Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Роль холинергической и иммунной системы в регуляции воспаления при анафилактическом и эндотоксическом шоке

Актуальность темы. Включение шоковых состояний атопической (анафилактический шок) и неатопической (эндотоксический шок) природы в ряд наиболее тяжелых ургентных клинических состояний связано с быстрой генерализацией системной воспалительной реакции (Sampson et al., 2006). Лекарственная терапия эндотоксического шока включает гемодинамические, антимикробные и дезинтоксикационные средства (Мальцева Л.А. и соавт., 2005; Hotchkiss, Karl, 2003), анафилактического шока — антигистаминные препараты, прессорные агенты, бронходилятаторы и системные глюкокортикоиды (Сумин С.А., 2006; Simons, Sheikh, 2007). Однако воздействие не только на эффекторные органы, но и на интегративные системы организма, в частности на нейроиммунные механизмы регуляции позволяет обеспечить как срочные, так и отсроченные адаптивные реакции при шоке (Мазуркевич Г.С., Багненко С.Ф., 2004). Вместе с тем известно, что в профилактике и интенсивной терапии шоковых состояний холинергические средства практически не используются (Tang, 2003), хотя дисфункция холинергической системы играет важную роль в патогенезе анафилактического и эндотоксического шока — поражении легких, сердца, кровеносных сосудов и др. (Pavlov et al., 2006; Gwilt et al., 2007). Попытка коррекции t анафилактического и эндотоксического шока в эксперименте показала возможность модуляции активности М-холинорецепторов на уровне периферических эффектов, предупреждая таким образом развитие патохимической стадии анафилактического шока (Нежинская Г.И. и соавт., 2004), или стимуляцией эфферентов nervus vagus (п. vagus) при эндотоксическом шоке («холинергический противовоспалительный ответ») (Тгасеу, 2007).

Иммунный компонент в инициации шоковых состояний атопической и неатопической природы хорошо известен: продукция IgE, IgGl при анафилактическом шоке (Finkelman, 2007); активация афферентов п. vagus медиаторами воспаления IL-lp, TNFa и др. (Pavlov et al., 2006). Однако роль иммунной системы в реализации проявлений шоковой реакции остается недостаточно изученной. Попытки десенсибилизации организма при анафилактическом шоке малоэффективны (Owen, 2007). Об иммунологической стадии эндотоксического шока известно, что в этот период усиливается продукция иммуноглобулина класса IgM (Reid et al., 1997), а денервация селезенки, связанная с нарушением целостности п. vagus, приводит к увеличению продукции провоспалительных цитокинов и смертности животных от шока (Huston et al., 2006).

Целью работы явилось изучение участия холинергической и иммунной систем в регуляции воспаления при анафилактическом и эндотоксическом шоке.

Задачи исследования:

1. Оценка на моделях in vitro и in vivo иммунотропной активности холинергических препаратов центрального и периферического действия.

2. Исследование на модели гиперчувствительности замедленного типа с развитием реакции Артюса влияния холинергических препаратов на воспаление и уровень сенсибилизации организма к антигену.

3. Изучение влияния холинергических препаратов на анафилактический индекс реакции при их введении на иммунологической или патохимической стадии анафилактического шока.

4. Изучение влияния холинергических препаратов на изменение частоты сердечных сокращений, вызванное введением липополисахарида Salmonella typhi при индукции эндотоксического шока.

5. Исследование роли парасимпатической системы в развитии эндотоксического шока на модели денервированной селезенки, обусловленной пересечением абдоминальных ветвей п. vagus.

6. Изучение влияния холинергических препаратов на иммунный (уровень антителогенеза) и медиаторный (содержание серотонина) ответ интактной или денервированной селезенки.

Научная новизна работы. Установлено, что препараты центрального действия: антагонист мускариновых рецепторов атропин, агонист мускариновых и никотиновых рецепторов холина альфосцерат и антихолинэстеразный препарат галантамин, а также антагонист периферических мускариновых рецепторов ипратропий иммунологически активны в течение 28 суток и более. Препараты способны модулировать продукцию провоспалительного цитокина IL-ip, его рецепторного антагониста IL-IRa, IL-4, инициирующего переключение Thl- на ТЪ2-ответ, и влиять на реакцию гиперчувствительности замедленного типа, лежащую в основе развития воспаления.

