Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Роль иммунологических механизмов в развитии противоопухолевого эффекта антител против белка р53

На правах рукописи

ТЕНДЛЕР

)

Евгений Вольфович

РОЛЬ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ В РАЗВИТИИ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ЭФФЕКТА АНТИТЕЛ ПРОТИВ БЕЛКА р53

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена в Государственном Учреждении Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Российской Академии Медицинских наук, Санкт-Петербург, Россия и в медицинском центре Рамбам, Хайфа, Израиль.

Научные руководители доктор медицинских наук, чл. корр. РАМН, профессор Фрейдлин Ирина Соломоновна доктор философии, профессор, Зиндер Орен.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Климович Владимир Борисович доктор медицинских наук Серебряная Наталья Борисовна

Ведущая организация:

ГОУ Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет имени академика И.П.Павлова

Защита диссертации состоится 2005 года в часов на заседании

диссертационного совета Д 001.022.01 при ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН.

Автореферат разослан " .2005 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук <// с \ Бурова Л.А.

ЪЛЪЪ

пит

ОБЩ \Я ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Белок р53 дикого типа (\vtp53) содержится в нормальных клетках в латентном состоянии и не выявляется обычными методами, но оказывает противоопухолевое действие. Более половины всех случаев рака у человека сопровождаются мутациями р53 гена, во многих других случаях выявляется потеря функциональной активности р53 белком без мутации в гене. И в том и в другом случае р53 накапливается в злокачественно трансформированной клетке в значительных количествах. р53 подходит для заместительной генной терапии, так как он является мощным индуктором апоптоза раковой клетки. Однако, терапия с использованием р53-гена имеет существенные ограничения. Учитывая это, для лечения опухолей, содержащих нормальный или мутантный р53 белок, становятся более актуальными иммунологические подходы. Возможно проведение иммунотерапии путем введения р53 белка. Однако, как аутоантиген, он слабо иммуногенен, даже в своей мутантной форме. Остается открытым вопрос о противоопухолевой эффективности введения самого белка р53 или анти-р53-антител, действие которых может быть опосредовано выработкой и противоопухолевым действием антиидиотипических антител. Канцерогенез сопряжен с серьезными повреждениями иммунной системы, лимфоидной ткани с нарушениями функций Т- и В-лимфоцитов.

Опухолевый рост, как правило, идет на фоне выраженного иммунодефицита. В связи с этим представляло интерес изучение влияния иммунизации белком р53 и введения антител против р53 на лимфоидную ткань в условиях химически индуцированного канцерогенеза. Актуальность настоящего экспериментального исследования связана с поиском новых путей иммунотерапии опухолей с использованием антител, направленных против белка р53, и изучением иммунологических механизмов их противоопухолевого действия.

Цель исследования. Изучить роль иммунологических механизмов в развитии противоопухолевого эффекта антител, направленных против белка р53.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить экспрессию белка р53 в кишечнике крыс в динамике химически индуцированного канцерогенеза.

2. Оценить влияние введения крысам р53 антиген-липосомного комплекса или анти-р53-иммуноглобулина на интенсивность химически индуцированного канцерогенеза.

3. Изучить иммуноморфологические изменения в селезенке животных, получивших р53 антиген-липосомный комплекс или анти-р53-иммуноглобулин на фоне химически индуцированного канцерогенеза.

. РОК.. НАЦИОНАЛЬНА^

I библиотека I

3 Оценить влияние введения крысам р53 антиген-липосомного комил("-са или анти-р53-иммуноглобулина на экспресси.з белка р53 и помп.пели, косвенно отражающие активность канцерогенеза и пропннюпухолевого действия в органах-мишенях канцерогенного действия

4 Изучить экспрессию промотора р53 у трансгенных мышей на фоне химически индуцированного канцерогенеза и введения анти-р53-антител.

Научная новизна.

Виернме было проведено комплексное изучение противоопухолевого действия анш-р53- антител Впервые показано увеличение содержания белка р53 в )ми к;.шальных клетках толстого кишечника крыс в процессе химически индуцированного канцерогенеза в ответ на введение анти-р53-hmmj hoi лобулина. На модели трансгенных мышей впервые показано, что »ведение анти-р53-антител усиливает экспрессию промотора р53 и увеличивает содержание белка р53 в клетках кишечника. В экспериментах чаре! исгрирован выраженный противоопухолевый эффект введения крысам р^З ашигсн-липосомного комплекса или анти-р53- иммуноглобулина.

Теоретическая и практическая значимость результатов работы.

Выявленное в экспериментах резкое возрастание содержания белка р53 в шокачественных тканях при введении анти-р53-антител представляет интерес для обсуждения гипотезы о роли антиидиотипических антител, coo I не 1 ствующих «внутреннему образу» антигена.

Зарегистрированное параллельное увеличение выраженности аиопгоза, экспрессии р53 белка и количества Т лимфоцитов в инфильтратах и примыкающих к опухолям тканях можно рассматривать как результат активации иммунной системы в ответ на введение р53 антиген-липосомного комплекса или анти-р53-антител.

Полученные экспериментальные данные могут служить основой для разработки принципиально новых методов иммунотерапии злокачественных опухолей.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1 Показано возрастание уровня экспрессии белка р53 в эпителиальных кленах толстого кишечника крыс в процессе химически индуцированного канцерогенеза.

2 В ответ на введение анти-р53-антител на фоне химически иидуиированного канцерогенеза усиливается экспрессия промотора р53 и повышается содержание белка р53 в эпителиальных клетках кишечника.

3 При введении крысам р53 антиген-липосомного комплекса или анти-рхЗ-ашшел на фоне химически индуцированного канцерогенеза iapei исфирован выраженный противоопухолевый эффект.

4. При введении крысам анти-р53 -антител на фоне химически индуцированного канцерогенеза предотвращалось рг^-виие В-иммунодефицита, характерного для крыс-опухоленосителей, и возрастало количество дендритных клеток и макрофагов в селезенке.

5. При введении крысам анти-р53-антител на фоне химически индуцированного канцерогенеза отмечено усиление локальной инфильтрации опухолей CD25+ клетками и процесса апоптоза в опухолях.

Личный вклад автора в проведенное исследование. Личным вкладом автора в выполненную работу является самостоятельное выполнение всех иммунологических и молекулярно-биологических исследований, интерпретация полученных результатов. Вклад соавторов ограничивается предоставлением в его распоряжение ряда оригинальных моноклональных антител и трансгенных мышей.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на 15 международных научных конференциях и доложены на научной конференции с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 2002г.). Диссертационная работа апробирована на научной конференции отдела иммунологии НИИЭМ РАМН 05 октября 2004 г.

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 16 печатных работ, в том числе 14 статей в научных журналах и 2 тезисов конференций.

Объем и структура диссертации. Объем работы составляет 121 страницу машинописного текста, включая 22 таблицы и 12 рисунков. Список литературы состоит из 168 наименований, из них 20 работ принадлежат отечественным авторам и 148 - зарубежным.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования.

Опыты были выполнены на 104 крысах линии Sprague-Dawley, и 60 трансгенных мышах с человеческим р53 промотором и CAT (chloramphenicol acetyl transferase)-pHnopTepHbiM геном, любезно предоставленных профессором V. Rotter (Институт Вейцмана, Реховот, Израиль).

