Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Роль интерлейкина -1 в активации гипофизарно-надпочечниковой системы у мышей в процессе формирования иммунного ответа

'21 ¡'< Я 9 Ъ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 612.45.018-06:612.11?.94.015:612.6

КРЫМСКАЯ Людмила Георгиевна

РОЛЬ ИНТЕРЛЕИКИНА-1 В АКТИВАЦИИ ГИПСФИЗАРНО-ШДПОЧЕЧНИКОВОИ СИСТЕМЫ У ШЛЕИ В ПРОЦЕССЕ ФОРМИРОВАНИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА.

14.00.36 - Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 1992

Работа выполнена в Институте клинической иммунологии Сибирского отделения Российской Академии медицинских наук.

Научный руководитель: академик АЕН РФ

доктор медицинских наук, профессор КОЗЛОВ В.А.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

ШИРИНСКИИ B.C.

кандидат биологических наук, ИДОВА Г.В.

Ведущая организация: Российский государственный

медицинский университет

Защита диссертации состоится "_"_1992 г.

в _ часов на заседании специализированного защитного совета

К.001.01.01 (Аллергология и иммунология) Института клинической иммунологии СО РАМН по адресу.: 630091, г.Новосибирск, ул.Ядрин-цовская, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института клинической иммунологии СО РАМН.

Автореферат разослан "_"_1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук ff^&zeftZ- о. Т.КУДАЕВА.

. и- . - ■ '.-J

Актуальность_проблемы Одной из ключевых проблем современной шмунологии является регуляция иммунного ответа, что имеет огромное значение для развития теоретической иммунологии и в дальнейшем позволит успешно вмешиваться с целью коррекции в течение любого заболевания иммунной природы.

Данные последних лет свидетельствуют о тесной взаимосвязи иммунной и эндокринной систем организма. Особую роль в этих взаимодействиях играет система гипофиз-кора надпочечников (ГНС), продукты которой (адренокортикотропный гормон (АКТГ), глюкокор-тикоиды) регулируют пролиферацию и секреторную активность практически всех типов клеточных элементов иммунной системы, обладают широким спектром регуляторных воздействий на многие иммунные реакции (Bateman et al., 1989; Carr, Blalock, 1989), оказывают модулирующее влияние на синтез интерлейкинов, специфических медиаторов иммунной системы, а также экспрессию рецепторов к ним (Snyder, Unanue,1982; Akahoshl et al.,1987, Snyers et al.,1990). С другой стороны, накапливается все больше данных о том, что белки, продуцируемые активированными клетками иммунной системы -интерлейкин-1 (ИЛ-1), ИЛ-2, интерфероны, гормоны тимуса- существенно влияют на целый ряд эндокринных показателей (Welgent, Blalock, 1987; Bateman et al., 1989; ChesnokoYa, Ignatleva, 1990). Эти данные позволили выдвинуть предположение о существовании единого иммуноэндокринного комплекса для поддержания гомеостаза в организме (Bateman et al., 1989). .

По-видимому, особая роль в реализации ir/муноэндокринных взаимодействий принадлежит макрофагам, что объясняется их уникальными свойствами (Козлов, Громыхина, 1983; Фрейндлин, 1984; Маянский, Маянский, 1989). Этим клеткам отводится центральная роль в индукции, развитии и регуляции клеточного и гуморального иммунного ответа, что обусловлено способностью их к захвату, переработке и представлению антигена лимфоцитам, к экспрессии la-белков, продукции важных иммунорегуляторных молекул, таких как ИЛ-1, фактор некроза опухоли (ФНО), простагландин Е2 (ПГЕ2), к выработке других неспецифических стимулирующих и супрессиругацих сигналов.

Среди обширного ряда секреторных продуктов макрофагов особое место занимает ИЛ-1, биологически активный медиатор, действие которого направлено на клетки почти всех органов и тканей организма (Чередеев, 1990; Dlnarello, 1984).

Широкий спектр биологических эффектов ИЛ-1, в том числе и его ключевая роль в формировании иммунного ответа, по всей видимости, и послужили причиной возросшего за последние годы числа исследования, посвященных проблеме регуляции функциональной активности ГНС со стороны указанного монокина. Актуальность этой проблемы объясняется еще и тем, что выяснение тонких механизмов влияния ИЛ-1 на функционирование коры надпочечников, выявление эндогенных модуляторов продукции глккокортикоидов имеет не только теоретическое значение, но и важно в области практической медицины, поскольку нарушение секреции ИЛ-1 мононуклеарными фагоцитами является существенным патогенетическим звеном многих воспалительных, вирусных, инфекционных и аутоиммунных заболеваний (Чередеев, 1990), что мохет отражаться на функционировании такой важной регуляторной системы как ГНС. Однако, несмотря на интенсивные исследования, предпринятые за последние годы в указанной области, многие вопросы, касающиеся механизмов действия монокина на активность ГНС, специфичность эффектов изучаемого медиатора, роли взаимодействия ИЛ-1 и глккокортикоидов в формировании гуморального иммунного ответа остаются, к сожалению, невыясненными.

Цель_исследования. Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы явилось изучение механизмов влияния ИЛ-1 на функционирование надпочечников у мышей, а также роли взаимодействия этого монокина и глккокортикоидов при формировании гуморального иммунного ответа.

В рамках проблемы ставились следующие задачи:

1. Исследовать влияние различных препаратов ИЛ-1 (рекоыби-нантные ИЛ-1 а и ИЛ-1 р человека и нативный ИЛ-1 мыши) на функциональную активность коры надпочечников у мышей.

2. Изучить эффекты ИЛ-1 на активность центральных нейроэн-докринных структур ГНС.

3. Оценить участие ПГЕ в опосредовании действия монокина на функциональную активность ГНС.

4. Изучить эффекты ИЛ-1 на продукцию глккокортикодов надпочечниками In vitro.

