Автореферат и диссертация по медицине (14.00.02) на тему:Морфологические аспекты приспособления гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы к действию стресса в раннем постнатальном онтогенезе

На правах рукописи

Загребия Валерий Леонидович

Морфологические аспекты приспособления гипоталамо-гипофизарно-надпочсчниковой системы к действию стресса в раннем постнатальном онтогенезе

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

14.00.02 анатомия человека 003 177289

03.00.25 гистология, цитология, клеточная биология

Научные руководители:

д.м.н., проф. М.Ю. Капитонова,

член-корр. РАМН д.мл., проф С. Л. Кузнецов

Волгоград, 2007

003177289

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава»

Научные руководители доктор медицинских наук, профессор Капитонова Марина Юрьевна член-корр РАМН, доктор медицинских наук, профессор Кузнецов Сергей Львович

Официальные оппоненты

- доктор медицинских наук, профессор Хлопонин Петр Андреевич

- доктор медицинских наук, профессор Коробкеев Александр Анатольевич

Ведущая организация - Тверская государственная медицинская академия

Защита состоится « 26 » декабря_2007г в 9.00 час на заседании

Диссертационного совета Д 208 008 01 при ГОУ ВПО «Волго1радский государственный медицинский университет Росздрава» по адресу 400066 Волгоград, плПавших борцов, 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Волгоградского государственного медицинского университета (400066 Волгоград, плЛавших борцов, 1)

Автореферат разослан « ^ » ноября_2007г

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук,

доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Активация гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (11 НС) со стимуляцией высвобождения кортикотропин-рилизинг-факгора (КРФ) нейронами мелкоклеточных фракций паравентрикулярного ядра (ПВЯ) гипоталамуса с последующей секрецией адренокортикотропного гормона (АКТГ) в аденопшофизе и глюкокортикоидов в коре надпочечников является основным нейроэндокринным ответом на действие стрессорных агентов и важнейшим механизмом поддержания гомеостаза в организме при стрессе. Важнейшей детерминантой адаптационных изменений при стрессорных воздействиях является конвергенция нейральных и гуморальных афферентных сигналов на уровне КРФ-позитивных нейронов ПВЯ, однако лежащие в ее основе интегративные механизмы остаются невыясненными (И Г.Акмаев, 2003; К.В.Судаков, 2005, А G.Watts et al., 2002, A.F De Nicola et al, 2006, G.Aguilera et al., 2007)

Регуляция ГГНС чрезвычайно сложна, и при многих патологических состояниях отмечается гиперактивация гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной оси (ГТАО), что может быть связано с ее дисрегуляций на уровне ПВЯ или на более высоком уровне, усугубляемой действием стрессорных факторов, однако механизмы этого состояния остаются не до конца выясненными (S.B. Pinnock et al., 2001, O.Chan et al, 2002) Адаптация 11 HC при стрессе может быть неадекватной потребности восстановления гомеостаза1 если стресс-индуцированный ответ нейроэвдокринной системы избыточен или недостаточен по интенсивности или продолжительности, то восстановления физиологических параметров не произойдет, что может привести к развитию разнообразных патологических состояний, включая депрессии и другие аффективные расстройства Нарушение регуляции адаптационного ответа при стрессе может влиять на рост и развитие организма и предопределять его индивидуальную чувствительность к развитию

эндокринных, сердечно-сосудистых, иммунных и метаболических заболеваний (J.Chrousos et al., 1998; Q.Yang, 2000). Особенности активации ITAO при различных состояниях, таких как стресс, инфекции, метаболические нарушения в раннем детстве остаются мало изученными (C.D.Walker et al., 1997; G.W Dent et al., 2000; S.Morley-Fletcher et al., 2003), хотя известно, что именно стрессы раннего детства нередко приводят к развитию взрослой психопатологии, извращению последующих стресс-ассоциированных нейроэндокринных и поведенческих реакций, а варианты ответов ГГНС растущего организма на действие стрессорных агентов характеризуются широким диапазоном от глубокой гипореспонсивности до резкой фасилитации нейроэндокринного ответа (S Morley-Fletcher et al., 2003, S.Levine 2005; D.M.Vazquez et al., 2006). При этом ряд авторов полагают, что ГГНС легче адаптируется к действию системных стрессоров, в то время как действие процессивных стрессоров нередко вызывает дезадаптацию (H.F.Figuiredo et al., 2003). Напротив, другие авторы считают, что напротив именно психологические стрессоры, действуя хронически, быстро вызывают габитуацию ГГАО в противоположность физическим стрессорам, адаптация к которым более продолжительна и сопровождается фасшштацией при действии нового стрессора (D.Zelena et al., 2003; M.M.Ostrander et al., 2006). Одни исследователи демонстрируют, что уровень активации ГГАО отражает продолжительность стрессорного воздействия, а не его интенсивность (A.Garcia et al., 2000), в то время как другие доказывают, что на уровень габитуации ГГНС при хроническом стрессе влияет прежде всего интенсивность стрессорного агента (D.L Pitman et al., 1996; V.Chesnokova et al., 2002; A.Jaferi et al., 2006), а третьи утверждают, что оба фактора в равной степени влияют на респонсивность ГГНС (G.Chrousos, 1998; B.S.McEwen, 2000) Некоторые авторы считают причиной дезадаптации ГГАО при хроническом стрессе диссоциацию между ее центральным и периферическим звеном

(S Levine et al., 1991,2005; D.M.Vazquez et al., 2006), тогда как другие считают звено оси на уровне АКТГ - кортикостероиды достаточно стабильным и определяют локус диссоциации оси на уровне обратной связи, кортикостероиды - ПВЯ (J.P. Herman et al., 2003; S. Retana-Marquez et al., 2003).

Глубокие противоречия сохраняются в литературе в объяснении нарушения механизма отрицательной обратной связи в 11 НС при хроническом стрессе, когда несмотря на длительный выброс глюкокортикоидов, десенситизации ГГАО оси не происходит, и она продолжает, сохраняя активность, стимулировать повышенную выработку кортикостероидов (S.Makino et al., 1999, M.F.Dallman et al., 2000; A.Jaferi et al., 2003).

В связи с выше изложенным в настоящем исследовании нами предпринята попытка определить, как созревание ГТНС в раннем постнатальном онтогенезе влияет на изменение ее приспособительного потенциала при различных видах хронического стресса

Целью настоящего исследования является изучение возрастных аспектов взаимодействия различных звеньев ГГАО в приспособлении организма к хроническому действию системных и процессивных стрессоров в препубертатном периоде постнатального онтогенеза Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи

1 Охарактеризовать особенности респонсивности отдельных компонентов ГГНС при хроническом действии системного стрессора в растущем организме экспериментальных животных.

2 Исследовать возрастные особенности активации различных звеньев ГГАО при хроническом действии процессивного стрессора в раннем постнатальном онтогенезе.

3 Оценить секреторную, митотическую и апоптотическую пластичность аденогипофиза как центрального звена ГГАО в условиях приспособления растущего организма к хроническому стрессу

Научная новизна работы.