Впервые доказана возможность предупреждения иммунологической стадии анафилактического шока с помощью атропина (0,08 мг/кг), ипратропия (6,2 мкг/кг) или его комбинации с неостигмином (0,04 мг/кг). Показано, что для купирования патохимической стадии анафилактического шока эффективно применение атропина (0,08 мг/кг) в комбинации с галантамином (0,4 мг/кг), что приводит к существенному снижению индекса анафилактической реакции.

Установлено, что эффекты периферического мускаринового антагониста метацина могут быть связаны с его фармакологически активным метаболитом холином или с эффектами альбумина, который существенно увеличивал антианафилактогенную активность препарата на иммунологической стадии и сам по себе снижал интенсивность патохимической стадии шока.

Впервые показано снижение тахикардии у крыс с эндотоксическим шоком, получивших за 30 мин до его индукции препараты центрального действия — агонист М- и Н-холинорецепторов холина альфосцерат (90 мг/кг) или антихолинэстеразный препарат галантамин (0,45 мг/кг).

Впервые показано, что, по сравнению с иннервированной селезенкой (интактные крысы), прерывание абдоминальных ветвей п. vagus на уровне пищевода не влияет на уровень антителогенеза, но снижает в ней содержание серотонина. При эндотоксическом шоке и денервации селезенки холина альфосцерат (90 мг/кг) или галантамин (0,45 мг/кг), снижают функциональную активность В-лимфоцитов, нормализуют содержание серотонина, что свидетельствует о важной роли ненервных эффектов препаратов в реализации шока.

Впервые показана возможность регуляции холинергическими препаратами системного иммунного (активность В-лимфоцитов) и медиаторного (содержание серотонина) ответа селезенки при анафилактическом и эндотоксическом шоке.

Научно-практическая значимость работы. Изучение иммунотропной активности холинергических препаратов центрального действия показало наличие у них пролонгированного действия, что теоретически обосновывает возможность их применения в профилактике и лечении шоковых состояний атопической и неатопической природы. Установлена эффективность применения холинергических препаратов на иммунологической (атропин, ипратропий или его комбинация с неостигмином) и патохимической (атропин в комбинации с галантамином) стадии анафилактического шока, а также при эндотоксическом шоке (холина альфосцерат, галантамин), что может служить предпосылкой для поиска путей фармакологической инициации противовоспалительных механизмов с участием холинергической системы в клинической практике.

Подтверждена результативность применения реакции гиперчувствительности замедленного типа с развитием реакции Артюса для оценки влияния холинергических препаратов на воспаление и уровень сенсибилизации организма к антигену, что позволяет использовать ее для прогноза действия препаратов на иммунологическую стадию анафилактического шока. Показана эффективность модели денервации селезенки, обусловленной нарушением целостности и. vagus, для изучения ненервных эффектов холинергических препаратов. Установление структуры метаболитов метацина позволяет судить об их участии в терапевтических эффектах препарата, а также может иметь важное значение для теоретических и практических аспектов снижения числа побочных эффектов холинергических препаратов и повышения их безопасности.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Холинергические препараты центрального и периферического действия пролонгируют первичный; иммунный ответ, модулируют продукцию цитокинов.(1Ь-1(3, IL-IRa, IL-4), иммуноглобулинов (IgM, IgG, IgA) и влияют на развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа и развитие реакции Артюса.

2. Формирование иммунологической стадии анафилактического шока можно предупреждать с помощью атропина, ипратропия и его» комбинации; с неостигмином, патохимической стадии анафилактического шока -введением атропина, в комбинации с галантамином, а эндотоксического шока - применением холина альфосцерата или галантамина.