5. Проанализировать корреляционные взаимоотношения между уровнем глюкокортикоидов в крови мышей после иммунизации и величиной первичного гуморального иммунного ответа, оценив при этом роль ИЛ-1.

Основные результаты исследований.и их_новизна_ Впервые про-

ведена комплексная оценка изменений функциональной активности ГНС под действием ИЛ-1. Показано, что введение и а, и () формы монокина человека, а также нативного ИЛ-1 мши приводит к увеличению уровня кортикостерона в крови экспериментальных животных. Впервые установлено, что повышение уровня гормона в крови мышей под действием ИЛ-1 обусловлено приростом биологически активной свободной фракции гормона, так как концентрация транскортша при этом воздействии не менялись. Впервые обнаружено, что в реализации эффекта ИЛ-1 на функционирование ГНС участвуют простагланди-ны. Показано, что действие монокина на глгасокортикоидную функцию надпочечников опосредовано через активацию центральных нейроэндокринных структур. Вместе с тем обнаружено влияние ИЛ-1 и непосредственно на надпочечники, причем впервые установлено, что его эффекты на продукцию глисокортикоидов зависят от исходной секреторной активности клеток железы. Показано, что разные формы ИЛ-1 человека (аир) осуществляют свое действие на функционирование коры надпочечников через разные механизмы: ИЛ—1р вызывает опосредованное через центральные нейроэндокринные структуры повышение концентрации кортикостерона в крови, тогда как ИЛ-1а способен стимулировать как секрецию АКТГ, так и оказывать модулирующее влияние непосредственно на периферические железы. Полученные данные свидетельствуют о том, что ИЛ-1 участвует в реализации взаимодействия иммунной и нейроэвдокринной систем, и уровень продукции ИЛ-1 макрофагами и глккокортикоидов надпочечниками является одним из факторов, определящих величину первичного гуморального ответа у мышей.

Научная и практическая ценность работы. Полученные результаты развивают представление о взаимодействии иммунной и эндокринной систем. Данные о влиянии ИЛ-1 на функционирование надпочечников раскрывают механизмы взаимосвязи этих систем и роли этого взаимовлияния для формирования иммунного ответа.

Кроме того, полученные данные могут служить и прогрессу практического здравоохранения, поскольку позволяют учитывать изменения функциональной активности таких жизненно важных желез внутренней секреции кгк надпочечники в зависимости от разного уровня продукции ИЛ-1 макрофагами при различных патологических состояниях. Материалы диссертации используются в лекционном курсе то иммунологии, читаемом в Новосибирском государственном университете. Выли разработаны и внедрены методические рекоментации

"Комплексная оценка функциональной активности надпочечников у мышей в норме и после различных воздействий", предназначенные для работников научно-исследовательских учреждений, и клиницистов Основные положения, выносимые на защиту:

1. ИЛИ способен влиять на активность ГНС как через центральные нейроэндокринные структуры, так и непосредственно на надпочечники, оказывая модулирующее влияние в зависимости от исходного уровня секреторной активности железы.

2. Монокин оказывает свое действие на функционирование надпочечников ln vivo посредством простагландин-зависимых механизмов.

3. Баланс продукции ИЛИ и глисокортиковдов, складывающийся в процессе формирования иммунного ответа, является одним из факторов, определяющих интенсивность антителообразования в организме.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Всесоюзном симпозиуме "Регуляция иммунного гомеостаза" (Суздаль, 1986), на Всесоюзной конференции "Стресс и иммунитет" (Ростов-на-Дону, 1989), на Всесоюзном симпозиуме с международным участием "Система мононуклеарных фагоцитов в норме и при патологических состояниях" (Новосибирск, 1990), на советско-американском рабочем совещании по нейроиммунологии (Новосибирск, 1991), на научной конференции ИКИ СО РАМН (Новосибирск, 1992). Апробация диссертации состоялясь на расширенном семинаре ИКИ СО РАМН (Но-вошйфск, 1992).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ. Объем и структура работы. Диссертация изложена на 162 листах машинописного текста, содержит 19 рисунков и 7 таблиц; состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов исследования (глава 2), изложения результатов собственных исследований и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов. Список циторованной литературы включает 288 источников, в том числе 246 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Эксперменты проведены приблизительно на 3000 мышей-самцов (CBAxC57BL/6)F1 в возрасте 2-3 месяца, полученных из.питомника лабораторных животных "Столбовая", а также из экспериментально-биологической клиники лабораторных животных ИКИ СО РАМН.

В работе использованы рекомбинантные ИЛ-1a (Horrman-La-Ro-che, США) и ИЛ-1 р человека (НИИ генетики, Москва), нативный хро-матографически очищенный ИЛ-1 мыши, а также фрагмент ИЛ-1р (163-

171) (НПО "Вектор", Новосибирск). Препараты разводили средой 199 и вводили однократно внутривенно по 1-100 нг/мышь, а фрагмент ИЛ-10 (163-171) в дозах 4-400 нг/мышь. Контролем служили животные, получавшие бычий сывороточный альбумин (БСА) в том же объеме среды 199.

Также использовались следующие препараты: дексаметазон (De-xamethason, Serva), который вводили внутрибрпшшно по 10 мкг на мышь в 0,2 мл физ- раствора за 40 мин до инъекции ИЛ-1; индоме-тацин (Indometaclne, Sigma) - по 250 мкг/мышь в объеме 0,2 мл среды 199 за 1 час до введения монокина. При исследовании действия ИЛ-1 на надпочечники In vitro железы инкубировали в растворе Кребса-Рингера с добавлением препаратов монокина (по 1, 10 и 100 нг/мл). В экспериментах на суспензии клеток надпочечников (которую получали по методу Sayers (1971) с использованием коллагена-зы) ИЛ-1 применяли в концентрациях от 0,1 до 100 нг/мл. В раде экспериментов анализировали изменения стероидогенеза в клетках надпочечников под действием простагландина Eg (Prostaglandin Eg, Sigma) в концентрации 10_6М, АКТГ (Corticotropin, Serva) в концентрациях от 0,17 до 17000 мкЕд/мл, либо индометацина в конечной концентрации 0,3 мкг/мл.

