Автореферат и диссертация по медицине (14.01.04) на тему:Феномен апоптоза клеток костного мозга и синовиальной оболочки в патофизиологии ревматоидного артрита

На правах рукописи

ДОРОШЕВСКАЯ АННА ЮЛЬЕВНА

ФЕНОМЕН АПОПТОЗА КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА И СИНОВИАЛЬНОЙ ОБОЛОЧКИ В ПАТОФИЗИОЛОГИИ РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА

14.01.04 - внутренние болезни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

11 МАР 2015

Владивосток - 2015

005560464

005560464

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, доцент Дубиков Александр Иванович Официальные оппоненты:

Зонова Елена Владимировна, доктор медицинских наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра терапии, гематологии и трансфузиологии факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки врачей, профессор кафедры. Отгева Эльвира Николаевна, доктор медицинских наук, профессор, краевое государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Институт повышения квалификации специалистов здравоохранения» министерства здравоохранения Хабаровского края, кафедра внутренних болезней, доцент кафедры. Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Воронежская государственная медицинская академия имени H.H. Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится «27» марта 2015 года в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.007.04 при ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 690002, г. Владивосток, проспект Острякова, д. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации и на сайте www.vgmu.ru.

Автореферат разослан «я^015 года Ученый секретарь

диссертационного совета

Кондрашова Надежда Михайловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Общепризнанным является тот факт, что ревматические заболевания (РЗ) по своему влиянию на состояние здоровья современного общества находятся на одном из первых мест. Такое положение определяется увеличением их распространенности, подверженностью ревматическим болезням всех возрастных групп населения, склонностью к хронизации и неуклонному прогрессированию, ведущим к снижению дееспособности, ранней инвалидизации пациентов и накоплению их в популяции [Фоломеева О.М., 2008].

Особое теоретическое и медико-социальное значение имеет ревматоидный артрит (РА), классический пример хронических воспалительных заболеваний человека, распространенность которого в популяции составляет 0,5-1,5%. Согласно официальной статистике, в Российской Федерации в 2003 году зарегистрировано 280 тысяч пациентов (260 тыс. взрослых и 20 тыс. подростков), страдающих достоверным РА, из них более 26 тысяч впервые заболевших. Ежегодно в РФ регистрируется около 300 тысяч больных [Чичасова Н.В., 2009, Оконенко Л.Б., 2014].

Поражая преимущественно лиц трудоспособного возраста, РА приводит к ранней инвалидизации: около 50% больных теряют трудоспособность в течение первых 5 лет заболевания, продолжительность жизни пациентов сокращается на 8-10 лет. РА в развернутой стадии характеризуется прогрессирующим течением с формированием деформаций суставов, развитием тяжелых функциональных нарушений и поражений внутренних органов. По данным эпидемиологических исследований, частота сердечно - сосудистых событий у пациентов с РА в 3,96 раза выше, чем в популяции и на 30-60% выше, чем у больных с другой патологией суставов. Обзор исследований показал, что прямая стоимость РА составляла к 2000 году около 6000 евро в год. Ухудшение функции суставов приносит обществу наибольшие финансовые потери, поскольку расходы на заболевание пропорциональны нарастанию функциональной недостаточности (ФН). Показано, что общие затраты возрастают с -5000 евро на пациента с

минимальной ФН и до ~20000 евро на пациента с тяжелой ФН. Общая стоимость РА в странах западной и восточной Европы на 2006 год составляет от 42 млрд. до 3,4 млрд. евро в год, соответственно [Дубиков А.И., 2004].

В последние годы достигнут значительный прогресс в понимании патогенеза РА, а также в разработке современных технологий и средств иммунодиагностики, иммуномониторинга и иммунопрогнозирования, составивших, по мнению большинства исследователей, основу современных программ лечебно-реабилитационных и лечебно-профилактических мероприятий в клинике РА [Сучков C.B., 2004]. В проводимых ранее исследованиях изучалась роль апоптоза в патофизиологии РА. Данные исследования были посвящены изучению состояния апоптоза в клетках синовиальной оболочки (СО) на ранней и поздней стадии РА [Дубиков А.И., 2004], другие - изучению состояния апоптоза клеток СО на ранней и поздней стадиях адъювантного артрита [You X., 2006,]. Исследователями было доказано угнетение апоптоза на ранней стадии артрита и активация апоптоза на поздней стадии [Дубиков А.И., 2004]. К сожалению, остается неясным состояние апоптоза в других тканях у больных РА, имеет ли нарушение механизмов апоптоза при РА системный характер, какой из путей апоптоза наиболее активен при РА, влияет ли длительность и активность заболевания на динамику механизмов регуляции апоптоза. Раскрытие новых патофизиологических механизмов заболевания, в частности изучение различных путей апоптоза клеток красного костного мозга и синовиальной оболочки, может стать основой для разработки новых стратегий прогнозирования течения и лечения РА.

