Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Роль иммунофенотипирования рака молочной железы в процессе неоадъювантной химиотерапии

На правах рукописи

0034Б535Э

СУББОТИНА АННА АЛЕКСАНДРОВНА

Роль иммунофенотипирования рака молочной железы в процессе неоадьювантной химиотерапии.

14.00.14 - онкология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

...... -с*?

Москва 2009

003465359

Работа выполнена на кафедре онкологии лечебного факультета Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова, на базе хирургического отделения опухолей молочных желез, лаборатории иммунологии гемопоэза НИИ КО ГУ Российского Онкологического Научного Центра им. H.H. Блохина РАМН

Научные руководители: доктор медицинских наук,

профессор И.В. Высоцкая

доктор медицинских наук, профессор Н.Н.Тупицын

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор К.Л. Чимишкян

доктор медицинских наук, профессор В.Ю. Сельчук

Ведущее учреждение: ГОУ ДПО Российская Медицинская Академия последипломного образования

Защита диссертации состоится 2009 года в часов на

заседании диссертационного совета (Д.001.017.02) ГУ Российского Онкологического Научного Центра им. H.H. Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Российского Онкологического Научного Центра им. H.H. Блохина РАМН.

Автореферат разослан «-^^¿^>/^2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор /,, ' Л Ю.А.Барсуков

Общая характеристика работы.

Актуальность темы В структуре онкологической заболеваемости женщин рак молочной железы занимает первое место, его удельный вес составляет 19,8% (М.И. Давыдов, Е.М. Аксель, 2005). Несмотря на определенные успехи в диагностике и лечении, темпы прироста заболеваемости раком молочной железы неуклонно растут, причем значительную долю составляют местно-распространенные формы заболевания (М.И. Давыдов, В.П. Летягин, 2006). Комплексная терапия данной категории пациенток является сложной задачей. Вот почему проблема прогнозирования исхода болезни и выбора адекватных схем индукционного лечения, является первостепенной в клинической практике.

Общеизвестно, что опухоли, имеющие одинаковую стадию по классификации ТЫМ, зачастую радикально отличаются по агрессивности течения заболевания и чувствительности к проводимой терапии. Это объясняется индивидуальными биологическими особенностями злокачественных клеток (Уегопеэ! и. ег а1., 1995).

За последние годы существенно расширились представления об особенностях биологии рака молочной железы, идентифицирован ряд характерных генетических изменений. Исследуются биологические показатели, которые могут иметь прогностическое значение. Изучаются возможные маркеры лекарственной чувствительности и резистентности. Они ведутся по двум основным направлениям: изучение иммунофенотипа опухоли и изучение противоопухолевого иммунитета (Н.Н.Тупицын и соав, 2007; Артамонова Е.В., 2005; Огнерубов Н.А., 1992; Кампова-Полевая Е.Б., Огнерубов Н.А., 1994; Доросевич А.Е. и соавт., 1994). Иммунологические исследования в последние годы стали одним из приоритетных направлений в структуре научных изысканий. Впервые высокую информативность и значимость иммунофенотипирования опухолей продемонстрировано при гемобластозах.

При изучении этой патологии построена схема иммунологической дифференцировки гемопоэтических клеток, и определено прогностическое значение проведения иммунофенотипирования. (Н.Н.Тупицын, 2007).

Для солидных опухолей вообще и для рака молочной железы, в частности, система знаний об изменении иммунофенотипа эпителиальных клеток по мере их дифференцировки - предмет активного изучения. Исследования в этом направлении стали широко применяться с внедрением в клиническую практику использования моноклональных антител как к лейкоцитарным молекулам, так и к антигенам и рецепторам специфичным для эпителиальных клеток (Якубовская Р.И., Коростелева М.Д., 1988; Тупицын Н.Н. и соавт., 1990; Артамонова Е.В., 1992; Доросевич А.Е. и соавт. 1994; Барышников А.Ю., Тоневицкий А.Г., 1997; Манько В.М., 1990).

Длительное время шло накопление материала, и лишь в настоящее время стали появляться данные о клинической значимости того или иного маркера.

Этой актуальной задаче посвящено настоящее исследование. Нам представлялось небезынтересным не просто оценить значимость иммунофенотипических показателей, но изучить те специфические изменения, которые, возможно, происходят с ними в процессе специфического лечения.

Цель исследования

Оценить значение иммунофенотипа опухоли и динамику его изменений в процессе неоадъювантной терапии у больных местно-распространенным раком молочной железы.

Задачи исследования

1. Оценить иммунофенотипические характеристики рака молочной железы в процессе неоадъювантной химиотерапии, их ассоциации с клинико-рентгенологическим эффектом лечения.

2. Выявить взаимосвязь иммунофенотипа с выраженностью лекарственного патоморфоза в опухолевой ткани.

3. Изучить динамику инфильтрации рака молочной железы субпопуляциями лимфоцитов в процессе индукционной терапии.

4. Определить взаимосвязь между уровнями иммуиокомпетентных клеток в опухоли и эффективностью проводимого лечения.

Научная новизна

Впервые проведено сопоставление результатов неоадъювантной химиотерапии рака молочной железы у пациенток с различными иммунофенотипическими особенностями первичной опухоли. Оценена взаимосвязь между уровнями лимфоидной инфильтрации опухоли и эффективностью проводимого лечения. Изучена динамика интратуморальнйй лимфоидной инфильтрации в процессе неоадъювантного лечения и взаимосвязь иммунофенотипа рака молочной железы с выраженностью лекарственного патоморфоза в опухолях.

Выявлена четкая взаимосвязь между иммунофенотипическими особенностями рака молочной железы и эффективностью неоадъювантной химиотерапии. Установлено, что полихимиотерапия в режиме САБ селективно элиминирует С095-позитивные клетки, что позволяет добиться большей степени выраженности патоморфоза в СБ95-позитивной группе больных. Это свидетельствует о большей эффективности лечения антрациклин-содержащими комбинациями. Данный факт, впервые установленный в нашем исследовании, позволяет корректировать индукционное лечение с учетом иммунологического фенотипа клеток рака молочной железы.

В работе продемонстрирована зависимость эффекта химиотерапии (регрессия опухоли) от иммунофенотипических особенностей рака молочной железы. Установлена высокая информативность экспрессии общей Р-цепи интегринов С029 и рецептора апоптоза РА8/АРО-1 (СБ95) на опухолевых клетках.

Определена достоверная взаимосвязь между уровнями инфильтрации ткани рака молочной железы различными субпопуляциями лимфоцитов до назначения неоадъювантной химиотерапии и степенью выраженности патоморфоза удаленной опухоли. Выраженность патоморфоза коррелировала от уровней лимфоцитарной инфильтрации опухоли. Достоверная связь с эффективностью химиотерапии имела место в случаях наличия в опухолевой ткани активированных Т-лимфоцитов (СБ25+). Обнаружение этих клеток при исследовании опухолевой ткани до начала химиотерапии ассоциировалось с большей выраженностью лекарственного патоморфоза в удаленной опухоли. Активированные лимфоциты играли роль в выраженности патоморфоза только в случаях проведения антрациклин-содержащими схемами.

Таким образом, проведенная нами работа позволила на основе применения ряда новых антител и индивидуализированных подходов к учету результатов иммуногистохимических реакций установить значение иммунофенотипа при местно-распространенном раке молочной железы.