Моноклональные анти-р53-антитела РАЬ-1620, РАЬ-421, РАЬ-240, полученные от гибридомных линий клеток, и поликлональное антитело аН-р53 также любезно предоставлены проф. V. Rotter. РАЬ-1620 специфично для дикого типа р53 белка. РАЬ-421 - распознает эпитоп, расположенный между аминокислотами 372 и 382 человеческого р53. РАЬ-240 специфично для мутантной и денатурированной формы р53, реагирует с р53 многих видов. Поликлональное антитело аН-р53 было получено путем многократно

иммунизации кроликов р53 белком, полученным генно-инженерным путем. Кроличьи поликлональные антитела (am™-p53-IgG), полученные против крысиного растворимого опухолевого р53, были любезно предоставлены проф. I. Zusman (Еврейский университет, Реховот, Израиль). Для идентификации типов клеток использовалась иммунопероксидазная техника с коммерческими наборами антител, специфичных для антигенов крыс: CD3, CD4, CD8 (Sigma), CD 19, CD25 (Pharmingen), F4/80 (Serotec) и FITC-коньюгированные кроличьи антитела к CAT (Serotec).

В качестве канцерогенов использовали: N-метил-М-нитро-нитрозогуанидин (MNNG) (Sigma), 1,2-диметилгидразин - (DMH) (Fluka, Германия), Азоксиметан (АОМ) (Sigma).KHHeTH4ecKoe исследование слизистой оболочки толстой кишки проводили с использованием ауторадиографии. Слайды были приготовлены общепринятым методом, покрыты эмульсией NTBj (Eastman Kodak) методом погружения, затем их опускали в раствор Kodak D-19 при 18°С и в фиксатор Kodak F-10, промывали и слегка окрашивали гематоксилином и эозином.

Анти-р53-антитела в сыворотках крыс определяли при помощи твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) (Pharma Cell, Immunotech) по методике производителя.

Иммуногистохимические исследования проводились авидин-биотин-пероксидазным методом. Срезы рассматривались под микроскопом Zeiss (Axioskop) с использованием х 20, х 40 и х 100 объективов.

Апоптотический индекс (AI) был определен, используя ApopTag кит (Oncor, Inc, Gaithersburg, MD) по методике производителя и был рассчитан, как процент TUNEL - положительных клеток на 1000 клеток.

Все иммуноморфологические исследования были выполнены с использованием стандартных процедур. Исследовали морфологию селезенки, количество митотических и апоптотических клеток, содержание CD25+ и CD3+ Т лимфоцитов, CD20+ В лимфоцитов, дендритных клеток и макрофагов. Ферментативная активность CAT определялась в извлеченных органах, после гомогенизации отдельных органов на льду. 12 мкл из каждого лизата было использовано для ацетилирования [14С]хлорамфеникола. Хлорамфеникол и его ацетил ированные радиоактивные дериваты разделялись при помощи нисходящей тонкослойной хроматографии (TLC) на стеклянной пластине, покрытой силикагелем (Sigma) и затем визуализировались путем ауторадиографии. Радиоактивные пятна соскабливались, растворялись в соответствующем растворителе и подсчитывались на бета-счетчике. Пленка сканировалась при помощи денситометра. Результат представлялся как % CAT конверсии.

Индукция опухолей проводилась еженедельным подкожным введением АОМ или DMH, а также иктраректальным введением MNNG.

Статистический анализ средних значений перечисленных параметров проводили, используя Kruskal-Wallis и Mann-Whitney U, для выявления достоверности различий между отдельными воздействиями или интервалами времени и для определения статистически значимых различий между группами крыс значения р<0.05 рассматривались как статистически значимые.

Результаты исследования и их обсуждение Особенности экспрессии разных типов антигена р53 в опухолях, индуцированных химическими канцерогенами, и в нормальной ткани толстого кишечника

Крыс обследовали до введения и через 8, 15, 25, 35 и 40 недель после введения канцерогенного вещества. Проводили иммуногистохимические исследования с тремя анти-р53-моноклональными антителами (РАЬ-1620, РАЬ-421 и РАЬ-240). Более 20% клеток образующихся опухолей положительно окрашивались Pab-1620 антителом и 50-60% Pab-421 и Pab-240 антителами. Во всех опухолях было найдено ядерное окрашивание всеми тремя антителами.

Иммуногистохимический анализ показал, что в крысиных опухолях толстой кишки, как доброкачественных, так и злокачественных, наряду с ядерным часто наблюдается и цитоплазматическое окрашивание на р53 белок. В доброкачественных опухолях обнаруживали дикий тип р53 с более высокой частотой, чем мутантный. В злокачественных опухолях наблюдалось обратное соотношение (табл.1).

Следует отметить, что у контрольных животных (до введения канцерогенов) только единичные клетки слизистой толстого кишечника давали ядерную окраску и только с антителом, специфичным для дикого типа р53. Таким образом, было установлено, что р53 активно экспрессируется в опухолях и не экспрессируется в нормальной слизистой до начала индукции опухоли.

Таблица 1.

Иммуногистохимическое выявление цитоплазматического белка р53 в ютетках доброкачественных и злокачественных опухолей толстого кишечника крыс._

Тип опухоли Число образцов % клеток, окрашенных антителами:

Pab-1620 Pab-421 Pab-240

Доброкачественные 10 25 40 35

Злокачественные 10 5 30 65

Влияние введения р53-антиген-липосомного комплекса на канцерогенез и состояние иммунной системы

Опухоли толстой кишки индуцировались подкожными введениями ЛОМ, 15 мг/на животное, один раз в неделю в течение 2 недель. Двумя месяцами позже, части крыс было начато введение комплекса р53 антигена с липосомами. Комплекс содержал 600 наномоль липосом, и 10-12 мкг р53. Подкожные введения (0.5 мл) делались каждые десять дней в течение первого месяца, и один раз в месяц в течение последующих четырех месяцев.

Через шесть месяцев после первой обработки канцерогеном были подсчитаны образовавшиеся опухоли толстого кишечника и исследованы селезенки всех крыс. Крысы были разделены на пять групп. В группу 1 были включены крысы, получившие только липосомы (п=4); группа 2 - крысы без опухолей, обработанные АОМ и получившие липосомы, (п=4); группа 3 -крысы с опухолями, обработанные АОМ и получившие липосомы (п=22). Крысы групп 4 (п=14) (без опухолей) и 5 (п=12) (с опухолями), обработанные АОМ и впоследствии получившие р53-липосомный комплекс. В сыворотках крови, полученных от крыс каждой из перечисленных выше групп, определяли уровень антител против белка р53. АОМ индуцировал опухоли у 84.6 % крыс. У большинства животных развивалось по несколько опухолей (1.9 опухоли/на животное), причем 60 % опухолей были высоко-злокачественными. р53-липосомный комплекс оказывал существенный противоопухолевый эффект. Число крыс, несущих опухоли, в группе с введением р53-липосомного комплекса, было снижено до 46.4 %. Были также найдены различия в микроскопической структуре опухолей: от крыс, получивших р53-липосомный комплекс и от крыс, получивших только липосомы. Многие из опухолей, развившихся у животных, получивших р53-липосомный комплекс, были доброкачественными или на ранней стадией малигнизации. Митотический индекс был выше у получивших только липосомы крыс, по сравнению с получившими р53-липосомный комплекс животными. Области лимфоидных инфильтратов и их ширина были значительно больше у крыс, получивших р53-липосомный комплекс, по сравнению с получившими только липосомы (табл.).

Таблица 2.

Параметры опухолей толстого кишечника крыс, получивших р53-липосомный комплекс

Параметры Крысы, получившие только липосомы Крысы, получившие р53-липосомный комплекс

Митотический индекс 3.4 ±0.5 2.9 ±0.5

Площадь инфильтратов(%) 14.9 ±0.8 23.7±1.3а

Размер инфильтратов (цш2) 250 ± 12 360±14а

а различия между двумя группами крыс статистически достоверны, р < 0.01.

