Автореферат и диссертация по медицине (14.01.08) на тему:Роль индигенной микрофлоры при воспалительных заболеваниях кишечника у детей

Г) С/

На правах рукописи

□034Э0 1 ИПАТОВА МАРИЯ ГЕОРГИЕВНА

РОЛЬ ИНДИГЕННОИ МИКРОФЛОРЫ ПРИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ КИШЕЧНИКА

УДЕТЕЙ

14.00.09 - Педиатрия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 4ЯНВ

Москва, 2009

003490118

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии» Минздравсоразвития России и ГОУ ВПО РГМУ Росздрава

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Кафарская Людмила

Ивановна

кандидат медицинских наук Шумилов Петр

Валентинович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Горелов Александр

Васильевич

доктор медицинских наук, профессор Делягин Василий

Михайлович

Ведущая организация: Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф.Владимирского

Защита диссертации состоится «__»_ в_часов на заседании

диссертационного Совета Д.208.050.01 при ФГУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии» Минздравсоразвития, по адресу: 117997, г. Москва, Ленинский проспект, д. 117, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ ФНКЦ ДГОИ Минздравсоразвития и на сайте www.niidg.ru Автореферат разослан «_»_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Чернов В.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), к которым относятся неспецифический язвенный колит (НЯК) и болезнь Крона (БК), представляют собой хронически текущие, рецидивирующие воспалительные заболевания желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), приводящие к необратимому нарушению его структуры и функции [Яблокова Е.А., 2006]. Рост заболеваемости у детей, поздняя диагностика, приводящая к различным осложнениям, и неблагоприятный прогноз обусловливают особую актуальность изучения данной проблемы.

Этиология ВЗК остается до конца неизвестной. Многие исследователи пришли к единому мнению, что в патогенезе воспалительных заболеваний кишечника лежит взаимодействие генетической предрасположенности, факторов внешней среды, иммунорегуляторных механизмов и кишечной микрофлоры 1?. БсаМайял й а1., 2005].

Результаты современных отечественных и зарубежных исследований указывают на значительную роль индигенной микрофлоры в патогенезе воспалительных заболеваний кишечника, в особенности его дистальных отделов. Но имеющийся объем информации об особенностях кишечной микрофлоры у пациентов с ВЗК недостаточен для глубокого понимания конкретной роли различных видов бактерий в развитии данной патологии. Это связано, в первую очередь, с несовершенством рутинных бактериологических методов исследования микрофлоры, а также недостаточным вниманием к изучению качественного и количественного состава пристеночной микрофлоры толстой кишки у пациентов с БК и НЯК. В большинстве исследований изучалась преимущественно фекальная микрофлора, которая по составу существенно отличается от микрофлоры слизистой оболочки ЖКТ [Р.В. ЕскЬи^ й а1., 2005].

В последние годы развитие молекулярной систематики бактерий и методов детекции нуклеиновых кислот, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени сделали возможным выявление в исследуемом материале тех групп бактерий, учет которых был крайне затруднен из-за сложности или невозможности их культивирования методами классической бактериологии. Полученные данные кардинально изменили представление о составе пристеночной микрофлоры кишечника [Matsuki Т. et al., 2002, Miyamoto Y. et al., 2002, Matsuki, T. et al., 2004].

На сегодняшний день нет единого консенсуса относительно роли микробного компонента в развитии ВЗК, состава кишечной микрофлоры у пациентов с БК и НЯК в зависимости от активности и распространенности заболевания. Все известные исследования проводились только у взрослых пациентов [Swidsinski A. et al. 2002; Eckburg Р.В. et al., 2005, Takaishi H. et al, 2008].

Изучение особенностей состава индигенной пристеночной микрофлоры и иммунологической реактивности к ней у пациентов с НЯК и БК важно не только для понимания патогенеза ВЗК, но и необходимо для разработки новых диагностических и терапевтических подходов, оценки эффективности и безопасности новых методов лечения, что делает нашу работу крайне актуальной.

Цель исследования

Установить особенности состава пристеночной микрофлоры кишечника и адаптивного иммунитета у детей с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом для оптимизации лечебно-диагностических и профилактических мероприятий.

Задачи исследования:

1. Выявить особенности анамнестических, клинических и лабораторно-инструментальных данных у детей с различными вариантами течения болезни Крона и неспецифического язвенного колита.

2. Изучить количественный и качественный состав основных представителей пристеночной микрофлоры в биоптате слизистой оболочки кишечника у детей с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом методом количественного ПЦР в режиме реального времени с группоспецифическими праймерами.

3. Выявить корреляционные связи между количественным содержанием различных представителей индигенной микрофлоры (группа В. fragilis, группа С. leptum, группа C.coccoides, род Bifidobacterium, род Lactobacillus, род Prevotella и кластер Atopobium) при различных течениях воспалительных заболеваний кишечника у детей с клиническими и лабораторно-инструментальными данными.

4. Исследовать титр антител класса IgG к основным представителям индигенной микрофлоры в сыворотке крови с помощью иммуноферментного анализа у детей с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом и оценить его диагностическую и прогностическую роль.

5. Оптимизировать лечебно-диагностические и профилактические мероприятия на основании установленных особенностей состава пристеночной микрофлоры у детей с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом.

Научная новизна.

Впервые была проведена комплексная оценка пристеночной микрофлоры толстой кишки у детей с БК и НЯК методом количественного ПЦР в режиме реального времени с группоспецифическими праймерами. Выявлены особенности количественного и качественного состава пристеночной микрофлоры (группа В. fragilis, группа С. leptum, группа C.coccoides, род Bifidobacterium, род Lactobacillus, род Prevotella и кластер

АЮроЫит) в зависимости от нозологической формы, особенностей клинического течения, распространенности патологического процесса и проводимой терапии.

Впервые оценена иммуногенная роль индигенной флоры (на примере бифидобактерий и лактобацилд) в патогенезе воспалительных заболеваний кишечника по данным иммуноферментного анализа. Показано, что повышение уровня 1§С-антител к лактобациллам и бифидобактериям коррелируют с распространенностью и активностью патологического процесса при НЯК и может быть использовано в качестве диагностического и прогностического критерия у детей с ВЗК.

Полученные результаты данного исследования могут послужить основой для дальнейшей качественной и количественной идентификации основных представителей пристеночной микрофлоры кишечника, для разработки новых диагностических критериев болезни Крона и неспецифического язвенного колита, для оптимизации методов медикаментозной терапии у детей и мониторинга их эффективности.

Практическая значимость.

Изучен состав пристеночной микрофлоры толстой кишки у детей с БК и НЯК методом количественного ПЦР в режиме реального времени с группоспецифическими праймерами в зависимости от нозологической формы, особенностей клинического течения и распространенности патологического процесса. Предложены новые дополнительные диагностические критерии у детей с БК и НЯК. Показано влияние проводимой терапии на состав пристеночной микрофлоры и роль ее изменения на течение ВЗК у детей.

Показана высокая диагностическая ценность определения титра антител класса ^О к лактобациллам и бифидобактериям в сыворотке крови у детей с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом посредством иммуноферментного анализа и его прогностическая роль для определения активности течения неспецифического язвенного колита у детей.

Предложены дополнительные диагностические критерии БК и НЖ у детей в зависимости от состава пристеночной микрофлоры кишечника и уровня ^О-антител к лактобациллам и бифидобактериям.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на XIV Российской Гастроэнтерологической неделе (Москва 6-8 октября 2008г), VII Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», Москва 21-23 октября 2008 г., 11-ом Международном Славянобалтийском научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро-2009», Санкт-Петербург 20-22 мая 2009 г., 2-ом международном конгрессе по пробиотикам «Санкт-Петербург - Пробиотики-2009», Санкт-Петербург 28-30 октября 2009 г.