У экспериментальных животных анализировали как уровень кор-тикостерона в крови, так и удельную продукцию гормона надпочечниками в условиях In vitro. Концентрацию кортикостерона определяли методом конкурентного белкового связывания с использованием транскортина крыс в модификации, не требующей предварительной экстракции стероидов (Тинников, Бажан,1984). Уровень АКТГ и про-лактина в плазме крови определяли с помощью стандартных наборов реактивов (фирмы Sea-Ire-Sorîn (Франция) и Farmos Diagnostica (Финляндия)). Для оценки концентрации кортикостероид-связывамце-го глобулина (транскортина) в крови мышей использовали радиоли-гандный метод, разработанный совместно с сотрудником ИЦиГ СО РАН А.А.Тинниковым.

Для оценки продукции ИЛ-1 выделенные адгезией на пластике из суспензии спленоцитов макрофаги в концентрации 106 клеток/мл культивировали в 24-луночных пластиковых планшетах (Llnbro lab. Inc.) в течение 6 часов при температуре 37°С и 5% COg в атмосфере. Для культивирования использовали среду RPMI-1640 (Flow lab. Inc. ) с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина (Flow Lab.Inc.), 80 мкг/мл гентамицина (Sigma) и

10 кМ HEPES-буфера (Serva). По истечении инкубационного периода супернатанты клеток тестировали на наличие ИЛ-1 активности модифицированным нами методом Phillips и ЕаЬзоп (1983) по пролиферации тимоцитов, индуцированных субмитогенной дозой Кон А. Уровень биологически активного ИЛ-1 оценивали по индексу влияния (ИВ):

число имп/мии в Кон А-индуцированной культуре тимоцитов с исследуемым супернатантом

число имп/мин в Кон А-индуцированной культуре тимоцитов без супернатанта

Количество АОК в селезенке экспериментальных мышей определяли по количеству локальных зон гемолиза в полужидкой среде на 4 сутки после иммунизации животных эритроцитами барана (ЭБ) (Cunningham, 1965).

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с использованием t-критерия Стысщента и Вилкоксона-Мэнна-Уит-ни. Корреляционный анализ проводили по методам Спирмена и Пирсона.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что во время иммунного ответа происходят изменения уровня глккокортикоидов в крови экспериментальных животных. Однако данные на этот счет противоречивы: одни авторы обнаружили усиление активности ГНС в индуктивную фазу иммунного ответа, тогда как другие - в продуктивную. В связи с этим на первом этапе работы была поставлена задача проследить динамику глюкокорти-коидной реакции на антиген у мышей-самцов (CBAxC57BL/6)F1 на протяжении процесса антителообразования, особенно в первые часы после иммунизации, когда происходит формирование иммунного ответа. Результаты проведенных экспериментов свидетельствуют о том, что иммунизация мышей ЭБ в дозе 2-108 приводит к увеличению в 4-5 раз уровня кортикостерона в крови по сравнению с контрольными животными в перше 4 часа после введения антигена. В течение всего последующего периода наблюдения (до 96 час) не было обнаружено достоверных различий концентрации кортикостерона между контрольными и иммунизированными животными.

Таким образом, представленные результаты свидетельствуют о том, что иммунизация мышей (CBAxC57BL/6)F1 Т-зависимым антигеном (эритроцитами барана) приводит к усилению функциональной активности коры надпочечников в перше часы после введения антигена.

Для проверки предположения, что ИЛ-1, секретируемый активированными антигеном макрофагами, является сигналом, исходящим от

иммунной системы для стимуляции глшокортикоидной функции надпочечников, были проведены эксперименты с введением мышам ИЛ-1.

Результаты экспериментов, представленные на рис.1, свидетельствуют о том, что введение животным хроматографически очищенного ИЛ-1 мышей приводило к увеличению концентрации корико[-стерона в плазме крови по сравнению с аналогичным показателем у контрольных груш. Максимальная глюкокортикоидная реакция на монокин была отмечена через 2 часа, после чего уровень гормона возвращался к исходным величинам. Введение монокина в различной степени разведения приводило к дозозависимому повышению уровня кортикостерона в крови экспериментальных животных (коэффициент корреляции=0,790, р<0,01, п=47) (рис. 1), что свидетельствует о специфическом эффекте монокина на активность ГНС.

Аналогичные результаты были получены и с а-, и с р-формами рекомбинантного ИЛ-1 человека. Так, внутривенное введение мышам ИЛ-1 а и ИЛ-1|3 приводило к дозозависимому увеличению концентрации кортикостерона по сравнению с контролем, получавшим БСА. Как и в случае с ИЛ-1 мышей, максимальная реакция системы гипофиз-кора надпочечников на монокин была отмечена через 2 часа.

Известно, что уровень общего кортикостерона в плазме крови является суммой нескольких показателей, а именно: неспециБически связанный с белками крови, специфически связанный с транскорти-ном и свободный гормон (Розен, 1984). В соответствии с современными представлениями, именно свободная, не связанная с белками крови, фракция глкжокортикоидов является гормонально - активной (Faessler et al., 1986). Для того, чтобы выявить изменения величины определенной фракции гормона, были предприняты эксперименты, в которых анализировали колебания как концентрации общего кортикостерона, так и уровня транскортина в крови мышей в ответ на введение ИЛ-1.