Впервые с применением иммуногистохимии и имидж-анализа охарактеризованы особенности активации, габитуации и взаимодействия различных звеньев ГТНС растущего организма в различные возрастные периоды под хроническим действием различных по природе стрессоров системных и процессивных Впервые получены данные о корреляции стресс-ассоциированных сдвигов в центральном и периферическом звеньях ГГАО и возрастной опосредованности их диссоциации при хроническом стрессе. Выявлены возрастные периоды в раннем посгаатальном онтогенезе с максимальной респонсивностью и минимальным адаптационным потенциалом при хроническом воздействии физических и психологических стрессоров.

Теоретическое значение работы заключается в выяснении онтогенетических особенностей кинетики ответа ГГАО и взаимодействия ее звеньев при воздействии системных и процессивных стрессоров в растущем организме

Практическая значимость работы состоит в получении данных относительно диапазона респонсивности разных звеньев ГГАО и их стресс-индуцированной дихотомии в различные возрастные периоды раннего постнатального онтогенеза, которые могут быть использованы при разработке мер профилактики стресс-ассоциированных нейроэндокрянных сдвигов в растущем организме

Публикации и опробация материалов диссертации. Материалы диссертации были доложены на 63-ой итоговой научной конференции студентов и молодых ученых ВолГМУ, 26-29 апреля 2005 г, Волгоград, II научной конференции с международным участием, «Современные проблемы науки и образования, 2-9 июля 2005 г, г. Умаг (Хорватия); X региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области», ноябрь 2005,

Волгоград; научной конференции с международным участием «Современные наукоемкие технологии», 20-27 ноября 2005г, о.Тенерифе (Испания); XI региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области, 810 ноября 2006 года, Волгоград, IV научной конференции с международным участием «Проблемы экспериментальной и клинической медицины», 18-28 января 2007 г, Паттайа (Тайланд), 65-ой юбилейной открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием, 25-27 апреля 2007 г., Волгоград, заседании Волгоградского отделения Всероссийского научного общества анатомов, гистологов и эмбриологов, октябрь 2007.

Результаты исследования отражены в 7 публикациях, I из которых - в издании, рекомендованном ВАК для опубликования материалов диссертаций

Положения, выносимые на защиту:

1 Кинетика адаптационного ответа ГГНС при хроническом стрессе в раннем постнатальном онтогенезе различается при действии процессивных и системных стрессоров

2. Секреторная, митотическая и апоптотическая пластичность аденогипофиза как центрального звена ГГАО при хроническом стрессе в растущем организме имеет отчетливую возрастную зависимость

Объем и структура диссертации. Текст диссертации изложен на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, главы 1 - обзора литературы, главы 2 с описанием материала и методов исследования, глав 3 и 4, содержащих описание результатов исследования, обсуждения полученных данных и выводов Диссертация иллюстрирована 3 таблицами и 34 рисунками, из которых 28 - микрофотографии Библиографический указатель содержит 189 источников: 31 отечественный и 158 зарубежных.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Исследование проведено на 72 животных - крысах породы Sprague-Dawley 3-х возрастных групп 14 дней (грудной период), 21 день (подсосный период), 30 дней (инфантный период, Западнюк И.П. и др, 1974) - по 24 животных в каждой группе Животные каждой группы разделялись на 3 подгруппы: две экспериментальных и одна - контрольная, по 8 животных в каждой подгруппе. Животные 1-ой экспериментальной группы испытывали хронический стресс, наблюдая за животными 2-ой группы со дна пустого пластикового бассейна (процессивный стрессор, F Т Pijlman et al, 2002), в то время как животные 2-ой экспериментальной группы подвергались хроническому иммобилизационному стрессу - водной иммерсии (системный стрессор, A.Yamomotova et al., 2000). Продолжительность стрессорного воздействия составила 5 часов в день на протяжении 7 дней ежедневно с 10 00 до 15 00. Животные контрольной подгруппы находились на всем протяжении эксперимента в другом помещении, вне контакта с экспериментальными животными

По окончании последнего стрессорного воздействия животных экспериментальных и контрольных групп взвешивали, забивали под анестезией, у них извлекались головной мозг, гипофиз, надпочечники, а также тимус (для выявления стресс-ассоциированных изменений) и желудок (для оценки состояния слизистой оболочки макроскопически) Гипофиз, надпочечники и тимус взвешивались. Органы фиксировались формалином и заливались в парафин Гистологические срезы гипоталамуса, гипофиза, надпочечников, а также тимуса окрашивались гематоксилин-эозином и по Ван Гизону Срезы гипоталамуса дополнительно окрашивались иммуногистохимически моноклональными антителами против кортикотропин-рилизиг-факгора (Sigma, USA, #С5348), а срезы гипофиза - против АКТГ (клон

02АЗ, синтетический иммуноген, конъюгированный с IgG цыпленка) - маркера кортикотропоцитов (DAKO, Дания, #М3501); PCNA (клон РС10) - ядерного антигена пролиферирующих клеток (Serotec, #МСА1558), каспазы -3 (Sigma, USA, #АНР476) - маркера апоптоза Количественная оценка иммуногистохимически окрашенных препаратов гипоталамуса и гипофиза проводилась с помощью имидж-анализа с использованием микроскопа NIKON Eclipse Е600 (Япония), и камеры Nikon Coolpix 995 (Япония) с применением программы ImagePro+ Вариационно-статистическая обработка данных проводилась с применением программы Excel.

Полученные результаты и их обсуждение

Как показало проведенное исследование, стресс приводил к замедлению темпов роста тела экспериментальных животных, и к концу эксперимента масса тела у них была значительно меньше, чем у крыс группы возрастного контроля (рис 1) Как следует из рис 1, замедление роста тепа экспериментальных животных продемонстрировано значимо меньшей массой тела у крыс 2-ой экспериментальной группы При этом в младшей возрастной подгруппе масса тела животных 2-ой экспериментальных групп была также значимо ниже, чем у 1-ой. У животных 1-ой экспериментальной группы масса тела по сравнению с возрастным контролем снижалась не достоверно

Рис.1. Динамика массы тела экспериментальных и контрольных животных при хроническом стрессе в раннем постнатальном онтогенезе

(М+/-т, г).

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

| |- 14 дней ИИ-21 день | |- 30 дней *-р<0.05 **-р<0.01 ***-р< 0.001

Определение относительной массы гипофиза показало (рис.2), что этот показатель высоко достоверно увеличивался у всех животных 2-ой экспериментальной подгруппы по сравнению с группами возрастного контроля, в то время как в 1 -ой экспериментальной группе младшей и средней возрастных подгруппах увеличение не достигало уровня достоверности и лишь старшей группе оно было значимым. Между двумя экспериментальными подгруппами различия были недостоверными во всех возрастных подгруппах.

Анализ массы надпочечника (для анализа использовался правый надпочечник как в большей степени подверженный стресс-ассоциированным изменениям (В.Г. Шаляпина и др., 2001) показал, что полного параллелизма динамики этого показателя со сгресс-индуцированной гипертрофией гипофиза не наблюдалось.