Внедрение в практику

Разработанные дополнительные микробиологические диагностические критерии БК и НЯК у детей внедрены в практику и используются в педиатрическом отделении городской детской клинической больницы № 13 имени Н.Ф. Филатова г. Москвы. Основные научные положения и выводы внедрены в педагогический процесс курса гастроэнтерологии и диетологии ФУВ кафедры детских болезней № 2 ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова Росздрава.

Публикации: По теме диссертации имеется 6 публикаций, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на _ страницах машинописного текста и

состоит из введения, обзора литературы, описания объема и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения, выводов и

практических рекомендаций. Работа проиллюстрирована __таблицами и

_рисунками. Библиография содержит_литературных источников:_

отечественных и_иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объем и методы исследования

Работа выполнялась на базе отделения гастроэнтерологии с гепатологической группой (зав. отд. - д.м.н., проф. А.С.Потапов) НИИ Педиатрии ГУ НЦЗД РАМН (директор - академик РАМН, д.м.н., проф. A.A. Баранов), кафедры микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО Российского государственного медицинского университета им. Н.И.Пирогова Росздрава (зав. кафедрой - д.м.н., проф. Кафарская Л.И.) и лаборатории иммунохимической диагностики ФГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (зав. лабораторией - д.м.н. Ястребова Н.Е.).

Таблица 1.

Объем проведенных исследований _

Наименование исследования Количество исследований

Клиническое обследование, сбор анамнеза, осмотр 51

Клинический анализ крови 51

Общий анализ мочи 51

Копрограмма 51

Коагулограмма 38

Биохимический анализ крови 51

Иммунологические исследования крови 51

Ультразвуковое исследование органов брюшной полости 51

Колоноскопия 51

Гистологическое исследование биоптатов тонкой и толстой кишки 51

Оценка активности по индексу ЛасИтНеш^ (клинический, эндоскопический) 26

Оценка активности по педиатрическому индексу болезни Крона (РСБА!) 17

Оценка простого эндоскопического индекса активности при болезни Крона (SES-CD) 17

Уровень igG антител к антигенам лактобацилл и би ф идобактериям 50

ПЦР в режиме реального времени бактерий: Clostridium coccoides, Clostridium leptum, Bacteroides fragilis, Bifidobacterium, Lactobacillus, Prevotella, Atopobium 32

Было обследовано 43 ребенка с воспалительными заболеваниями кишечника в возрасте от 1,5 лет до 17 лет 10 мес. (26 мальчиков и 17 девочек). Из них у 26 детей был диагностирован НЯК, у 17 - БК. Средний возраст обследованных детей с ВЗК составлял 12,2±3,97 лет. Длительность ВЗК у наблюдаемых детей в среднем составила 3,6±3,4 лет. Референтная группа включала 24 ребенка (у 8 детей исследовались биоптаты слизистой оболочки толстой кишки, у 16 - сыворотка крови), не имевших воспалительных заболеваний кишечника и других воспалительных заболеваний на момент забора материала. Группа сравнения была сопоставима с исследуемой группой по возрасту и половому составу.

Таблица 2.

Распределение детей с ВЗК (п=43) по полу и возрасту.

до 3-х лет 4 года -12 лет 13 лет-17 лет

БК (%) м 1(5%) 6(35%) 4(24%)

д 0 4 (24%) 2 (12%)

НЯК (%) м 1 (4%) 4(15%) 10(39%)

Д 1 (4%) 5(19%) 5(19%)

Всего (%) 3(7%) 19 (44%) 21 (49%)

Диагнозы НЯК . и БК устанавливались на основании жалоб, данных анамнеза и результатов клинико-лабораторных, эндоскопических и морфологических методов исследования.

Клинический осмотр проводился с применением общепринятых методов пальпации, перкуссии и аускультации. При осмотре обращали

9

внимание на общее состояние ребенка, телосложение и состояние питания, цвет, температуру и наличие изменений кожных покровов, форму и размер живота. Физическое развитие детей оценивали по стандартным центильным таблицам (А.В. Мазурин, И.М. Воронцов, 2001).

Для определения клинической активности НЯК у детей использовали балльную шкалу Rachmilewitz (D.Rachmilewitz, 1989), БК - с помощью педиатрического индекса активности болезни Крона (PCDAI) (H.J. Loonen, А.М. Griffiths et al., 2003).

Эндоскопическую активность НЯК определяли с использованием эндоскопического индекса Rachmilewitz. Оценка эндоскопической активности БК проводилась при помощи простого эндоскопического индекса активности болезни Крона (SES-CD). Гистологические исследования биоптатов слизистой оболочки кишечника выполнялись в патоморфологической лаборатории ГНЦК МЗ РФ (зав.- д.м.н., проф. Капуллер Л.Л.).

Изучение особенностей состава индигенной пристеночной микрофлоры (группа Clostridium coccoides, группа Clostridium leptum, группа Bacteroides fragilis, род Bifidobacterium, род Lactobacillus, род Prevotella, и кластер Atopobium) проводилось методом ПЦР в режиме реального времени с помощью группоспецифических праймеров на кафедре микробиологии Российского государственного медицинского университета им. Н.И.Пирогова Росздрава (зав. кафедрой - д.м.н., проф. Кафарская Л.И.). Забор материала для исследования проводился во время плановой диагностической фиброколоноскопии с лестничной биопсией (назначена лечащим врачом согласно индивидуального плана обследования). Для исследования брался один дополнительный биоптат слизистой оболочки прямой кишки, который хранился в сухой пластиковой микропробирке при температуре -80°С до проведения исследования. Выделение ДНК из образцов проводилось по методу Boom с использованием набора ZR Genomic DNA Tissue MiniPrep (ZYMO RESEARCH) в соответствии с рекомендациями

изготовителя. Постановку реакции ПЦР в режиме реального времени осуществляли с использование готовых 2,5Х ПЦР-смесей («Синтол») в приборе АНК-32 («Синтол»). Флуоресценция в пробирках детектировалась в режиме реального времени на канале FAM (возбуждение 492 нм, эммиссия 520 нм). Значения пороговых циклов определялись автоматически прибором. Построение калибровочных кривых и расчет значений концентрации бактериального геномного ДНК в исследуемых образцах проводили с использованием программы Microsoft Excel.

Для изучения иммунологической реактивности к индигенной микрофлоре кишечника проводилось определение антител класса IgG к лактобациллам и бифидобактериям на базе лаборатории иммунохимической диагностики ФГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (зав. лабораторией - д.м.н. Ястребова Н.Е.). Для приготовления диагностических систем для ИФА использовались пробиотические штаммы Bifidobacterium bifidum 791 и Lactobacillus rhamnosus 1, которые культивировались в питательной среде MRS (Himedia Labs, Индия) в анаэробных условиях при 37°С. Препараты клеточных стенок были получены методом дезинтеграции и центрифугирования (Ястребова Н.Е. и др.. 1999). Антитела класса IgG к бифидобактериям и лактобациллам определяли с помощью иммуноферментного анализа. Учет результатов на спектрофотометре при длине волны 492нм. Оптическую плотность растворов в каждой ячейке измеряли с помощью многоканального автоматического горизонтального фотометра "Titertech Multiscan®MC" фирмы "Flow Laboratories" (Англия).

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета программ BIOSTAT и STATISTICA 6.0. В обработку результатов входил анализ распределения признаков и их числовые характеристики. В случае, если выборка подчинялась закону нормального распределения, для анализа использовались критерии параметрической статистики с вычислением средней и стандартного отклонения, при сравнении признаков применялся Т-тест. В случаях

ненормального распределения, в анализе полученных результатов использовались критерии непараметрической статистики с вычислением медианы и 25%-ой и 75%-ой перцентилей. При сравнении двух независимых признаков использовался критерий Манна-Уитни, а при сравнении зависимых признаков - парный критерий Уилкоксона. Для сравнения долей использовался критерий углового преобразования Фишера. При сравнении однородных величин различия считались достоверными при р<0,05. В целях выявления характера взаимодействия между показателями, характеризующими изменение в организме ребёнка, анализировалась линейная корреляция Пирсона (г) или ранговая корреляция Спирмена (г5). Корреляционная связь при коэффициенте корреляции до 0,5 расценивалась как низкая, 0,5-0,7- умеренная, 0,7-0,9-сильная.