Существенные различия были найдены в реакции селезенки на канцероген и р53-липссомяый комплекс. У крыс, подвергнутых действию канцерогенного вещества, у которых не развились опухоли (группа 2), область белой пульпы уменьшилась на 12 %, главным образом, из-за сокращения слоя мантии (В зона), который уменьшился до 37.3 % по сравнению с его областью у контрольных крыс. Область периартериальных лимфоидных муфт (ПАЛМ) (Т зона), также уменьшилась до 75.2 % по сравнению с ее областью у контрольных крыс. Области, занятые маргинальной зоной и красной пульпой, увеличились на 125 % и 119 %, соответственно. Все эти изменения отражают особенности иммунной реакции селезенки крыс на канцероген.

У получивших р53-липосомный комплекс крыс, которые были свободны от опухоли (группа 4), вышеописанные изменения в селезенке были более выраженными. Область фолликулярных зародышевых центров (В зона) увеличилась на 244.4 %. Слой мантии почти исчез, и ПАЛМ уменьшились до 83.5 % по сравнению с соответствующей структурой в группе 2. Эти изменения отражают усиление иммунного ответ со стороны В и Т систем селезенки. Острое уменьшение слоя мантии - резервуара В лимфоцитов и ПАЛМ - резервуара Т лимфоцитов свидетельствуют о недостаточности лимфоидной системы.

Влияние введения липосом, содержащих белок р53, на изменения состава спленоцитов, было отмечено, главным образом, у крыс, у которых развились опухоли (группа 5), в то время как свободные от опухоли крысы (группа 4), не отличались от свободных от опухолей животных, получивших только липосомы. У несущих опухоли крыс (группа 5), получивших р53-липосомный комплекс, были замечены глубокие изменения в лимфоидной структуре селезенки, по сравнению с получившими только липосомы животными, имеющими опухоли (группа 3). Полная область белой пульпы была больше (111.1 % от той же области у крыс, получивших только липосомы) главным образом из-за расширения слоя мантии, и особенно маргинальной зоны. У крыс, получивших р53-липосомный комплекс, свободных от опухоли (группа 4), показано умеренное уменьшение области белой пульпы как результат уменьшения ПАЛМ и маргинальной зоны до 75.9 % и 79.2 % от их площади в группе 2, соответственно.

Развитие опухоли у крыс, получивших только липосомы, сопровождалось уменьшением апоптотического индекса (А1) в ткани толстой кишки и ПАЛМ. У крыс, получивших р53-липосомный комплекс, апоптотический индекс был уменьшен в ПАЛМ, но имел тенденцию к увеличению в ткани толстого кишечника и опухолях.

Уровень am и i ел upoiH» белка р53 (ELISA) в сыворотках крови крыс, юлучишпих Kaiincpoien и р53~линосомный когнлел:, более чем в 50 раз превышал уровень атител в сыворотке крыс, получивших канцероген и пусты« линосомы.

Таким образом, р53-линосомный комплекс оказывал существенный нрожкоопухолсвый эффект. Мио1ис из опухолей, развившихся у получивших рУ$ липосомный комплекс животных, были доброкачественными или на ранней стадии малипшчации. В опухолевой ткани мичотический индекс был ниже, а область лимфоидных инфильтратов увеличена значительно по сравнению с крысами, получившими только липосомы. Изменения в структуре толс»спки уменьшались при введении р53-липосомного комплекса. Одновременно с мим была отмечена тенденция к увеличению апоп готического индекса и ткани толстой кишки и опухолях. Полученные данные позволяю! утверждать, что введение р53-липосомного комплекса, сопровождающееся выраженным специфическим иммунным ответом, направленным прении белка р53, оказывает выраженное противоопухолевое действие.

Илимпис введения а1пи-р53-антител на процесс канцерогенеза в ■ оло ом кишечнике крыс

Исследование способности au гитсл предотвращать индукцию опухолей.

Кроличьи поликлональпые антитела, направленные против крысиного растворимого опухолевого р53, были получены против белка р53, выделенного Ol крыс с адспокарциномами или от крыс с доброкачественными опухолями.

5 недельным крысам-самцам вводили подкожно четырехкратно анти-рУ5 иммуноиюбулип (100 мкг на животное) с двухнедельным интервалом, и taiCM ежемесячно н 1ечение 3 месяцев. Контрольным крысам вводили нормальный кроличий иммуноглобулин в той же дозе и по той же схеме. Индукция опухолей канцерошюм DMH (20 mi/кг) была начата через две педели после последнего введения антител и продолжена в течение 7 недель. Крысы были забиш через 6 месяцев после начала индукции опухолей.

Резулмаи.!, полученные нри введении крысам антител, направленных против белка р53, выделенного от крыс с аденокарциномами (группа А), досюверпо пс отличались оч таковых в контрольной lpynne крыс, получивших нормальный IgCr кролика. В группе А наблюдали высокое количество опухолей, включая значтельное количество карцином. Введение крысам атител, направленных против белка р53, выделенного от крыс с доброкачса ценными опухолями (группа Б), сопровождалось выраженным профилактическим противоопухолевым эффектом: количество крыс с опухолями

уменьшилось до 44 %, а количество опухолей на одно животное сократилось до 0.8 но сравнению с 4.4 в контрольной группе. Причем большинство опухолей (71%) было доброкачественными при отсутствии метастазов (рис.1).

Группы крыс

Рисунок 1. Защитный противоопухолевый эффект кроличьего анти-р53 иммуноглобулина при химически индуцированных опухолях толстой кишки у крыс. По оси ординат - процент животных без опухолей.

Введение ^О антител, направленных против белка р53, выделенного от крыс с доброкачественными опухолями, значительно снижает канцерогенный эффект ОМН. В то же время защитное действие 1§С антител, направленных против белка р53, выделенного от крыс со злокачественными опухолями (аденокарциномами), было выражено значительно слабее.

Оценка противоопухолевой активности антител, направленных против белков р53 и р64.

Так как опухолеассоциированный белок, выделенный из доброкачественных опухолей крыс, содержал две основные фракции - р53 и р64, целесообразно было провести сравнительное изучение действия антител к этим двум белкам в параллельном эксперименте. Белок р64 был получен тем же методом, как и р53, из доброкачественных опухолей, но отличался молекулярной массой - 64 килодальтон.

Введение крысам антител, полученных против белка р64, в дозе 100 мкг/на животное (группа А), вызывало сходные результаты с контрольной группой крыс, получавших неспецифический кроличий иммуноглобулин в той же дозе: большое количество крыс с опухолями, при высокой доле злокачественных опухолей. В отличие от этого, противоопухолевый эффект был достигнут после введения крысам антител, специфичных для р53 белка, в дозе 100 мкг/на животное (группа Б): количество крыс-оггухоленосителей уменьшилось до 80% с одновременным уменьшением доли

члокачос1 ценных опухолей (рис.2). ^С; антитела, направленные против белка р53, оччеишво ослабляли онкогенное действие ОМН, в то время как, противоопухолевое действие антител, направленных против р64, было шачительпо слабее выражено. Из полученных результатов ясно, что противоопухолевый эффект обладают именно анти-р53-антитела, а фракция р64 пс индуцирует образования антител, имеющих противоопухолевый эффект.

Г»М* А

Группы крыс

Рисунок 2. Противоопухолевый эффект анти-р53-антител при химически индуцированных опухолях толстого кишечника крыс. По оси ординат - % крыс без опухолей и с доброкачественными опухолями.

Влияние введения антител против белка р53 на состояние иммунной системы крыс при экспериментальном химическом канцерогенезе. Влияние введения аити-р53 антител на клеточный состав селезенки на фоне канцерогенеза.