Цель исследования: определение роли Р53- зависимого, митохондриального путей апоптоза, механизмов остановки клеточного цикла клеток костного мозга и синовиальной оболочки в патофизиологии ревматоидного артрита.

Задачи исследования:

- изучить активность молекул Р53, Р21 и PUMA в клетках красного костного мозга и синовиальной оболочки у больных с ранней и поздней стадией РА;

- изучить активность антиапоптотической молекулы (Mdm2) в клетках красного костного мозга и синовиальной оболочки у больных с ранней и поздней стадией РА;

- установить соотношение между экспрессией про- и антиапоптотических молекул в зависимости от стадии, активности РА, а так же структурных изменений опорно-двигательного аппарата.

Научная новизна.

В настоящей работе проведено исследование различных путей апоптоза клеток костного мозга и синовиальной оболочки у больных РА.

Выявлены особенности экспрессии проапоптотических и антиапоптотических маркеров на различных стадиях РА.

Установлены прямые связи между про- и антиапоптотическими маркерами клеток красного костного мозга, синовиальной оболочки и индексами активности, структурными изменениями костной ткани на ранней и поздней стадиях РА.

Представлена возможность прогнозирования прогрессирования структурных изменений и степени тяжести течения РА при определении маркеров апоптоза на различных стадиях РА.

Практическая значимость.

Проведенное исследование расширило представления о роли феномена апоптоза не только клеток синовиальной оболочки, но и клеток красного костного мозга в патофизиологии ранних и поздних стадий РА. Установленные тенденции экспрессии Р53, Р21, PUMA и Mdm2 молекул на различных стадиях РА открывают возможность прогнозирования течения заболевания и перспективы разработки персонифицированного подхода к лечению заболевания в зависимости от стадии патологического процесса. Положения, выносимые на защиту:

1. Феномен апоптоза клеток костного мозга и синовиальной оболочки играет определенную роль в патофизиологии как ранних, так и поздних стадий РА.

2. Ранняя стадия РА характеризуется высокой активностью антиапоптотической молекулы Mdm2.

3. Поздняя стадия РА отличается высокой активностью проапоптотических молекул Р53, Р21 и PUMA.

4. Активность проапоптотических молекул у больных РА может служить прогностическим индексом высокой активности заболевания, низкого качества жизни, прогрессирования структурных изменений.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 4в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, 2 — в зарубежных изданиях.

Внедрение результатов исследования: Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при подготовке студентов, врачей-интернов, клинических ординаторов, ревматологов на кафедре факультетской терапии ГБОУ ВПО ТГМУ Министерства здравоохранения Российской Федерации; в практике Городского ревматологического центра КГАУЗ «Владивостокская клиническая больница №2». Оформлены и утверждены 2 акта о внедрении, 1 Патент Российской Федерации на изобретение.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на XIII Тихоокеанской международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием (Владивосток, 2012 г.), X Дальневосточном медицинском конгрессе «Человек и лекарство» с международным участием (Владивосток, 2013 г.), XI Тихоокеанском медицинском конгрессе с международным участием (Владивосток, 2014 г.),

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 98 страницах, содержит 27 рисунков, 9 таблиц, состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 104 источника (16 - отечественных и 88 - зарубежных авторов).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования. В исследовании приняли участие 70 больных европеоидной расы женского пола. Диагноз РА соответствовал критериям Американской Ревматологической Ассоциации (ACR/EULAR 2010) [Ревматология: национальное руководство, 2008]. Согласно классификации РА от 2007 года [Ревматология: национальное руководство, 2008], больные были

разделены на две группы: с ранней стадией РА (35 пациентов) и поздней стадией РА (35 пациентов). Все больные были серопозитивны по ревматоидному фактору (RF) класса Ig М. У 51 пациента в сыворотке крови определялись антитела к циклическому цитруллинированному пептиду (ССР). 19 пациентов были серонегативны по антителам к ССР. Стадии РА оценивались согласно рентгенологической классификации по Штейнброкеру [Ревматология: национальное руководство, 2008]. У 27 пациентов была R I стадия, у 8 пациентов - R II стадия, у 14 пациентов - R III стадия и R IV стадия - у 21 пациента. По наличию или отсутствию эрозивных изменений костных структур в суставах кистей и стоп, выделяли эрозивный (35 пациентов) и неэрозивный РА (35 пациентов).