Практическая значимость Полученные в настоящем исследовании результаты имеют большое практическое значение, поскольку позволяют в определенной степени предсказать ответ на различное неоадъювантное лечение больных местно-распространенным раком молочной железы на основе изменения иммунофенотипа опухолевых клеток. Это позволяет выбирать наиболее эффективный вариант предоперационного лекарственного лечения.

Такие показатели, как С025, СОТ, СБ29, СБ95, могут быть рекомендованы в качестве специфических маркеров, пригодных для мониторинга эффективности противоопухолевого лечения.

Апробация работы состоялась 17 декабря 2008 года на совместной научной конференции с участием кафедры онкологии ММА им. И.М. Сеченова, хирургического отделения опухолей молочных желез, лаборатории иммунологии гемопоэза, хирургического отделения опухолей женской

репродуктивной системы, хирургического отделения диагностики опухолей, хирургического отделения реконструктивной и сосудистой хирургии, отдела патологической анатомии опухолей человека, отделения радиохирургии ГУ Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН, кафедры онкологии Российского Государственного Медицинского Университета.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 4 печатных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 172 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Иллюстрирована 70 таблицами и 9 рисунками. Указатель литературы содержит 154 источника, из которых 44 отечественных и 110 зарубежных.

Материалы и методы Общая характеристика больных и методов исследования

Материалом для настоящей работы послужили результаты 62 исследований опухолевого иммунофенотипа у 31 больной, местно-распространенным раком молочной железы. Все пациентки наблюдались и получали лечение в клиниках ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН в 2004-2005 гг.

Возраст женщин находился в пределах от 27 до 72 лет, средний возраст составил 49,3. Из них у 14 больных (45,2%) менструальная функция была сохранена, 2 пациенток (6,4%) находились в состоянии перименопаузы и 15 больных - в постменопаузе (48,4%).

Стандартный объем предоперационного обследования у больных раком молочной железы включал маммографию обеих молочных желез в двух проекциях, ультразвуковое исследование подмышечных, надключичных и

подключичных лимфатических узлов, органов малого таза и печени, рентгенографию органов грудной клетки, сканирование костей скелета. По данным предоперационного исследования отдаленных метастатических изменений у пациенток, включенных в исследование, выявлено не было.

У всех больных клинический диагноз рака молочной железы был подтвержден данными гистологического исследования опухоли, которое проводилось дважды - на материале кор-биопсии до неоадъювантной химиотерапии и на материале хирургически удаленной опухоли. Наибольшее количество наблюдений относилось к Illb стадии (70,9%), на 2-м месте по частоте были больные со 116 стадией (16,1%), а наименьшее число составляли пациентки с Illa стадией (13,0%) опухолевого процесса (табл. 1).

Таблица 1.

Распределение больных РМЖ по стадиям TNM.

Стадия Количество больных Частота

абс. %

116 стадия: (T2N1M0) 5 16,1%

Illa стадия: (T3N1M0) 4 13,0%

IHb стадия:

T4N0M0 3 9,7%

T4N1M0 10 32,2%

T4N2M0 9 29,0%

Всего 31 100%

До проведения настоящей работы никакого специфического лечения больным не проводили.

При гистологическом исследовании получено, что наиболее часто встречался инфильтративный протоковый рак - 23 наблюдения (74,2%). Обращает на себя внимание достаточно высокая пропорция инфильтративного

долькового рака - 7 случаев (22,6%). И лишь в 1 клиническом случае (3,2%) отмечена слизистая форма новообразования. Результаты морфологического исследования представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Распределение больных раком молочной железы в зависимости от

гистологической формы опухоли.

Гистологический тип опухоли Количество больных абс. Частота %

Инфильтративный протоковый рак 23 74,2%

Инфильтративный дольковый рак 7 22,6%

Слизистый рак 1 3,2%

По характеру неоадъювантной терапии больные были разделены на 2 группы: первая группа (16 пациенток) получила 2 курса полихимиотерапии по схеме САБ, вторая группа (15 пациенток) - полихимиотерапию по схеме СМБ УР.

Через 2,5-3 недели после окончания химиотерапии у всех пациенток по клиническим и рентгенологическим данным оценена степень регрессии опухоли. Полного эффекта, а также прогрессирования заболевания за время наблюдения отмечено не было. У всех пациенток наблюдался частичный эффект с различной степенью регрессии опухоли. У 71% больных зарегистрирован умеренно-выраженный эффект, в остальных случаях изменения трактовались как минимальный клинический эффект. Данные представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Клннико-рентгенологнческнй эффект в процессе неоадъювантной терапии у больных РМЖ. (вне зависимости от примененной схемы)

Вариант регрессии Количество больных

Абс. %

Выраженный (>50%) 8 25,8

Умеренный (>25%) 14 45,2

Минимальный (<25%) 9 29,0

Итого: 31 100

Выраженность лечебного патоморфоза оценивали по гистологическим данным после оперативного этапа: в 14 клинических случаях (50,0%) — выявлены признаки II степени, у 10 (35,7%) больных степень дегенеративных изменений соответствовала I степени и лишь в 3-х клинических случаях (10,7%) удалось достигнуть выраженной (III степени) лечебного патоморфоза (рис.1).

О I степень ^ II степень Р Ш степень без признаков

Рис.1. Распределение больных РМЖ в зависимости от выраженности лечебного патоморфоза.

Рецепторный статус опухоли определен у всех больных. У большинства пациенток опухоли не содержали рецепторов эстрогенов и прогестерона (РЭ-РП-) (45,2%). В 22,6% клинических случаев обнаружены оба вида рецепторов (РЭ+РП+). Отрицательный рецепторный статус по рецепторам эстрогенов и положительный по рецептору прогестерона (РЭ-РП+) - в 12,9% наблюдений. Опухоль, положительная по рецепторам эстрогенов и отрицательная по прогестерону обнаружена у 19,6% больных. Данные представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Рецепторный статус опухолей у больных раком молочной железы.

РЭ+РП+ РЭ+РП- РЭ-РП+ РЭ-РП-

абс. % абс. % абс. % абс. %

7 22,6 6 19,3 4 12,9 14 45,2

Иммунологическое исследование проводилось на криостатных срезах 31 опухолей молочных желез, полученных в ходе оперативного вмешательства и трепанобиопсии.

Основными реактивами, с помощью которых выполнялось исследование, являются отечественные и зарубежные моноклональные антитела (МКА). Специфичность использованных в работе МКА представлены в таблице 5.

Таблица 5. Специфичность использованных МКА

№ Кластер дифференцировки Название МКА

I. Антигены опухолевых клеток

1 Панцитокератины КЬ-1

2 С029(УЬА-Р1) К-20

3 СБ95 (РА8/АРО-1) 1СО-160

4 мис-1 1СО-25

5 Сй71 (рецептор трансферрина) 1СО-95

6 НЪА-1 1СО-53

7 НЬА-П (НЬЛ-БЯ) 1СО-1

8 СБ54 Му-13

II. Лейкоцитарные антигены

9 СШ5 (лейкоциты) 1СО-58

10 СВ7 (Т-клетки) 1СО-87

11 С020 (В-клетки) Ь26

12 СБ25 (активированные Т-лимфоциты) 1СО-Ш5

Иммуногистохимическое обнаружение экспрессии антигенов на опухолевых и иммунокомпетентных клетках с помощью МКА.

Непрямая реакция поверхностной иммунофлуоресценции (РИФ) на криостатных срезах.

