаном приводит к довольно быстрой нормализации функциональной активности ЛУ.

Для исследования функции трансцеллюлярного массопереноса в эндотелиоцитах лимфатических синусов на фоне модели воспаления и в условиях эндолимфатического введения лекарственных препаратов, использовался метод криофрактографии. При сравнении контрольных данных и данных, полученных в эксперименте, заметна существенная разница. На фоне модели воспаления плотность кавеол эндотелия постепенно уменьшалась и к 7 суткам эксперимента была ниже контрольных данных на 67 % (табл. 8).

Таблица 8.

Плотность кавеол эндотелия лимфатических синусов брыжеечных ЛУ при моделировании воспаления

Группы экспериментальных животных Сроки забора материала Объемная плотность кавеол

Контроль (интактные животные) 2,7+0,07

1 сутки 2,5+0,07

Модель воспаления 3 сутки 2,1+0,04*

5 сутки 1,6+0,01*

7 сутки 0,9+0,01*

Эндолимфатическое введение 1 супси 2,6+0,06

роцефина и имунофана на фоне модели 3 сутки 2,8+0,05

воспаления 5 сутки 3,0+0,03*

7 сутки 3,2+0,03*

Примечание: звездочкой (*) отмечены значения, достоверно отличающиеся от контроля (р <0,05).

В тоже время наблюдалось увеличение плотности кавеол эндотелия лимфатических синусов уже на 3 сутки после эндолимфатического введения роцефина и имунофана, а к 7

суткам показатель объемной плотности эндотелиальных кавеол был даже выше контрольных данных на 19% Эти данные демонстрируют отрицательное влияние воспаления на процесс трансэндотелиального переноса в эндотелиоцитах лимфатических синусов ЛУ, и наоборот, нормализацию плотности кавеол эндотелия на фоне эндолимфатического введения лекарственных препаратов

Корреляционный анализ, проведенный в группе животных с моделью воспаления, выявил три статистически достоверные сильные корреляционные связи между исследуемыми параметрами (рис 2).

А. Б.

Рис.2. Циклограмма корреляционных связей между параметрами брыжеечных ЛУ у крыс при моделировании воспаления (А) и при эндолимфатнческом введении роцефина и имунофана на фоне модели воспаления (Б).

П р и м е ч а _ е д н я я положительная корреляционная связь,

———» сильная положительная корреляционная связь,

______ средняя отрицательная корреляционная связь,

сильная отрицательная корреляционная связь

\\т - объемная плотность ГМЦР, Уус - объемная плотность лимфатических синусов, УУК - объемная плотность кавеол эндотелия лимфатических синусов.

По мере возрастания срока эксперимента параллельно изменяются Имит и Имигр, объемная плотность ГМЦР и объемная плотность лимфатических синусов ЛУ. Сильная положительная связь выявлена между Имит. и объемной плотностью кавеол эндотелиоцитов лимфатических синусов Это говорит о том, что при снижении трансэндотелиального массопереноса в эндотелиоцитах лимфатических синусов уменьшается количество поступающего пластического материала, необходимого митотически делящимся клеткам У животных с эндолимфатическим введением роцефина и имунофана на фоне модели воспаления сохраняются сильные положительные корреляционные связи между Имит и Имигр, объемной плотностью ГМЦР и объемной плотностью лимфатических синусов В то же время отмечается сильная отрицательная связь между объемной плотностью лимфатических синусов и объемной плотностью кавеол эндотелия лимфатических синусов Следовательно, можно считать, что нормализация объема ГМЦР и лимфатических синусов

при эндолимфатическом введении роцефина и имунофана приводит к увеличению объемной плотности кавеол эндотелия лимфатических синусов, а в результате этого возрастает интенсивность процессов трансэндотелиального переноса пластически необходимых материалов для клеток ЛУ, в результате возрастает показатель пролиферативной активности, увеличивается количество митотически делящихся иммунокомпетентных клеток, что приводит к положительному эффекту при воспалительном процессе.