Ни через 2, ни через 24 часа после введения различных форм рекомбинантного ИЛ-1 человека не было отмечено достоверных различий уровня транскортина между экспериментальными и контрольной грушами (5,3 + 0,5; 5,4 + 0,4; 6,4 + 0,4 после введения 100 нг/ мышь БСА, ИЛ-1а и ИЛ-1 р. соответственно). В то же время концентрация кортикостерона в крови мышей после инъекции монокина была значительно повышена по сравнению с аналогичным показателем у контрольных животных (11,3 + 1,7; 38,2 + 2,6 и 48,0 + 1,3 через 2 часа после инъекции ЮОнг/мышь БСА, ИЛ-1а и ИЛ-1р, соответст-

— 60-

я

n

|50 и 40-

Д

а, 301 о

8 20 «

о «

Ч*

~ 30' s m о а. к

о 20

р<

о

о 10 о к

К f а, о к

h

i

li

i

время (час)

0 i 1 20 10

1

1 ИЛ-1

Рис. 1. Изменения концентрации кортикостерона в

изменения концентраци мшей (CBAiC57BL/B)F1

плазме крови ИЛ-1 мшей

а). через 1, 2, 3 и 6 часов после введения (разведение 1:1) - 1 и физ.р-ра - 2;

б).. через 2 часа после инъекции физ.р-ра - 0 и мышиного ИЛ-1 в разной степени разведения.

венно). Следовательно, можно предположить, что увеличение уровня гормона, наблюдаемое после введения ИЛ-1, происходит главным образом за счет прироста свободной фракции глюкокортикоидов.

Таким образом, результаты этой серии экспериментов подтверждают наше предположение о том, что ИЛ-1 является одним из сигналов иммунной природы, способным повышать функциональную активность надпочечников при формировании иммунного ответа. ИЛ-1, секретируемый макрофагами при взаимодействии этих клеток с антигеном; вызывает дозозависимое увеличение уровня глюкокортикоидов в крови животных. Повышение концентрации кортикостерона в ответ на введение монокина, по-видимому, обусловлено возрастанием величины свободной (не связанной с транскортином) фракции гормона.

Учитывая данные об опосредовании ряда эффектов ИЛ-1 проста-гландинами, представляло интерес выяснить роль данного эйкозано-ида Во влиянии монокина на уровень кортикостерона в крови. Для этого за 1 час до инъекции монокина мышам был введен ингибитор синтеза простагландинов индометацин. Введение индометацина отменяло стимуляцию функциональной активности коры надпочечников под действием ИЛ-1а человека и ИЛ-1 мыши (рис.2). Инъекция фрагмента ИЛ-Iß (163-171), который обладает иммуностимулирующими свойствами интактной молекулы, но не способен усиливать синтез проста-

гландинов (Ап1;оп1 еЪ а1., 1986), не приводила, к изменениям концентрации кортикостерона в крови экспериментальных животных (рис. 2). Результаты этих экспериментов свидетельствуют об участии простагландинов в опосредовании эффектов ИЛ-1 на функциональную активность коры надпочечников.

Следующим этапом наших исследований явилось выяснение вопроса, опосредуется ли действие ИЛ-1 на глюкокортикоидную функцию надпочечников через центральные нейроэндокринные структуры. Для этого были предприняты эксперименты с введением мышам дексамета-зона, который по механизму отрицательной обратной связи ингиби-рует продукцию кортикотропин-рилизинг фактора и АКТГ (Коуасз, Мегеу, 1987). Предварительное введение дексаметазона приводило к отмене увеличения уровня гормона в ответ на инъекцию ИЛ-1а и ИЛ-1р. Не было обнаружено достоверных различий уровня глюкокор-тиковдов в крови меаду контрольной и экспериментальными группами на фоне дексаметазона (0,6 + 0,1; 0,7 +0,3 и 1,0 +0,2 мкгЖ после введения БСА, ИЛ-1 а и ИЛ-1р, соответственно).

Кроме того, были предприняты эксперименты, в которых оценивались изменения уровня АКТГ в ппазме крови в ответ на введение монокина. Как видно из рис.3, инъекция ИЛ-1а или ИЛ-1р приводила к дозозависимому транзиторному увеличению концентрации АКТГ в плазме крови мышей. Максимальный эффект монокина на секрецию АКТГ был отмечен через 30-60 пин после инъекции ИЛ-1. Через 1,5 часа концентрация этого тропного для надпочечников гормона достоверно не отличалась от соответствующего показателя у контрольных животных.

Таким образом, повышение уровня глюкокортикоидов, наблюдаемое после введения ИЛ-1, обусловлено усилением активности центральных звеньев системы гипофиз- надпочечники, что находит отражение в увеличении секреции АКТГ.

Для того, чтобы определить, является ли активация системы гипофиз - надпочечники специфическим ответом на монокин или неспецифическим стрессом, вызванным инъекцией препарата ИЛ-Г, мы анализировали в крови мышей изменения уровня пролактина, который является одним из маркеров стресса (В1зе111 ег а1.,1989). Введение ИЛ-1а не приводило к достоверным изменениям концентрации пролактина в крови по сравнению с контрольными животными, получавшими БСА (22,5 + 2,2; 24,3 + 7,5; 12,2 + 3,5 мЕД/л после введения 100 нг/мышь БСА, 10 и 100 нг/мышь ИЛ-1а, соответственно).

к 2

§20

р. х

о

X о

о 10

е<

о

о

к

я

н

л

о

к

а *

Л

I

«26 Н к г

"24

§22 р<

х ю

ё 6 Рч

ш /I

^ 4 о

А

л

1

ИНТ. 12 12

А Б

Рис. 2. Концентрация кортикостерона в плазме крови мышей (СВАхС57ВЬ/6)Р1 через 2 часа после введения:

а). 1 - БСА (50 нг/мышь), 2 - ИЛ-1а (50 нг/мышь) на фоне предварительной (за 1 час) инъекции

А .спиртового раствора (5%) или Б. индометацина (250 мкг/ мышь);

б). 1 - БСА (100 нг/мышь), 2 - ИЛ-1 р (100 нг/мышь), 3, 4, .5 - 4, 40, 400 нг/мышь фрагмента ИЛ-1р (163-171), соответственно .