Результаты исследования

При поступлении в клинику у большинства детей (62%) наблюдалось обострение заболевания. Самыми частыми клиническими проявлениями у детей, страдающих НЯК, были частый разжиженный стул до 4 - 6 раз в сутки (69%), кровь в стуле (50%) и болевой синдром (54%), локализующийся по ходу толстой кишки и имеющий связь с актом дефекации. У 69% детей с НЯК отмечались внекишечные проявления. У детей с БК самыми частыми клиническими проявлениями были кашицеобразный стул 1 - 3 раз в сутки (47%), болевой синдром (24%) и кровь в стуле (12%). Внекишечные проявления у детей, страдающих БК, отмечались чаще (82%). Наибольшая часть детей с НЯК (35%) имели умеренную клиническую активность, высокая активность и низкая активность составили по 23%, соответственно. 19% детей находились в состоянии ремиссии. Наибольшая часть детей с БК (47%) имели умеренную клиническую активность, высокая активность отмечалась у 29%, а низкая -у 18% детей. 6% детей находились в состоянии ремиссии.

При эндоскопическом обследовании у детей с НЯК преобладали распространенные формы поражения толстой кишки (панколит) - 65% и низкая степень активности (35%), в то время как умеренная активность отмечена у 31% детей, а высокая в 23% случаев. У 12% детей эндоскопическая картина соответствовала стадии ремиссии. Среди детей с БК преобладало сочетанное поражение толстой и подвздошной кишки (илеоколит) - 82% и умеренная степень активности (47%), в то время как высокая активность отмечена у 12% детей, и низкая в 23% случаев. У 18% детей эндоскопическая картина соответствовала стадии ремиссии.

Результаты лабораторных исследований у детей с ВЗК указывали на наличие анемии (14,7%) и латентного дефицита железа (38,2%). Среди неспецифических изменений крови, свойственных хроническому воспалению, у больных с НЯК и БК наиболее часто встречались лейкоцитоз, моноцитоз, тромбоцитоз, ускорение СОЭ, диспротеинемия, гипергаммаглобулинемия, увеличение уровней иммуноглобулинов класса А, в и М, циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Причем для больных с НЯК был характерен более высокий уровень 1§М, 1§0 и ЦИК.

Все дети с ВЗК получали базисную терапию препаратами 5-аминосалициловой кислоты. Системные глюкокортикостероиды (преднизолон, метилпреднизолон) получали 13 детей (7 детей с НЯК и 6 детей с БК), цитостатическую терапию (азатиоприн или циклоспорин) получали 14 детей (по 7 детей в каждой группе), 2 детей с НЯК и 4 ребенка с БК получали антицитокиновую терапию (инфликсимаб). Антибактериальную терапию (метронидазол) получали 11 пациентов с ВЗК (3 детей с БК и 8 детей с НЯК).

Анализируя количественный состав пристеночной микрофлоры, было выявлено, что суммарная бактериальная плотность (количество бактерий, которые были идентифицированы методом ПЦР в каждом исследуемом биоптате) у детей с НЯК, БК и группе сравнения не имеет статистически

значимых отличий. У детей с ВЗК была выявлена более низкая бактериальная плотность В. fragilis и Prevotella и повышенное количество Lactobacillus по сравнению с группой сравнения. При оценке бактериальной обсемененности пристеночной микрофлоры у детей исследуемых групп было выявлено, что для детей с НЯК характерны более высокие значения С. coccoides. Полученные отличия не были статистически значимыми, за исключением В. fragilis, которые были статистически ниже у пациентов с БК по сравнению с группой сравнения (р<0,05), что возможно связано с особенностями данной нозологии. Полученные результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3.

Результаты ПЦР состава пристеночной микрофлоры ректосигмоидного _отдела кишечника у детей, исследуемых групп, (М±а)_

Бактериальная группа Праймер Больные НЯК (n=16) Больные БК (n=8) Группа сравнения (n=8)

loglO, клеток/г

Bacteroides . fragilis (группа) g-Bfra-F g-Bfra-R 6,45±0,72 6,16±0,25* 6,89±0,89

Prevotella (род) g-Prevo-F g-Prevo-R 6,31±0,82 6,1±1,16 6,53±0,75

Clostridium coccoides (группа) g-Ccoc-F g-Ccoc-R 8,1511,05 7,72+1,37 7,83+1,07

Clostridium leptum (группа) sg-Clept-F sg-Clept-R3 7,51+0,41 7,3±0,49 7,4210,43

Atopobium (кластер) c-Atopo-F c-Atopo-R 8,39±0,32 8,48+0,44 8,3210,21

Lactobacillus (РОД) g-Lacto-F g-Lacto-R 2,59+0,63 2,56±0,34 2,2910,58

Bifidobacterium (род) g-Bifi-F g-Bifi-R 7,39±0,15 7,37+0,26 7,6310,58

*- р < 0,05 по сравнению с группой сравнения

В связи с тем, что на количественный состав микрофлоры влияет прием антибактериальных препаратов, а дети (42%), страдающие ВЗК, часто получают

антибактериальную терапию (метронидазол), мы оценили количественный состав пристеночной микрофлоры в зависимости от приема антибактериального препарата. При оценке суммарной бактериальной плотности пристеночной микрофлоры у детей исследуемых групп было выявлено, что для детей с ВЗК, не принимавших антибактериальные препараты, характерны более высокие значения, особенно С. coccoides (табл. 4). У детей, получавших антибиотики, было снижено количество большинства исследуемых бактериальных групп, за исключением Atopobium, уровень которых оставался неизменным, и Lactobacillus, для которых была характерна тенденция к нарастанию. Наиболее выраженное снижение бактериальной плотности было отмечено со стороны представителей рода Prevotella (р<0,01) и rpynns В. fragilis (р<0,05).

Таблица 4.

Результаты ПЦР состава пристеночной микрофлоры ректосигмоидного

отдела кишечника у детей, исследуемых групп в зависимости от _ проводимой терапии, (М±о)__

Бактериальная группа Прамеры Больные ВЗК, принимавшие АБ (n=10) Больные ВЗК, не принимавшие АБ (п=14) Группа сравнения (п=8)

loglO, клеток/г

Bacteroides fragilis (группа) g-Bfra-F g-Bfra-R 6,14±0,25* 6,51±0,75 6,89+0,89

Prevotella (род) g-Prevo-F g-Prevo-R 5,64+0,89** 6,67+0,71 6,53±0,75

Clostridium coccoides (группа) g-Ccoc-F g-Ccoc-R 7,47+1,45 8,27±0,93 7,83±1,07

Clostridium leptum (ipynna) sg-Clept-F sg-Clept-R3 7,31±0,39 7,4910,46 7,42±0,43

Atopobium (кластер) c-Atopo-F c-Atopo-R 8,39±0,34 8,44±0,38 8,32±0,21

Lactobacillus (род) g-Lacto-F g-Lacto-R 2,67±0,72 2,42±0,35 2,29+0,58

Bifidobacterium (РОД) g-Bifi-F g-Bifi-R 7,39±0,21 7,44±0,29 7,63±0,58

Суммарная бактериальная плотность. 8,61±0,41 8,78±0,5 8,65+0,4

*-р< 0,05 по сравнению с группой сравнения **- р < 0,01 по сравнению с группой сравнения и р < 0,05 по сравнению с детьми, не получавшими антибактериальную терапию

При оценке состава пристеночной микрофлоры было выявлено, что для детей с ВЗК характерно снижение доли представителей филогенетического отдела Bacteroidetes (В. fragilis и Prevotella), особенно у детей с БК, у которых снижение содержания В. fragilis было статистически значимым (р<0,05), и рост представителей филогенетического отдела Firmicutes {Lactobacillus, С. leptum, C.coccoides), особенно у детей с НЯК, у которых повышение C.coccoides и Lactobacillus было более существенным, хотя и статистически не значимым. Доля представителей филогенетического отдела Actinobacteria была примерно одинаковой во всех исследуемых группах (рис. 1).