ВЫВОДЫ

1. Корковые зоны лимфатических узлов брюшной полости имеют большую плотность кровеносных микрососудов. Лабиринтная пространственная организация ретикулярных волокон наиболее интенсивно развита в маргинальном и промежуточном корковом синусах лимфатических узлов.

2. Эмиграция и иммиграция лимфоцитов осуществляется соответственно через межэндотелиальные щели в основном в маргинальном, промежуточном корковом и проксимальных отделах промежуточного мозгового синусах и через эндотелиоциты посткапиллярных венул.

3. Эндолимфатическое введение физиологического раствора повышает пролиферативную и миграционную активность иммунокомпетентных клеток лимфатических узлов, а также интенсивность трансэндотелиального массопереноса в эндотелиоцитах лимфатических синусов.

4. Тимэктомия приводит к структурно-функциональной перестройке лимфатических узлов брюшной полости, проявляющейся в снижении количественного соотношения лимфоидных элементов, их пролиферативной и миграционной активности.

5. Эндолимфатическое введение имунофана приводит к возрастанию показателей объемной плотности лимфоидных элементов Т- и В-зависимых зон лимфатических узлов, показателей митотической и миграционной активности иммунокомпетентных клеток, сниженных после тимэктомии.

6. Интраперитонеалъное введение 60 млрд. микробных тел культуры золотистого стафилококка приводит к угнетению иммунологической активности брыжеечных лимфатических узлов, к увеличению объемной плотности гемомикроциркуляторного русла и лимфатических синусов, к снижению интенсивности трансэндотелиального массоперено-са в эндотелиоцитах лимфатических синусов.

7. Эндолимфатическое введение роцефина и имунофана устраняет в брыжеечных лимфатических узлах повреждающее действие от введения 60 млрд, микробных тел культуры золотистого стафилококка, что проявляется в нормализации показателей объемной

плотности гемомикроциркуляторного русла и лимфатических синусов, процессов пролиферации и миграции иммунокомпетентных клеток, в увеличении интенсивности трансэвдотелиального массопереноса в эвдотелиоцитах лимфатических синусов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шишло В.К., Вазило BE., Антропова ЮГ., Кодина Т.В. Функциональная анатомия лимфатических узлов в условиях перфузионного эндолимфатического введения растворов неклеточного типа// Проблемы лимфологии и количественной патологии: Сборник статей. - M.: РМА, 1997.- С. 67.

2. Кодина Т.В. Показатели объемной плотности синусов лимфатического узла при эндолимфатическом введении различных растворов// Успехи теоретической и клинической медицины, выпуск 2: Материалы II научной сессии РМАПО. - М.: РМА, 1997.-С. 38-39.

3. Вырснков Ю.Е., Вазило BE., Шишло В.К., Антропова Ю.Г., Круглова И С, Кодина Т.В. Реакция лимфатических узлов на лекарственное насыщение лимфатической системы// Сборник научных трудов памяти академика ДА. Жданова посвящается (90 лет со дня рождения).- М, 1998.- С. 38-39.

4. Выренков Ю Е., Урвачева А.Б., Шишло В К, Круглова И.С., Вазило В.Е., Кодина Т.В. Пролиферативная и миграционная активность лимфоцитов лимфатических узлов при экспериментальном воспалении// Человек и лекарство. VII Российский национальный конгресс: Тезисы докладов. -М., 2000.- С. 484.

5. Кодина Т.В., Шишло В К., Цой Г.К. Реакция лимфатических узлов на лаваж лимфатической системы// Конгресс лимфологов России: Сборник материалов. -М., 2000.-С. 39.

6. Кодина Т.В, Иванова ВО. Морфофункциональное обоснование применения роцефина// Деформирующий бронхит. - М: РМАПО, 2000 -С. 77-83.

7. Кодина Т.В. Исследование концентрации роцефина в биологических жидкостях, органах и тканях экспериментальных животных//Руководство по клинической лимфологии. - М.: РМАПО, 2001.- С. 42-49.