Замороженные срезы (толщина 4-6 мкм) помещали по три среза на поверхность обезжиренных предметных стекол. Срезы фиксировали в ацетоне при комнатной температуре в течение 4 секунд. Перед окраской антителами срезы фиксировали в течение 10 минут в ацетоне при 4 С. Последующие этапы реакции проводили при комнатной температуре во влажной камере. Инкубировали срезы 10 минут в среде 199 рН 7,2-7,4. Антитела наносили на 30 минут. Отмывали в среде 199 10 минут. Наносили ФИТЦ-меченные Р(аЬ)2 -фрагменты антисыворотки против глобулинов белой мыши на 30 минут. Отмывали в среде 199 10 минут. Клетки консервировали 50% глицерином на физиологическом растворе. Срезы накрывали покровным стеклом, и характеризовали антигенположительные клетки и структуры. Специфические реакции учитывали на микроскопе Ахюр1ап-2 (Германия).

Прямая реакция иммунофлуоресценции на криостатных срезах.

Срезы опухолей молочных желез фиксировали в ацетоне, как описано выше. Отмывали в среде 199 10 минут. Затем наносили ФИТЦ- меченные антисыворотки или моноклональные антитела и инкубировали 30 минут. Отмывали в среде 199 10 минут. Клетки консервировали 50% глицерином на физиологическом растворе и учитывали специфическое свечение на люминисцентном микроскопе.

При иммунофенотипировании опухолевых клеток результаты реакций учитывали полуколичественным методом, предложенным НаттегНгщ й а1. (1987). Выделяли 3 типа взаимодействия антител с опухолевыми клетками:

Отрицательная реакция (-): менее 10% антигенположительных опухолевых клеток.

Мозаичная реакция (+/-): антиген присутствовал на части (от 10% до 80%) опухолевых клеток.

Мономорфная реакция (+): антиген экспрессируется большинством (более 80%) опухолевых клеток.

При иммунофенотипировании иммунокомпетентных клеток в гистологических срезах опухоли выделяли 3 типа иммунных реакций, каждую из которых условно оценивали в баллах:

Отрицательная реакция (антигенположительные клетки не определяются или определяются небольшое их количество в препарате) -0 баллов

Умеренный тип реакции (умеренное количество антигенположительных клеток, расположенных разрозненно или мелкими группами) -1 балл

Выраженный тип иммунной реакции (множество антигенположительных клеток в срезе, могут встречаться крупные группы и инфильтрата из этих клеток) - 2 балла.

Статистическая обработка результатов исследования.

Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием программы SPSS: корреляционный анализ, сравнение средних, анализ по таблицам сопряженности признаков с применением критерия х-квадрат (Аптон Г., 1982).

Результаты исследования и обсуждение.

У всех больных был изучен иммунофенотип опухолевых клеток до и после проведения неоадъювантной химиотерапии как в целом по группе, так и в зависимости от примененной схемы (CAF и CMF VP). Оценена экспрессия клетками опухоли панцитокератинов (в 100% случаев мономорфный

положительная реакция), молекул интегринов (СЕ>29), трансферринового рецептора (С071), молекул НЬА-1 и II классов, СЭ 95 (рецептор, опосредующий апоптоз), антигенов М11С-1 и СБ 54 (1САМ-1, молекула межклеточной адгезии), а также показатели инфильтрации опухоли субпопуляциями лимфоцитов (рис.2).

Рисунок 2.

Иммунофенотип клеток рака молочной железы.

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

С029 ГО95 мие-1 ГО71 НЬМ

И отрицательная Ы мозаичная Имономорфная

1

ньл-ои

СО-54

Чаще всего экспрессировались антигены М11С 1, С071, молекул НЬА I-класса и общей Р-цепи интегринов С029.

Нам представлялось интересным оцененить, насколько иммунофенотип клеток рака молочной железы, взаимосвязан с эффективностью неоадъювантной химиотерапии. Мы использовали 2 критерия эффективности

химиотерапии - регрессию опухоли, на основании клинико-рентгенологических данных и степень патоморфоза опухолевой ткани.

В нашем исследовании 2 этих признака были достоверно взаимосвязаны между собой. В целях большей наглядности и информативности анализа, мы сочли целесообразным использовать минимальное дробление на группы и объединили 0-1 степени патоморфоза (как незначительную или минимальную) и II-III степени (отчетливый, умеренный патоморфоз).

Минимальный клинико-рентгенологический эффект в большинстве случаев (62,5%) ассоциировался с незначительной степенью патоморфоза в опухоли. И лишь в (37,5%) случаев наблюдался отчетливый лечебный патоморфоз.

В группе больных, с выраженным клиническим эффектом после неоадъювантного этапа, незначительная степень патоморфоза опухолевой ткани практически не наблюдалась. В абсолютном большинстве случаев (87,5%) отмечена отчетливая степень морфологических изменений.

У пациенток с умеренно-выраженным клиническим эффектом незначительный и отчетливый лечебный патоморфоз наблюдался в сопоставимых пропорциях (41,7% и 58,3%, соответственно).

Взаимосвязь между признаками была высокодостоверна: р = 0,019 (рис.3).

Рисунок 3.

Взаимосвязь клинического и морфологического регресса опухоли в процессе неоадъювантной химиотерапии у больных раком молочной

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

патоморфоз

Из числа иммунофенотипических маркеров рака молочной железы только один - УЪА р, был взаимосвязан со степенью регрессии опухоли.

При нарастании уровней экспрессии СБ 29 на опухолевых клетках чувствительность к проводимой химиотерапии снижалась. При СО 29 -негативных опухолях минимального эффекта не наблюдалось, при мозаичной экспрессии пропорция таких больных составила 25,0 % , а при мономорфной экспрессии СБ 29 - в 37,5 % случаев неоадъювантное лечение было менее эффективным.

Напротив, случаев с выраженным эффектом при наличии СО 29 на всех опухолевых клетках практически не наблюдали (1 случай из 16 (6,0 %)). Рис.4

железы.

87,5%

62^%

р=0,019

Клинический эффект:

& минимальный

И умеренный

И выраженный

незначительный

отчетливый

Рисунок 4.

Взаимосвязь экспрессии СЛ29 на клетках рака молочной железы с эффективностью неоадъювантной химиотерапии

50% 45% 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0%

47,0%

37,5%

минимальным выраженный

Эффект

Н СР29 -, +/-0СО29 +

Дальнейший анализ проведен с учетом схемы неоадъювантной химиотерапии. Интересно отметить, что интегрины УЬА-(3 были информативны только при использовании схемы САР, у этих больных достоверность связи возрастала в сравнении с общей группой (рис.5.)

Рисунок 5.

Взаимосвязь экспрессии С029 на опухолевых клетках с эффективностью неоадъювантной химиотерапии

Схема САР

Схема СМТ УР

~7Ж

0%

0%

выраженный

0 С029 -, +/- 0СШ9 +

ВС029+-/- ВСБ29 +

При анализе патоморфоза наиболее информативным оказался рецептор апоптоза СБ 95.

В целом по группе больных достоверной связи выраженности патоморфоза с экспрессией С095 не отмечено (р=0,08). В группе пациенток, получавших схему САБ, установлено, что по мере нарастания экспрессии СБ95 от отрицательной до мономорфной частота умеренно-выраженного патоморфоза возрастает с 44 до 86%. Минимальный патоморфоз при отсутствии С095 составил 56%, при наличии 14%. Признаки достоверно взаимосвязаны (рис.6).

Рисунок 6.