Для оценки активности РА использовался индекс активности болезни DAS 28 [Ревматология: национальное руководство, 2008]. Низкая активность соответствовала значениям индекса DAS 28 менее 3,2 (0 пациентов), средняя -3,3-5,1(38 пациентов), высокая - более 5,1(32 пациента).

Для оценки качества жизни больных использовался индекс HAQ [Амирджанова В.Н., 2009]. У 19 пациентов индекс HAQ был в диапазоне от 0 до 0,9, у 43 пациентов - от 1,0 до 1,9 и у 8 пациентов индекс HAQ был от 2,0 до 2,9.

Больные отбирались по мере поступления в ревматологическое отделение Владивостокской клинической больницы №2. Забор материала производился после клинического, лабораторного и инструментального обследования. Терапия базисными модифицирующими течение заболевания препаратами, как и нестероидными противовоспалительными препаратами не отменялась.

Методы лабораторного н инструментального исследования.

У всех (70) пациентов исследовали костный мозг (КМ) и у 30 пациентов синовиальную оболочку суставов (СО), с последующим приготовлением мазков и замороженных срезов. В каждом из указанных биологических материалов определялись белки-регуляторы апоптоза р53, р21, PUMA и Mdm2 иммуногистохимическим и иммуноцито.химическим методами с использованием первичных мышиных моноклональных антител р53. р21 и кроличьих

поликлональных антител PUMA и Mdm2 и вторичных антител - Alexa 488, Alexa 546. Исследование проводилось с применением микроскопа биологического Axio Imager Z2 (Karl Zeiss) и трансмиссионного электронного микроскопа Libra 120 (Karl Zeiss). До обработки первичными и вторичными антителами образцы ткани СО суставов и мазки КМ фиксировали в 4% растворе параформа. В последующем фиксированный материал неоднократно промывали раствором фосфатно-солевого буфера.

Контрольную группу составили 30 женщин европеоидной расы, средний возраст которых составил 55,75 (38-70 лет) с остеоартрозом (OA) в сочетании с тромбоцитозом. У всех пациентов контрольной группы был произведен забор красного КМ для исключения гематологической причины тромбоцитоза (патологии обнаружено не было), забор СО для контроля был произведен у 10 пациентов в ходе проведения эксплоративной артротомии коленного сустава по поводу предполагаемого повреждения менисков.

Информированное согласие на проведение стернальной пункции и артроскопии у пациентов было получено.

Количественный анализ иммуннопозитивных клеток определяли как отношение общего числа клеток в поле зрения (Ыобщ.) к количеству клеток, содержащих р53, р21, PUMA и Mdm 2 (Nx) по формуле апоптотического индекса (АИ) = (Nx* 100) / No6iy. Данные обрабатывали методом вариационной статистики с определением t- критерия достоверности по Стьюденту (Р<0,1).

Иммуногистохимическое и иммуноцитохимическое исследование образцов выполнялось на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии моря им. A.B. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук.

Статистическая обработка данных

Статистическая обработка всех полученных цифровых данных проводилась с использованием персонального компьютера по программе «Статистика». Подсчитывались следующие показатели: средняя арифметическая (М), среднее квадратичное отклонение (5), средняя ошибка средней арифметической (±ш),

коэффициент достоверности показателя (t) и различий (t и р), коэффициент линейной корреляции (±г), ошибка (mrxy) и достоверность коэффициента корреляции (t).

Результаты исследований и обсуждение Ревматоидный артрит - это хроническое воспалительное заболевание, характеризующееся гиперплазией синовиальной ткани и ее внедрением в хрящ и кость с последующей их деструкцией [Cha H.S., 2010, You X., 2006]. Данные изменения являются следствием дисбаланса между пролиферацией клеток внутреннего слоя синовиальной оболочки сустава и апоптозом или программированной смертью клетки с другой [Cha H.S., 2010]. Ключевым моментом в блокировании клеточного цикла и индукции в клетках апоптоза является экспрессия р53-белка, который служит фактором транскрипции для р21 ингибитора G1- фазы клеточного цикла и для ряда анти - и проапоптотических белков, таких как PUMA, и Mdm 2 [Castedo M., 2004].

При углубленном изучении роли апоптоза в патогенезе РА и зависимости активности программированной клеточной смерти от стадии РА оказалось, что на ранних стадиях РА зарегистрирована низкая интенсивность апоптоза, а на поздней стадии выявлена значительная активизация апоптоза [Дубиков А.И., 2004, Firestein G.S., Echeverri F., 1997, Dubikov A.I., Kalinichenko S. 2010]. Результаты, полученные в ходе данной работы, позволяют судить о молекулярных механизмах апоптоза клеток КМ и СО у больных с различными вариантами РА.