8. Кодина Т.В., Цой Г.К. Микроциркуляторное русло органов иммунитета// Микроциркуляция и способы ее коррекции. -М.: РМАПО, 2003.- С. 39-40.

9. Шишло В К., Цой Г.К., Кодина Т.В. Регионарная лимфатическая терапия// Современные технологии в эндоскопии - М.: РМАПО, 2004. - С. 17-23.

10. Кодина Т.В. Функциональная морфология лимфатических узлов брюшной полости в условиях эндолимфатического введения имунофана на фоне

иммунодефицита// Молодые женщины в науке Тезисы докладов Всероссийской научной конференции - Иваново Иван гос Ун-т, 2004 - С 225-226 11. Кодина ТВ, Подосенкова ТВ, Катаев СИ Морфология лимфатических узлов брюшной полости в условиях эксперимента// Проблемы лимфологии и интерстициального массопереноса. Труды ГУ НИИКиЭЛ СО РАМН-Новосибирск, 2004 - Т10 -Ч 1 - С 192-195.

Список сокращений

ГМЦР - Гемомикроциркуляторное русло

И мит - Индекс митотической активности И мигр - Индекс миграционной активности

ЛУ - Лимфатический узел

ПКВ - Посткапиллярная венула

СЭМ - Сканирующая электронная микроскопия

Подписано в печать 8.1204

Формат 60x90 1/16 Печать RISO

Усл. печ. я. 1,5 Тираж 100 экз.

Напечатано с готовых оригиналов в типографии ООО «Х- Press» г. Иваново, пр. Ленина, 19.

i t

2622

»

16ФЕВ 2005 V

Актуальность научного исследования. Учению о лимфатической системе минуло более трех веков. Безусловно, приоритет в изучении морфологии лимфатической системы принадлежит отечественным ученым, работы которых вызвали бурное развитие клинической лимфологии. При анализе отечественной и зарубежной литературы обращает на себя внимание тот факт, что исследования последних лет концентрируются на изучении вне органных путей транспорта лимфы и изучении лимфатического узла (ЛУ) при различных экспериментальных воздействиях. По всей вероятности, толчком к этому явилось широкое внедрение в клиническую медицину оперативных методов лимфокоррекции таких, как дренирование грудного протока с последующей детоксикацией лимфы, лаваж лимфатической системы и эндолимфатическое введение антибиотиков и других лекарственных препаратов как нового направления в лечебной практике. Этот факт заставил большинство научных школ, занимающихся вопросами изучения лимфатической системы, более детально проводить исследования, особенно в области изучения ЛУ и коллекторных лимфатических сосудов. Вышеизложенное позволяет сделать вывод о том, что изучение лимфатической системы целесообразно проводить в двух направлениях - с клинической и теоретической точек зрения с целью обоснования новых методов лечения (Выренков Ю.Е., 1989, 1997, 2000; Вторенко В.И., 2002; Ефименко Н.А. с соавт., 2001, 2003; Выренков Ю.Е., Шевхужев З.А., 2003; Ярема И.В., Евдокимов В.В., 2003).

Анализируя современную литературу можно видеть, что основное внимание исследователей, работающих на стыке биологии и медицины, акцентируется на изучении морфологии органов и систем, так как существуют наблюдения, что биохимические и иммунологические данные не всегда соответствуют клинической картине, поэтому с точки зрения практической медицины морфо-функциональные критерии являются наиболее адекватными, достаточно полно отражающими состояние организма (Morris P., 1985). В этом причина того, что в настоящее время практически ни одно клиническое и клинико-экспериментальное исследование не может не затрагивать изучения морфо-функционального статуса органов и тканей.