* - р<0.01.

**

§ 400 -I с

~ 300-1

200

100

400 -

с.

с

300 .

С—

§ 200 -

100

0,5

—г-

0,5

Рис. 3. Изменения концентрации (СВАхС57ВЬ/6)Р

1 1,5 время (час.) крови мышей

АКТГ в плазме 1 после введения ИЛ-1а (А) и ИЛ-1р (Б).

1. БСА (100 нг/мышь), 2. ИЛ-1 (10 нг/мышь), 3. ИЛ-1 (100 нг/мышь),

достоверность отличия от контроля * - р<0.05, ** - р<0.01.

Таким образом, можно' предполагать, что активация ГНС после инъекции монокина не является результатом неспецифического стресса. Для ответа на вопрос, влияет ли ИЛ-1 непосредственно на

О

надпочечники, было проведено несколько серий экспериментов, в которых исследовали эффекты монокина различного происхождения на стероидогенез в железе In vitro.

Добавление рекомбинантного ИЛ-Ip в среду, в которой инкубировались клетки надпочечников, в широком диапазоне концентраций (0,1-100 нг/мл, что соответствует 6х10-12- 6х10-9М) не приводило к достоверному изменению продукции кортикостерона. Суммарные результаты 6 экспериментов, предпринятых в тетрапликатах, представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Влияние ИЛ-1р на продукцию кортикостерона суспензией клеток надпочечников In vitro.

Концентрация ИЛ-1р Продукция кортикостерона

(нг/мл) (нг/100мкл/1,5 часа)

0 1,5 + 0,1 0,1 1 ,4 ± 0,1

1 1,6 + 0.1 10 1,5 + 0,1 100 1,3 + 0,1

■Многочисленные эксперименты, проведенные на суспензии клеток надпочечников мышей (CBAxC57BL/6)F1, показали, что рекомби-нантный ИЛ-1а человека оказывает разнонаправленное действие на секреторную активность надпочечников в зависимости от исходного уровня продукции кортикостерона этой железой. Добавление различных концентраций ИЛ-1а к суспензии клеток надпочечников дозо-зависимым образом стимулировало освобождение кортикостерона, когда базальный уровень продукции гормона был низким. На фоне же высокой секреторной активности надпочечников ИЛ-1а в использованном диапазоне концентраций дозозависимым образом подавлял стероидогенез In vitro (рис. 4).

Так как добавление индомегацина к суспензии клеток надпочечников не приводило к отмене эффекта ИЛ-1 на продукцию кортикостерона In vitro при различной исходной секреторной активности этой железы, можно заключить, что влияние монокина на стероидогенез в надпочечниках не опосредован через усиление синтеза про-стагландинов.

Проведенные нами эксперименты позволяют предполагать, что одним из механизмов ингибирования продукции глюкокортиковдов под

Рис. 4. Влияние ИЛ-1а человека на продукцию корти-костерона суспензией клеток надпочечников мышей (СВА1С57ВЬ/б)Р^. * - р<0.05.

*

I

»

I

Ó 0*1 í 10 100 ИЛ-1 а (нг/мл) действием ИЛ-Ia является препятствие реализации эффекта АКТГ на клетки надпочечников (например, продукция кортикостерона при добавлении АКТГ в концентрации 0,2 мкЕд/мл составляла 7,7 + 1,1, а при совместном инкубировании с ИЛ-1 (10 нг/мл) равнялась 4,0 + 1,5 нг/100мкл/1,5 час.; при концентрации АКТГ 20 мкЕд/мл 17,0 ± 1,7 и 13,3 + 0,8 без и в присутствии ИЛ-1а, соответственно). Так как ИЛ-1 содержит последовательность аминокислот, сходную с молекулой АКТГ (Завьялов, Денесюк,1987), возможно, что в этом случае происходит экранирование рецепторов к АКТГ на клетках надпочечников.

Обнаружив шгибиругаций эффект ИЛ-1 на стероидогенез на фоне высокой секреторной активности надпочечников, который не совпадал с результатами, полученными In vivo, мы провели следующую серию экспериментов на цельных железах, в которых сохраняются межклеточные взаимоотношения, характерные для этого органа. В качестве доноров надпочечников в предпринятых исследованиях были использованы мыши (CBAxC57BL/6)F1, полученные из питомника лабораторных животных "Столбовая" и перенесшие стресс, вызванный транспортировкой. Необходимо отметить, что фоновый уровень продукции кортикостерона надпочечниками у этих мышей в 2-3 раза выше, чем обычно наблюдаемый в наших экспериментах In vitro.

ИЛ-1р, добавленный в инкубационную среду к надпочечникам от таких животных, достоверно подавлял продукцию кортикостерона только в концентрации 100 нг/мл. В то же время ИЛ-1 сх оказался эффективным уже при концентрации 1 нг/мл (рис.5). Аналогичные результаты были получены и при инкубации надпочечников с ИЛ-1 мышей (2,34 + 0,30 (контроль) и 1,45 + 0,17 мкг/ЮОмг/час (после добавления ИЛ-1)).