Наши наблюдения показывают, что на ранней и поздней стадиях РА в клетках КМ экспрессируются как про-, так и антиапоптотические белки. Р53-, р21-, PUMA- и Mdm2-no3HTiiBHbie клетки в образцах КМ по своим морфологическим характеристикам могут быть отнесены к мононуклеарными клетками. О месте синтеза изучаемых белков можно судить по локализации флюоресцирующих меток, которые располагались как в ядре, так и в цитоплазме мононуклеарных клеток КМ.

На ранней стадии РА значения АИ клеток КМ, содержащих антиапоптотический белок Mdm2, превышали значения АИ клеток, содержащих проапоптотические белки (р53, р21 и PUMA) (Таблица 1, Диаграмма 1). Данный факт позволяет утверждать о превалировании активности антиапоптотического белка Mdm2 над активностью проапоптотических белков р53, р21 и PUMA на ранней стадии РА.

Таблица 1. Количественная характеристика p53-, p21-, PUMA- и Mdm2-иммунопозитивных клеток красного костного мозга на ранней и поздней стадиях РА

Малые молекулы Ранняя стадия РА (АИ) (п=30) Поздняя стадия РА (АИ' (п=30) Группа контроля (АИ) (п=30)

Р53 30,5* (±1,9) 52,9* (±4,4) 8,4 (±0,5)

PUMA 29,6* (±1,8) 39,3* (±3,9) 5,6 (±0,4)

Р21 41,8* (±2,1) 54,7* (±3,4) 4,6 (±0,4)

Mdm2 56,7* (±4,2) 43,8* (±2,6) 3,9 (±0,3)

Примечание: *-достоверность различия с группой контроля (р<0,1). Диаграмма 1. Динамика активности p53-, p21-, PUMA- и Mdm2-иммунопозитивных клеток красного костного мозга на ранней и поздней стадиях РА

Примечание: *- достоверность различия с группой контроля (р<0,1).

Из спектра изучаемых проапоптотических молекул в клетках КМ на ранней стадии РА наибольший АИ отмечен у клеток с экспрессией молекулы р21 (Таблица 1, Диаграмма 1). Значения АИ «главной» проапоптотической молекулы р53 занимают промежуточное положение, при сравнении со значениями АИ молекул Р21 и PUMA (Таблица 1, Диаграмма 1). Абсолютные значения АИ молекулы PUMA, при сравнении с АИ молекул р53 и р21, наименьшие (Таблица 1, Диаграмма 1). Данный факт позволяет предполагать угнетение митохондриального пути апоптоза, или PUMA- опосредованного пути, на ранней стадии РА в клетках КМ, в наибольшей степени, при сравнении с р53 и р21-опосредованными путями апоптоза.

Прямо противоположная тенденция наблюдается при оценке уровня экспрессии белков маркеров апоптоза на поздней стадии РА в клетках КМ.

На поздней стадии РА активность проапоптотических белков маркеров апоптоза выше, чем на ранней (Таблица 1, Диаграмма 1). Активируются не только р53- и PUMA- опосредованные механизмы апоптоза, но и механизмы старения клетки (р21- зависимые).

Об угнетении антиапоптотических механизмов на поздней стадии РА можно судить по снижению уровня экспрессии антиапоптотического белка Mdm2, при сравнении с ранней стадией. АИ клеток, экспрессирующих белок Mdm2 на поздней стадии в 1,3 раза ниже такового на ранней стадии РА (Таблица 1, Диаграмма 1).

Из всех изученных в настоящем исследовании проапоптотических белков на поздней стадии РА, при сравнении с ранней, в наибольшей степени активируется белок р53. АИ клеток, содержащих белок р53, на поздней стадии превышает аналогичный на ранней стадии в 1,7 раза (Таблица 1, Диаграмма 1). Интенсивность экспрессии белка PUMA как на поздней, так и на ранней стадии РА максимально снижена, при сравнении с экспрессией молекул р53 и р21, что позволяет утверждать о выраженном угнетении PUMA- опосредованного или митохондриального пути апоптоза клеток КМ на поздней и ранней стадиях РА (Таблица 1, Диаграмма 1).

Таким образом, полученные нами данные не только подтверждают известный факт выраженного снижения активности апоптоза на ранней стадии РА [Дубиков А.И., 2004], но и позволяют утверждать, что угнетение «главного» пути апоптоза -р53- опосредованного, вызванное предположительно мутацией белка р53, приводит к тотальному угнетению основных механизмов апоптоза, реализуемых белками р21 и PUMA. Вероятно, такая выраженная инактивация белка р53 не может повлиять на активность молекулы Mdm2, реализующей антиапоптотические эффекты в полной мере.