Выраженность патоморфоза опухолевой ткани (схема САГ) в зависимости от экспрессии СБ95 на опухолевых клетках.

100% -90% -80% -70% -60% -Ш, -40% -30% -20% -10% -0% -Минимальный патоморфоз Умеренный патоморфоз

ВС095- ВС09}+

Мы проанализировали динамику изменения иммунофенотипа клеток рака молочной железы до и после неоадъювантной химиотерапии. Из числа изученных маркеров только СБ 95 изменял профиль экспрессии, остальные достоверно не различались.

В случаях экспрессии СБ 95 полная элиминация клеток, несущих антиген, под действием химиотерапии по схеме САБ наблюдалась в 55% случаев. Это позволяет предположить, что именно СБ95+ клетки являются мишенью химиотерапии.

Следующая часть нашей работы посвящена оценке взаимосвязи лимфоидной инфильтрации опухоли и эффекта неоадъювантной химиотерапии.

Нами изучены важнейшие субпопуляции интратум оральных лимфоцитов:

-общий уровень лимфоидной инфильтрации по СБ45

- уровень Т-клеток (С07)

- активированных клеток (С025)

- В-лимфоцитов (С020)

Преобладали умеренная и выраженная лимфоидная и Т-клеточная инфильтрации, уровни В- клеток были, как правило, низкими. В 35% случаев в ткани рака молочной железы присутствовали активированные (СЭ25+) лимфоциты (рис.7).

Рисунок 7.

Субпопуляции лимфоцитов в ткани молочной железы.

В процессе неоадъювантной химиотерапии уровни инфильтрации опухоли различными субпопуляциями лимфоцитов изменялись, однако, закономерностей в этом процессе мы не отметили. Чаще всего уровни инфильтрации оставались такими же, как до проведения неоадъювантной химиотерапии. Повышение их уровней в сравнении с исходными значениями

отмечено чаще, чем снижение. Это является косвенным опровержением представления о том, что химиотерапия действует, в первую очередь, на лимфоидную систему, включая интратуморальную (рис.8).

Рисунок 8.

Динамика интратуморальной лимфоидной инфильтрации опухоли в процессе неоадъювантной химиотерапии.

60,0%

54,8% 54,8%

0 снижение 0 без изменения 0 повышение

Динамика интратуморальных лимфоцитов не была взаимосвязана с исходным фенотипом опухоли и ответом (клинико-рентгенологическим, морфологическим) на неоадъювантную химиотерапию. Единственным исключением является антиген СВ25 в группе больных, получавших режим СШ УР.

При возрастании уровней С025+ клеток минимального эффекта не отмечалось: он был выраженным в четверти клинических случаев и умеренно-выраженным в - 75% наблюдений.

Таким образом, наиболее уязвимые с точки зрения представлений о химиотерапевтическом воздействии активированные, пролиферирующие Т-I клетки (С025 положительные) в значительной части случаев не 1 элиминируются, а возрастают в процессе неоадъювантной химиотерапии. Т.е. нарастание количества этих клеток в опухоли ассоциируется с эффективностью схемы СМР УР. Именно в этих случаях, мы отмечали только умеренный или выраженный эффект (рис.9).

Рисунок 9.

Эффективность схемы СМР УР в зависимости от динамики уровней активированных лимфоцитов (СБ25+) в опухоли.

80,0%

1>=0.02

75%

20,0%

40,0%

60,0%

50,0%

30,0%

70,0%

10,0%

0,0%

{3 минимальный эффект О умеренный эффект 0 выраженный эффект

снижение

без изменения

повышение

С025

Тем не менее, не столько динамика, сколько исходный профиль инфильтрации опухоли субпопуляциями лимфоцитов, влиял (или, точнее, был ассоциирован с эффективностью химиотерапии).

Мы оценили, насколько уровень инфильтрации опухоли (до начала лечения), может быть взаимосвязан с эффектом неоадъювантной химиотерапии - регрессией опухоли по клинико-рентгенологическим данным.

При нарастании инфильтрации опухоли Т-клетками частота выраженной регрессии опухоли по клинико-рентгенологическим данным возросла с 7 до 47%. Полученные данные свидетельствуют о том, что предсуществующие в опухоли Т-клетки создают благоприятный фон (своего рода потенцирование) для противоопухолевого действия химиотерапии (рис.10).

Рисунок 10.

Эффективность неоадъювантной химиотерапии рака молочной железы у больных с различным уровнем интратуморальных Т-клеток.

47%

£3 минимальный эффект □ ум еренный эффект 0 выраженный эффект

умеренная выраженная

Т-клегочная инфильтрация

Мы не отметили достоверной связи уровней лимфоидной инфильтрации (СЭ45) с выраженностью клинико-рентгенологической регрессии. Результаты были сходными в обеих группах. Так, при наличии значительной инфильтрации опухоли частота выраженных эффектов была несколько выше

и составила 31% по сравнению с группой пациенток, где инфильтрация была незначительной - 22%.

Что же касается В- клеточной инфильтрации, здесь мы не выявили взаимозависимости.

Чрезвычайно интересным оказался анализ сопоставлений взаимосвязи уровней активации интратуморальных лимфоцитов с противоопухолевым эффектом неоадъювантной терапии. У большинства пациенток показатели активации (экспрессия СЭ25 на лимфоцитах) были минимальными или соответствующие клетки практически отсутствовали в опухолевых срезах. У 36% больных отчетливая пропорция С025-позитивных лимфоцитов присутствовала в опухолевых срезах. При наличии активированных интратуморальных лимфоцитов отчетливый противоопухолевый эффект наблюдался у 55% пациенток. В то время как при отсутствии СВ25+ клеток эффективность химиотерапии была в 5 раз ниже. Эти признаки достоверно взаимосвязаны р=0,005.

Иными словами, при наличии в ткани рака молочной железы отчетливой пропорции активированных лимфоцитов (СБ25+) эффективность неоадъювантной химиотерапии существенно повышается. Т.е. активация показателей интратуморального иммунитета потенцирует эффект лекарственного воздействия. Эти данные во многом напоминают взаимосвязи, отмеченные нами в отношении интратуморальных Т-лимфоцитов, однако, являются еще более достоверными (рис.11).

Рисунок 11.

Эффективность неоадъювантной химиотерапии рака молочной железы с различным уровнем СО25+ клеток.

70%

65%

20%

40%

30%

60%

50%

10%

0%

Ш минимальный эффект И умеренный эффект И выраженный эффект

отсутствуют

присутствуют

С025+ клетки

Мы провели анализ взаимосвязи уровней активации лимфоцитов (С025+клетки) с выраженностью Т-клеточной янгратуморальной реакции и не установили достоверной взаимосвязи между этими признаками.

При наличии активированных лимфоцитов в ткани опухоли выраженная Т-клеточная реакция наблюдалась несколько чаще (63,6%), чем при их отсутствии. Однако признаки не взаимосвязаны. Это говорит о том, что каждый из анализируемых показателей имеет самостоятельное значение в потенцировании противоопухолевого эффекта химиотерапии (табл.6).

Таблица 6.

Взаимосвязь между наличием активированных лимфоцитов (СБ25+) в ткани опухоли и выраженностью Т-клеточной реакции.

СБ25+ клетки Т-клеточная реакция

Слабая Выраженная

Отсутствуют 12 (60%) 8 (40%)

Присутствуют 4 (36,4%) 7 (63,6%)

С целью установления наиболее эффективной схемы неоадъювантного лечения с учетом иммунологических показателей интратуморальных иммунных реакций, мы проанализировали раздельно клинико-иммунологические ассоциации у больных, получавших САР, и у больных, получавших лечение по схеме СМБУР.