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

•ч ' ' ' у 1

34.0% - 33,7 % "Т. ■ ' 34,7%

37,4% 39,0% 38,5%

IfBlii UJf'/.

шшшш.

ЩШШЙЙ Viii';-:': _ ■

□ Actinobacteria

□ Firmicutes

В Bacteroidetes

Группа сравнения

НЯК

БК

Рисунок 1. Доли отдельных филогенетических отделов бактерий в составе пристеночной микрофлоры у детей, исследуемых групп

С целью изучения особенностей состава пристеночной микрофлоры кишечника у детей с разными нозологическими формами ВЗК, его влияния на клиническую и эндоскопическую картину, и оценки индигенной флоры при различной площади поражения и применяемой терапии были отдельно проанализированы дети с НЯК и БК.

Для детей с НЯК характерно относительно повышенная бактериальная плотность C.coccoides и Lactobacillus, при некотором снижении Bifidobacterium, В. fragilis и Prevotella. В период обострения у детей с НЯК отмечается тенденция к повышению бактериальной плотности до loglO 8,95±0,38, в то время как в период ремиссии она составляет loglO 8,65+0,28.

Максимальная бактериальная плотность отмечается у детей с низкой клинической активностью (loglO 8,65±0,28). По мере повышения клинической активности отмечалась тенденция к снижению показателей бактериальной плотности (log 10 8,46±0,63), что связано с усилением агрессивности проводимой терапии, в том числе антибактериальной. При высокой клинической активности было снижено содержание представителей всех исследуемых групп, за исключением Lactobacillus, уровень которого был максимальным у детей с высокой активностью НЯК, a Bifidobacterium у этих детей практически отсутствовали (табл. 5). Максимальные значения Bifidobacterium были отмечены у детей с низкой активностью заболевания. Данные закономерности изменений уровня Lactobacillus и Bifidobacterium подтверждаются выявленными прямыми сильными корреляционными связями Lactobacillus с высокой клинической активностью НЯК (rs=0,86, /КО,01), a Bifidobacterium с низкой клинической активностью заболевания (г8=0,79,р<0,05).

При анализе лабораторных показателей с исследуемыми бактериальными группами было выявлено, что для Bifidobacterium характерна прямая сильная корреляционная связь (rs=0,78, р<0,05) с уровнем IgM в сыворотке крови. Для Lactobacillus была выявлена прямая сильная корреляционная связь с повышением СРВ (rs=0,83,^<0,001).

Средние значения представителей индигенной микрофлоры в зависимости от клинической активности у детей с НЯК

Больные с высокой степенью активности (п=4) Больные с умеренной степенью активности (п=5) Больные с низкой степенью активности (п=4) Больные в периоде ремиссии (п=3)

Bacteroides fragilis (группа) 6,0510,09 6,54±0,77 6,97+1,06 6,16±0,03

Prevotella (род) 5,69±1,18 6,49±0,58 6,66±0,55 6,36±0,90

Clostridium coccoides (группа) 7,50±2,11 8,40±0,70 8,66±0,77 7,64±1,21

Clostridium leptum (группа) 7,55 7,50+0,18 7,80±0,39 7,1910,69

Atopobium (кластер) 8,23+0,48 8,39+0,30 8,60+0,13 8,3010,20

Lactobacillus (род) 3,36±0,35 1,92±0,41 2,41±0,22 2,8010,22

Bifidobacterium (род) н/о 7,08±0,38 7,72±0,24 7,3310,08

Суммарная бактериальная плотность 8,46+0,63 8,81±0,38 8,95±0,46 8,65+0,27

н/о - не обнаружено

При индивидуальном анализе бактериальных групп в зависимости от эндоскопического индекса активности по Rachmilewitz нами было отмечено, что для детей с высокой эндоскопической активностью характерно снижение бактериальной плотности Prevotella, по сравнению с детьми, у которых эндоскопическая картина соответствовала умеренной и низкой активности. Однако это количество было схоже с количеством копий нуклеотидных последовательности Prevotella у детей, находящихся в эндоскопической ремиссии. У детей с умеренной эндоскопической активностью не было выявлено статистически значимых отличий бактериальной плотности исследуемых бактерий по сравнению с эндоскопической картиной у других детей. При низкой клинической активности были выявлены самые высокие значения копий нуклеотидных последовательностей Prevotella по сравнению

с другими группами эндоскопической активности и эти отличия были статистически значимы (р<0,05). Эндоскопическая ремиссия у детей с НЯК характеризовалась самой низкой бактериальной плотностью Clostridium leptum и Clostridium coccoides (табл. 6).

Таблица 6.

Средние значения представителей индигенной микрофлоры в зависимости от эндоскопической активности у детей с НЯК

Больные с высокой степенью активности (п=5) Больные с умеренной степенью активности (п=3) Больные с низкой степенью активности (п=6) Больные в периоде ремиссии (п=2)

Bacteroides fragilis (группа) 6,36±0,78 6,28±0,48 6,70±0,92 6,2210,07

Prevotella (род) 5,96±0,99 6,19±1,03 6,90±0,26* 5,5910,38

Clostridium coccoides (группа) 8,04±1,37 8,77 8,45+0,82 7,1211,11

Clostridium leptum (группа) 7,51±0,09 7,50±0,18 7,6410,45 6,64

Atopobium (кластер) 8,25±0,41 8,42+0,18 8,4310,36 8,5610,09

Lactobacillus (род) 2,8±0,77 2,37+0,91 2,33+0,48 2,7210,20

Bifidobacterium (род) 7,32 7,48+0,69 7,3910,57 7,25

Суммарная бактериальная плотность 8,60±0,59 8,6910,20 8,8710,52 8,6310,04

*- р < 0,05 по сравнению с бактериальной плотностью у детей с

высокой, умеренной эндоскопической активностью и в периоде ремиссии.

Анализируя связь бактериальной плотности с распространенностью патологического процесса при НЯК, было выявлено, что при проктосигмоидитах повышена бактериальная плотность Bacteroides fragilis, Clostridium coccoides по сравнению с проктитами и панколитами. А у детей с проктитами количество копий нуклеотидных последовательностей Bifidobacterium было ниже порогового уровня чувствительности.

При анализе зависимости состава индигенной пристеночной микрофлоры от проводимой терапии была выявлена обратная сильная корреляционная связь Bifidobacterium с применением антибактериальной терапии (rs=-0,79, /к0,05) и прямая корреляционная связь умеренной силы приема цитостатической терапии (азатиоприн) и уровнем Lactobacillus (rs=0,67„p<0,05)

Для детей с БК характерно более низкое значение B.fragilis (р<0,05), С. leptum, C.coccoides и Prevotella при некотором нарастании бактериальной плотности Lactobacillus. Уровень Bifidobacterium и Atopobium не отличались от группы сравнения.

При оценке зависимости состава пристеночной микрофлоры от клинической активности у детей с БК было выявлено, что максимальная бактериальная плотность отмечалась у детей с умеренной клинической активностью БК (loglO 9,02±0,36), по мере нарастания активности бактериальная плотность падает до loglO 8,37±0,59, что связано с применением антибактериальной терапии. Детей с низкой клинической активностью в исследовании не было. В стадии ремиссии находился один ребенок, и суммарная бактериальная плотность у него составила loglO 8,79.

Высокая клиническая активность у детей с БК характеризовалась снижением бактериальной плотности C.coccoides и Prevotella по сравнению с бактериальной плотностью у детей с умеренной клинической активностью и ремиссией. При умеренной клинической активности значения бактериальной плотности были схожи с результатами количественного ПЦР исследуемых бактерий у ребенка, находившегося в ремиссии (табл. 7).