В синовиальной оболочке апоптоз развивается в различных тканевых элементах. На ранней стадии РА чаще выявляются синовиоциты А- и В-подтипов. Синовиоциты А- типа соответствуют моноцитарным фагоцитам, синовиоциты подтипа В имеют морфологию фибробластических элементов. На поздней стадии РА морфологический профиль смещается в сторону фибробластов стромального слоя гипертрофированной синовиальной оболочки [Дубиков А.И., 2004].

Результаты оценки АИ про- и антиапоптотических молекул в клетках СО на ранней и поздней стадиях РА имеют однонаправленные тенденции с показателями АИ этих же молекул в клетках КМ. На ранней стадии отмечается преобладание активности антиапоптотической молекулы Mdm2 (Таблица 2, Диаграмма 2). На поздней стадии РА регистрируются высокие показатели АИ проапоптотических молекул (Таблица 2, Диаграмма 2). О месте синтеза белков р53, р21, PUMA и Mdm2 можно судить по локализации флюоресцирующих меток белков маркеров апоптоза (р53, р21, PUMA и Mdm2), которые были выявлены в цитоплазме и ядрах синовиоцитов.

Таблица 2. Количественная характеристика p53-, p21-, PUMA- и Mdm2-иммунопозитивных клеток синовиальной оболочки на ранней и поздней стадиях

РА

Малые молекулы Ранняя стадия РА (API) (п=15) Поздняя стадия РА (АИ) (п=15) Группа контроля (АИ) (п=10)

Р53 43,9* (±2,8) 69,3* (±2,8) 9,4 (±0,6)

продолжение таблицы 2

PUMA 89,5*(±2,0) 96,7* (±0,6) 4,8 (±0,7)

Р21 70,1 *(±3,5) 75,2* (±2,1) 5,3 (±0,7)

Mdm2 85,4* (±2,6) 24,5* (±1,7) 3,1 (±0,5)

Примечание: *- достоверность различия с группой контроля (р<0,1). Диаграмма 2. Динамика активности p53-, p21-, PUMA- и Mdm2-иммунопозитивных клеток синовиальной оболочки на ранней и поздней стадиях РА

Примечание: *- достоверность различия с группой контроля (р<0,1). Результаты, полученные нами, подтверждают известный факт об угнетении механизмов апоптоза на ранней стадии и активации на поздней стадии РА. Причем, эта особенность прослеживается в клетках не только СО, но и красного КМ.

Мы попытались в своей работе расшифровать более детально механизмы угнетения апоптоза, что позволит получить новые молекулярные диагностические

и прогностические маркеры, а также обозначить перспективные терапевтические мишени.

АИ клеток, содержащих проапоптотические белки (р53, PUMA, р21) в клетках красного КМ и в клетках СО на ранней стадии РА меньше АИ клеток, содержащих антиапоптотический белок Mdm2, что свидетельствует о тотальном

угнетении механизмов апоптоза на ранней стадии РА как в клетках красного КМ, так и в клетках СО.

На поздней стадии РА в клетках красного КМ и СО, наоборот, АИ клеток, содержащих проапоптотические молекулы (р53, PUMA, р21), по своим значениям превышает АИ, клеток, содержащих антиапоптотическую молекулу Mdm2, иллюстрируя активацию механизмов апоптоза в клетках красного КМ и СО на поздней стадии заболевания.

Количество М0т2-позитивных клеток в образцах КМ и СО на разных стадиях РА (Таблица 1, Таблица 2, Диаграмма 1, Диаграмма 2) достоверно не различалось, что свидетельствует о равномерной и выраженной супрессии апоптоза с самой ранней стадии РА и говорит о системном характере этого явления. Не исключено, что этот механизм деактивации апоптоза является основным при РА.

Такое одновременное и однонаправленное изменение механизмов гибели клеток в красном КМ и СО свидетельствует о системном характере нарушения механизмов апоптоза при РА и позволяет рассматривать апоптоз клеток красного КМ своеобразным коррелятом апоптоза клеток СО. Параллельное угнетение апоптоза двух гетерогенных по клеточному составу тканей сопровождается более выраженным угнетением апоптоза клеток СО и в меньшей степени клеток КМ. Выявленная тенденция даёт основания оценивать степень угнетения про- и антиапоптотических молекул, а соответственно и состояние апоптоза, в клетках СО у больных РА по уровню экспрессии про- и антиапоптотических белков в клетках КМ. Возможность использовать данные о степени активности апоптоза клеток красного КМ независимо от стадии РА как маркер активности апоптоза клеток СО позволяет оценить изменения в клетках СО практически у каждого пациента с РА на любой стадии заболевания без внедрения в полость сустава.