Как и в целом по группе уровни С045 лимфоцитов и В- клеток не были достоверно связаны с эффектом химиотерапии. Значимость инфильтрации Т-клетками также снижалась. Это крайне важно, т.к. при любой из использованных схем отмечалась достоверная связь с активированными клетками С025 (р=0,045 при использовании схемы САР; р=0,02 при использовании схемы СМБ УР).

При проведении анализа уровней инфильтрации ткани рака молочной железы различными субпопуляциями лимфоцитов до лечения (материал кор-биопсии) и степени патоморфоза хирургически удаленной опухоли после лекарственного лечения, получены следующие результаты: нарастание уровней лимфоидной инфильтрации и, в частности, Т-лимфоцитов сопровождалось большим патоморфозом опухолевой ткани. При значительной инфильтрации опухоли СБ45+ клетками, умеренный патоморфоз наблюдался вдвое чаще, чем минимальный (67% и 33%). Аналогичные данные получены для Т-клеток

(СЭ7+) - (73% и 27%). Достоверные связи с выраженностью патоморфоза получены для субпопуляции активированных Т-лимфоцитов (СБ25+) — девятикратное преобладание умеренного патоморфоза над минимальным (90% и 10%) в случаях наличия СБ25+ лимфоцитов в опухолевой ткани до начала лечения. Создается впечатление, что наличие в опухолевой ткани активированных Т-лимфоцитов привносит своего рода синергидное или потенцирующее действие в отношении влияния химиопрепаратов на опухолевую ткань. Хотя пропорция этих клеток в опухолевой ткани была, как правило, небольшой, именно они, а не Т-клетки в целом, имели достоверную связь с выраженностью патоморфоза. Этот факт легко объясним, ведь только активированные Т-лимфоциты-киллеры (СБ25+) способны оказывать цитотоксическое действие в отношении опухолевых клеток. В настоящее время широко обсуждается роль Т-регуляторных клеток, которые также экспрессируют СБ25, но способны супрессировать противоопухолевое действие Т-лимфоцитов. Наши данные свидетельствуют о том, что экспрессия СБ25 на интратуморальных лимфоцитах в процессе химиотерапии в основном нарастает, что ассоциируется с положительным эффектом лечения. По-видимому, данный антиген примущественно представлен на Т-киллерах, а не на Т-регуляторных лимфоцитах в опухолевой ткани (рис.12).

Рисунок 12.

Взаимосвязь лечебного патоморфоза с наличием активированных лимфоцитов в опухолевой ткани.

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

56%

90%

О минимальный патоморфоз

□ умеренный патоморфоз

отсутствуют

присутствуют

С025+ клетки

Далее мы оценили связь лимфоидной инфильтрации с эффектом режимов САР и СШ1 УР.

Выраженность патоморфоза не была взаимосвязана с уровнями Т-клеточной инфильтрации опухоли. Достоверная связь с эффективностью химиотерапии имела место в случаях наличия в опухолевой ткани активированных Т-лимфоцитов (С025+). Обнаружение этих клеток при исследовании опухолевой ткани до назначения химиотерапии ассоциировалось с большей выраженностью лекарственного патоморфоза. Более всего это было выражено в группе пациенток получавших антрациклины (р=0,014).

Таким образом, проведенное нами исследование показало, что иммунофенотип клеток рака молочной железы и уровни лимфоидной инфильтрации опухоли субпопуляциями лимфоцитов имеют взаимосвязь с эффективностью неоадъювантной химиотерапии.

Из выбранных параметров наиболее значимыми в плане оценки прогноза и ответа на индукционную терапию следует отметить СЭ29, СЭ95, СТ>1 и

СЭ25.

выводы

1. Иммунофенотип клеток рака молочной железы и уровни лимфоидной инфильтрации опухоли субпопуляциями лимфоцитов имеют взаимосвязь с эффективностью неоадъювантной химиотерапии.

2. В процессе неоадъювантной химиотерапии имунофенотип клеток рака молочной железы не изменяется (УЬА-|3, МиС-1, 1САМ-1, НЬА-1 и II классов, трансферринового рецептора). Экспрессия С095 после индукционной терапии отличается от исходного уровня, в основном, за счет элиминации СИ95 - позитивных клеток

3. Эффективность неоадъювантной химиотерапии по схеме С А!7 (степень регрессии опухоли, выраженность патоморфоза) достоверно взаимосвязана с иммунофенотипом рака молочной железы: С029-позитивные опухоли являются более резистентными (р=0,04), а СБ95-позитивные - более чувствительными (р=0,04).

4. Изменения инфильтрации ткани рака молочной железы субпопуляциями Т-, В- лимфоцитов и активированных клеток в процессе неоадъювантной терапии рака молочной железы носят разнонаправленный (незакономерный) характер.

5. Нарастание интратуморальных СБ25+ лимфоцитов в ходе лечения по схеме СМ!7 УР ассоциируется с большей степенью регрессии опухоли (р=0,02).

6. Эффективность терапии индукции первично неоперабельного рака молочной железы достоверно выше в случаях инфильтрации опухоли Т-клетками (р=0,02) и активированными (С025+) клетками (р=0,005).

Список работ, опубликованных по теме диссертации -

1. Субботина A.A., Тупицын H.H., Летягин В.П., Высоцкая И.В, Максимов К.В., Ким Е.А. Взаимосвязь эффективности неоадъювантной химиотерапии при раке молочной железы с уровнями лимфоидной инфильтрации опухоли. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Профилактика и лечение злокачественных новообразований в современных условиях». - Барнаул. - 2007г. - с. 130.

2. Субботина A.A., Летягин В.П., Тупицын H.H., Высоцкая И.В., Ким Е.А. Исследование опухолевого фенотипа в процессе индукционной химиотерапии первичного рака молочной железы // Маммология. - 2006г. - №1. - с. 77-79.

3. Субботина A.A., Тупицын H.H., Летягин В.П., Высоцкая И.В. Взаимосвязь между уровнями лимфоидной инфильтрации опухоли и эффективностью неоадъювантной терапии // Маммология. - 2006г. - №4. -с. 30-33.

4. Субботина A.A., Летягин В.П., Тупицын H.H., Высоцкая И.В., В.Д.Ермилова. Анализ результатов неоадъювантного лечения больных с учетом иммунофенотипических особенностей рака молочной железы. // Опухоли женской репродуктивной системы.- 2008г. - №4. - с. 31-34.

Подписано в печать 12.03.09 Формат 60x84/16. Бумага офсетная.

_Тираж 100 экз. Заказ №236_

Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Рак молочной железы является одной из самых распространенных форм злокачественных новообразований в мире. Во всех экономически развитых странах отмечается неуклонный рост заболеваемости и увеличение смертности от рака этой локализации, а научным исследованиям по данной проблеме отводится одно из ведущих мест в онкологической науке.

Общеизвестно, что опухоли, имеющие одинаковую стадию по классификации TNM, зачастую радикально отличаются по агрессивности течения заболевания и чувствительности к проводимой терапии. Это объясняется индивидуальными биологическими особенностями конкретной популяции злокачественных клеток (Veronesi U. et al., 1995).