Ли ги-р53-аититела, противоопухолевая активность которых была гесшровапа в представленных выше экспериментах, были использованы для дальнейших исследований. Исследование действия этих антител на вторичные лимфоидпые органы (селезенку) было выполнено на следующих группах крыс: 1) крысы, получившие нормальный кроличий иммуноглобулин в дозеЮО мкг/па животное; 2) крысы, обработанные канцерогенным веществом, без опухолей, получившие нормальный кроличий иммуноглобулин в дозеЮО мкг па животное; 3) крысы, обработанные канцерогенном, с опухолями, получившие нормальный кроличий иммуноглобулин в дозе 100 мкг/на животное; 4) крысы, обработанные канцерогеном, без опухоли, получившие кроличьи антитела к опухолевому белку р53, в дозе 100 мкг/на животное; .5) крысы обработанные канцерогеном, получившие антитела и развившие

опухоли. Изучался материал от 7-8 крыс из каждой группы.

У крыс, получивших нормальный кроличий иммуноглобулин (группа 1), белая пульпа занимает больше половины области селезенки, намного больше, чем в других фуппах крыс. Основные компоненты белой пульпы - слой мантии (57.8 % фолликулярной области) и маргинальная зона. Зародышевые центры распространялись более чем на 42.2 % фолликулярной области. Они содержали, главным образом, малые и средние лимфоциты (74.9 %), лимфобласты (8.9 %) и дендритные клетки (6.2 %). Количество митотических и апоптотических клеток было незначительным во всех селезеночных областях. Отдельные СВ25+ клетки были найдены в периартериальных лимфатических муфтах и в маргинальной зоне.

У животных, получивших канцероген и нормальный кроличий иммуноглобулин, но не развивших опухолей (группа 2) были выявлены значительные изменения пролиферативной активности В и Т лимфоцитов. Ареал герминативных центров расширился до 68.4% от фолликулярной области. Количество С020+В лимфобластов возросло до 61.7%, в то же время количество Т лимфоцитов снизилось до 18.3%. Количество дендритных клеток и митотических клеток резко увеличилось. Слой мантии уменьшился до 31.6 % фолликулярной области. Область ПАЛМ, с главным образом СЭЗ+Т лимфоцитами и некоторым количеством макрофагов и апоптотических клеток, увеличилась. Количество СБ254 клеток достигло 6.9±0.4/10000 мкм2. Было увеличено количество лимфобластов в маргинальной зоне и плазматических клеток и нейтрофилов в красной пульпе.

У обработанных канцерогеном и получивших нормальный кроличий иммуноглобулин животных с опухолями толстой кишки (группа 3) пролиферативные изменения, включая бласттрансформацию лимфоцитов, наблюдались на более низком уровне, чем у крыс без опухолей. В результате, количество лимфобластов в зародышевых центрах и плазматических клеток в красной пульпе уменьшилось. Количество лимфоцитов и лимфобластов, фолликулов и расширений белой пульпы и ее компонентов уменьшилось значительно. Область В-зоны составила половину и слой мантии составил четвертую часть, относительно крыс контрольной группы. Слой мантии во многих фолликулах был опустошен. Количество апоптотических клеток уменьшилось. Области ПАЛМ и маргинальной зоны (Т зона) уменьшены до 22 -28 %. Количество С025 клеток составило 9.1±0.4/10,000 мкм2, что на 32 % выше по сравнению с обработанными канцерогеном крысами без опухолей (р<0.01). Было также увеличено количество дендритных клеток в фолликулах, макрофагов в маргинальной зоне и плазматических клеток в красной пульпе.

У крыс, получивших кроличьи антитела к опухолевому белку р53, обработанных канцерогеном, но не развивших опухоли (группа 4) пролиферативные изменения были подобны тем, что описаны для крыс без опухолей, получивших нормальный 1§С, но были более интенсивны.

Область фолликулов увеличилась и слой мантии расширился. Увеличилось количество дендритных клеток в фолликулах, макрофагов в маргинальной зоне, плазматических клеток и лимфобластов в красной пульпе. Количество С1)25' клеток составило 5.7^4/10,000 мкм2. Количество нейтрофилов снизилось.

У крыс, получивших кроличьи антитела к опухолевому белку р53 и разнивших опухоли (группа 5), пролиферация была сильнее выражена, чем у таких же крыс, получивших нормальный ^О. Значительное увеличение пролиферации было найдено в областях белой пульпы и ПАЛМ. Слой мантии охватил 39.2 % фолликулярной области. Общее количество клеток, лимфобластов в фолликулах, дендритных клеток и макрофагов увеличилось. Количество СЛ)25' клеток составило 7.3± 0.5/10.000 мкм , что меньше на 20% но сравнению с группой крыс, получивших нормальный (р<0.05). Было значительно понижено количество апоптотических клеток в ПАЛМ и маргинальной зоне и нейтрофилов и эозинофилов в красной пульпе.

Таким образом, введение кроличьих анти-р53-антител на фоне канцерогенеза, привело к стимуляции селезеночной В системы, кроме того, активизировало продукцию макрофагов и дендритных клеток. Видимых морфологических признаков выраженной активации Т клеточной системы в селезенке не обнаруживалась. Количество СВ25' клеток в селезенках крыс, получивших анти-р53-антитела, было уменьшено по сравнению с контролем, что можно связать с перераспределением этих клеток.

Влиииис введения анти-р53 антител на морфологические признаки локальных иммунных реакций в слизистой толстого кишечника и непосредственно и опухолях на разных стадиях малигнизации в процессе химического канцерогенеза.

Исследования были выполнены на нормальной ткани и опухолях толе им о кишечника, полученных от крыс следующих групп: 1) контрольная группа - крысы, обработанные канцерогенным веществом, получившие неснецифический иммуноглобулин кролика в дозе 100 мкг на животное и разнившие опухоли 2) крысы, обработанные канцерогеном и получившие кроличьи антитела к опухолевому р53, в дозеЮО мкг/на животное и развившие опухоли. Материал был получен от 7-8 крыс из каждой группы. Были изучены следующие показа!ели: площадь лимфоидных инфильтратов, количество (Л)25'клеток, экспрессия р53, апонтотический индекс, экспрессия РСЫА и митотический индекс.

Иммупогистохимический анализ показал, что онкогенез в толстом кишечнике крыс сопровождался существенным увеличением экспрессии р53 белка в опухолях, выделенных от крыс различных экспериментальных групп (получивших и не получивших анти-р53-^С).

Аденокарциномы крыс, получивших антитела, имели большее количество р53-поз,,тиг.ных клеток, чем подобные опухоли от крыс, н° получивших антител.

Анонтоз был достоверно увеличен в нормальной слизистой толстой кишки и тканях опухоли от крыс, получивших антитела, по сравнению с контрольными. А1 был увеличен в 6 раз в нормальной слизистой толстого кишечника и больше чем в 2 раза в опухолях. Области лимфоцигарной инфилырации были в два раза больше в опухолях крыс, получивших антитела (темные столбики), по сравнению с контрольной группой (светлые столбики): 26.8+3.5 и 13.1±3.2, соответственно (р<0.05). КоличеС1во С025' клеток в таких инфильтратах увеличивалось с 7.91:1.5 % в опухолях от контрольных крыс, до 18.6+0.5 % (р < 0.001) в опухолях от крыс, получивших антитела (рис.3).

^!

Площадь лимфоцитарных инфильтратов {% от площади среза)

Процент С 0 25+ Т лимфоцитов

Рисунок 3. Области лимфоцитарной инфильтрации и количество СБ251 клеток в опухолях крыс.

Анализ совокупного эффекта действия канцерогена и анти-р53-антител на клетки толстого кишечника показал, что введение анти-р53-антител достоверно активизирует процесс апоптоза и экспрессию р53 белка как в морфологически нормальной, так и в опухолевой ткани. В тоже время в опухолях крыс, получивших анти-р53-антитела, выявлено отчетливое усиление локальных иммунологаческих реакций, которые проявлялись ростом площади лимфоцитарных инфильтратов и количества СГ325 ьГ-лимфоцитов в этих инфильтратах.