Полученные нами результаты позволяют предполагать, что на ранней стадии РА происходит мутация белка р53, ведущая к тотальному угнетению основных механизмов апоптоза, реализуемых белками PUMA, р21, но не влияющая на активность молекулы Mdm2, которая на таком фоне в полной мере реализует антиапоптотические эффекты.

Таким образом, складывается впечатление, что молекулу Mdm2 можно рассматривать в качестве перспективной мишени для разработки новых лекарственных препаратов, с целью повышения интенсивности программированной клеточной смерти синовиальных клеток на ранней стадии РА. Перспектива регуляции активности белка р53 в случае его мутации -невысока.

Сравнивая уровень экспрессии в клетках красного КМ проапоптотических молекул между собой (р53, PUMA, р21), можно отметить, что наименьший уровень экспрессии наблюдается у белка PUMA на ранней и поздней стадиях РА (Таблица 1, Диаграмма 1). Кроме того, количество PUMA- позитивных клеток в красном КМ на поздней стадии не превышает количества Mdm2- позитивных клеток. Таким образом, наблюдается угнетение PUMA- опосредованного пути апоптоза как на ранней, так и на поздней стадии РА в клетках красного КМ.

Противоположная тенденция наблюдается в клетках СО, независимо от стадии РА: уровень экспрессии белка PUMA имел максимальный уровень среди всех изучаемых молекул, в том числе и Mdm2 на ранней стадии артрита (Таблица 2, Диаграмма 2).

Резюмируя вышесказанное, можно утверждать о тотальном угнетении митохондриального или PUMA- опосредованного пути апоптоза в клетках красного КМ в сочетании с максимальным уровнем экспрессии белка PUMA в клетках СО, независимо от стадии РА. По нашему мнению, весьма интенсивное присутствие молекул белка PUMA на ранней стадии РА в синовиоцитах не исключает, что митохондриальный путь апоптоза пролиферирующих клеток синовиальной оболочки является основным при РА.

В задачи нашего исследования входила не только оценка состояния экспрессии про- и антнапоптотических молекул в клетках красного КМ и СО, но и установление соотношения между экспрессией про- и антнапоптотических молекул в зависимости от стадии, активности РА и структурных изменений опорно-двигательного аппарата. Для этого нами была оценена сила и достоверность корреляционной связи между молекулами р53, р21, PUMA, Mdm2

и степенью активности артрита, структурными изменениями суставов, иммунологическими маркерами РА на ранней и поздней стадиях РА.

Боль в суставах не только ограничивает объем движений у больных с РА, но и резко снижает качество жизни больных. Индекс HAQ считается наиболее удачным инструментом для оценки качества жизни и определения эффективности терапии при проведении рандомизированных клинических исследований при РА [Амирджанова В.Н., 2009]. Обнаружение сильной положительной корреляционной связи между индексом HAQ, находящимся в диапазоне средних значений (1,0-1,9), и молекулой PUMA, экспрессируемой в клетках красного КМ, (+0,73, t=l,4) на ранней стадии РА, может служить прогностическим индексом снижения качества жизни у больных с ранней стадией РА.

Несмотря на тотальное угнетение апоптоза на ранней стадии РА, сильные корреляционные связи отмечены между проапоптотическими молекулами и индексом активности РА DAS28. Так, выявлена положительная связь между молекулами р53 (+0,85, t=3,5), PUMA (+0,76, t=2,3) с одной стороны и индексом активности РА DAS28, находящимся в диапазоне, соответствующему высокой степени активности РА (DAS28 >5,1), с другой. Последнее обстоятельство указывает на практическую значимость определения уровня экспрессии белков Р53 и PUMA у больных с ранней стадией РА.

Достоверная связь между молекулой PUMA и индексом активности РА DAS28, индексом оценки качества жизни HAQ как на ранней (+0,73), так и на поздней (+0,91) стадиях РА иллюстрирует отмеченную выше патофизиологическую роль самой молекулы. В этой связи трудно переоценить прикладную значимость исследования уровня экспрессии белка PUMA, как биологического маркера прогрессирования РА.

Сильная корреляционная связь между ранними структурными изменениями в суставах и проапоптотическими молекулами р53 (+0,83, t=2,9) и PUMA (+0,94, t=5,5) указывает на прямую связь между количеством клеток, экспрессирующих данные белки, и рентгенологическим прогрессированием РА. Таким образом, молекулы р53 и PUMA могут рассматриваться в качестве маркеров возможного

прогрессирования структурных изменений в суставах у больных РА уже на ранних стадиях заболевания.