Средние значения представителей индигенной микрофлоры у детей с различной клинической активности БК

Больные с высокой степенью активности (п=4) Больные с умеренной степенью активности (п=3) Больные в периоде ремиссии (п=1)

Bacteroides fragilis (группа) 6,23±0,37 6,0910,04 6,1

Prevotella (род) 5,57±0,97 6,6911,46 6,47

Clostridium coccoides (группа) 6,74+1,27 8,9110,45 8,28

Clostridium leptum (группа) 7,02±0,48 7,70+0,45 7,36

Atopobium (кластер) 8,29±0,55 8,7110,23 8,56

Lactobacillus (род) 2,43+0,35 2,7510,42 2,68

Bifidobacterium (род) 7,4810,25 7,16+0,29 7,42

Суммарная бактериальная плотность 8,37+0,59 9,0210,36 8,79

Для детей с БК с целью оценки клинического значения состава пристеночной микрофлоры мы проанализировали особенности клинической активности и выявили прямую сильную корреляционную связь С. leptum и С. coccoides с умеренной клинической активностью (rs=0,83, р<0.05) и обратную зависимость этих представителей индигенной микрофлоры с высокой активностью заболевания (rs=-0,88,/><0,05).

При оценке клинических симптомов БК у детей с представителями индигенной микрофлоры была выявлена прямая сильная корреляционная связь между наличием Atopobium и повышением температуры тела (rs=0,88, р<0,01), С. leptum и учащением стула до 3 раз в сутки (rs=0,84, р<0,05), Lactobacillus и примесью крови в стуле (rs=0,86, р<0,05), в то время как

уровень Bifidobacterium имеет обратную сильную корреляционную связь с примесью крови в стуле (rs=-0,88,/K0,05).

При анализе лабораторных показателей с исследуемыми бактериальными группами было выявлено, что для С. coccoides характерна прямая сильная корреляционная связь (rs=0,83, р<0,05) с анемией и нейтрофилезом. Для С. leptum также была выявлена прямая сильная корреляционная связь (rs=0,90, р<0,05) с повышением уровня нейтрофилов в периферической крови у детей с БК. Для Lactobacillus была выявлена прямая сильная корреляционная связь (rs=0,81,p<0,05) с повышением СОЭ, а также повышением уровня IgG в сыворотке крови (rs=0,82,p<0,05).

Таблица 8.

Средние значения представителей индигенной микрофлоры у детей с различной эндоскопической активностью БК__

Больные с высокой степенью активности fn=2) Больные с умеренной степенью активности (п=3) Больные с низкой степенью активности (п=2) Больные в периоде ремиссии (п=1)

Bacteroides fragilis (группа) 6,05±0,09 6,30±0,41 6,08±0,04 6,11

Prevotella (род) 5,08±0,01 6,41±1,10 6,45±2,03 6,47

Clostridium coccoides (группа) н/о 7,58+1,44 7,65+2,21 8,28

Clostridium leptum (группа) н/о 7,04±0,50 7,68+0,48 7,36

Atopobium (кластер) 8,54±0,64 8,22±0,65 8,76±0,23 8,56

Lactobacillus (род) 2,87±0,25 2,54±0,23 2,2±0,35 2,68

Bifidobacterium (род) 7,33+0,05 7,12+0,33 7,76 7,42

Суммарная бактериальная плотность 8,57±0,2 8,43+0,76 9,06±0,52 8,79

н/о - не обнаружено

При оценке особенностей эндоскопической картины у детей с БК в зависимости от характера бактериального пейзажа пристеночной микрофлоры было выявлено, что для детей с высокой эндоскопической активностью по SES-CD характерно снижение бактериальной плотности Prevotella, по сравнению с детьми, у которых эндоскопическая картина соответствовала умеренной, низкой активности и эндоскопической ремиссии. Clostridium leptum и Clostridium coccoides были ниже порогового уровня чувствительности (табл. 8).

При оценке состава пристеночной микрофлоры в зависимости от распространенности патологического процесса при болезни Крона было выявлено, что при панколитах бактериальная плотность Prevotella, С. leptum и С. coccoides были выше, чем при илеоколитах. У детей с БК была выявлена прямая сильная корреляционная связь С. leptum и C.coccoides (rs=0,82, /КО,05 и rs=0,82, р<0,05, соответственно) с изолированным поражением толстой кишки, и обратная сильная корреляционная связь с вовлечением в патологический процесс подвздошной кишки (rs=-0,83, ¿><0,05 и rs=-0,83, /><0,05, соответственно).

Индивидуальный анализ каждой бактериальной группы с эндоскопической картиной выявил прямую сильную корреляционную связь Atopobium (rs=0,73, р<0,05) с наличием язв в слизистой оболочке толстой кишки и прямую сильную корреляционную связь Atopobium (rs=0,75,/?<0,05) с воспалительными полипами в толстой кишке.

При анализе проводимой терапии у детей с БК была выявлена обратная сильная корреляционную связь Prevotella с антибактериальной терапией (rs=0,85, /к0,01) и между уровнем Bifidobacterium и проводимой цитостатической терапией (rs=0,83,/><0.05).

Исследование IgG-антител к лактобациллам и бифидобактериям показало, что повышение уровня антител к бактериальным антигенам лактобацилл и бифидобактерий более характерно для больных с НЯК по

сравнению с БК и группой сравнения. Повышение уровня 1§0-антител было выявлено у 55% детей с НЯК и только у одного ребенка с БК.

Повышенный уровень ^С-антител к лакто- и бифидобактериям значимо чаще встречается в активный период заболевания (/К0,05). В период обострения уровень ^О-антител был повышен у 71 % детей с НЯК, в то время как в период ремиссии этот показатель был повышен только в 17% случаев (р<0,05). Повышенный уровень этих показателей чаше встречается у детей с НЯК при высокой клинической активности (36%), в то время как максимальная доля детей с нормальным уровнем ^в-антител приходится на клиническую ремиссию НЯК (рис.2).

□ дети с НЯК без повышения уровня 1д С-антител Ш дети с НЯК с повышенным уровнем!д й-антител

Рисунок 2. Клиническая активность по индексу ЛасЬтПелукг у детей с НЯК с различным уровнем ^О- антител к лактобациллам и бифидобактериям

Для детей с повышенным уровнем ^-антител к лактобациллам и бифидобактериям характерна большая распространенность и активность патологических эндоскопических изменений. У 73% детей повышенный уровень ^О-антител к лактобациллам и бифидобактериям сочетался с панколитом, и лишь в 27% случаев повышение уровня ^О- антител отмечалось при локализованных формах (рис.3).

простит и панколит

проктосигмоидит

□ дети с НЯК без повышения уровня 1д в-антител И дети с НЯК с повышенным уровнем 1д О-антител

Рисунок 3. Распространенность поражения ЖКТ у детей с НЯК с различным уровнем 1§С- антител к лактобациллам и бифидобактериям.

При анализе корреляционной зависимости показателей иммунограммы с уровнем 1§0-антител к бифидобактериям и лактобациллам (табл. 9) была выявлена статистически значимая (/><0,05) сильная (г=0,71) прямая линейная корреляционная связь между уровнем иммуноглобулинов класса М и уровнем ^й-антител к бифидобактериям, и показателями 1§М и уровнем ¡¿О-антителами к лактобациллам. Статистически значимых корреляционных связей уровня ^в-антител к лактобациллам и бифидобактериям с другими показателями иммунограммы выявлено не было.