Особенности экспрессии белка р53 у р53-трансгенных мышей и влияние введения анти-р53-анти ■ ел на иммуноморфологические характеристики селезёнки трансгенных мышей на фоне химически индуцированного канцерогенеза.

В опытах па крысах было показано увеличение экспрессии в тканях, прс1српевающих злокачественную трансформацию, содержания белка р53, который може1 служи 1Ь потенциальной мишенью действия апти-р53-антитсл, обладающих отчетливым противоопухолевым эффектом. Специальная серия экспериментов,

выполненная на трансгенных мышах, была предпринята с целью выяснить, связано ли увеличение содержания белка р53 в злокачественно трансформированных тканях с усилением транскрипции гена или с замедлением его распада. Р53 промотор-трансгенные мыши были созданы, как эффективная модель для исследования экспрессии р53 гена в разных органах и возможной модуляции генной экспрессии. Трансгенные мыши имели ферментный паттерн - CAT (chloramphenicol acetyl transferase), связанный с р53 промотором и экспрессирующийся при активации промотора. Фрагмент ДНК, использовавшийся для микроиньекции, содержал сиквенс р53 промотора. р53 промотор CAT трансгенные мыши имели сниженный уровень р53 мРНК до 47% от исходной линии.

Трансгенные мыши этой линии обладали чрезвычайно высокой чувствительностью к действию даже низких доз диметилгидразина (DMH), что проявлялось их высокой летальностью. У выживших трансгенных мышей размер селезенки был необычно большой. Мы изучали тканеспецифическую экспрессию р53 гена в различных частях кишечника р53-трансгенных мышей, обработанных низкими дозами канцерогенного вещества и получивших различные варианты анти-р53-антител: моноклональное антитело РАЬ-421(200 мкг/мл), и моноклональное антитело D0-l(200 мкг/мл), полученные от гибридомных линий клеток и поликлональное антитело аН-р53 (200 мкг/мл). DO-1 антитело специфично против р53 белка человека. Обработка DMH сопровождалась токсическим эффектом с летальным исходом. Опухолегенный эффект DMH был найден только у мышей контрольной группы.

Экспрессия промотора р53 у трансгенных животных в нормальной тонкой кишке была вдвое выше чем в толстой (табл.3.) Это различие в экспрессии р53 промотора в тонком и толстом кишечнике трансгенных мышей согласуется с гипотезой о том, что тонкий кишечник лучше защищен от различного рода геномных повреждений, чем толстый кишечник. Несмотря на большое сходство в структуре и функциях тонкого и толстого кишечника рак тонкого кишечника встречается намного реже, чем рак толстого кишечника, причем как у человека, так и при экспериментальном моделировании у грызунов. Иммуногистохимические исследования показали выраженную окраску цитоплазмы эпителиальных клеток тонкого кишечника флуоросцеином, коньюгированным с анти-САТ-антителом. Обработка DMH значительно уменьшила экспрессию р53 трансгена в тонком кишечнике (от 100 % до 18 %) и в толстом кишечнике (от 52 % до 10 %) (табл.3). Введение антител противодействовало угнетающему действию DMH на экспрессию р53 трансгена как в тонком, так и в толстом кишечнике. Это особенно относится к анти-р53-^0-антителам и антителам аН-р53 (табл.3).

Таблица 3.

Тканеспецифическая экспрессия р53 гена в различных частях кишечника р53-трансгенных мышей, обработанных низкими дозами канцерогенного вещества с последующим введением различных анти-р53-антител (экспрессия р53 промотора, ассоциированного с CAT- рипортерным геном).

Органы и способы воздействия CAT /мг тканиа (среднее ± SE)

Нормальная слизистая тонкой кишки (Ileum) 100

Нормальная слизистая толстой кишки 52.2±4.2

(Colon)

Ileum + DMH 18.0±1.9

Ileum + DMH + Pab-421 21.8±2.1

Ileum + DMH + Pab-DOl 20.2±1.8

Ileum + DMH +Ab анти-р53 36.6±1.5

Ileum + DMH + Ab aH-p53 72.0±4.5

Colon + DMH 10.4±1.4

Colon + DMH + Pab-21 18.8±1.7

Colon + DMH + Pab-DOl 24.5±2.1

Colon + DMH + Ab анти-р53 27.8±3.3

Colon + DMH + Ab <xH-p53 65.3±3.9

3 Результат выражен как процент от уровня экспрессии CAT в нормальной слизистой тонкой кишки (принятого за 100 %).

Чтобы исследовать возможный механизм, который может лежать в основе повышенной чувствительности к диметилгидразину у р53 трансгенных мышей, мы изучили особенности иммуноморфологии их селезенки.

Как уже отмечалось, после обработки низкими дозами канцерогенного вещества трансгенные мыши были свободны от опухолей. Предварительное введение антител никак не повлияло на этот результат, но данные морфометрии селезенки, по сравнению с контрольной группой трансгенных, ничем не обработанных мышей (группа 1), изменились. Введение трансгенным мышам поликлонального кроличего иммуноглобулина против белка р53 вызывало интенсивную бласттрансформацию и существенную экспансию белой пульпы и фолликулярных зародышевых центров при уменьшении бласттрансформации в ПАЛМ и в маргинальной зоне. Это указывает на то, что введение этих антител, вызывает, главным образом, ответ В-клеточной системы, и в меньшей степени реакцию Т-клеточной системы. Кроме того, эти мыши не имели никаких

признаков недостаточности лимфоидной системы: общее количество лимфоидных клете:; в фолликулах и ПАЛМ было выше, чем у мышей, не получавших антител.

Введение мышам различных антител к белку р53, с последующей ОМН обработкой, приводило к изменениям в селезенке, которые были подобны тем, что описаны после введения ОМН и несколько изменялись под влиянием различных антител. Уменьшение в области фолликулов, их зародышевых центров и слоя мантии было найдено у мышей, получивших антитела к белку р53 (РАВ-001 и особенно аН-р53, но не РАВ-421). Число СГ)19+В лимфоцитов у мышей, обработанных ПМН и получивших антитела к белку р53 (РАВ-001 или аН-р53) было вдвое меньше, чем у мышей, подвергнутых действию только ОМН. Это указывает на существенную недостаточность лимфоидной системы селезенки у этих мышей. ПАЛМ (Т зона) была увеличена у мышей, получивших антитела к белку р53 (РАВ-001 и, главным образом, РАВ-421), по сравнению с мышами обработанными только ОМН. Уменьшение в области ПАЛМ было найдено только у мышей, получивших антитела аН-р53.

Существенное увеличение общего количества СОЗ+Т лимфоцитов у мышей, подвергнутых действию ОМН и получивших поликлональный кроличий иммуноглобулин против белка р53 или моноклональные антитела 001 или РаЬ-421, показывает, что эти антитела влияют положительно на Т систему селезенки, нивелируя ингибирующие эффекты канцерогенного вещества. Поликлональные антитела аН-р53, с другой стороны, вызвали уменьшение числа Т лимфоцитов в селезенке, но по аналогии С025+ клетками у крыс, можно предположить, что произошло перераспределение этих клеток.

ВЫВОДЫ

Уровень экспрессии р53 белка в ядраг-и Цитоплазме клеток коррелирует с профессией развития злокачественных опухолей толстой кишки, индуцированных канцерогенами у крыс.

Введение липосомного комплекса с р53 антигеном оказывает выраженный противоопухолевый эффект при химически индуцированном раке толстой кишки крыс.

Введение крысам антител, направленных против белка р53, способствует повышению экспрессии белка р53 в клетках слизистой толстой кишки и в клетках опухолей, индуцированных канцерогенами. Введение крысам антител против р53 белка, выделенного от крыс с доброкачественными опухолями, оказывает сильный противоопухолевый эффект, предотвращая развитие опухолей и злокачественную трансформацию доброкачественных опухолей.