Обращает на себя внимание тот факт, что большинство, если не все стимулирующие продукцию ИЛ-1 мононуклеарными фагоцитами агенты, параллельно индуцируют синтез этими клетками и проста-гландина Eg, причем секреция последнего начинается уже в первые минуты после оказанного воздействия (ffebb, Osherofí, 1976). Поскольку ИЛ-1 и ПГЕ^ принадлежит ключевая роль в формировании иммунного ответа (Козлов, Громьшша, 1983), мы посчитали необходимым изучить совместное влияние ИЛ-1 и ЛГЕ^ на стероидогенез в надпочечниках In vitro. Полученные данные свидетельствуют о том, что тогда как сам простагландин Е2 в концентрации 10_6М не имел какого-либо эффекта на секреторную активность изучаемой железы, добавление эйкозаноида вместе с монокином приводило к восстановлению удельной продукции глшокортикоидов, подавленной под влиянием как а, так и f) формы ИЛ-1 (рис. 5). Таким образом, ПГЕ2 отменял ингибирующий эффект ИЛ-1 на стероидогенез, который был выявлен при высокой исходной секреторной активности надпочечников.

Эти данные, свидетельствущие о ингибируицем действии ИЛ-1 а на стероидогенез в надпочечниках In vitro при высоком исходном уровне продукции гормона, нашли подтверждение в опытах In vivo, в которых животным вводили ИЛ-1 а в дозе 50 нг/мышь на фоне предварительной инъекции индометацина. В экспериментах на мышах, демонстрирующих низкий исходный уровень удельной продукции кортикостерона надпочечниками (серия I), введение ИЛ-1а вызывало 6-кратное увеличение уровня гормона в крови по сравнению с животными, получавшими БСА. В то же время введение монокина на фоне предварительной (за 1 час) инъекции индометацина в дозе 250 мкг/мышь не приводило к достоверным изменениям концентрации кортикостерона в крови мышей по сравнению с контрольной группой.

В других же экспериментах (серия II) у интактных мышей были обнаружены высокие значения удельной продукции глккокортикоидов надпочечниками и, как следствие, высокая концентрация кортикостерона в плазме крови. Введение таким животным ИЛ-1а (50 нг/

1 10 10 100 БСА ИЛ-1 а ИЛ-1 р

1 10 10 1ООнг/мл ПГЕ2 ИЛ-1а+ПГЕ2 ИЛ-1р+ПГЕ2

Рис. 5. Влияние ИЛ-1 на удельную продукцию кортикостерона надпочечниками мышей (CBAiC57BL/6)l'1 In vitro при совместном

инкубировании с IITEg (10'

Примечание: * - р<0.05, ** - р<0.01.

мышь) также приводило к увеличению уровня кортикостерона в плазме крови, однако в этом случае прирост составлял только 100%. Монокин, введенный на фоне индометацина, приводил к достоверному снижению уровня кортикостерона в крови, что сопровождалось достоверным снижением удельной продукции гормона надпочечниками (2,34+0,32 и 1,08+0,13 мкг/1ООмг/час после введения БСА и ИЛ-1).

Результаты этих опытов свидетельствуют о том, что ИЛ-1 способен оказывать прямое, не опосредованное гипоталамусом и гипофизом, влияние на надпочечники. Две формы ИЛ-1 человека различались по способности изменять секреторную активность железы. ИЛ-1р в наших экспериментальных моделях не влиял существенным образом на продукцию глюкокортюсовдов In vitro, тогда как ИЛ-1 а оказался модулятором секреции кортикостерона, и направление эффекта этого монокина на стеровдогенез в надпочечниках определялось ба-зальным уровнем секреции гормона. По-видимому, эффект ИЛ-1а на секреторную активность надпочечников не опосредован через прос-тагландинзависимые механизмы. Можно предположить, что действие монокина на железу носит фазный характер: стимулирующий на ранних стадиях ответа (когда секреторная активность снижена) и ин-гибируиций при возрастании продукции глюкокортиковдов надпочечниками. По-видимому, обнаруженное нами разнонаправленное действие ИЛ-1а на секреторную активность надпочечников в зависимости от их исходного состояния отражает существующую в организме воз-

ложность модуляции глюкокортикоидной функции в соответствии с потребностями иммунной системы.

Представленные результаты подтверждают высказанное предположение о том, что ИЛ—1 является одним из факторов, способных стимулировать систему гипофкз-надпочечники в процессе формирования иммунного ответа. ИЛ-1 активирует как центральные нейроэндокринные структуры, так и влияет непосредственно на надпочечники, оказывая модулирующий эффект в зависимости от исходного уровня продукции гормона железой.

В чем же заключается физиологический смысл эффектов ИЛ-1 на функциональную активность надпочечников? Для ответа на этот вопрос была проведена серия экспериментов, в которых мышей иммунизировали однократно тремя различными дозами ЭБ и исследовали корреляции между гормональными и иммунологическими показателями. Так как ранее было показано, что пик глхкокортиковдного ответа на внутривенное введение 2-1О8 ЭБ наблодается через 3-4 часа после инъекции антигена, у мышей через 4 часа после иммунизации разными дозами антигена ( 2-107, 2-108 и 2-109 ЭБ) анализировали изменения в крови уровней кортикостерона и транскортина, а таете ИЛ-1 активность в супернатантах макрофагов, выделенных из селезенки на пике гормонального ответа на антиген и культивируемых In vitro в течение 6 час. Контрольным мышам вводили среду 199 в том же объеме. Через 4 дня у иммунизированных животных определяли количество АОК в селезенке.

У всех иммунизированных животных обнаружено ожидаемое повышение концентрации кортикостерона по сравнению с группой, получавшей среду (табл. 2). Исключение составили лишь мыши, которым вводили минимальную дозу антигена (г-Ю^ЭБ). У этих животных не отмечено достоверных различий уровня гормона по сравнению с контрольными мышами. Повышение концентрации кортикостерона через 4 часа после иммунизации зависело от дозы введенного антигена (коэффициент корреляции г=0,703, р<0,01, п=65). В то же время у изучаемых групп животных не было обнаружено достоверных различий уровня транскортина по сравнению с интактной и контрольной группами, за исключением группы, иммунизированной максимальной дозой антигена. В этом случае концентрация кортикостеровд-связыванцего глобулина была достоверно снижена по сравнению с другими группами экспериментальных животных. Можно предположить, что повышение уровня кортикостерона в плазме крови, наблкщаемое у мышей в от-

Таблица 2.