Корреляционная связь показателей гуморального иммунитета и ^С-антитител к лакто- и бифидобактериям у детей с НЯК (п=20)

Показатели ^в-антитела к бифидобактериям 1§0-антитела клактобациллам 1ЕМ ДО 1еА ЦИК

^О-антител а к бифидобактериям 0,96* 0,71* 0,34 -0,08 0,10

^б-антитела к лактобациллам 0,96* 0,71* 0,35 -0,05 0,05

0,71* 0,71* 0,19 0,18 -0,16

I & 0,34 0,35 0,19 -0,16 0,57*

1ёА -0,08 -0,05 0,18 -0,16 -0,09

ЦИК 0,10 0,05 -0,16 0,57* -0,09

*-р< 0,05

Группа детей с НЯК с повышенным уровнем ^С-антител к индигенной микрофлоре кишечника характеризуется более старшим возрастом (14,5±2,5 лет), поздней манифестацией (в 11,3±3,3 лет) и меньшей длительностью заболевания (3,1±0,2 лет), что отличает их от детей с нормальным уровнем антител (11,6±2,9 лет, 6,4±3,8 лет и 5,0±2,5 лет соответственно), но данные различия статистически не значимы.

У детей с повышенным уровнем ^в-антител к лакто- и бифидобактериям чаще отмечались анемия (45,5%) и дефицит массы тела (45,0%), то в группе с нормальным уровнем ^й-антител эти клинические симптомы не были выявлены ни у одного пациента. Была выявлена статистически значимая (р<0,05) прямая корреляционная связь средней силы (г5>0,5) между уровнем ^й-антител к бифидобактериям и частотой анемии у детей с НЯК, между уровнем 1§0-антител к бифидобактериям и частотой дефицита массы тела у детей с НЯК и между уровнем 1§С-антитсл к лактобациллам и частотой дефицита массы тела у детей с НЯК.

Таким образом, в нашем исследовании у детей с ВЗК отмечается повышение уровня антител к лакто- и бифидобактериям. Повышение уровня

26

^С-антител к лактобациллам и бифидобактериям коррелируют с распространенностью и активностью патологического процесса при НЯК. Однако, ИФА - является непрямым методом микробиологической диагностики и направлен на определение наличия и концентрации специфических антител в организме больного. Следовательно, несмотря на его надежность, доступность и относительную простоту в техническом выполнении необходимо учитывать возможность перекрестных иммунологических реакций с другими представителями индигенной микрофлоры.

В результате наших исследований выявлены различия в составе пристеночной микрофлоры при различных формах течения ВЗК у детей. По всей видимости, эти изменения в составе индигенной микрофлоры могут оказывать непосредственное влияние на характер течения, распространенность патологического процесса и риск развития осложнений, влияя через механизмы иммунной системы на активацию гуморального звена иммунитета, что негативно сказывается на течении ВЗК у детей и на эффективности проводимой терапии. Дети с разными вариантами течения ВЗК имеют различный состав пристеночной микрофлоры и уровень 1£0-антител к бифидобактериям и лактобациллам, что может быть использовано в качестве дополнительных диагностических критериев (табл. 10).

Дополнительные диагностические критерии при ВЗК у детей.

НЯК БК

Клиническая активность Высокая Т Lactobacillus | Bifidobacterium 1Prevotella f уровня IgG-антител к бифидобактериям и лактобациллам J, Prevotella | C.coccoides | C. leptum

Умеренная 4 Lactobacillus t C.coccoides t C. leptum

Низкая Т B.fragilis t Bifidobacterium t C.coccoides -

Ремиссия J. C. leptum -

Эндоскопическая активность Высокая J. Prevotella t уровня IgG-антител к бифидобактериям и лактобациллам | C.coccoides 1 C. leptum J, Prevotella

Умеренная t C.coccoides -

Низкая I B.fragilis t Prevotella -

Ремиссия | Prevotella J. С. leptum J. C.coccoides

Площадь поражения Илеоколит - -

Панколит Пристеночная микрофлора - без особенностей; t уровня IgG-антител к бифидобактериям и лактобациллам f Prevotella t C.coccoides I C. leptum

Проктосигмоидит | С. leptum f C.coccoides t B.fragilis -

Проктит 1 С. leptum | C.coccoides | Bifidobacterium -

выводы

1. Популяционные уровни отдельных представителей пристеночной микрофлоры (Bacteroides fragilis, Lactobacillus, Clostridium leptum, Clostridium coccoides, Prevotella, Bifidobacterium) отличаются при различных формах воспалительных заболеваниях кишечника у детей различного возраста и влияют на характер, остроту, распространенность патологического процесса при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите.

2. При воспалительных заболеваниях кишечника у детей в составе пристеночной микрофлоры отмечается нарастание доли представителей отдела Firmicutes, при одновременном снижении доли представителей филогенетического отдела Bacteroidetes. У детей с болезнью Крона выявлено снижение количества Bacteroides fragilis по сравнению с детьми в группе сравнения (loglO 6,16+0,25 vs. loglO 6,89±0,89;р<0,05).

3. Выявлены сильные корреляционные связи Atopobium с развитием эрозивно-язвенных изменений (rs=0,73, р<0,05) и формированием воспалительных полипов (rs=0,75, р<0,05) в толстой кишке у детей, страдающих болезнью Крона, что, возможно, является факторами прогрессирования патологического процесса.

4. Маркером развития изолированного поражения толстой кишки при болезни Крона у детей является значительное повышение уровня представителей групп Clostridium coccoides (rs=0,82, р<0,05) и Clostridium leptum (rs=0,82, p<0,05). Клинически это проявляется умеренной активностью (rs=0,83, р<0,05) с определенным симптомокомплексом в виде учащенного стула (rs=0,84, р<0,05), воспалительными изменениями периферической крови и анемией (rs=0,90, р<0,05).

5. У детей, страдающих НЯК и болезнью Крона, определены более высокие популяционные уровни представителей рода Lactobacillus, что сопровождалось более высокой клинической активностью НЯК (rs=0,86, /><0,01) и повышением острофазовых белков (rs=0,83, /КО,001); для болезни Крона - наличием примеси крови в стуле (rs=0,86, р<0,05), ускорением СОЭ 0¥=0,81, р<0,05) и повышением сывороточного уровня IgG (rs=0,82,/T<0,05).

6. У 55% детей с неспецифическим язвенным колитом установлено повышение уровня IgG-антител к лактобациллам и бифидобактериям, что может служить дополнительным показателем высокой клинической и эндоскопической активности и распространенности патологического процесса.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Морфологическое исследование биоптатов слизистой оболочки толстой кишки у детей с воспалительными заболеваниями кишечника должно сопровождаться изучением качественного и количественного состава пристеночной микрофлоры методом ПЦР в режиме реального времени, что важно для диагностики, подбора терапии и построения прогноза.

2. Целесообразно в качестве критерия активности и распространенности патологического процесса исследовать титр IgG-антител к лактобациллам и бифидобактериям у детей с неспецифическим язвенным колитом.

3. Диагностическими критериями воспалительных заболеваний кишечника у детей служат нарастание доли представителей отдела Firmicutes, при одновременном снижении доли представителей филогенетического отдела Bacteroidetes в составе пристеночной микрофлоры кишечника.

4. Для оценки активности и определения прогноза течения болезни Крона и неспецифического язвенного колита у детей целесообразно

использовать разработанные нами дополнительные диагностические критерии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Ипатова М.Г., Осипов Г.А., Хромова С.С. //Значение микробного фактора в развитии воспалительных заболеваниях кишечника у детей// Сборник материалов Четырнадцатой Российской Гастроэнтерологической недели « Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колопроктологии», Москва, 2008г. Т.18 -№5-С.84.

2. Хандамирова О .О., Шумилов П.В., Ипатова М.Г., Цимбалова Е.Г., Цветков П. М., Осипова Е.Ю., Карпина JI.M. // Индукция цитокинов под влиянием белков бактериальных оболочек у детей с воспалительными заболеваниями кишечника // Сборник материалов Четырнадцатой Российской Гастроэнтерологической недели «Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колопроктологии», Москва, 2008г. Т. 18 - №5 - С.64.