Введение крысам анти-р53-антител предотвращает развитие В-иммунодефицита, характерного для крыс-опухоленосителей, и вызывает повышение количества дендритных клеток и макрофагов в селезенке. Введение крысам анти-р53-антител вызывает усиление инфильтрации опухолей С025+клетками и активизацию процессов апоптоза в опухолях, индуцированных канцерогенами.

У р53 трансгенных мышей экспрессия промотора р53 под действием канцерогена снижается как в слизистой тонкой, так и в слизистой толстой кишки. Введение трансгенным мышам анти-р53-антител приводит к увеличению экспрессии р53 промотора и к уменьшению иммуносупрессивного влияния канцерогенов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

!. Tendler Y., Reshef R., Cohen I., Barzilai M., Shasha S.M., Rotter V., Shkolnik T. Histochemical studies of progressive p53 mutations during colonic carcinogenesis in Sprague-Dawley rats induced by N-Methyl-N-Nitro-Nitrosoguanidine or Azoxymethane. // Pathobiology. - 1994. - V. 62. - P. 232-237.

2. Zusman I., Zusman R., Gurevich P., Korol D., Tendler Y. High tumor-preventive effects of polyclonal IgG generated against p53 tumor-associated protein obtained from benign-tumor bearing rats. // Oncology Reports. - 1996. - V. 3. - P. 975-979.

3. Zusman I., Gurevich P., Sandler В., Zusman R., Smirnoff P. and Tendler Y. Tumor-suppressor effects of anti-p53 IgG on chemically induced colon cancer in rats. //Cancer J. - 1997. - V. 10. - P. 116-120.

4. Tendler Y., Ben-Hur H., Gurevich P., Berman V., Sandler В., Nyska A., Zion H., and Zusman I. Role of apoptosis, proliferaiting cell nuclear antigen and p53 protein in the immune response of rat colon cells and vaccination with anti-p53 polyclonal antibodies. //Anticancer Research. - 199 7\_- V. 17, - P. 4653-4658.

5. Ben-Hur H., Gurevich P., Zion H., Berman V., Tendler Y., Sandler В., Zinder O. and Zusman I. Immune response of rat spleen cells to a carcinogen and to vaccination with anti-p53 polyclonal antibodies. // Anticancer Research. - 1998. - V. 18.-P. 273-282.

6. Tendler Y., Gurevich P., Sandler В., Diamond E., Lischinsky S., Shkolnik Т., Zinder O., Zusman I. Tissue-specific expression of the p53 tumor-suppressor gene in the intestine of transgenic mice exposed to DMH and p53 antibodies. // Oncology Reports - 1999. - V. 6. - P. 883-886.

7. Ben-Hur H., Plonsky E., Gurevich P., Berman V., Tendler Y., Moriel E., Guy M., Sandler В., Rozenberg V., Zusman R. and Zusman I. Morphological and morphometric studies of the splenic antitumor immune response, elcited by liposome-covered soluble p53 kDa antigen, in chemically-induced rat colon cancer. // International J. of Molecular Medicine. -1999. - V. 3. - P. 545-549.

8. Gurevich P., Ben-Hur H.,. Sandler B, Berman V., Tendler Y., Zinder O. and Zusman I. Effects of low doses of carcinogen and different antibodies on the splenic lymphoid system of p53 transgenic mice: Morphometric and immunohistochemical stadies. // International J. of Molecular Medicine. - 1999. - V. 4. P. - 197-202.

9. Tendler Y., Ben-Hur H., Gurevich P., Sandler B.,. Berman V, Zinder O. and Zusman I. Response of the spleen of Balb/c and p53-transgenic mice to low doses of carcinogen and to polyclonal antibodies generated against the soluble 53 kDa protein. // Anticancer Research. - 2000. - V. 20. - P. 385-390.

10. Ben-Hur H., Gurevich P., Hagay Z., Berman V., Tendler Y„ Sandler В., Zinder O. and Zusman 1. Immune response of rat spleen cells to a carcinogen and to vaccination with anti-p53 polyclonal antibodies. // Anticancer Res. - 1998. - V. 18. -P. 273-282.

11. Zusman I., Gurevich P., Sandler В., Zusman R., Smirnoff P., Tendler Y. Tumor-suppressor effects of anti-p53 IgG on chemically induced colon cancer in rats //Cancer J. - 1997.-V. 10.-P. 116-120.

12. Zusman Zusman R., Gurevich P., Korol D., Tendler Y Hi-jh t imor-preventive effects of polyclonal IgG generated against p53 tumor-asscociated protein obtained from benign tumor-bearing rats. // Oncol Rep. - 1996. - V. 3. - P. 975-979.

13. Zusman I., Reifen R., Livni O., Smirnoff P., Gurevich P , Sandler В., Nyska A., Gal R., Tendler Y. and Madar Z. Role of apoptosis, proliferating cell nuclear antigen and p53 protein in chemically induced colon cancer in rats fed corncob fiber treated with the fungus Pleurotus ostreatus. // Anticancer Res. - 1997. - V. 17. - P. 2105-2114.

14. Tendler Y., Weisinger G., Coleman R., Diamond E., Lischinsky S„ Kerner H., Rotter V., Zinder O. Tissue-specific p53 expression in the nervous system. // Brain Res Mol Brain Res. - 1999. - V. 72(1). - P. 40-46.

15. Тендлер E., Зиндер О., Зусман И. Иммуные механизмы антиопухолевого эффекта р53 IgG при химически индуцированном раке толстого кишечника у грызунов.// Медицинская иммунология. - 2002. - т.4. - с. 312-313.

16. Тендлер Е.В., Паньшин А.Г., Зусман И., Зиндер О., Фрейдлин И.С. Возможные механизмы противоопухолевого действия анти р53 иммуноглобулина. // Медицинская иммунология. - 2005. - т.7. - с. 284-285.

Отпечатано в типографии ЧП «Тулупов» Свидетельство № 4244 от 01.04.1998 г. 197110, СПб, ул. Кемская, д. 10 тираж 100 экз.

РНБ Русский фонд

2QQ6-4 3493

Актуальность темы. Белок р53 дикого типа (wtp53) содержится в нормальных клетках в латентном состоянии и не выявляется обычными методами, но оказывает противоопухолевое действие. Более половины всех случаев рака у человека сопровождаются мутациями р53-гена, во многих других случаях выявляется потеря функциональной активности р53-белком без мутации в гене. И в том, и в другом случае р53 накапливается в злокачественно трансформированной клетке в значительных количествах. р53 подходит для заместительной генной терапии, так как является мощным индуктором апоптоза раковой клетки. Однако терапия с использованием р53-гена имеет существенные ограничения. Учитывая это, для лечения опухолей, содержащих нормальный или мутантный р53-белок, становятся более актуальными иммунологические подходы. Возможно проведение иммунотерапии путем введения р53-белка. Однако, как аутоантиген, он слабо иммуногенен, даже в своей мутантной форме. Остается открытым вопрос о противоопухолевой эффективности введения самого белка р53 или анти-р53-антител, действие которых может быть опосредовано выработкой и противоопухолевым действием анти-идиотипических антител. Канцерогенез сопряжен с серьезными повреждениями иммунной системы, лимфоидной ткани с нарушениями функций Т- и В-лимфоцитов. Опухолевый рост, как правило, идет на фоне выраженного иммунодефицита. В связи с этим представляло интерес изучение влияния иммунизации белком р53 и введения антител против р53 на лимфоидную ткань в условиях химически индуцированного канцерогенеза. Актуальность настоящего экспериментального исследования связана с поиском новых путей иммунотерапии опухолей с использованием антител, направленных против белка р53, и изучением иммунологических механизмов их противоопухолевого действия.