В связи с развитием иммунологии внимание исследователей оказалось сфокусированным на изучении ЛУ, поскольку данные органы являются эффекторным звеном иммунологических реакций, где происходит контакт генетически чужеродного материала с иммунокомпетентными клетками. За последние 10-15 лет благодаря развитию иммуноморфологических методов исследования, включая иммуноцитохимические с применением моноклональных антител, наука обогатилась новыми сведениями, позволяющими сформулировать целостную концепцию о строении и функции ЛУ, как органа иммунной системы (Выренков Ю.Е. с соавт., 1995, 1997).

Известно, что при реализации организмом иммунного ответа ЛУ занимает одно из центральных мест, т.к. в нем сосредоточены все основные структурно-функциональные единицы, необходимые для осуществления иммунологических реакций. Среди морфологов, иммунологов и практических лимфологов прочно утвердился взгляд, что для поддержания иммунного гомеостаза важнейшими функциями ЛУ являются гемопоэтическая (пролиферация иммунокомпетентных клеток), иммунопоэтическая (антителообразование) и функция обеспечения рециркулирующего пула лимфоцитов, путем миграции их через стенки посткапиллярных венул (ПКВ) и лимфатических синусов. Изменение параметров звеньев иммунологических реакций может явиться адекватным тестом в определении действия лекарственных веществ, непосредственно влияющих на ЛУ (Дейл М.М. с соавт., 1998).

Лимфатические узлы, как часть лимфатической системы имеют огромное функциональное значение для организма как в норме, так и при патологических процессах. Несмотря на то, что вот уже несколько веков лимфатическая система является объектом исследования для анатомов и гистологов, интерес к ее изучению не только не угас, но и значительно возрос. Объясняется это тем, что, во-первых - постоянно расширяется спектр методов изучения лимфатической системы - морфологических, гистохимических, иммуноморфологических, радиоизотопных, а во-вторых -практически не ограничено количество патологических состояний и экспериментальных моделей, которые требуют тщательного изучения. В этом направлении наибольший интерес для морфологов представляют собой задачи, непосредственно связанные с клиникой. Так, возросшее количество иммунодефицитных состояний с одной стороны, и применение методов коррекции этих состояний - с другой, ставит перед исследователями очень актуальный на сегодняшний день вопрос о реактивности лимфатической системы в целом и ее важнейшего звена - ЛУ, в частности. Следует учесть и тот факт, что современные лимфогенные методы подразумевают прямое воздействие лекарственных препаратов на ткань ЛУ (Ефименко Н.А. с соавт., 2001). Однако недостаточное экспериментальное обоснование последствий манипуляций на лимфатической системе вызывает определенную настороженность клиницистов к применению эндолимфатической терапии, что может быть преодолено только после получения детальных морфологических данных.

Эндолимфатическое введение иммуностимуляторов является малоизученным методом, особенно, с точки зрения воздействия их на морфологию ЛУ, хотя иммуномодуляторы все чаще применяются при иммунодефицитных и иммунодепрессивных состояниях. Поэтому актуальной в настоящее время задачей является морфологическая оценка изменений, происходящих в ЛУ при иммунодефицитных состояниях, а также морфологическая оценка эффективности эндолимфатического введения иммуномодуляторов с целью коррекции данных состояний. Актуален также вопрос о том, имеются ли особенности реакции на иммунодефицитное состояние и эндолимфатическую иммуностимуляцию у ЛУ разных топографических групп.

Лимфатическим узлам принадлежит ключевая роль в патогенезе воспаления (Сапин М.Р. с соавт., 1978; Банин В.В., 1982; Куприянов В.В., 1983; Бородин Ю.И. с соавт., 1987; Миносян Л.А., 1991). Являясь главным препятствием распространению инфекции на пути от патологического очага в кровеносное русло, ЛУ претерпевают ряд изменений, которые могут быть как защитно-приспособительными, так и патологическими. Оценка реакции ЛУ на инфекционные процессы, особенно на фоне все более широкого внедрения в клиническую практику эндолимфатического введения лекарственных препаратов, позволит стимулировать естественные защитные силы организма, что и является конечной целью патогенетической терапии (Покровский В.И. с соавт., 1994; Выренков Ю.Е., Вторенко В.И., 1996; Вторенко В.И., 2002; Шевхужев З.А., 2002; Мержвинский И.А., 2002; Выренков Ю.Е., Шевхужев З.А., 2003; Ярема И.В., Бабаев Р.С., 2003).