■ А 1 -

т 80,14 ±3,02

11 1 г) .■Ч. ■ . м , : -н : ■ : гл :■ 1- ; 5

НЕо ■ Я 41 ■ т С\ с* 1 «л -Н 0© г< ** а* ■ щт : ч. ; г* -Н 1

Контроль Стресс ожидания Иммерсионный стресс

Рис.2. Динамика относительного веса гипофиза животных (%о) при хроническом стрессе, М+/-Ш.

0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0

I I- И дней ШШ-2\ день Г ]- 30 дней *-р<0.05 ** - р < 0.01 ***-р <0.001 Истинную гипертрофию надпочечников, не связанную с возрастным увеличением массы, мы также проанализировали с использованием ее относительного показателя (рис.3). Как следует из рисунка, гипертрофия надпочечников, проявляющаяся высоко достоверным увеличением их относительной массы, имела место во всех возрастных подгруппах 2-ой экспериментальной группы и в старшей подгруппе 1-ой экспериментальной группы, что также не соответствует динамике относительного веса гипофиза. При этом между двумя экспериментальными группами различия имелись в младшей и средней возрастных подгруппах. Увеличение по данному параметру в 1-ой экспериментальной группе по сравнению с возрастным контролем составило 22,2% (р>0,05); 39,2% (р<0,01); 47,1% (р<0,001) в младшей, средней и старшей возрастной подгруппе соответственно и во 2-ой экспериментальной подгруппе 58,9%; 78,3%; 68,3% (р<0,001) соответственно.

Рис. 3. Динамика относительного веса надпочечника животных (%о) при хроническом стрессе, М+/-Ш.

I***

-5-

*гг а-

№

№

Контроль

Стресс ожидания Иммерсионный стресс

]-14 дней ИИ-21 день I 1-30 дней *-р<0.05 ** - р < 0.01

г-р< 0.001

Таким образом, органометрическое исследование показало, что вес тела экспериментальных животных при хроническом стрессе не снижался, но возрастной прирост его существенно замедлялся, причем более чувствительным данный параметр был к действию системного стрессора по сравнению с прогрессивным во всех возрастных подгруппах. Абсолютный вес гипофиза и надпочечников с возрастом увеличивался, в то время как относительный — уменьшался. Стресс дифференцированно изменял эти два показателя в рамках экспериментальных групп и возрастных подгрупп, однако оба они также были более чувствительны к действию физического стрессора против психологического, и наибольшая степень гипертрофии гипофиза отмечалась в возрасте, соответствующем инфантному периоду, а надпочечников - периоду перехода на самостоятельное питание.

Микроскопическое исследование надпочечника продемонстрировало, что у контрольных животных младшей из изученных возрастных групп, с исходным возрастом, соответствующим грудному периоду, отчетливо контурируется корковое и мозговое вещество, и в корковом веществе - все 3 зоны, клубочковая, пучковая и сетчатая, причем последняя очень хорошо выражена как онтогенетически самая древняя, а пучковая зона, напротив, имеет относительно небольшую толщину по сравнению с надпочечником крыс старшей возрастной группы С возрастом отмечалось увеличение толщины коркового вещества надпочечников, главным образом за счет пучковой зоны Хронический стресс, как психологический, так и физический, вызывал гипертрофию коркового вещества преимущественно за счет пучковой зоны, с появлением характерной пенистой структурой спонгиоцигов При этом наибольшая степень гипертрофии отмечалась среди спонгиоцитов внутренней части пучковой зоны У животных младших возрастных подгрупп выраженность стресс—ассоциированных изменений в надпочечнике была существенно меньше в 1-ой экспериментальной группе по сравнению со 2-ой, в то время как в старшей возрастной подгруппе различия между экспериментальными группами были минимальными Это свидетельствует о возрастной зависимости стресс-индуцированной респонсивности надпочечников на действие процессивных стрессоров с тенденцией к ее увеличению с возрастом.

В гипофизе контрольных животных на гистологических срезах, окрашенных гематоксилин-эозином, с возрастом отмечено некоторое увеличение доли базофильных аденоцитов, концентрирующихся в базофильном клине аденогипофиза. При этом и в базофильном клине, и в латеральных крыльях pars anterior ацидофильные клетки оставались во всех возрастных подгруппах преобладающими среди хромофильных аденоцитов, несколько доминирующих количественно над хромофобными клетками, не зависимо от

возраста животных. Помимо окраски цитоплазмы, базофильные клетки отличались также от ацидофнлов большими размерами, треугольной формой и большими размерами более светлых, чем у ацидофилов, ядер с более частным обнаружением ядрышек Образование фолликулов и микрокист не было характерно для аденогипофиза ни одной из возрастных групп контрольных животных

При хроническом стрессе у животных обеих экспериментальных групп наблюдались микроциркуляторные нарушения виде расширения и полнокровия кровеносных сосудов, гипертрофия и гиперплазия базофильных аденоцитов не только в базофильном клине, но и в латеральных крыльях Отмечалось изменение соотношения ацидофильных и базофильных клеток с возрастанием доли последних на фоне общего увеличения плотности клеток, прежде всего за счет главных эндокриноцитов. У животных 2-ой экспериментальной во всех возрастных подгруппах отмечалось формирование фолликулов и микрокист, заполненных пенистым или гомогенным содержимым, в целом не характерных для животных 1-ой экспериментальной группы, за исключением старшей возрастной подгруппы.

При гистологическом исследовании срезов гипоталамуса, изготовленных, руководствуясь атласом в Рахтов и С.А^Ывоп (1998), в мелкоклеточной фракции его ПВЯ при хроническом стрессе в обеих экспериментальных группах отмечается гипертрофия нейронов, увеличение числа ядрышек и эухроматина в их ядрах Таким образом, уже на качественном уровне рутинного гистологического исследования при хроническом стресс выявлялись стресс-ассоциированные изменения во всех возрастных подгруппах обеих экспериментальных групп Их выраженность была связана с исходным возрастом животных и видом стрессорного воздействия, что нашло свое

подтверждение и было конкретизировано при иммуногисто химическом исследовании.

Окрашивание гипоталамуса на КРФ показало наличие скоплений иммунореактивных нейронов в ПВЯ гипоталамуса. С возрастом число КРФ-позитивных нейронов в мелкоклеточной фракции ПВЯ возрастало При хроническом стрессе отмечалась тенденция увеличения числа иммунореактивных клеток во всех возрастных подгруппах обеих экспериментальных групп

Окрашивание на АКТГ гистологических срезов контрольных животных показало, что иммунопозитивные клетки преобладают в латеральных крыльях pars anterior крыс всех трех возрастных групп, а не в базофильном клине, где, хотя плотность базофилов относительно выше, обусловлено это, очевидно, сосредоточением в нем других популяций базофильных аденоцитов Иммунореакгивные клетки имеют характерную треугольно-звездчатую форму, расположены они чаще поодиночке, реже мелкими группам по 2-3 клетки Уже на качественном уровне обращает на себя внимание тенденция уменьшения доли иммунореактивных клеток с возрастом При хроническом стрессе во всех возрастных подгруппах имело место увеличение доли и размеров АКТГ+клеток, а также их формы: они становились округлыми или овальными, отростки у большинства клеток исчезали или оставались короткими и более широкими Клетки чаще всего были собраны в конгломераты, до 10 клеток на группу. Гипертрофия АКГГ-иммунореактивных аденоцитов была больше выражена у животных 2-ой экспериментальной группы

Иммунореакгивные ядра аденоцитов pars anterior при окрашивании на PCNA, выявляющем ядерный антиген пролиферирующих клеток, равномерно распределялись по аденогипофизу и скоплений не образовывали. В младшей возрастной группе они располагались несколько более плотно по периметру

латеральных крыльев, однако в старших возрастных группах эта тенденция не просматривалась Количество иммунореактивных клеток, как и АКТГ-положительных клеток, имело тенденцию к возрастному уменьшению. При хроническом стрессе клетки с иммунореактивными ядрами приобретают тенденцию к более неравномерному распределению, также увеличивая свою плотность вдоль контура латеральных крыльев.