Влияние иммунизации тремя различными дозами ЗБ на уровень в крови кортикостерона, транскортина, продукцию ИЛ-1 активности макрофагами селезенки, выделенными через 4 часа после введения антигена, и количество АОК в селезенке на 4 сутки.

доза антигена кортикосте-рон (мкгЖ) транскортин (1044) ИЛ-1 активность (ИВ) АОК/селезен-ку

интактные 3,1 ± 0,7 (12) 6,5 ± 0,3 (12) 2,49 ± 0,18 (9) -

среда 8,5 ± 0,9 (12) 6,8 ± 0,8 (12) 2,98 ± 0,13 (9) -

2-Ю7 ЭБ 8,3 ± 1,2 (13) 6,1 ± 0,5 (13) 2,14 ± 0,11 (8) « 118253 ± 11859 (10)

2-108 ЭБ 17,9 ± 1,9 (11) * 6,0 ± 0,3 (11) 1,70 ± 0,11 (7) » 74029±7109 (10) **

2-Ю9 ЭБ 23,5 ± 1,6 (14) * 4,4 ± 0,3 (14) * 1,32 ± 0,08 (7) * 20493 ± 2453 (10) **

Примечание: * - различия достоверны (р<0,01) по сравнению с группой мышей, получавших среду 199; ** - JX0.01 по сравнению с мышами, иммунизированными 2-10' ЭВ.

вет на иммунизацию различными дозами ЭБ, обусловлено увеличением свободной, не связанной с транскортином, фракции гормона.

Проведенные эксперименты свидетельствуют о том, что первичный иммунный ответ на Т-зависимый антиген, ЭБ, о величине которого судили по количеству АОК в селезенке, уменьшается в зависимости от дозы введенного антигена. Корреляционный анализ данных выявил обратную зависимость между количеством АОК в селезенке и дозой антигена (г=-0,719, р<0,01, п=48).

Кроме того, мы тестировали продукцию ИЛ-1 активности селезеночными макрофагами, изолированными на пике гормональной реакции на антиген. Результаты экспериментов, представленных в табл. 2, свидетельствуют о том, что иммунизация мышей приводит к дозо-зашсимому снижению продукции ИЛ-1 макрофагами селезенки, выделенными через 4 часа после введения антигена, по сравнению с ин-тактными и контрольными животными, получавшими среду 199. Известно, что глкжокортикоиды в физиологических концентрациях способны ингибировать продукцию ИЛ-1 культурами моноцитов и макрофагов мышей и крыс (Snyder, .Unanue, 1982). По-видимому, супрессия продукции макрофагами данного монокина в перше часы после иммунизации является одним из факторов, обусловливающих снижение величины иммунного ответа.

Для проверки гипотезы, что именно ИЛ-1, секретируемый макрофагами в ответ на иммунизацию, является одним из факторов, повышающих уровень глюкокортиковдов в первые часы после введения антигена, была проведена следующая серия экспериментов, когда мышей иммунизировали тремя различными дозами ЭБ и в более ранние сроки (через 2 часа), а также через 4 часа после инъекции антигена забирали сыворотку и надпочечники для определения уровня кортикостерона в крови и инкубатах, и кроме того через 2 часа после иммунизации из селезенки выделяли" макрофаги для оценки продукции ИЛ-1 активности.

Как и в предыдущих экспериментах, обнаружено дозозависимое повышение уровня кортикостерона в плазме крови через 2-4 часа после иммунизации (рис.6). Кроме того, обнаружено достоверное дозозависимое усиление удельной продукции кортикостерона надпочечниками через 2 и 4 часа после введения антигена (г=0,784, р<0,01, п=30; г=0,455, р<0,01, п=28 для 2- и 4-часовых интервалов соответственно). Не было обнаружено достоверных различий удельной продукции кортикостерона мевду контрольной й иммунизированной минимальной используемой дозой ЭБ грушами в оба исследованных промежутка времени, что соответствует данным об отсутствии изменений уровня гормона в крови мышей этой группы. Таким образом, можно предположить, что увеличение уровня кортикостерона, наблюдаемое через 2-4 часа после введения антигена, вызвано предварительным усилением продукции глккокортикои-дов надпочечниками.

Представленные па рис. 6 данные свидетельствуют о том, что введение антигена приводит к дозозависимому (г=0,814, р<0,01, п=19) увеличению продукции ИЛ-1 макрофагами селезенки, за исключением группы, получавшей максимальную дозу ЭБ. У мышей этой группы было отмечено значительное снижение ИЛ-1 активности в су-пернатантах макрофагов, выделенных из селезенок' через 2 часа после инъекции антигена. Анализируя все полученные данные, определили коэффициент корреляции между количеством АОК в селезенке и уровнем кортикостерона на пике глкжокортикоидного ответа на антиген, который был равен -0,850 (р<0,01).

Суммируя все полученные данные, можно утверждать, что макрофаги в процессе формирования иммунного ответа секретируют мо-нокин, стимулирующий функциональную активность системы гипофиз-надпочечники. Повышение уровня глюкокортиковдов в первые часы

40-

8 П О Р.

® § зон

о к

20-

10

л о

О

X а к

н

8

3-

■ I

2 4

время (час)

100-

50

■ I

2 4

время (час)

1

* * ■х

Рис. 6. Влияние иммунизации тремя различными дозами ЭБ на концентрацию кортикостерона в крови (А), удельную продукцию гормона надпочечниками (Б), иЛ-1 активность в супернатан-тах селезеночных макрофагов, выделенных через 2 часа после введения антигена (В) и количество А0К в селезенке на 4 сутки (Г).

1, 2, 3, 4 - мыши,_ получавшие внутривенно среду 199, 2-Ю7, 2-

■108 и 2-Ю9 ЭБ, соответственно.