Социальное значение этой формы рака настолько велико, что исследования по проблеме рака молочной железы занимают одно из ведущих мест в клинической онкологии. За последние годы существенно расширились представления об особенностях биологии рака молочной железы, идентифицирован ряд характерных генетических изменений. Исследуются биологические показатели, которые могут иметь прогностическое значение. Изучаются возможные маркеры лекарственной чувствительности и резистентности.

Они ведутся по двум основным направлениям: изучение иммунофенотипа опухоли и изучение противоопухолевого иммунитета (Н.Н.Тупицын и соав, 2007; Артамонова Е.В.,1992; Огнерубов Н.А., 1992; Кампова-Полевая Е.Б., Огнерубов Н.А., 1994; Доросевич А.Е. и соавт., 1994). Иммунологические исследования в последние годы стали одним из преорететных направлений в структуре научных изысканий. Впервые высокая информативность и значимость иммунофенотипирования опухолей продемонстрирована при гемобластозах.

При изучении этой патологии построена схема иммунологической дифференцировки гемопоэтических клеток, и определенно прогностическое значение проведения иммунофенотипирования. (Н.Н.Тупицын, 2007).

Для солидных опухолей вообще и для рака молочной железы, в частности, система знаний об изменении иммунофенотипа эпителиальных клеток по мере их дифференцировки — предмет активного изучения. Исследования в этом направлении стали широко применяться с внедрением в клиническую практику использования моноклональных антител как к лейкоцитарным молекулам, так и к антигенам и рецепторам специфичным для эпителиальных клеток (Якубовская Р.И., Коростелева М.Д., 1988; Тупицын Н.Н. и соавт., 1990; Артамонова Е.В., 1992; Доросевич А.Е. и соавт. 1994; Барышников А.Ю., Тоневицкий А.Г., 1997; Манько В.М., 1990).

Длительное время шло накопление материала, и лишь в настоящее время стали появляться данные о клинической значимости того или иного маркера. Этой актуальной задаче посвящено настоящее исследование. Нам представлялось небезынтересным не просто оценить значимость иммунофенотипических показателей, но изучить те специфические изменения, которые, возможно, происходят с ними в процессе специфического лечения.

Цель исследования:

Оценить значение иммунофенотипа опухоли и динамику его изменений в процессе неоадъювантной терапии у больных местно-распространенным раком молочной железы.

Задачи исследования:

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Оценить иммунофенотипические характеристики рака молочной железы в процессе неоадъювантной химиотерапии, их ассоциации с клинико-рентгенологическим эффектом лечения.

2. Выявить взаимосвязь иммунофенотипа с выраженностью лекарственного патоморфоза в опухолевой ткани.

3. Изучить динамику инфильтрации рака молочной железы субпопуляциями лимфоцитов в процессе индукционной терапии.

4. Определить взаимосвязь между уровнями иммунокомпетентных клеток в опухоли и эффективностью проводимого лечения.

Научная новизна:

Впервые проведено сопоставление результатов неоадъювантной химиотерапии рака молочной железы у пациенток с различными иммунофенотипическими особенностями первичной опухоли. Оценена взаимосвязь между уровнями лимфоидной инфильтрации опухоли и эффективностью проводимого лечения. Изучена динамика интратуморальной лимфоидной инфильтрации в процессе неоадъювантного лечения и взаимосвязь иммунофенотиа рака молочной железы с выраженностью лекарственного патоморфоза в опухолях.

Выявлена четкая взаимосвязь между иммунофенотипическими особенностями РМЖ и эффективностью неоадъювантной химиотерапии. Установлено, что полихимиотерапия в режиме CAF селективно элиминирует СВ95-позитивные клетки, что позволяет добиться большей степени выраженности патоморфоза в CD95-позитивной группе больных. Это свидетельствует о большей эффективности лечения антрациклин-содержащими комбинациями. Данный впервые установленный в настоящем исследовании факт, позволяет корректировать индукционное лечение с учетом иммунологического фенотипа клеток рака молочной железы.

В работе продемонстрирована зависимость эффекта химиотерапии (регрессия опухоли) от иммунофенотипических особенностей РМЖ.

Установлена высокая информативность экспрессии общей 0-цепи интегринов CD29 и рецептора апоптоза FAS/APO-l(CD95) на опухолевых клетках.

Определена достоверная взаимосвязь между уровнями инфильтрации ткани рака молочной железы различными субпопуляциями лимфоцитов до назначения неоадъювантной химиотерапии и степенью выраженности патоморфоза удаленной опухоли. Выраженность патоморфоза коррелировала от уровней лимфоцитарной и Т-клеточной инфильтрации опухоли. Достоверная связь с эффективностью химиотерапии имела место в случаях наличия в опухолевой ткани активированных Т-лимфоцитов (CD25+). Обнаружение этих клеток при исследовании опухолевой ткани до начала химиотерапии ассоциировалось с большей выраженностью лекарственного патоморфоза в удаленной опухоли. Активированные лимфоциты играли роль в выраженности патоморфоза только в случаях проведения антрациклин-содержащими схемами.

Таким образом, проведенная нами работа позволила на основе применения ряда новых антител и индивидуализированных подходов к учету результатов иммуногистохимических реакций установить значение иммунофенотипа при местно-распространенном раке молочной железы.

Практическая значимость:

Полученные в настоящем исследовании результаты имеют большое практическое значение, поскольку позволяют в определенной степени предсказать ответ на различное неоадъювантное лечение больных местно-распространенным раком молочной железы на основе изменения иммунофенотипа опухолевых клеток. Это позволит выбрать наиболее эффективный вариант предоперационного лекарственного лечения.

Такие показатели, как CD25, CD29, CD95, CD7 могут быть рекомендованы в качестве специфических маркеров, пригодных для мониторинга эффективности противоопухолевого лечения.

ВЫВОДЫ:

1. Иммунофенотип клеток рака молочной железы и уровни лимфоидной инфильтрации опухоли субпопуляциями лимфоцитов имеют взаимосвязь с эффективностью неоадъювантной химиотерапии.

2. В процессе неоадъювантной химиотерапии имунофенотип клеток рака молочной железы не изменяется (VLA-J3, MUC-1, ICAM-1, HLA-I и П классов, трансферринового рецептора). Экспрессия CD95 после индукционной терапии отличается от исходного уровня, в основном, за счет элиминации С095-позитивных клеток.

3. Эффективность неоадъювантной химиотерапии по схеме CAF (степень регрессии опухоли, выраженность патоморфоза) достоверно взаимосвязана с иммунофенотипом рака молочной железы: CD29-позитивные опухоли являются более резистентными (р=0,04), a CD95-позитивные — более чувствительными (р=0,04).

4. Изменения инфильтрации ткани рака молочной железы субпопуляциями Т-, В- лимфоцитов и активированных клеток в процессе неоадъювантной терапии рака молочной железы носят разнонаправленный (незакономерный) характер.

5. Нарастание интратуморальных CD25+ лимфоцитов в ходе лечения по схеме CMF VP ассоциируется с большей степенью регрессии опухоли (р=0,02).

6. Эффективность терапии индукции первично неоперабельного рака молочной железы достоверно выше в случаях инфильтрации опухоли Т-клетками (р=0,02) и активированными (CD25+) клетками (р=0,005).

Заключение.

Лечение больных раком молочной железы на современном этапе представляет сложную и зачастую неоднозначно решаемую проблему. Гормональные, иммунологические и метаболические сдвиги, генетические факторы определяют исход данного заболевания и должны учитываться при составлении плана лечения (Шомова М. и соавт., 2000). Активно ведется поиск маркеров рака молочной железы, ассоциированных с прогнозом заболевания, для своевременного изменения (интенсификации, индивидуализации) лечебных программ в прогностически неблагоприятных группах.