Окрашивание на каспазу-3, выявляющую гибнущие адоптозом клетки, позволило вывить небольшое количество иммунореактивных клеток в аденогипофизе, также несколько более густо расположенных в латеральных крыльях по сравнению с базофильным клином Тенденции уменьшения с возрастом, в противоположность другим иммуногистохимическим реакциям, отмечено не было. При стрессе явного увеличения доли иммунореактивных клеток ни в одной экспериментальной группе на качественном уровне отмечено не было Таким образом, несмотря на наличие определенных тенденций возрастных и стресс-ассоциированных изменений на различных уровнях ГТНС, на качественном и полуколичественном уровнях отмечались существенные индивидуальные различия их иммуногистохимической картины Для количественной оценки выявленных сдвигов был применен имидж-анализ с автоматической оценкой удельной плотности иммунореактивных клеток.

Количественная оценка иммуногистохимически окрашенных гистологических препаратов показала (рис 4), что при 01фаске на АКТГ, несмотря на тенденцию к снижению доли иммунореактивных клеток с возрастом в контрольных подгруппах, в обеих экспериментальных группах отмечалось их увеличение, которое нарастало по мере увеличения возраста животных и во 2-ой экспериментальной группе было больше, чем в 1-ой Между экспериментальными группами различия по данному показателю не было отмечено ни в одной возрастной подгруппе В 1-ой экспериментальной группе

увеличение доли иммунореактивных адеиоцитов не достигало уровня значимости в младшей и средней возрастной подгруппах, что свидетельствует о гипореспонсивности данного звена ГГАО в данные возрастные периоды.

Рис. 4. Удельная площадь АКТГ-позитивных клеток аденогипофиза животных при хроническом стрессе (М+/-Ш, %).

25

20

15

10

5

0

I 1-14 дней ЮН-21 день I |- 30 дней *-р<0.05 **-р<0.01 *** - р< 0.001

Для выяснения механизмов гиперплазии адренокортикотропоцитов нами также произведена количественная оценка митотической и апоптотической пластичности аденогипофиза при разных видах стресса в возрастном аспекте (Рис.5,6).

Контроль Стресс ожидания Иммерсионный стресс

Рис.5. Удельная площадь каспаза-3-позитивных клеток аденогипофиза животных при хроническом стрессе (%).

8 7 6 5 4 3 2 1 О

I [-14 дней [Ц|]-21 день ЦЦ- 30 дней *-р<0.05 **-р < 0.01 ***-р< 0.001 Как следует из рис.5, доля иммунореактивных клеток имела тенденцию к снижению с возрастом в контрольных группах животных. При хроническом стрессе доля гибнущих апоптозом клеток увеличивалась достоверно во всех возрастных подгруппах 2-ой экспериментальной группы и в младшей возрастной подгруппе 1-ой экспериментальной группы. Между двумя экспериментальными группами различий не выявлено ни по одной возрастной подгруппе. Наибольших значений апоптотический индекс достигает при стрессе в период грудного возраста.

Распределение РСИА-иммунореактивных клеток представлено на рис.6.

Контроль Стресс ожидания Иммерсионный стресс

Рис.6. Удельная площадь РСМД-позитивных клеток аденогипофнза неполовозрелых крыс при хроническом стрессе (%).

Контроль Стресс ожидания Иммерсионный стресс

I [-14 дней ШШ-21 день [ 1-30 дней *-р<0.05 **-р<0.01 *** -р<0.001

Как следует из рисунка, у контрольных животных отмечалось снижение с возрастом показателя пролиферативного потенциала клеток: с периода грудного возраста на 17,8% к периоду перехода на самостоятельное питание (р>0,05) и 38,2% к инфантному периоду (р<0,01). Хронический стресс вызывал увеличение доли иммунореактивных клеток в обеих экспериментальных группах, однако в противоположность другим иммуногистохимическим реакциям, это увеличение было значимым лишь у животных 1-ой экспериментальной группы. Между двумя экспериментальными группами различия были значимыми лишь в старшей возрастной подгруппе (р<0,05).

Таким образом, количественный иммуногистохимический анализ аденогипофиза с использованием реакций на АКТГ, PCNA и каспазу-3 показал, что динамика данных показателей весьма неоднозначна в различные возрастные периоды раннего постнатального онтогенеза при действии процессивного и

системного стрессора и нуждается в проведении сравнительного анализа с динамикой респонсивности на других уровнях ГГАО.

Результаты количественной оценки КРФ-позитивных нейронов в ПВЯ представлен на рис.7.

Рис,7. Удельная площадь КРФ-позитивных клеток паравентрикулирного ядра гипоталамуса растущих крыс при хроническом стрессе (%).

Контроль

Стресс ожидания Иммерсионный стресс

Й-21 день I 1-30дней *-р<0.05 **-р<0.01 ***-р <0.001

I I - 14 дней

При анализе распределения иммунореакгивных клеток в контрольной группе также обращает на себя снимание наличие возрастной закономерности увеличения плотности КРФ+нейронов от грудного периода на 13,5% (р>0,05) до подсосного периода и на 39,5% до инфантного (р<0,01). Хронический стресс также вызывал увеличение доли иммунореакгивных клеток в ПВЯ, которое имело различный уровень значимости в обеих экспериментальных группах всех возрастных подгрупп. Между двумя экспериментальными группами различия по данному показателю определены лишь в старшей возрастной подгруппе

(р<0,05). Таким образом, наивысшая степень активации ГТАО на уровне гипоталамуса отмечена при действии хронического процессивного стрессора в средней возрастной подгруппе, что свидетельствует о высокой респонсивности данного звена оси при психологическом стрессе в период перехода на самостоятельное питание. Несколько меньшее увеличение данного показателя отмечалось в старшей подгруппе 1-ой экспериментальной группы и в младших подгруппах 2-ой экспериментальной группы, что может свидетельствовать, в зависимости от уровня активации других звеньев, либо о сниженной респонсивности, либо о развитии адаптационных изменений, демонстрирующих эффективность отрицательной обратной связи в регуляции ГТАО