3. Хандамирова О.О., Шумилов П.В., Ипатова М.Г., Цимбалова Е.Г., Цветков П. М., Румянцев С.А., Мухина Ю.Г. // Особенности экспрессии цитокинового профиля при воспалительных заболеваниях кишечника у детей // Сборник материалов Седьмого Российского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», Москва, 2008 г.-С. 65.

4. М.Г. Ипатова, П.В. Шумилов, Н.Е. Ястребова, A.C. Потапов //Нарушение иммунного ответа к индигенной микрофлоре при воспалительных заболеваниях кишечника у детей // журнал «Педиатрия» им. Г. Н. Сперанского, 2009г. - 88 (6) - С.55-59

5. П.В. Шумилов, О.О. Хандамирова, H.A. Малахинова, М.Г. Ипатова, С.А. Румянцев, A.C. ПотаповУ/ Роль иммунных нарушений и микробного фактора в развитии воспалительных заболеваний кишечника у детей // Вопросы детской диетологии.// 2009г. Т.7 - №4. С. 20-24.

6. Ипатова МГ., Шумилов П.В., Осипов Г.А., Ястребова Н.Е., Цимбалова Е.Г.//Особенности пристеночной микробиоты при воспалительных заболеваниях кишечника у детей// Сборник материалов 2-ого международного конгресса по пробиотикам «Санкт-Петербург -Пробиотики-2009», Санкт-Петербург 28-30 октября 2009 г., С. 16

Список сокращений

АБ - антибиотики БК - болезнь Крона

ВЗК - воспалительные заболевания кишечника

ИФА - иммуноферментный анализ

НЯК - неспецифический язвенный колит

ПЦР - полимеразная цепная реакция

рРНК - рибосомная рибонуклеиновая кислота

СРВ - С-реактивный белок

СОЭ - скорость оседания эритроцитов

ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы

Ig - иммуноглобулин

Подписано в печать:

18.12.2009

Заказ № 3231 Тираж -100 экз. Печать трафареггная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Болезнь Крона (БК) и неспецифический язвенный колит (НЯК), которые объединены термином «воспалительные заболевания кишечника» (ВЗК), представляют собой одну из наиболее серьезных и нерешенных проблем в современной гастроэнтерологии и колопроктологии. По уровню заболеваемости ВЗК уступают другим гастроэнтерологическим заболеваниям, но по тяжести течения, частоте осложнений и летальности они занимают одно из ведущих мест в структуре болезней желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) [10].

Современные эпидемиологические исследования свидетельствуют о значительной распространенности заболеваемости ВЗК с тенденцией к увеличению частоты начала заболевания в детском возрасте. Распространенность ВЗК у детей в мире в настоящее время составляет 2,2 — 6,8 на 100 ООО детей [43, 91, 92, 121, 174, 179]. По данным Е. Lanfholz et al. в Дании почти у 40% больных первая манифестация заболевания наблюдалась до достижения ими 10-летнего возраста, a R. Behrens с соавторами указывают, что примерно у 1/3 пациентов манифестация ВЗК происходит до достижения ими 18 лет [32, 51, 97]. Отдельные российские данные о распространенности ВЗК у детей подтверждают общую мировую тенденцию к росту ВЗК. Но большинство российских исследований носит ретроспективный характер.

ВЗК у детей и взрослых пациентов схожи в своей клинической манифестации и имеют одинаковый базисный терапевтический алгоритм, но дети, страдающие НЯК и БК, имеют ряд важных особенностей [12, 13]. Преобладание распространенных форм и тотальных колитов наблюдаются у 60-80% детей и лишь у 20-30% взрослых. Ранняя инвалидизация, поздняя диагностика, приводящая к различным осложнениям, включая летальный исход, отсутствие четких диагностических критериев - обусловливают особую актуальность изучения данной проблемы в детском возрасте.

НЯК и БК до сих пор остаются неизлечимыми заболеваниями и часто требуют обширной терапии с применением различных групп лекарственных препаратов, а при их неэффективности даже хирургического вмешательства. Лечение ВЗК противовоспалительными, антибактериальными препаратами, кортикостероидами и/или иммуносупрессивными препаратами, как правило, эффективно, но не способствует полному излечению [135,136]. Безусловно, необходимы новые подходы в лечении этих заболеваний, что, в свою очередь, требует более полного понимания факторов, приводящих к развитию ВЗК.

До сих пор этиология ВЗК остается до конца неизвестной. Многие исследователи пришли к единому мнению, что взаимодействие генетической предрасположенности, факторов внешней среды, иммунорегуляторных механизмов и кишечная микрофлора функционально интегрированы в патогенезе ВЗК [64]. Совокупность этих факторов приводит к нарушению эпителиального барьера в кишечнике с формированием и поддержанием хронического воспаления в пищеварительном тракте.

Нормальная микрофлора играет важную роль для жизнедеятельности растущего детского организма [70]. Доказано ее благотворное воздействие на физиологию кишечника и организм в целом, что обусловлено защитными, структурными и метаболическими эффектами. Огромное значение нормальная микрофлора играет в колонизационной резистентности, а также в созревании и нормальном функционировании иммунитета [60].

Результаты современных отечественных и зарубежных исследований указывают на значительную роль индигенной микрофлоры в патогенезе воспалительных заболеваний кишечника. Микрофлора ЖКТ состоит более чем из 1014 бактериальных клеток, что примерно в 10 раз больше количества соматических и гаметных клеток в теле человека [28]. Можно предположить, что такая высокая концентрация микрофлоры в просвете кишечника может служить причиной того, что многие микробные патогены могут быть потенциальным этиологическим фактором ВЗК. Подобное предположение остается дискутабельным и требует дальнейшего изучения в детской гастроэнтерологии.

В качестве инфекционного агента изучались многие микроорганизмы [26, 42, 48, 61, 63, 66, 102, 130, 135, 136, 153, 165, 168], но результате дальнейших исследований не было получено убедительных данных, подтверждающих эти предположения. Кроме того, концепция об инфекционной этиологии не согласуется с благоприятным действием иммуносупрессивной терапии.

Хотя конкретная инфекционная причина ВЗК не установлена, современные клинические и экспериментальные исследования свидетельствуют об утрате иммунологической толерантности к нормальной микрофлоре при развитии хронического воспаления в кишечнике при ВЗК [36, 134, 142, 143, 152, 158, 160].

Однако в клинических исследованиях у больных с ВЗК было выявлено, что интестинальная микрофлора претерпевает большие изменения. Они включают в себя высокую сосредоточенность бактерий в мукозном слое, как в воспаленных, так и невоспаленных участках кишки [166].

На сегодняшний день данные о кишечной микрофлоре у пациентов ВЗК неоднозначны. Это обусловлено тем, что традиционные методы выделения микроорганизмов в культуре дают неполную картину состава микрофлоры кишечника вследствие того, что одни виды бактерий, обитающих в ЖКТ, лучше поддаются культивированию, чем другие. В результате искажается состав кишечной микрофлоры, что приводит к недооценке роли отдельных микроорганизмов и целых бактериальных групп у здоровых детей и при патологических процессах. Также в большинстве исследований изучалась преимущественно фекальная микрофлора, которая по составу существенно отличается от микрофлоры слизистой оболочки ЖКТ [55]. Доминирующая часть пристеночной микрофлоры, в которой в значительной степени преобладают некультивируемые анаэробы, остается мало изученной.

В настоящее время для изучения микрофлоры в качестве. наиболее чувствительного и быстрого метода широко применяется метод ПЦР с использованием специфических праймеров, которые позволяют определить род и вид представителей микробиоценоза. Уже разработаны специфические праймеры для многих известных видов бактерий, которые присутствуют в пищеварительном тракте [113, 114, 119]. ПЦР в режиме реального времени с видоспецифичными праймерами может предоставить точные количественные данные о пристеночной микрофлоре.