Недостаточное развитие диагностики злокачественных новообразований, многочисленные трудности в оценке прогноза и выборе адекватной тактики лечения, необходимость улучшения дифференциальной диагностики анапластических и первично генерализованных форм, взаимосвязь фенотипа опухоли и иммунного ответа организма, а также возможности использования моноклональных антител в терапии рака - все это делает поиск и изучение опухолеассоциированных антигенов одной из актуальнейших проблем современной онкологии.

Исследование иммунологического фенотипа клеток рака молочных желез продолжаются примерно два десятилетия. За это время качественно изменился набор иммунодиагностикумов - моноклональные антитела практически повсеместно вытеснили использовавшиеся ранее ксеногенные антисыворотки. Трудно даже дать простой перечень маркеров раковых клеток, доступных для изучения с помощью МКА. Среди них эпителиально специфичные маркеры, такие как цитокератины и Egp34; антигены, характерные преимущественно для железистого эпителия; рецепторы для факторов роста и дифференцировки клеток (рецептор эпидермального фактора роста, трансферриновый рецептор); маркеры апоптозного каскада; молекулы клеточной адгезии; лейкоцитарные антигены HLA I и II и многие другие.

Однако, несмотря на достаточно продолжительный период изучения маркеров клеток рака молочных желез, несмотря на значительный прогресс, достигнутый на молекулярном и субмолекулярном уровнях, ясности понимания биологической роли целого ряда белков, идентифицируемых как маркеры клеток рака молочной железы, все еще нет.

В работе использованы материалы 62 клинических, морфологических, иммуногистохимических исследований, проведенных у 31 больной раком молочной железы, находившихся на лечении в хирургическом отделении опухолей молочных желез РОНЦ РАМН им. Н.Н.Блохина в период с 2004г. по 2005г. В исследуемую группу вошли женщины в возрасте от 27 до 72 лет. Средний возраст составил 49,3 года. В репродуктивном возрасте находились 14 больных (45,2%), в состоянии перименопаузы - 2 больные (6,4%), в менопаузе - 15 женщин (48,4%).

Распространенность опухолевого процесса оценивалась согласно Международной классификации злокачественных опухолей по системе TNM, а также клинической классификации по стадиям. У большинства больных (70,9%) была установлена III б стадия, на 2-м месте по частоте были больные со Иб стадией (16,1%). Наименьшее число пациенток с Ша стадией (13,0%). У всех больных диагноз верифицирован цитологически, а также по данным трепан- или кор-биопсии.

В настоящей работе проведено сопоставление результатов неоадъювантной химиотерапии рака молочной железы у пациенток с различными иммунофенотипическими особенностями первичной опухоли, оценена взаимосвязь между уровнями лимфоидной инфильтрации опухоли и эффективностью проводимого лечения, изучена динамика интрамуральной лимфоидной инфильтрации в процессе неоадъювантного лечения и взаимосвязь между иммунофенотипом рака молочной железы с выраженностью патоморфоза в опухолях.

У всех пациенток оценена экспрессия на клетках опухоли молекул интегринов (CD29), трансферринового рецептора (CD71), молекул HLA-I и II классов, CD 95 (рецептор, опосредующий апоптоз), антигенов MUC-1 и CD 54 (ICAM-1, молекула межклеточной адгезии).

У 31 больной первичным раком молочной железы изучен иммунофенотип опухолевых клеток до и после проведения неоадъювантной химиотерапии как в целом по группе, так и в зависимости от примененной схемы (CAF и CMF VP). Основная идея работы состояла в том, чтобы выявить, насколько выраженность клинического эффекта зависит от экспрессии тех или иных антигенов на мембране или в цитоплазме раковых клеток. Эффективность различного противоопухолевого лечения оценивалась по степени клинико-рентгенологического эффекта и степени выраженности лекарственного патоморфоза. По нашим данным наиболее достоверным маркером опухолевых клеток, для которого отмечены статистически значимые различия до и после проведения неоадъювантной химиотерапии, является рецептор апоптоза CD95. Изменения, происходящие в процессе лечения, заключались в снижении или полном исчезновении антиген позитивных клеток в CD95+ случаях. С условием этого можно сказать, что клетки рака молочной железы, экспрессирующие CD95, более чувствительны к неоадъювантной химиотерапии в сравнении с CD95-негативными клетками. При дальнейшей оценке CD95 - позитивной группы в зависимости от схемы неоадъювантной терапии получены интересные данные: в динамике лечения элиминируются именно CD95 позитивные клетки.

Наши данные полностью подтверждают высказанную гипотезу о том, что оценка эффективности неоадъювантного лекарственного лечения рака молочной железы в иммунофенотипически различных группах должна проводиться с обязательным учетом того, какая схема химиотерапии применяется у больных. При лечении по программе CMF VP ни один из анализируемых маркеров не изменял профиль экспрессии. Прикладным аспектом этого наблюдения является то, что иммунофенотип после проведения неоадъювантной химиотерапии по схеме CMF VP не изменяется по сравнению с таковым до начала лечения. Следовательно, при проведении лечения по схеме CMF VP иммунофенотипирование можно проводить на материале удаленной после неоадъювантной химиотерапии опухоли, не опасаясь, что лечение могло изменить антигенный профиль опухолевых клеток.

Что же касается неоадъювантной химиотерапии по схеме CAF, то она селективно элиминирует CD95- позитивные клетки, и именно этим обусловлена ее эффективность в данной группе пациенток.

Таким образом, иммунофенотипические особенности рака молочной железы влияют на эффективность неоадъювантной химиотерапии. Это обусловлено тем, что применение схемы CAF селективно элиминирует CD95- позитивные клетки, что отражается на большей выраженности патоморфоза в CD95- позитивной группе больных, то есть большей эффективности лечения антрациклин-содержащими схемами у этих пациенток.

Другим общепринятым критерием эффективности химиотерапии является выраженность патоморфоза опухолевых клеток. Исследование выраженности патоморфоза после неоадъювантной химиотерапии в зависимости от иммунофенотипа рака молочной железы проведено у 28 больных. По нашим данным, ни один из иммунофенотипических признаков рака молочной железы не имел достоверной связи со степенью выраженности патоморфоза.

Иными словами, при проведении анализа эффективности неоадъювантной химиотерапии рака молочной железы на основе патоморфоза опухолевой ткани ни один из иммунологических признаков раковых клеток не был взаимосвязан с эффективностью химиотерапии.

Представлялось весьма интересным провести анализ раздельно в группах больных, получавших полихимиотерапию по схеме CAF и по схеме CMF VP. Мы оценили эффект на основании выраженности патоморфоза под действием химиотерапии по схеме CAF. Результаты свидетельствуют о том, что два маркера опухолевых клеток достоверно связаны с выраженностью патоморфоза под влиянием химиотерапии по схеме CAF — CD95 и HLA-I. Наиболее интересны и достоверны данные, основанные на экспрессии рецептора апоптоза CD95. По мере нарастания пропорции CD95 -позитивных опухолевых клеток (отсутствии экспрессии, рецептор представлен на части клеток, мономорфная экспрессия на всех клетках), частота умеренного патоморфоза также возрастала - 44,4%, 83,3%, 100%. Напротив, в группе больных с минимальным патоморфозом преобладали антиген-негативные по CD95 случаи (83,3%). Это указывает на наибольшую эффективность химиотерапии по схеме CAF у больных раком молочной железы, опухолевые клетки которых экспрессируют FAS/APO-1 антиген. Взаимосвязь выраженности патоморфоза с экспрессией HLA-I была менее значимой, чем связь с экспрессией CD95, однако находилась в диапазоне достоверных значений, р=0,048. У больных с полным отсутствием антигена на опухолевых клетках умеренный патоморфоз наблюдался вдвое чаще, чем при мономорфной экспрессии HLA- 75% и 37,5% соответственно. Вместе с тем, наибольшая частота умеренно выраженного патоморфоза (100%) отмечена у больных с экспрессией антигена на части раковых клеток.