Дня оценки эффективности отрицательной обратной связи в регуляции активности ГГАО нами проведен корреляционный анализ изменений на разных уровнях ГГАО при хроническом стрессе Его результаты показали, что между относительной массой надпочечника и экспрессией КРФ в ПВЯ существует достоверная сильная отрицательная корреляционная связь (г=-0,71, р<0,05) во 2-ой экспериментальной группе старшей возрастной подгруппы при действии системного стрессора, достоверная средняя по силе корреляционная связь между этими показателями во 2-ой экспериментальной группе средней возрастной подгруппы (г=-0,60, р<0,05) и в 1-ой экспериментальной группе старшей возрастной подгруппы (г=-0,56; р<0,05). В остальных возрастных подгруппах обеих экспериментальных групп связь была слабой и недостоверной. Таким образом, корреляционный анализ продемонстрировал, что нейроэндокринная пластичность гипоталамуса, проявляющаяся уровнем экспрессии КРФ в мелкоклеточной фракции ПВЯ гипоталамуса в зависимости от уровня активации периферического звена I I НС, имеет онтогенетическую опосредованность и связана с парадигмой стрессорного воздействия

Итак, предпринятое нами изучение нейроэндокринной инфраструктуры адаптационного ответа на действие стресса показало, что в раннем

постнахальном онтогенезе с исходным возрастом экспериментальных животных, соответствующим грудному периоду, переходу на самостоятельное питание и инфантному периоду имеет место различная респонсивность ГГАО на действие системного и процессивного стрессоров Так изменения на уровне периферического звена 11 НС - надпочечников - демонстрировали наибольшую степень активации при хроническом действии системного стрессора, причем в исходном возрасте, соответствующем переходу на самостоятельное питание. Вместе с тем, на уровне аденогипофиза, как показало иммуногистохимическое исследование, максимальный уровень активации наблюдался в возрасте, соответствующем преювенильному периоду. На уровне ПВЯ, напротив, наивысший уровень респонсивности отмечен при хроническом действии процессивного стрессора, а именно — в исходном возрасте, соответствующем переходу на самостоятельное питание Таким образом, эти данные демонстрируют, что парадигма стресса находит свое отражение в возрастной кинетике ответа ГГАО на хроническое действие стрессора Полученные нами результаты объясняются различиями в центральных механизмах интеграции стрессовых сигналов, зависящих от атрибутов стрессорного воздействия: системные стрессоры, действующие через периферическую нервную систему, вызывают немедленную физиологическую реакцию прямо на уровне ПВЯ гипоталамуса, в то время как процессивные стрессоры (т.е.психологические, генерированные ЦНС сигналы) требуют интерпретации на более высоком уровне головного мозга, чем ГГНС (Л.Р.Негтап а1., 2003), и время достижения функциональной зрелости этих структур в раннем пренатальном онтогенезе не совпадает В полной мере эта закономерность отражена в выявленных особенностях активации ГГАО в исходном возрасте экспериментальных животных, соответствующем трудному периоду В это время действие процессивного стрессора отмечено пшореспонсивностью на всех уровнях ГГАО, что укладывается в концепцию стресс-гипореспонсивного

периода, который у крыс длится с 3-го по 14-ый день жизни (G.W Dent et al., 2000). Вместе с тем действие системного стрессора в этой возрастной подгруппе характеризуется высокой степенью активации IT АО на всех ее уровнях, что заставляет по-новому оценить онтогенетические аспекты гистофизиологии 11 НС в растущем организме.

Адаптация ГГНС при хроническом стрессе характеризуется не только степенью активации и адекватностью уровня последней сипе стрессорного воздействия, но и параметрами десенситизации ГГАО в связи с действием механизма отрицательной обратной связи, активируемого при продолжительном стрессе для предотвращения избыточного ответа со стороны как центральных, так и периферических компонентов ГГНС, сопряженного с хроническим повышением КРФ и гиперпродукцией глюкокортикоидов (A.G.Watts et aL, 2002; G.Aguilera et al., 2007). Проведенный нами анализ показал, что, несмотря на наличие гиперреспонсивности со стороны надпочечников во всех возрастных подгруппах 2-ой экспериментальной группы и старших возрастных подгрупп 1-ой экспериментальной группы, выраженная десенситизация на уровне ПВЯ отмечается лишь в старшей возрастной подгруппе 2-ой экспериментальной группы. Таким образом, адекватные адаптационные изменения в 11 НС в раннем постнатальном онтогенезе развиваются в ответ на действие системного стрессора в преювенилыюм возрастном периоде Этому свидетельствует также наличие достоверной сильной отрицательной корреляционной связи между показателем относительной массы надпочечника н экспрессии КРФ в ПВЯ гипоталамуса Умеренная достоверная корреляционная связь отмечалась между этими показателями в возрастной подгруппе периода перехода на самостоятельное питание при действии системного стрессора и в инфантном периоде при действии процессивного стрессора, что свидетельствует о более низком уровне адаптации к данным видам стресса в отмеченных возрастных интервалах

Вместе с тем корреляция между этими показателями в подсосном периоде при действии процессивного стрессора и в грудном периоде при действии системного стрессора была слабой и недостоверной Все это свидетельствует о достаточно раннем формировании адаптационного потенциала ГГНС в раннем посгнатальном онтогенезе (в инфантном периоде) к действию физических стрессоров и о замедленной адаптации к действию процессивных стрессоров, которая не достигает значимого уровня даже к началу преювенильного периода.

Проявлением дезадаптации ГГАО при хроническом стрессе считается диссоциация между уровнями ее активации в центральном и периферическом звене оси. Проведенное нами исследование показало наличие стресс-ассоциированной дихотомии гипофизарно-надпочечниковой системы во 2-ой экспериментальной группе младшей возрастной подгруппы и 1-ой экспериментальной группе средней возрастной подгруппы, свидетельствующей о гиперреопонсивности надпочечников при хроническом стрессе в отмеченные возрастные периоды в рамках смоделированных стрессовых парадигм (Y.M.UIrich-Lai et al., 2006), а также достижении функциональной зрелости ГГАО в преювенильном периоде Последнее суждение подтверждается также выявленным нами характером взаимосвязи между уровнем экспрессии КРФ в ПВЯ и АКТГ в аденогипофизе: в старшей возрастной группе при действии системного стрессора на фоне относительного снижения доли КРФ+нейронов в ПВЯ, уровень экспрессии АКТГ в pars anterior аденогипофиза свидетельствует о сохраняющейся гиперактивации, что может расцениваться как показатель морфо-функциональной зрелости гипоталамо-гипофизарной системы (I.Skultetyova et al., 1999) Полученные нами данные согласуются с результатами других авторов, наблюдавших при хроническом стрессе небольшое непостоянное увеличение уровня кортшсостерона без увеличения уровня АКТГ (C.N.Haile et al., 2001, J.L.Simpkiss et al., 2003). Диссоциация между уровнем АКТГ и кортшсостерона может быть объяснена тем, что

продукция глюкокортикоидов регулируется не исключительно высвобождением АКТГ, а также АКТТ-независимыми механизмами, такими, например, как симпатическая иннервация (A.Kiss et al., 1994; Y.M.UJrich-Lai et al., 2000), a также увеличением порога активации стрессовой оси, характерным для действия психологических стрессоров (H.Houshyar et aL, 2001).