Актуальной проблемой является также поиск комплекса адекватных и в то же время простых и легко воспроизводимых методов оценки морфо-функционального состояния ЛУ при иммунодефицитном состоянии и воспалительной реакции. Хотя в арсенале исследователей имеются такие информативные методы как иммуноморфология, трансмиссионная (ТЭМ) и сканирующая электронная микроскопия (СЭМ), радиоизотопный анализ, все же методы световой микроскопии не утратили своего значения и по сегодняшний день, и причина этого - их общедоступность и простота в сочетании с достаточной информативностью.

На сегодняшний день наиболее адекватным анатомическим методом исследования лимфатической системы является СЭМ, обладающая широким диапазоном увеличений, высокой разрешающей способностью, возможностью анализа больших площадей тканей в сочетании с трехмерной характеристикой изучаемой структуры. Кроме того СЭМ позволяет судить о пространственной организации лимфатических и кровеносных сосудов, их взаимоотношениях, микрорельефе их внутренней поверхности, оценивать различные структурные элементы (Ефименко Н.А. с соавт., 2003).

Цель и задачи исследования

Цель данной работы - изучение морфологии лимфатических узлов брюшной полости в норме, при экспериментальном иммунодефиците, воспалительном процессе и в условиях эндолимфатического введения лекарственных препаратов.

В соответствии с целью были поставлены следующие основные задачи исследования:

1. Выявить с помощью современных и адекватных морфологических и морфометрических методов изучения лимфатической системы микроанатомические параметры лимфатических узлов брюшной полости у интактных крыс.

2. Определить влияние эндолимфатического введения физиологического раствора на структурно-функциональные параметры лимфатических узлов брюшной полости.

3. Выявить морфологические особенности перестройки лимфатических узлов брюшной полости крыс при тимэктомии.

4. Определить влияние эндолимфатического введения имунофана на фоне тимэктомии на структурно-функциональные преобразования лимфатических узлов брюшной полости.

5. Выявить морфологические особенности перестройки брыжеечных лимфатических узлов при экспериментальном воспалении.

6. Определить влияние эндолимфатического введения роцефина в комплексе с имунофаном на структурные преобразования брыжеечных лимфатических узлов при экспериментальном воспалении.

Для реализации поставленных задач необходимо было выполнение некоторых методических разработок. Во-первых, найти технические решения для воспроизведения выбранной модели иммунодефицитного состояния и последующей эндолимфатической иммуностимуляции, а именно, отработать технику операции тимэктомии и катетеризации периферического лимфатического сосуда. У мелких лабораторных животных это представляет определенные технические трудности. Во-вторых, создать модель воспаления. И в-третьих, разработать комплекс морфометрических методов, направленных на оценку морфо-функционального состояния ЛУ.

Научную новизну исследования можно сформулировать следующим образом:

1. На основе сканирующей электронной микроскопии выявлены закономерности организации рельефа поверхности эндотелия синусов лимфатических узлов.

2. Определена пространственная организация ретикулярной ткани в пределах лимфатических синусов,

3. Впервые определено иммуномодулирующее влияние имунофана на ткань лимфатических узлов брюшной полости при эндолимфатическом его введении на фоне тимэктомии.

4. Впервые выявлено стимулирующее влияние эндолимфатического введения физиологического раствора на показатели иммунологической активности лимфатических узлов брюшной полости.

5. Впервые определены морфологические критерии эффективности влияния эндолимфатического введения роцефина в комплексе с имунофаном, на фоне экспериментального воспаления, на структурные параметры брыжеечных лимфатических узлов.

Практическая ценность работы заключается в следующем:

1, Созданная модель иммунодефицитного состояния в комплексе с эндолимфатическим введением имунофана дает возможность для проведения дальнейших исследований в области изучения морфологии лимфатических узлов при иммунодефицитах различного генеза.