Активизация экспрессии главного проапоптотического белка р53 на поздней стадии РА сопровождается прямой связью количества последней с неэрозивным вариантом РА (+0,8, t=3,6). Эрозивный вариант РА на поздней стадии коррелировал с количеством антиапоптотической молекулы Mdm2 (+0,7, t=2,9). Неэрозивную форму РА считают более благоприятным вариантом течения артрита. Установлено, что предотвращение структурных повреждений в дебюте РА способствует сохранению функциональной активности пациентов в долговременной перспективе [Arend Р., 2012]. В связи с этим, определение уровня экспрессии молекулы р53 на ранних стадиях РА с целью оценки перспективы развития эрозивных повреждений суставов было бы весьма полезным.

Антитела к ССР не только являются диагностическим маркером, но и имеют большое значение в развитии РА. Серопозитивный по антителам к ССР РА составляет 70-80% всех случаев РА. Эти антитела обнаруживают на самых ранних стадиях и даже до клинической манифестации заболевания. Появление антител связывают с более активным течением заболевания и более выраженной деструкцией суставов [Ревматология: национальное руководство, 2008]. Наличие достоверной положительной связи между серонегативным по антителам к ССР вариантом РА и молекулой PUMA позволяет рассуждать о возможном влиянии PUMA-опосредованного пути апоптоза на процесс цитруллинирования. Чем больше клеток экспрессирует белок PUMA, тем ниже активность цитруллинирования белков у пациентов с поздней стадией РА.

Таким образом, основываясь на достоверных корреляционных связях между малыми молекулами и индексами активности РА и структурных изменений в суставах, выявленных в ходе нашего исследования, молекулы р53, PUMA и Mdm2 можно рассматривать в качестве полезных индексов, дающих дополнительную информацию о характере течения и прогнозе при РА (Таблица 3).

Таблица 3. Показатели достоверных корреляционных связей между показателями распределения p53-, p21-, PUMA- и \Мт2-иммунореактивных

клеток костного мозга и синовиальной оболочки и индексами активности РА и

структурных изменений в суставах на ранней и поздней стадиях РА

Ранняя стадия Поздняя стадия

Р53 PUMA P21 Mdm2 P53 PUNÍA P21 Mdm2

Эрозивный вариант 0,7 t =2,86

Неэрозивный вариант 0,83 t=3,6

DAS28 3.25.1 0,74 t=3,08

DAS28 >5.1 0,85 t= 3,5 0,76 t=2,3 0,76 t=2,16

HAQ 1.01.9 0,73 t=2,09 0,91 t=4,55

Антитела к ССР отрицательные 0,82 t=l,44

Рентгенологическая стадия I 0,825 t=2,9 0,94 t=5,5

Примечание: t 99%- достоверность коэффициента корреляции.

Таким образом, исследование апоптоза клеток костного мозга и синовиальной оболочки у больных РА показало системный характер этого феномена при РА и доказало его значимую роль в патофизиологии РА на всех стадиях заболевания.

Выводы:

1. Патофизиологическая роль апоптоза клеток костного мозга и синовиальной оболочки на ранних и поздних стадиях ревматоидного артрита доказана результатами иммуноморфологических исследований образцов красного костного мозга и синовиальной оболочки больных РА.

2. Интенсивность апоптоза клеток костного мозга и синовиальной оболочки у больных РА имеет системный однонаправленный характер и зависит от

длительности заболевания и баланса анти- (Mdm2) и проапоптотических (Р53, PUMA, Р21) молекул.

3. Низкий уровень апоптоза клеток костного мозга и синовиальной оболочки на ранней стадии РА обусловлен гиперэкспрессией Mdm2 и низким уровнем экспрессии Р53. Максимальный уровень апоптоза клеток костного мозга и синовиальной оболочки характерен для поздней стадии РА и связан с гиперэкспрессией Р53, PUMA и Р21 молекул и низким уровнем экспрессии Mdm2 молекулы.

4. Количество клеток, содержащих белок PUMA, достоверно коррелирует с индексом активности РА DAS28 (г = 0,76 на ранней стадии РА и г = 0,74 на поздней стадии РА), индексом оценки качества жизни HAQ (г = 0,73 на ранней стадии РА и г = 0,91 на поздней стадии РА) и может служить показателем высокой активности процесса и низкого качества жизни.

5. Уровень белков PUMA и р53 в клетках костного мозга и синовиальной оболочки имеет достоверные корреляции с рентгенологической стадией процесса (г = 0,83 и г = 0,94 соответственно) и может быть использован в создании прогностических моделей структурных изменений костной ткани при РА.