Анализ пролиферативного потенциала аденоцитов гипофиза показал, что в противоположность данным других авторов (В.К.Перт и др., 2002), их пролиферативная активность не только не снижается, но, напротив, повышается во всех возрастных группах при обоих видах стресса, однако уровень значимости по данному показателю достигается лишь при действии процессивного стрессора в старших возрастных группах. Отсутствие значимой корреляции между гипертрофией гипофиза и экспрессией АКТГ в pars anterior с одной стороны и пролиферативной активностью аденоцитов с одной стороны позволяет заключить, что гиперплазия кортикотропоцигов при хроническом стрессе, масштабы которой также связаны с исходным возрастом животных и характером примененного стрессора, обусловлена не столько усилением их пролиферации, сколько форсированной дифференцировкой эндокриноцитов

Апоптотический индекс среди аденоцитов pars distalis в целом был не высок, он достоверно возрастал при системном стрессе во всех возрастных подгруппах, а также при действии процессивного стрессора в младшей возрастной группе, не коррелировал ни с одним из изученных экстраггагофизарных показателей активации и адаптации ГГАО, вносил свой вклад в формирование гипореспонсивности оси в младшей возрастной группе и, вероятно, зависел от регуляторных молекул, таких как нейропепгиды и нейротрансмиттеры, источником которых становится ГГНС при стресс-ассоциированном нарушении гомеостаза (V.Chesnokova et al., 2002).

выводы.

1 В раннем достнатальном онтогенезе хронический стресс вызывает изменение кинетики адаптационного ответа гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной оси, инфрастуктура которого зависит от вида примененного стрессора и возрастной категории экспериментальных животных.

2 Фенотипическая пластичность гипоталамуса при хроническом стрессе, проявляющаяся уровнем экспрессии кортикотропин-рилизинг фактора в мелкоклеточной фракции его паравентрикулярного ядра в зависимости от уровня активации периферического звена гипоталамо-гипо физарно -надпочечниковой системы, онтогенетически опосредована и связана с парадигмой стрессорного воздействия. Начиная с инфантного периода она обеспечивает адаптационную гибкость нейроэндокринного ответа в соответствии с типом действующего стрессора, системного или процессивного.

3.По данным иммуногистохимического исследования, секреторная пластичность аденогипофиза в большей степени связана с уровнем дифференцировки кортикотропоцитов, чем с амплитудой его апоптотической и митотической пластичности.

4. В грудной период при хроническом действии системного стрессора и в период перехода на самостоятельное питание при хроническом действии процессивного с1рессора отмечается сниженная способность коргикостероновой отрицательной обратной связи ограничить уровень экспрессии кортикотропин-рилизинг фактора, препятствующая габшуации гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной оси.

5 В 1рудной период при действии процессивного стрессора гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система гипореспонсивна на гипоталамическом, гипофизарном и адреиаловом уровне: гипоталамические кортикотропин-рилизинг фактор-позитивные нейроны не чувствительны к глюкокортикоидной обратной связи, и базальный уровень экспрессии АКТГ относительно независим

от уровня экспрессии кортикотропин-рилизинг фактора в паравентрикулярном ядре гипоталамуса.

б. В основе гипореспонсивности гипоталамо-гипофизарно-адренокортикапьной оси при хроническом действии процессивного стрессора в период перехода на самостоятельное питание лежит не столько увеличение эффективности глюкокортикоидной обратной связи, сколько диссоциация оси на уровне гипоталаму с-аденогипофиз, приводящая к уменьшению эффективности прямой положительной связи в ней на уровне кортикотропин-рилизинг-фактор - АКТГ

Практические рекомендации

1. Иммуногистохимические показатели респонсивности компонентов ГТАО могут использоваться для оценки адаптационного ответа нейроэндокринной системы на действие хронического стресса

2. Оценка секреторной, митотической и апоптотической пластичности аденогипофиза может применяться при разработке лечебных тактик, направленных на профилактику стресс-ассоциированных нейроэндокринных нарушений в растущем организме при действии хронического стрессора

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Нейроиммуноэндокринные аспекты хронического стресса на ранних этапах постнатального онтогенеза // В сб «X региональная конференция молодых исследователей Волгоградской области», Волгоград, Издательство ВолГМУ, 2005, с 23-24 (соавт - Худа Салех Т А)

2. Особенности реакции иммунной и эндокринной систем растущего организма на воздействие хронического стресса // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины. Мат-лы 63-ой итоговой научной конференции студентов и молодых ученых ВолГМУ, 26-29 апреля 2005 г, Волгоград, 2005, с.122-124 (соавт. Федорова О.В, Верстакова О.Е, Аснизам Асари М, Худа Салех Т.А, Хлебникове Л, Чернов ДА.).

3. Возрастные аспекты адаптации аденогипофиза к действию хронического стресса // Современные наукоемкие технологии, 2005, №10, С 54 (соавт.

Морозова 3 Ч, Капитонова М.Ю, Мохд Исшил З.И., Миронов В В, Васильева В А)

4 Реакция органов гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы на хронический стресс // В мат. XI региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области, Волгоград, 8-10 ноября 2006 года, с.28-29 (соавт Иванова Д П, Бойко A.C.)

5. Морфологические аспекты адаптации эндокринной системы к действию стресса в раннем постнатальном онтогенезе // Успехи современного естествознания- 2007-N1-С63-64 (соавт Капитонова М.Ю , Морозова З.Ч., Смирнова ТС)

6 Сравнительная микроморфология хромофильных клеток аденогипофиза в норме и при хроническим психоэмоциональном и смешанном стрессе в раннем постнатальном онтогенезе белых 1фыс // В сб.. «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины Мат-лы 65-ой юбилейной открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием, 25-27 апреля 2007 г, Волгоград, 2007, с 179-180 (соавт Бойко А.С, Иванова Д.П)

7 Морфо-функциональные аспекты постстрессовой адаптации гипофизарно-надпочечниковой системы растущего организма // Вестник ВолГМУ, 2007, N3, с 64-67 (соавт Капитонова М.Ю., Морозова З.Ч., Смирнова Т.С.). *

* - издание, рекомендованное ВАК РФ для опубликования материалов диссертаций

Загребин Валерий Леонидович

Морфологические аспекты приспособления гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы к действию стресса в раннем постнатальном онтогенезе

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

14 00 02 анатомия человека 03.00.25 гистология, цитология, клеточная биология

Бумага офсетная №80 Тираж 100 экз

Отпечатано Копировальный центр «Эстамп» г Волгоград, ул Островского, 3

Глава 1. Обзор литературы. 12

1.1 Морфо-функциональная характеристика гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы человека и экспериментальных животных в норме и при антропогенных воздействиях. 12

1.1.1 История становления представлений о гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной оси и ее стресс-респонсивности в раннем постнатальном онтогенезе. 13

1.1.2 Центральная регуляция гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы в норме и при стрессорных воздействиях 15

1.1.2.1 Участие лимбической системы в регуляции гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной оси в норме и при стрессе 18

1.1.2.2 Роль паравентрикулярного ядра гипоталамуса в реализации стресс-индуцированых реакций гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной оси 22

1.1.2.3 Гипоталамо-гипофизарные взаимоотношения и их значение для реализации стрессорного ответа 24

1.1.2.4 Морфо-функциональные особенности аденогипофиза: возрастной аспект 28

1.1.3 Современные представления о гистофизиологии надпочечника человека и экспериментальных животных в норме и при внешних воздействиях и роли периферического звена гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы в адаптации к стрессу 31

1.1.4

Механизм отрицательной обратной связи в регуляции гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной оси и его модуляция при стрессе

1.1.5

Возрастные аспекты стресс-реактивности гипофизарно-адренокортикальной оси гипоталамо

1.2

Влияние' параметров стрессорного воздействия на гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую ' систему человека и экспериментальных животных

Глава 2. Материал и методы исследования

Глава 3. Результаты исследования

3.1.