2. Комплекс морфологических тестов позволит достаточно быстро оценивать некоторые иммунологические функции лимфатических узлов без применения дорогостоящих методов.

3. Эндолимфатический путь введения имунофана и роцефина можно рекомендовать для рассмотрения к применению в клинике для лечения вторичных иммунодефицитов и воспалительных заболеваний.

4. Данные о морфологической организации компонентов лимфатических синусов и гемомикроциркуляторного русла (ГМЦР) лимфатического узла могут быть использованы в учебном процессе при преподавании анатомии, гистологии, физиологии и иммунологии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Микроциркуляторное русло лимфатических узлов брюшной полости и ретикулярные волокна их синусов имеют локальные особенности организации.

2. Эндолимфатическое введение физиологического раствора оказывает влияние на показатели иммунологической активности лимфатических узлов брюшной полости.

3. Тимэктомия и эндолимфатическое введение имунофана на фоне экспериментального иммунодефицита приводят к изменению количественного соотношения лимфоидных элементов, показателей пролиферативной и миграционной активности в лимфатических узлах брюшной полости.

4. Экспериментальное воспаление в полости брюшины, вызванное золотистым стафилококком приводит к изменению иммунологической активности брыжеечных лимфатических узлов, показателей объемной плотности их гемомикроциркуляторного русла и лимфатических синусов, трансэндотелиального массопереноса в эндотелиоцитах лимфатических синусов.

5. Эндолимфатическое введение роцефина и имунофана на фоне экспериментального воспаления в полости брюшины оказывает влияние на структурные образования брыжеечных лимфатических узлов, обеспечивая их иммунокомпетентность.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на объединенной научной сессии Российской медицинской академии естественных наук (Москва, 1996); П сессии Российской медицинской академии последипломного образования, посвященной 850-летию Москвы (Москва, 1997); 7 Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2000); конгрессе лимфологов России (Москва, 2000); всероссийской научной конференции «Молодые женщины в науке» (Иваново, 2004); международной научной конференции «Проблемы лимфологии и интерстициального массопереноса» (Новосибирск, 2004); межкафедральной конференции ГОУ ВПО ИвГМА Минздрава России (2004).

По материалам исследования опубликовано 11 работ.

ВЫВОДЫ

1. Корковые зоны лимфатических узлов брюшной полости имеют большую плотность кровеносных микрососудов. Лабиринтная пространственная организация ретикулярных волокон наиболее интенсивно развита в маргинальном и промежуточном корковом синусах лимфатических узлов.

2. Эмиграция и иммиграция лимфоцитов осуществляется соответственно через межэндотелиальные щели в основном в маргинальном, промежуточном корковом и проксимальных отделах промежуточного мозгового синусах и через эндотелиоциты посткапиллярных венул.

3. Эндолимфатическое введение физиологического раствора повышает пролиферативную и миграционную активность иммунокомпетентных клеток лимфатических узлов, а также интенсивность трансэндотелиального массопереноса в эндотелиоцитах лимфатических синусов.

4. Тимэктомия приводит к структурно-функциональной перестройке лимфатических узлов брюшной полости, проявляющейся в снижении количественного соотношения лимфоидных элементов, их пролиферативной и миграционной активности.

5. Эндолимфатическое введение имунофана приводит к возрастанию показателей объемной плотности лимфоидных элементов Т- и В-зависимых зон лимфатических узлов, показателей митотической и миграционной активности иммунокомпетентных клеток, сниженных после тимэктомии.

6. Интраперитонеальное введение 60 млрд. микробных тел культуры золотистого стафилококка приводит к угнетению иммунологической активности брыжеечных лимфатических узлов, к увеличению объемной плотности гемомикроциркуляторного русла и лимфатических синусов, к снижению интенсивности трансэндотелиального массопереноса в эндотелиоцитах лимфатических синусов.