Таким образом, при оценке выраженности патоморфоза под действием неоадъювантной химиотерапии по схеме CAF установлено, что наибольшую роль в эффективности лечения играет экспрессия рецептора апоптоза на раковых клетках — с нарастанием пропорции позитивных клеток нарастает выраженность патоморфоза. Результаты, полученные у больных, леченных по схеме CAF, являются более достоверными, чем в целом по группе, что свидетельствует о наибольшей эффективности данной схемы у больных с экспрессией CD95.

Следующим этапом нашей работы явилась оценка клинического эффекта на основании выраженности патоморфоза под действием химиотерапии по схеме CMF VP в иммунофенотипически различных группах больных раком молочной железы. Наши результаты свидетельствуют о том, что эффективность неоадъювантной химиотерапии рака молочной железы, оцениваемая на основании выраженности патоморфоза, не зависит от иммунофенотипа раковых клеток. Это во многом объясняет данные, полученные в целом по группе больных раком молочной железы. Близкая к достоверности связь эффективности лечения (выраженности патоморфоза) с экспрессией CD95 по всей группе больных становилась высокодостоверной только при проведении лечения антрациклин-содержащей схемой CAF, а применение CMF VP полностью нивелировало синергидное действие алоптотического рецептора FAS/APO-1. Этот факт установлен нами впервые и свидетельствует о возможности назначения неоадъювантных химиотерапевтических схем с учетом иммунологического фенотипа клеток рака молочной железы.

Достаточно большой раздел нашего исследования был посвящен изучению взаимосвязи между уровнями лимфоидной инфильтрации опухоли и эффективностью неоадъювантного лечения.

В числе иммунологических показателей местного противоопухолевого иммунитета нами были оценены: общие уровни лимфоидной инфильтрации (CD45), выраженность Т — клеточной инфильтрации (CD7), количество интрамуральных В - клеток (CD20), а также активация интрамуральных лимфоцитов на основании мембранной экспрессии молекулы CD25 (рецептор интерлейкина 2). Анализ проводился как в целом по группе, так и в зависимости от примененной схемы неоадъювантной химиотерапии (CAF, CMF VP).

Представленные данные указывают на существование связи интратуморальных иммунных реакций с эффективностью проводимой полихимиотерапии. Наибольшее значение с точки зрения получения выраженного противоопухолевого эффекта имеют два показателя: интенсивность Т- клеточной инфильтрации- количество Т-клеток в срезах — и уровни активации лимфоцитов — экспрессия рецептора интерлейкина 2. Эти показатели являются независимыми. Интенсивность Т-клеточной реакции имеет значение в основном при проведении лечения по схеме CAF (в меньшей степени - при применении схемы CMF VP). Полученные данные свидетельствуют о том, что Т-клетки в первичной опухоли создают благоприятный фон для противоопухолевого действия химиотерапии. Это очень важный параметр, впервые отмеченный в нашей работе. Показатели активации лимфоцитов (экспрессия CD25) предрасполагают к терапии вне зависимости от примененной схемы.

Нами установлена зависимость эффекта химиотерапии от иммунофенотипических особенностей РМЖ. Эффект оценивался по уровню регрессии первичной опухоли и выраженности патоморфоза, а также по динамики иммунофенотипических показателей. Информативными оказались экспрессия общей Р- цепи интегринов CD29 и рецептора апоптоза FAS/APO-1 (CD95) на опухолевых клетках. Оба эти маркера играют важную роль в реализации цитотоксического действия Т-лимфоцитов, что, в свою очередь, может потенцировать действие химиотерапии. Для проверки мы оценили, насколько уровень инфильтрации опухоли лимфоцитами (CD45), Т-клетками (CD7), В-лимфоцитами (CD20) и активированными лимфоцитами (CD25) зависит от иммунофенотипа первичной опухоли.

Достоверная связь отмечена для Т-лимфоцитов в случаях экспрессии на опухоли антигена CD29. Имела место определенная избирательность распределения, заключавшаяся в том, что при мозаичной экспрессии CD29 на опухолевых клетках наиболее редко отмечена слабая интрамуральная Т-клеточная реакция и наиболее часто — выраженная. По-видимому, уровни лимфоидной инфильтрации опухоли и субпопуляций оцененных нами интратуморальных лимфоцитов не зависят напрямую от иммунофенотипических особенностей рака молочной железы в группе больных, имеющих первично неоперабельную опухоль и нуждающихся в неоадъювантной химиотерапии.

Одной из задач нашей работы являлась оценка динамики изменения уровней лимфоидной инфильтрации опухоли в процессе неоадъювантной химиотерапии. Анализ проводился как в целом по группе больных, так и в зависимости от примененной схемы неоадъювантной химиотерапии CAF и CMF VP. Как показали наши исследования, химиотерапия не всегда вела к снижению лимфоидной инфильтрации. Динамика иммунных реакций не взаимосвязана с эффектом неоадъювантной химиотерапии. Взаимосвязь лимфоидной инфильтрации опухоли с эффектом проводимой полихимиотерапии прослеживается только по CD25 клеткам при схеме CMF VP.

Чрезвычайно интересно было оценить взаимосвязь между уровнями инфильтрации ткани рака молочной железы различными субпопуляциями лимфоцитов до назначения неоадъювантной химиотерапии и степенью выраженности патоморфоза удаленной опухоли. Анализ результатов показал, что в 39,3% патоморфоз был минимальным, в 60,7%- умеренным. Выраженность патоморфоза напрямую зависела от уровней лимфоцитарной и Т-клеточной инфильтрации опухоли. Достоверная связь с эффективностью химиотерапии имела место в случаях наличия в опухолевой ткани активированных Т-лимфоцитов (CD25+). Обнаружение этих клеток при исследовании опухолевой ткани до назначения химиотерапии ассоциировалось с большей выраженностью лекарственного патоморфоза в удаленной опухоли. Активированные лимфоциты играли роль в выраженности патоморфоза только в случаях проведения химиотерапии по схеме CAF.

Таким образом, проведенная нами работа позволила на основе применения ряда новых антител и индивидуализированных подходов к учету результатов иммуногистохимических реакций в зависимости от типа анализируемого маркера установить клиническое значение иммунофенотипа при местно-распространенном раке молочной железы. Полученные в настоящей работе результаты имеют большое практическое значение, поскольку позволяют в определенной степени предсказать ответ на различное неоадъювантное лечение больных местно-распрастраненным раком молочной железы. Знание особенностей опухолевого фенотипа — установленная в работе реальная возможность коррекции индукционной терапии.

Такие показатели, как CD7, CD25, CD29, CD95 могут быть рекомендованы в качестве специфических показателей, пригодных для мониторинга эффективности противоопухолевого лечения.