Динамика органометрических параметров экспериментальных, и контрольных животных при действии системного и процессивного стрессора

3.2.

Морфологическая характеристика надпочечников у контрольных и экспериментальных животных

3.3.

Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика аденогипофиза у контрольных и экспериментальных животных

3.4

Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика гипоталамуса и его паравентрикулярного ядра у контрольных и экспериментальных животных

3.5

Количественный иммуногистохимический анализ ■ звеньев гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы в норме, при действии системного и процессивного стрессоров

Глава 4. Обсуждение полученных результатов

ВЫВОДЫ

Список литературы

ВВЕДЕНИЕ

Активация гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГНС) со стимуляцией высвобождения кортикотропин-рилизинг-фактора (КРФ) нейронами мелкоклеточных фракций паравентрикулярного ядра (ПВЯ) гипоталамуса с последующей секрецией адренокортикотропного гормона-(АКТГ) в аденогипофизе и глюкокортикоидов в коре надпочечников является основным нейроэндокринным ответом на действие стрессорных агентов и важнейшим механизмом поддержания гомеостаза в организме при стрессе: Важнейшей детерминантой адаптационных изменений при стрессорных воздействиях является конвергенция нейральных и гуморальных афферентных сигналов в КРФ-позитивных нейронах ПВЯ^ однако лежащие в ее основе интегративные механизмы остаются во многом невыясненными (И.Г.Акмаев, 2001; 2003; В.Г.Шаляпина, 2000; 2002; 2003; К.В.Судаков, 2005; A.G.Watts et al., 2002; A.F. De Nicola et al., 2006; G.Aguilera et al., 2007).

Регуляция ГГНС чрезвычайно сложна, и при многих патологических состояниях отмечается' гиперактивация гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной оси (ГГАО), что может быть связано с ее дисрегуляций> на уровне ПВЯ или на более высоком уровне, усугубляемой действием стрессорных факторов, однако механизмы этого состояния не могут считаться-окончательно установленными (В.Г.Шаляпина, 2001; S.B. Pinnock et al., 2001; O.Chan et all, 2002). Адаптация ГГНС при стрессе может быть неадекватной потребности восстановления гомеостаза: если стресс-индуцированный ответ нейроэндокринной системы избыточен или недостаточен по интенсивности или продолжительности, то восстановления физиологических параметров не произойдет, что может привести к развитию разнообразных патологических состояний, включая депрессии и другие аффективные расстройства. Нарушение регуляции адаптационного ответа при стрессе может влиять на рост и развитие организма и предопределять его индивидуальную чувствительность к развитию эндокринных, сердечно-сосудистых, иммунных и метаболических заболеваний (J.Chrousos et al., 1998; Q.Yang, 2000). Особенности активации ГГАО при различных состояниях, таких как стресс, инфекции, метаболические нарушения в раннем детстве остаются мало изученными (C.D.Walker et al., 1997; G.W.Dent et al., 2000; S.Morley-Fletcher et al., 2003), хотя известно, что именно стрессы раннего детства нередко приводят к развитию взрослой психопатологии, извращению последующих стресс-ассоциированных нейроэндокринных и поведенческих реакций, а варианты ответов ГГНС растущего организма на действие стрессорных агентов характеризуются широким диапазоном от глубокой гипореспонсивности до резкой фасилитации нейроэндокринного ответа (S.Morley-Fletcher et al., 2003; S.Levine 2005; D.M.Vazquez et al., 2006). При этом ряд авторов полагают, что ГГНС легче адаптируется к действию системных стрессоров, в то время как действие процессивных стрессоров нередко вызывает дезадаптацию (H.F.Figuiredo et al:, 2003). Напротив, другие авторы считают, что именно психологические стрессоры, действуя хронически, быстро вызывают габитуацию ГГАО в противоположность физическим стрессорам, адаптация к которым более продолжительна и сопровождается фасилитацией при действии нового стрессора (D.Zelena et al., 2003; M.M.Ostrander et al., 2006). Одни исследователи демонстрируют, что уровень активации ГГАО отражает продолжительность стрессорного воздействия, а не его интенсивность (A.Garcia et al., 2000), в то время как другие доказывают, что на уровень габитуации ГГНС при хроническом стрессе влияет прежде всего интенсивность стрессорного агента (D.L.Pitman et al., 1996; V.Chesnokova et al., 2002; A.Jaferi et al., 2006), а третьи утверждают, что оба фактора в равной степени влияют на респонсивность ГГНС (G.Chrousos, 1998; B.S.McEwen, 1998, 2000, 2005). Некоторые авторы считают причиной дезадаптации ГГАО при хроническом стрессе диссоциацию между ее центральным и периферическим звеном (S.Levine et al., 1991, 2005; D.M.Vazquez et al., 2006), тогда как другие считают звено оси на уровне АКТГ - кортикостероиды достаточно стабильным и определяют локус диссоциации оси на уровне обратной связи: кортикостероиды - ПВЯ (J.P. Herman et al., 2003; S. Retana-Marquez et al., 2003).

Глубокие противоречия сохраняются в литературе в объяснении нарушения механизма отрицательной обратной связи в ГГНС при хроническом стрессе, когда, несмотря на длительный выброс глюкокортикоидов, десенситизации ГГАО оси не происходит, и она продолжает, сохраняя активность, стимулировать повышенную выработку кортикостероидов, а также в интерпретации феномена фасилитациии ГГАО, когда на фоне хронического стресса действие нового стрессора вызывает еще большую активацию ГГАО (S.Makino et al., 1999; M.F.Dallman et al., 2000; A.Jaferi et al., 2003).

В связи с выше изложенным в. настоящем1 исследовании нами предпринята попытка определить, как созревание ГГНС в раннем постнатальном онтогенезе влияет на изменение ее приспособительного потенциала при различных видах хронического стресса.

Целью настоящего исследования является изучение возрастных аспектов взаимодействия различных звеньев ГГАО в приспособлении организма к хроническому действию системных и процессивных стрессоров'в препубертатном периоде постнатального онтогенеза. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать особенности респонсивности отдельных компонентов ГГНС при хроническом действии системного стрессора в растущем организме экспериментальных животных.

2. Исследовать возрастные особенности гистофизиологии различных звеньев ГГАО при хроническом действии процессивного стрессора в раннем постнатальном онтогенезе.