Цель исследования. Изучить роль иммунологических механизмов в развитии противоопухолевого эффекта антител, направленных против белка р53.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить экспрессию белка р53 в кишечнике крыс в динамике химически индуцированного канцерогенеза.

2. Оценить влияние введения крысам р53-антиген-липосомного комплекса или анти-р53-иммуноглобулина на интенсивность химически индуцированного канцерогенеза.

3. Изучить иммуноморфологические изменения в селезенке животных, получивших р53-антиген-липосомный комплекс или анти-р53-иммуноглобулин на фоне химически индуцированного канцерогенеза.

4. Оценить влияние введения крысам р53-антиген-липосомного комплекса или анти-р53-иммуноглобулина на экспрессию белка р53 и показатели, косвенно отражающие активность канцерогенеза и противоопухолевого действия в органах-мишенях канцерогенного действия.

5. Изучить экспрессию промотора р53 у трансгенных мышей на фоне химически индуцированного канцерогенеза и введения анти-р53-антител.

Научная новизна.

Впервые было проведено комплексное изучение противоопухолевого действия анти-р53-антител. Впервые показано увеличение содержания белка р53 в эпителиальных клетках толстого кишечника крыс в процессе химически индуцированного канцерогенеза в ответ на введение анти-р53-иммуноглобулина. На модели трансгенных мышей впервые показано, что введение анти-р53-антител усиливает экспрессию промотора р53 и увеличивает содержание белка р53 в клетках кишечника. В экспериментах зарегистрирован выраженный противоопухолевый эффект введения крысам р53-антиген -липосомного комплекса или анти-р53-иммуноглобулина.

Теоретическая и практическая значимость результатов работы.

Выявленное в экспериментах резкое возрастание содержания белка р53 в злокачественных тканях при введении анти-р53-антител представляет интерес для обсуждения гипотезы о роли антиидитипических антител, соответствующих «внутреннему образу» антигена.

Зарегистрированное параллельное увеличение выраженности апоптоза, экспрессии р53-белка и количества Т-лимфоцитов в инфильтратах и примыкающих к опухолям тканях можно рассматривать как результат активации иммунной системы в ответ на введение р53 антиген-липосомного комплекса или анти-р53-антител.

Полученные экспериментальные данные могут служить основой для разработки принципиально новых методов иммунотерапии злокачественных опухолей.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Показано возрастание уровня экспрессии белка р53 в эпителиальных клетках толстого кишечника крыс в процессе химически индуцированного канцерогенеза.

2. В ответ на введение анти-р53-антител на фоне химически индуцированного канцерогенеза усиливается экспрессия промотора р53 и повышается содержание белка р53 в эпителиальных клетках кишечника.

3. При введении крысам р53-антиген-липосомного комплекса или анти-р53-антител на фоне химически индуцированного канцерогенеза зарегистрирован выраженный противоопухолевый эффект.

4. При введении крысам анти-р53-антител на фоне химически индуцированного канцерогенеза предотвращалось развитие В-иммунодефицита, характерного для крыс-опухоленосителей, и возрастало количество дендритных клеток и макрофагов в селезенке.

5. При введении крысам анти-р53-антител на фоне химически индуцированного канцерогенеза отмечено усиление локальной инфильтрации опухолей CD25+-клетками и процесса апоптоза в опухолях.

Личный вклад автора в проведенное исследование. Личным вкладом автора в выполненную работу является самостоятельное выполнение всех иммунологических и молекулярно-биологических исследований, интерпретация полученных результатов. Вклад соавторов ограничивается предоставлением в его распоряжение ряда оригинальных моноклональных антител и трансгенных мышей.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на 15 международных научных конференциях и доложены на научной конференции с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 2002г.). Диссертационная работа апробирована на научной конференции отдела иммунологии НИИЭМ РАМН 05 октября 2004 г.

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 16 печатных работ, в том числе 14 статей в научных журналах и 2 тезисов конференций.

Объем и структура диссертации. Объем работы составляет 121 страницу машинописного текста, включая 22 таблицы и 12 рисунков. Список литературы состоит из 168 наименований, из них 20 работ принадлежат отечественным авторам и 148 - зарубежным.

выводы

1. Уровень экспрессии р53 белка в ядрах и цитоплазме клеток коррелирует с прогрессией развития злокачественных опухолей толстой кишки, индуцированных канцерогенами у крыс.

2. Введение липосомного комплекса с р53-антигеном оказывает выраженный противоопухолевый эффект при химически индуцированном раке толстой кишки крыс.

3. Введение крысам антител, направленных против белка р53, способствует повышению экспрессии белка р53 в клетках слизистой толстой кишки и в клетках опухолей, индуцированных канцерогенами.

4. Введение крысам антител против р53 белка, выделенного от крыс с доброкачественными опухолями, оказывает сильный противоопухолевый эффект, предотвращая развитие опухолей и злокачественную трансформацию доброкачественных опухолей.

5. Введение крысам анти-р53-антител предотвращает развитие В-иммунодефицита, характерного для крыс-опухоленосителей, и вызывает повышение количества дендритных клеток и макрофагов в селезенке.

6. Введение крысам анти-р53-антител вызывает усиление инфильтрации опухолей СD25^клетками и активизацию процессов апоптоза в опухолях, индуцированных канцерогенами.

7. У р53 трансгенных мышей экспрессия промотора р53 под действием канцерогена снижается как в слизистой тонкой, так и в слизистой толстой кишки. Введение трансгенным мышам анти-р53-антител приводит к увеличению экспрессии р53 промотора и к уменьшению иммуносупрессивного влияния канцерогенов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Белок р53 дикого типа (wtp53) содержится в нормальных клетках в латентном состоянии и не выявляется обычными методами, но оказывает противоопухолевое действие. Более половины всех случаев рака у человека сопровождаются мутациями р53-гена, во многих других случаях выявляется потеря функциональной активности р53-белком без мутации в гене. И в том, и в другом случае р53 накапливается в злокачественно трансформированной клетке в значительных количествах. р53 подходит для заместительной генной терапии, так как он является мощным индуктором апоптоза раковой клетки. Однако терапия с использованием р53-гена имеет существенные ограничения. Учитывая это, для лечения опухолей, содержащих нормальный или мутантный р53-белок, становятся более актуальными иммунологические подходы. Так как в нормальных неопухолевых клетках содержится необнаружимо малое количество р53-белка, а в опухолевых — очень большое, то возможно проведение иммунотерапии путем введения р53-белка, однако, как собственный антиген, он слабо иммуногенен, даже в своей му-тантной форме. По этой причине мы попытались исследовать не только иммунизацию самим р53-белком, но и введение антител против р53 и изучить возможные иммуно-тропные эффекты. Канцерогенез сопряжен с серьезными повреждениями иммунной системы, с нарушениями функций Т- и В-лимфоцитов. Канцерогены оказывают повреждающее действие на лимфоидную ткань. Опухолевый рост, как правило, идет на фоне выраженного иммунодефицита. В связи с этим изучался вопрос о возможном влиянии иммунизации белком р53 и введения антител против р53 на лимфоидную ткань в условиях химического канцерогенеза. Наши данные свидетельствуют о том, что увеличение апоптоза, экспрессии р53-белка и числа CD25+ Т-лимфоцигов в инфильтратах и примыкающих к опухолям тканях можно рассматривать как результат активации иммунной системы в ответ на введение анти-р53 IgG или р53-антиген-липосомного комплекса.