7. Эндолимфатическое введение роцефина и имунофана устраняет в брыжеечных лимфатических узлах повреждающее действие от введения 60 млрд. микробных тел культуры золотистого стафилококка, что проявляется в нормализации показателей объемной плотности гемомикроциркуляторного русла и лимфатических синусов, процессов пролиферации и миграции иммунокомпетентных клеток, в увеличении интенсивности трансэндотелиального массопереноса в эндотелиоцитах лимфатических синусов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выявленные особенности морфологической организации ЛУ брюшной полости крыс на фоне экспериментального иммунодефицита и воспаления, а также в условиях эндолимфатического введения лекарственных препаратов существенно расширяют сведения относительно реакции лимфоузлов на данные воздействия. При тимэктомии снижается количественное соотношение лимфоидных элементов во всех зонах ЛУ, пролиферативная и миграционная активность иммунокомпетентных клеток. Элиминация центра Т-клеточной дифференцировки приводит к угнетению иммуноцитопролиферативной активности в В-зонах, в которых отмечается снижение активности герминтативных центров, приводящее к угнетению гуморального звена иммунитета.

Предположение о том, что чем более активен ЛУ в иммунологическом плане, чем больше антигенная насыщенность притекающей к нему лимфы, тем большие изменения количественного соотношения, а также показателей пролиферации и миграции лимфоидных элементов, имеют место в данном ЛУ при развитии иммунной недостаточности, представляет теоретический и практический интерес и требует дальнейшего изучения.

Проведенное исследование показало, что эндолимфатическое введение имунофана на фоне экспериментального иммунодефицита приводит к увеличению Т-клеточной популяции, влияет на функциональное созревание Т-клеток, в результате чего увеличивается и В-клеточная популяция. При эндолимфатическом введении имунофана, к последнему сроку наблюдения, отмечалось возрастание показателей объемной плотности лимфоидных элементов почти до контрольных величин и даже несколько выше. Об этом же свидетельствует и анализ индексов митотической и миграционной активности, которые превышают показатели, полученные от тимэктомированных животных, без эндолимфатического введения имунофана.

Являясь главным препятствием распространению инфекции на пути от патологического очага в кровеносное русло, ЛУ претерпевают ряд изменений, как защитно-приспособительного, так и патологического характера. Оценка реакции брыжеечных ЛУ на инфекцию показала, что в первые трое суток в узлах превалируют деструктивные процессы, захватывающие пути циркуляции лимфы и крови, области лимфопоэза и дифференцировки плазмоцитов. Лимфопоэтическая функция регионарных ЛУ, судя по морфологическим данным, начинает восстанавливаться только к 7 суткам после заражения животных.

Прямая управляемая эндолимфатическая терапия обладает выраженным этиологически и патогенетически обусловленным эффектом, что способствует скорейшему восстановлению защитных сил организма, и в первую очередь, процессов пролиферации и рециркуляции иммунокомпетентных клеток. При изучении брыжеечных ЛУ, после эндолимфатической терапии на фоне экспериментального воспаления, также выявлялись явления деструкции, отека паренхимы и дилятации кровеносных сосудов и лимфатических синусов. Морфометрический анализ ГМЦР и лимфатических синусов свидетельствовал, что у животных данной экспериментальной группы относительный объем этих показателей в первые сутки увеличивался. Однако на фоне продолжающейся эндолимфатической терапии происходила быстрая нормализация данных показателей. К концу эксперимента структура и клеточный состав ЛУ приближался к интактному. Анализ пролиферативной и миграционной активности показал, что если через сутки после введения микробных тел, т.е. через 6 часов после начала эндолимфатической терапии, происходило небольшое увеличение данных показателей, то в дальнейшем Имит. и Имигр. снижались и к последнему сроку наблюдения практически не отличались от контрольных данных. Таким образом, заражение животных патогенными дозами микроорганизмов с последующим проведением эндолимфатической терапии роцефином и имунофаном приводит к довольно быстрой нормализации функциональной активности ЛУ.