На сегодняшний день нет единого консенсуса относительно роли микробного компонента в развитии ВЗК, состава интестинальной микрофлоры у пациентов с БК и НЯК в зависимости от активности и распространенности заболевания. Изучение особенностей , состава t ♦ j t 1 индигенной пристеночной микрофлоры и иммунологической реактивности у v пациентов с ВЗК важно не только для понимания патогенеза ВЗК, но и необходимо для разработки новых диагностических и терапевтических подходов, оценки эффективности и безопасности новых методов лечения.

Цель исследования :

Установить особенности состава пристеночной микрофлоры кишечника и адаптивного иммунитета у детей с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом для оптимизации лечебно-диагностических и профилактических мероприятий.

Задачи исследования: 5 i

1. Выявить особенности анамнестических клинических и лабораторно-инструментальных данных у детей с различными вариантами течения болезни Крона и неспецифического язвенного колита.

2. Изучить количественный и качественный состав .основных представителей пристеночной микрофлоры в биоптате слизистой оболочки кишечника у детей с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом методом количественного ПЦР в режиме реального времени с группоспецифическими праймерами.

3. Выявить корреляционные связи между количественным содержанием различных представителей индигенной микрофлоры (группа В. fragilis, группа С. leptum, группа C.coccoides, род Bifidobacterium, род Lactobacillus, род Prevotella и кластер Atopobium) при различных вариантах течения воспалительных заболеваний кишечника у детей с клиническими и лабораторно-инструментальными данными.

4. Исследовать титр антител класса IgG к основным представителям индигенной микрофлоры в сыворотке крови с помощью иммуноферментного анализа у детей с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом и оценить его диагностическую и прогностическую роль.

5. Оптимизировать лечебно-диагностические и профилактические мероприятия на основании установленных особенностей состава пристеночной микрофлоры у детей с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом.

Научная новизна.

Впервые была проведена комплексная оценка пристеночной микрофлоры толстой кишки у детей с БК и НЯК методом количественного ПЦР в режиме реального времени с группоспецифическими праймерами. Выявлены особенности количественного и качественного состава пристеночной микрофлоры (группа В. fragilis, группа С. leptum, группа C.coccoides, род Bifidobacterium, род Lactobacillus, род Prevotella и кластер Atopobium) в зависимости от нозологической формы, особенностей клинического течения, распространенности патологического процесса и проводимой терапии.

Впервые оценена иммуногенная роль индигенной флоры (на примере бифидобактерий и лактобацилл) в патогенезе воспалительных заболеваний кишечника по данным иммуноферментного анализа. Показано, что повышение уровня IgG-антител к лактобациллам и бифидобактериям коррелируют с распространенностью и активностью патологического процесса при НЯК, и может быть использовано в качестве диагностического и прогностического критерия у детей с ВЗК.

Полученные результаты данного исследования могут послужить основой для дальнейшей качественной и количественной идентификации основных представителей пристеночной микрофлоры кишечника, для разработки новых диагностических критериев болезни Крона и неспецифического язвенного колита, для оптимизации методов медикаментозной терапии у детей и мониторинга их эффективности.

Практическая значимость.

Изучен состав пристеночной микрофлоры толстой кишки у детей с БК и НЯК методом количественного ПНР в режиме реального времени с группоспецифическими праймерами в зависимости от нозологической формы, особенностей клинического течения и распространенности патологического процесса. Предложены новые диагностические критерии активности у детей с БК и НЯК. Показано влияние проводимой терапии на состав пристеночной микрофлоры и роль ее изменения на течение ВЗК у детей.

Показана высокая диагностическая ценность определения титра антител класса IgG к лакто- и бифидобактериям в сыворотке крови у детей с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом посредством иммуноферментного анализа и его прогностическая роль для определения активности течения неспецифического язвенного колита у детей.

Предложены диагностические алгоритмы БК и НЯК у детей в зависимости от состава пристеночной микрофлоры кишечника и уровня IgG-антител к лактобациллам и бифидобактериям.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на XIV Российской Гастроэнтерологической неделе (Москва 6-8 октября 2008г), VII Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», Москва 21-23 октября 2008 г., 11-ом Международном Славянобалтийском научном форуме «Санкт-Петербург — Гастро-2009», Санкт-Петербург 20-22 мая 2009 г., 2-ом международном конгрессе по пробиотикам «Санкт-Петербург - Пробиотики-2009», Санкт-Петербург 28-30 октября 2009 г.

Внедрение в практику

Разработанные дополнительные микробиологические диагностические критерии БК и НЯК у детей внедрены в практику и используются в педиатрическом отделении городской детской клинической больницы № 13 имени Н.Ф. Филатова г. Москвы. Основные научные положения и выводы внедрены в педагогический процесс курса гастроэнтерологии и диетологии ФУВ кафедры детских болезней № 2 ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова Росздрава.

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рецензируемых ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 163 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объема и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения, выводов, и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 30 таблицами, 23 рисунками. Библиография содержит 189 литературных источников: 20 отечественных и 169 иностранных.

выводы

1. Популляционные уровни отдельных представителей пристеночной микрофлоры (Bacteroides fragilis, Lactobacillus, Clostridium leptum, Clostridium coccoides, Atopobium, Bifidobacterium) отличаются при различных формах воспалительных заболеваниях кишечника у детей различного возраста и влияют на характер, остроту, распространенность патологического процесса при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите.

2. При воспалительных заболеваниях кишечника у детей в составе пристеночной микрофлоры отмечается нарастание доли представителей отдела Firmicutes, при одновременном снижении доли представителей филогенетического отдела Bacteroidetes. У детей с болезнью Крона выявлено снижение количества Bacteroides fragilis по равнению с детьми контрольной группой (loglO 6,16±0,25 vs. loglO 6,89±0,89; /?<0,05).

3. Выявлены сильные корреляционные связи Atopobium с развитием эрозивно-язвенных изменений (rs=0,73, р<0,05) и формированием воспалительных полипов (rs=0,75, jc<0,05) в толстой кишке у детей, страдающих болезнью Крона, что, возможно, является факторами прогрессирования патологического процесса.

4. Маркером развития изолированного поражения толстой кишки при болезни Крона у детей является значительное повышение уровня представителей групп Clostridium coccoides (rs=0,82, р<0,05) и Clostridium leptum (rs=0,82, p<0,05). Клинически это проявляется умеренной активностью (rs=0,83, /?<0,05) с определенным симптомокомплексом в виде учащенного стула (rs=0,84, jc<0,05), воспалительными изменениями периферической крови и анемией (rs=0,90,p<0,05).

5. У детей, страдающих НЯК и болезнью Крона, определены более высокие популяционные уровни представителей рода Lactobacillus, что сопровождается высокой клинической активностью (rs=0,86, /КО,01) и повышением острофазовых белков (rs=0,83, /КО,001) у детей с НЯК, а при болезни Крона наличием примеси крови в стуле (rs=0,86, /КО,05), ускорением СОЭ (rs=0,81, /КО,05) и повышением сывороточного уровня IgG (rs=0,82,/K0,05).

6. У 55% детей с неспецифическим язвенным колитом установлено повышение уровня IgG-антител к лактобациллам и бифидобактериям, что может служить показателем высокой клинической и эндоскопической активности и распространенности патологического процесса.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Морфологическое исследование биоптатов слизистой оболочки толстой кишки у детей с воспалительными заболеваниями кишечника должно сопровождаться изучением качественного и количественного состава пристеночной микрофлоры методом ПЦР в режиме реального времени, что важно для диагностики, подбора терапии и построения прогноза.

2. Целесообразно в качестве критерия активности и распространенности патологического процесса у детей исследовать титр IgG-антител к лактобациллам и бифидобактериям у детей с неспецифическим язвенным колитом.

3. Диагностическими критериями воспалительных заболеваний кишечника у детей служат нарастание доли представителей отдела Firmicutes, при одновременном снижении доли представителей филогенетического отдела Bacteroidetes в составе пристеночной микрофлоры кишечника.

4. Для оценки активности и определения прогноза течения болезни Крона и неспецифического язвенного колита у детей целесообразно использовать дополнительные диагностические критерии.