Практические рекомендации:

1. Определение степени экспрессии PUMA и Р53 белков у больных на ранней и поздней стадиях РА в костном мозге рекомендуется использовать в оценке степени активности, возможной прогрессии структурных изменений костной ткани и снижения качества жизни. За границы нормы при определении АИ в синовиальной оболочке и костном мозге следует считать превышение АИ более 10%±0,73 и более 10%±0,84 соответственно.

2. Определение динамики экспрессии молекул Р53, Р21, PUMA и Mdm2 на ранних и поздних стадиях РА, может служить дополнительным обоснованием к назначению препаратов антицитокиновой и таргетной терапии РА.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кондратовский, П. М. Нарушения в системе белка р53 и их влияние на патогенез хронических лимфопролиферативных заболеваний / П. М. Кондратовский, А. И. Дубиков, А. Ю. Дорошевская // Онкогематология. -

2011.-№3.-С. 65-75.

2. Дорошевская, А. Ю. Малые молекулы (р53, PUMA, Mdm2, р21) -ключевые участники патогенеза ревматоидного артрита / А. Ю. Дорошевская, П. М. Кондратовский, А. И. Дубиков // Клиническая медицина.-2012.-№6.-С. 12-18.

3. Дорошевская, А. Ю. Белки регуляторы апоптоза- основа разработки инновационных стратегий лечения ревматоидного артрита / А. Ю. Дорошевская, П. М. Кондратовский, А. И. Дубиков // Материалы VII Национального конгресса терапевтов. — 2012. — С. 70.

4. Кондратовский, П. М. Прогностическая значимость молекул семейства р53 в лечении хронических лимфопролиферативных заболеваний / П. М. Кондратовский, А.И. Дубиков, А. Ю. Дорошевская // Человек и лекарство: материалы IX Дальневосточного медицинского конгресса. -

2012.-С. 36-37.

5. Белки регуляторы апоптоза- основа разработки инновационных стратегий лечения ревматоидного артрита (РА) / А. Ю. Дорошевская, П. М. Кондратовский, А. И. Дубиков [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2013. — Т. 156, № 9. — С. 355 — 358.

6. Белок PUMA в паттерне регуляторных молекул р53 определяет прогноз больных с лимфопролиферативными заболеваниями / А. Ю. Дорошевская, П. М. Кондратовский, А. И. Дубиков [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013. - Т. ! 56, № 12. - С. 820 -824.

7. Пат. RU, 2524616 С1, МПК G01N 33/53 (2006/01). Способ диагностики ранней стадии ревматоидного артрита / Дорошевская А. Ю.. Дубиков А. И.,

Кондратовский П. М. ; заявитель и патентообладатель Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Владивостокский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГОУ ВПО ВГМУ Минздрава России) (RU). - № 2013102634/15. ; заявл. 21.01.2013 ; опубл. 27.07.2014, Бюл. «Изобретения. Полезные модели» № 21.- 11 с.

8. Apoptosis regulator proteins: basis for the development of innovation strategies for the treatment of rheumatoid arthritis in patients of different age / Doroshevskaya A. Y., Kondratovskii P. M., Dubikov A. I. [et al.] // Bull. Exp. Biol. Med. - 2014. - Vol. 156, № 3. - P. 377 - 380.

9. PUMA protein in p53 regulatory molecule pattern determines the prognosis for patients with lymphoproliferative diseases / Kondratovskii P. M., Dubikov A. I., Doroshevskaya A. Y. [et al.] // Bull. Exp. Biol. Med. - 2014. - Vol. 156, № 6. -P. 849-853.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

DAS 28 (Disease Activity Score 28)- индекс активности болезни HAQ- Health Assessment Questionnaire (анкета оценки здоровья) RF Ig М- ревматоидный фактор класса иммуноглобулин М АИ- апоптотический индекс

Антитела к ССР- антитела к циклическому цитруллннированному пептиду

КМ- костный мозг

OA- остеоартроз

РА- ревматоидный артрит

РЗ-ревматические заболевания

СО- синовиальная оболочка

ФН- функциональная недостаточность

ДОРОШЕВСКАЯ АННА ЮЛЬЕВНА

ФЕНОМЕН АПОПТОЗА КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА И СИНОВИАЛЬНОЙ ОБОЛОЧКИ В ПАТОФИЗИОЛОГИИ РЕВМАТОИДНОГО

АРТРИТА

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 19 января 2015 года. Формат 60x84/21. Бумага писчая. Уч.- изд. л. 1,0. Тираж 110 экз. Заказ Отпечатано в типографии «Первая Чукотская Типография» 690021 г. Владивосток, ул. Запорожская, 87а.

Владивосток - 2015