3. Оценить секреторную, митотическую и апоптотическую пластичность аденогипофиза как центрального звена ГГАО в условиях приспособления растущего организма к хроническому стрессу.

Материалы и методы.

Данное исследование является экспериментальным, выполненным на неполовозрелых белых крысах породы Sprague Dawley, исходный возраст которых соответствовал грудному периоду (14 дней), периоду перехода на самостоятельное питание (21 день) и инфантному периоду (30 дней). Животные каждой возрастной подгруппы подвергались хроническому действию стрессора: системного или процессивного. Адаптационные изменения в нейроэндокринной системе экспериментальных животных сопоставлялись с таковыми у животных групп возрастного контроля на различных уровнях гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы с помощью гистологических и иммуногистохимических методов исследования, а также имидж-анализа с последующей статистической обработкой полученных данных (статистикой средних, статистикой различий, корреляционным анализом). Использовались иммуногистохимические методы окраски на КРФ для выявления иммунореактивных нейронов мелкоклеточной фракции ПВЯ гипоталамуса, АКТГ для выявления кортикотропоцитов в pars distalis аденогипофиза, PCNA и каспазы-3 для характеристики уровня пролиферации аденоцитов гипофиза.

Результаты исследования.

Проведенное исследование выявило комплекс адаптационных изменений в ГГНС растущего организма при хроническом стрессе в их возрастной динамике и позволило получить о гипореспонсивности ГТАО, ее диссоциации на уровне ПВЯ - аденогипофиз, гиперреактивности периферического звена ГГНС, габитуации в системе отрицательной обратной связи в зависимости от примененного стрессора (перимущественно физического или психогенного) в возрастном контексте. Иммуногистохимическое исследование позволило также выявить диапазон секреторной, апоптотической и митотической пластичности аденогипофиза при действии разных видов стрессоров на1 разных этапах раннего постнатального онтогенеза.

Научная новизна работы.

Впервые с применением иммуногистохимии и имидж-анализа охарактеризованы особенности активации, габитуации и взаимодействия различных звеньев ГГНС растущего организма в различные возрастные периоды (грудной период, период перехода на самостоятельное питание и преювенильный период) под хроническим действием различных по природе стрессоров: системных и процессивных. Впервые получены данные о степени корреляции стресс-ассоциированных сдвигов в центральном и периферическом звене ГТАО и возрастной опосредованности их диссоциации при хроническом стрессе. Выявлены возрастные периоды в раннем постнатальном онтогенезе с максимальной респонсивностью и минимальным адаптационным потенциалом при хроническом воздействии физических и психологических стрессоров.

Теоретическое значение работы заключается в выяснении онтогенетических особенностей кинетики ответа ГГАО и взаимодействия ее звеньев при воздействии системных и процессивных стрессоров в растущем организме.

Практическая значимость работы состоит в получении данных относительно диапазона респонсивности разных звеньев ГГАО и их стресс-индуцированной диссоциации в различные возрастные периоды раннего постнатального^ онтогенеза, которые могут быть использованы при разработке мер профилактики стресс-ассоциированных нейро-эндокринных сдвигов в растущем организме.

Внедрение в практику: результаты диссертационного исследования внедреньг в учебный процесс на кафедре факультетской терапии (в курсе эндокринологии) и на кафедре нормальной физиологии. г

Публикации и апробация материалов диссертации. Материалы диссертации были- доложены на 63-ой итоговой- научной конференции студентов и молодых ученых ВолГМУ, 26-29 апреля 2005 г., Волгоград; II научной конференции с международным участием, «Современные проблемы науки и образования, 2-9 июля 2005 г., г. У маг (Хорватия); X региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области», ноябрь 2005, Волгоград; научной конференции с международным участием «Современные наукоемкие технологии», 20-27 ноября < 2005г., о.Тенерифе (Испания); XI региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области, 810 ноября 2006 года, Волгоград; IV научной конференции с международным участием «Проблемы экспериментальной и клинической медицины», 18-28 января 2007 г., Паттайа (Тайланд); 65-ой юбилейной открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием, 25-27 апреля 2007 г., Волгоград; заседании Волгоградского отделения Всероссийского научного общества анатомов, гистологов и эмбриологов 13 октября 2007.

Результаты исследования отражены в 7 публикациях, 1 из которых - в издании, рекомендованном ВАК для опубликования материалов диссертаций.

Положения, выносимые на защиту:

1. Активация ГТАС при хроническом стрессе в раннем постнатальном онтогенезе имеет различные морфо-функциональные проявления при действии процессивных и системных стрессоров.

2. Секреторная, митотическая и апоптотическая пластичность аденогипофиза как центрального звена ГГАС при хроническом стрессе в растущем организме имеет отчетливую возрастную зависимость.

Практические рекомендации

1 .Иммуногистохимические показатели респонсивности компонентов ГГАО могут использоваться для оценки адаптационного ответа нейроэндокринной системы на действие хронического стресса.

2. Оценка секреторной, митотической и апоптотической пластичности аденогипофиза может применяться при разработке лечебных тактик, направленных на профилактику стресс-ассоциированных нейроэндокринных нарушений в растущем организме при действии хронического стрессора.

выводы.

1 .В раннем поетнатальном онтогенезе хронический стресс вызывает изменение кинетики адаптационного ответа гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной оси, инфрастуктура которого зависит от вида примененного стрессора и возрастной категории экспериментальных животных.

2. Фенотипическая пластичность гипоталамуса при хроническом стрессе, проявляющаяся уровнем экспрессии кортикотропин-рилизинг фактора в мелкоклеточной фракции его паравентрикулярного ядра в зависимости от уровня активации периферического звена гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы, онтогенетически опосредована и связана с парадигмой стрессорного воздействия. Начиная с инфантного периода она обеспечивает адаптационную гибкость нейроэндокринного ответа в соответствии с типом действующего стрессора: системного или процессивного.

3.По данным иммуногистохимического исследования, секреторная пластичность аденогипофиза в большей степени связана с уровнем дифференцировки кортикотропоцитов, чем с амплитудой его апоптотической и митотической пластичности.

4. В грудной период при хроническом действии системного стрессора и в период перехода на самостоятельное питание при хроническом действии процессивного стрессора отмечается сниженная способность кортикостероновой отрицательной обратной связи ограничить уровень экспрессии кортикотропин-рилизинг фактора, препятствующая габитуации гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной оси.

5.В грудной период при действии процессивного стрессора гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система гипореспонсивна на гипоталамическом, гипофизарном и адреналовом уровне: гипоталамические кортикотропин-рилизинг фактор-позитивные нейроны не чувствительны к глюкокортикоидной обратной связи, и базальный уровень экспрессии АКТГ относительно независим от уровня экспрессии кортикотропин-рилизинг фактора в паравентрикулярном ядре гипоталамуса.

6. В основе гипореспонсивности гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной оси при хроническом действии процессивного стрессора в период перехода на самостоятельное питание лежит не столько увеличение эффективности глюкокортикоидной обратной связи, сколько диссоциация оси на уровне гипоталамус-аденогипофиз, приводящая к уменьшению эффективности прямой положительной связи в ней на уровне кортикотропин-рилизинг-фактор - АКТГ.