Обработанные канцерогеном крысы без опухоли имели существенные изменения пролиферативной активности лимфоидных компонентов селезенки, макрофагов и дендритных клеток. Онкогенез толстой кишки вызвал глубокие изменения в селезенке. Елатрансформация снизилась по сравнению с крысами, у которых не появилась опухоль в результате канцерогенной обработки. Некоторые из зародышевых центров и слой мантии были опустошены. Количество плазматических клеток в красной пульпе резко уменьшилось. Уменьшение апоптоза было замечено в ткани ТК и в ПАЛМ селезенки. Все эти изменения отражают состояние супрессии как Т, так и В-систем иммунитета. Резкое увеличение количества дендритных клеток, CD25+ Т-клеток, макрофагов и ней-трофилов может рассматриваться как компенсаторная реакция селезенки на сильное антигенное воздействие.

Выраженность этих изменений снижалась как при введении анти-р53 IgG, так и при иммунизации р53-антиген-липосомным комплексом. Морфологически противоопухолевые эффекты выражались в повышении пролиферативной активности лимфоидной ткани в пределах опухолей и в окружающих их тканях. Апоптотический индекс имел тенденцию к повышению в ткани ТК и опухолях.

Мы обнаружили некоторые различия в селезеночном ответе на иммунизацию р53-антигеном по сравнению с введением антител против р53. Эти различия проявлялись, главным образом, в области, занятой различными составляющими белой пульпы. В целом, области белой и красной пульп, ПАЛМ и маргинальной зоны крыс, обработанных канцерогенными веществами, изменялись сходным образом после иммунизации р53-антигеном или введения анти-р53-антител. С другой стороны, фолликулы и их главные составляющие, зародышевый центр и слой мантии, реагировали различным образом.

Таким образом, недостаточность иммунной системы отмечалась в основном у несущих опухоли неиммунизированных крыс, это выражалось в значительном уменьшении областей белой пульпы, мантии, ПАЛМ и маргинальной зоны. В то же время, у иммунизированных крыс отмечена высокая активность В-клеточной системы селезенки. Т-система этих крыс была менее защищена, чем Т-система крыс, получивших антитела против р53 и имевших большие области ПАЛМ и значительное количество CD25+ Т-клеток.

Возможность супрессии онкогенеза через иммунную систему организма была проверена нами путем введения крысам анти-р53 IgG уже после индукции опухолей. Морфологическое исследование показало, что животные без опухоли, получившие канцероген и, впоследствии, антитела, развивают более мощную иммунную реакцию, чем те, которые получили только канцероген. Это проявлялось в расширении фолликулов и слоя мантии, в повышенном количестве дендритных клеток в фолликулах, макрофагов в маргинальных зонах, и плазматических клеток и лимфобластов в красной пульпе. Признаки недостаточности иммунной системы отсутствовали.

Недостаточность иммунной системы была найдена у получивших антитела крыс-опухоленосителей. Симптомы недостаточности были, однако, более слабо выражены, чем у крыс опухоленосителей, не пролучивших антител. Таким образом, обработка канцерогеном, сопровождаемая введением поликлональных анти-р53-антител, приводила к стимуляции селезеночной В-системы. Кроме того, введение антител также активизировало продукцию макрофагов и дендритных клеток. Активация Т-клеточной системы обнаруживалась только иммуногистохимическими методами.

Мы нашли, что канцерогенные вещества, даже в низких дозах, не приводящих к возникновению опухолей, вызывали существенные изменения структуры селезенки. Это проявлялось, главным образом, в увеличении бластгрансформации лимфоцитов.

Уменьшение общего количества лимфоидных клеток в фолликулах (В-зона) и ПАЛМ (Т-зона) отражает умеренную недостаточность лимфоидной системы селезенки, как ответ на действие низких доз канцерогенного вещества.

Введение трансгенным мышам антител против р53 (анти-р53 IgG) вызывало интенсивную бласттрансформацию и существенную экспансию белой пульпы и фолликулярных зародышевых центров, но уменьшало бласттрансформацию в ПАЛМ и в маргинальной зоне. Это указывает на то, что антитела к р53, вызывают, главным образом, ответ В-клеточной системы и, в меньшей степени, реакцию Т-клеточной системы. Введение мышам различных антител с последующей DMH-обработкой приводило к изменениям в селезенке, которые были подобны тем, что описаны после одного DMH и несколько изменялись под влиянием антител.

Введение р53-трансгенным мышам анти-р53 IgG, или моноклональных антител D01 и Pab 421 стимулировало селезеночную Т-систему, и поэтому могло уменьшить он-когенный эффект канцерогенных веществ.

Мы предполагаем, что введение анти-р53 IgG стимулирует продукцию антиидио-типических антител (АЬ2). Эти антитела - иммуноглобулины со специфичностью к детерминантам, расположенным в пределах переменной области специфичных к антигену антител (АЫ). Некоторые АЬ2 распознают идиотип в пределах участка объединения антигена и АЫ и могут имитировать пространственную структуру антигена, против которого АЫ были получены [102, 10, 11, 12]. Связанные с опухолью антигены (ОАА) часто экспрессируются в течение нормального эмбрионального развития и, возможно, представлены в нормальных тканях [34]. Как следствие, организм обычно толерантен к ОАА и эффективного антиопухолевого иммунного ответа не наблюдается. На основании полученных результатов нами был предложен новый подход для стимулирования противоопухолевого иммунного ответа к ОАА с использованием иммуномиметических молекул - антиидиотипических антител - АЬ2 [129, 10, 11, 12]. АЬ2 вступают в реакцию с участком антител, направленных против ТАА, и могут воспроизводить «внутренний образ» антигена [39]. Недавние эксперименты показали, что АЬ2 могут вызывать антиопухолевый эффект, непосредственно подавляя рост ОАА-экспрессирующих раковых клеток, или активируя иммунный противоопухолевый ответ через индукцию следующего поколения антител (АЬЗ) [30].

Можно предположить, что анти-р53 IgG стимулирует генерацию антиидиотипических антител по пути, подобному описанному в литературе [129, 39 , 30, 10, 11, 12]. Аналогичный эффект эндогенных антиидиотипических антител был найден (Ter-Grigorov, 1992) в экспериментах с иммунизацией мышей, инфицированных вирусом (Rauscher) лейкоза, аутоантителами против Н-20Ь антигена [142]. Были получены антиидиотипиче-ские человеческие антимышиные антитела, индуцированные при иммуносцинтиографии с мышиными Анти-СА 125-моноклональными антителами, которые продлевали жизнь пациентам с карциномой яичника [30].

Хотя р53 не относится к поверхностным антигенам клетки, олигопептидные фрагменты этого белка, в комплексе с антигеном гистосовместимости первого типа, пре-зентируются на клеточной поверхности и становяться мишенью для атаки CD25+T-лимфоцитов [44, 144]. В нормальных условиях концентрация белка р53 в тканях ничтожна, и его распад по убиквитиновому пути приводит к полной элиминации. При ма-лигнизации происходит нарастание уровня р53 за счет большей устойчивости мутантного р53, при этом его синтез снижается. Ситуация резко меняется при введении антител к белку р53. Возрастает экспрессия промотора, что является показателем усиления транскрипции специфической мРНК с последующим ускорением трасляции белка р53. Это, в свою очередь, приводит к образованию избыточного количества олигопептидов и их презентации в комплексе с МНС-1, по общепризнанным механизмам. Хотя в нашем распоряжении нет фактов, непосредственно подтверждающих противоопухолевое действие таких лимфоцитов, обнаружение массивной инфильтрации CD254 Т-лимфоцитами может косвенно свидетельствовать об этом.

Теоретическая и практическая значимость результатов экспериментального исследования состоит в том, что впервые было проведено комплексное изучение противоопухолевого действия анти-р53-антител. Полученные данные о резком возрастании содержания белка р53 в злокачественных тканях при введении анти-р53-антител могут служить основой для разработки принципиально новых методов экспериментальной терапии злокачественных опухолей.