« - р<0.05. »» - р<0.01. после иммунизации приводит к подавлению продукции ИЛ-1 активности и, как результат, к снижению величины иммунной реакции. По-видимому, для оптимального развития иммунного ответа в соответствии с возможностями организма необходимо достижение определенного баланса между глюкокортиковдами и ИЛ-1 (и другими факторами иммунной системы).

вывода

1. ИЛ-1, продуцируемый активированными макрофагами, является фактором, стимулирующим функциональную активность ГНС, по-

в

*

2

4

скольку введение его приводит к дозозависимому повышению концентрации кортикостерона в крови мышей. Этот эффект не является результатом неспеци|ического стрессорного воздействия, так как . изменения уровня такого маркера стресса как пролактин в ответ на инъекцию монокина не наблвдается.

2. Рекомбинантный ИЛ-1 а и р человека и ИЛ-1 мыши были эффективны в стимуляции ГНС, вызывая повышение уровня кортикостерона в крови экспериментальных животных-интегрального показателя активности ГНС. Повышение концентрации кортикостерона в плазме крови мышей происходит за счет прироста биологически активной (не связанной с белками крови) фракции гормона, о чем свидетельствует отсутствие изменений уровня транскортина - специфического транспортного белка для глюкокортиковдов - после введения ИЛ-1.

3. ИЛ-1 реализует свое действие на функциональную активность ГНС через активацию центральных нероэндокринных структур, так как дексаметазон, блокатор секреции кортикотропин-рилизинг фактора и адренокортикотропного гормона, отменяет эффект монокина на уровень кортикостерона в крови мышей, а введение ИЛ-1 приводит к дозозависимому повышению концентрации АКТГ в крови экспериментальных животных-

4. Эффект ИЛ-1 на функциональную активность надпочечников 1п у1уо опосредован через простагландинзависимые механизмы, так как подавление синтеза этих эйкозаноидов индометацином приводит к отмене повышения концентрации кортикостерона в плазме крови мышей после введения монокина.

5. ИЛ-1а человека оказывает прямое действие на функционирование коры надпочечников, модулируя секреторную активность этой железы. При высоком базальном уровне продукции кортикостерона монокин ингибирует стероидогенез в надпочечниках, тогда как при низком - повышает его.

6. Макрофаги посредством вырабатываемых ими цитокинов участвуют в межсистемной регуляции иммунного ответа. Существование подобного рода влияний со стороны мононуклеарных фагоцитов на кору надпочечников и, в свою очередь, глкжокортикоидов на функциональную активность макрофагов является, вероятно, одним из механизмов поддержания иммунно-эндокринного гомеостаза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Громыхина Н.Ю., Волкова Л.Г., Повещенко А.Ф., Козлов В.А. Влияние монокинов на функциональную активность надпочечников //

Всевоюзный симпозиум "Регуляция иммунного гомеостаза". Тезисы докладов.- Л.,1986.-С.34.

2. Громыхина Н.Ю., Повещенко А.Ф., Волкова Л.Г., Козлов В.А. Влияние простагландина Е2 на различные этапы дифференцировки полипотентной стволовой кроветворной клетки // Сб."Фундаментальные аспекты и практическое применение в медицине и сельском хозяйстве достижений биотехнологии".-Тарту, 1986.-С.147-152.

3. Громыхина Н.Ю., Крымская Л.Г., Козлов В.А. Эффект ПГЕ2 на функциональную активность надпочечников у мышей // Сб. "Синтез и исследование простагландинов".-Таллинн, 1986.-С.145.

4. Krymskaya L.G., Gromykhlna N.Yu., Kozlov V.A. Interleukin-1 effect on adrenal gland function In mice // Immunology Letters.-1987.-V. 15.-N4.-P.307-309.

5. Крымская Л.Г., Громыхина Н.Ю., Козлов В.А. Влияние интерлей-кина-1 на функциональную активность надпочечников у мышей // Бюлл.экперим.биол. и мед.-1988.-Jf3.-С.311-313.

6. Крымская Л.Г., Громыхина Н.Ю., Козлов В.А. Изменение секреторной активности надпочечников у мышей под действием интерлей-кина-1 и простагландина Е2 // Тез.докл.Всесоюзн.конф. "Стресс и иммунитет".-Ростов-на-Дону, 1989.-С.76.

7. Kozlov V.A., Gromykhlna N.Yu., Krymskaya L.G., Markova E.V. Interleukln-1 and glucocorticoid interrelation in the regulation of the imnuno response in mice // J.Immunol. Immunopharmacol.-1989.-V.9.-N3.-P.158.

8.'Krymskaya L.G., Gromykhlna N.Yu. Interleukln-1 effect on steroidogenesis in adrenal gland in mice // The first European young scientist conference on immunology.-Bratislava, 1990.-P.48.

9. Крымская Л.Г., Громыхина Н.Ю.-, Козлов В.А. Механизмы влияния ИЛ-1 на активность гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы у мышей // Тез.докл. V Всесоюзн. симпозиума "Взаимодействие нервной и иммунной систем".-Оренбург, 1990.-С.100-101.

10. Маркова Е.В., Крымская Л.Г. Взаимоотношения ИЛ-1 и глкжокор-тиковдов в регуляции иммунного ответа // Молодые ученые-медики -науке и практическому здравоохранению. Тез.докл.конф.молодых ученых СО АМН СССР.-Новосибирск, 1990.-С.33-34.

11. Громыхина Н.Ю..Крымская Л.Г., Повещенко А.Ф., Куракина О.В., Маркова Е.В., Козлов В.А. Механизмы иммунорегуляторной функции макрофагов // Тез.Всесоюзн.симпозиума с международным участием "Патогенез хронического воспаления".-Новосибирск, 1991.-С.80-82.