3. На антианафилактогенные эффекты мускаринового антагониста метацина могут влиять его фармакологически активный;метаболит холшг(метаболизм препарата может проходить по механизму гидролиза) и белки плазмы крови (альбумин, IgG);

4. Купирование холинергическими препаратами анафилактического? и* эндотоксического шока сопровождается* нормализацией антитело- и серотонинпродуцирующей; активности спленоцитов. Прерывание парасимпатической иннервации селезенки при эндотоксическом шоке приводит к усилению ненервных эффектов холинергических препаратов, связанных с их действием на спленоциты, модулируя иммунный и медиаторный ответ селезенки.

Публикации. По теме диссертации^ опубликовано 14 работ, в. том числе 5 статей в центральных журналах, рекомендованных перечнем ВАК. Личный- вклад диссертанта заключается в самостоятельном проведении большинства экспериментальных исследований, включая работу с лабораторными животными, проведение лабораторных тестов, статистическую обработку и интерпретацию полученных результатов. Электрокардиографические исследования и операция ваготомии проводились совместно с к.б.н. Н.Р. Евдокимовой (отдел нейрофармакологии им. С.В. Аничкова НИИЭМ СЗО РАМН), которой автор выражает искреннюю благодарность. Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на 4-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2006); на 2-м Международном симпозиуме по ненейрональному ацетилхолину (Майнц, Германия, 2006), на Ш съезде фармакологов России «Фармакология — практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007), на XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008), на 3-м Китайско-Российском международном симпозиуме по фармакологии (Харбин, 2008), на заседании общества фармакологов (Санкт-Петербург, 2009), на заседании отдела нейрофармакологии НИИЭМ СЗО РАМН (2007 - 2009). Структура и объем работы. Работа изложена на 138 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 35 таблицами и 8 рисунками. Библиографический указатель содержит 228 источников, из которых 27 отечественных и 201 зарубежных работ.

выводы

1. Холинергические препараты центрального и периферического действия изменяют уровень антителогенеза и его длительность, продукцию цитокинов (IL-ip, IL-IRa, IL-4); оценка их влияния на развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа и реакции Артюса позволяет прогнозировать уровень сенсибилизации организма и развитие воспаления.

2. Мускариновыми антагонистами или их комбинациями с антихолинэстеразными препаратами можно обеспечить десенсибилизирующий эффект (атропин, ипратропий, ипратропий с неостигмином) и предупреждать патохимическую стадию анафилактического шока (атропин с галантамином).

3. Фармакологическая коррекция холинергическими препаратами центрального действия (атропин, холина альфосцерат, галантамин) эфферентов nervus vagus при эндотоксическом шоке приводит к снижению тахикардии, вызванной введением липополисахарида Salmonella typhi.

4. Купирование анафилактического и эндотоксического шока, связанное с активацией центральной холинергической системы, приводит к нормализации иммунной (антителопродуцирующая активность В-лимфоцитов) и медиаторной активности (уровень серотонина) спленоцитов.

5. Целостность nervus vagus селезенки определяет активность её серотонинергических механизмов; парасимпатическая денервация органа изменяет влияние холинергических препаратов на иммунный и медиаторный ответ селезенки.

6. Прерывание nervus vagus при эндотоксическом шоке приводит к увеличению тахикардии и ненервных эффектов холинергических препаратов, связанных с их действием на В-лимфоциты и серотонинпродуцирующую активность селезенки.

7. На бронхолитические эффекты мускаринового антагониста метацина могут влиять белки плазмы крови: IgG усиливает протективное действие препарата, а альбумин отменяет его.

8. Метаболизм метацина может протекать по механизму гидролиза сложноэфирной связи в молекуле препарата с образованием фармакологически активного холина и фармакологически неактивной 2-гидрокси-2,2-дифенилуксусной кислоты.

Заключение

Предпосылки к модуляции активности холинорецепторов для разработки терапевтических подходов к лечению ряда заболеваний, в патогенезе которых имеет место нарушение экспрессии или функций М- и Н-холинорецепторов, достаточно обоснованы (Нежинская Г.И. и соавт., 2006; Racke et al., 2006; Fujii et al., 2008). Известно, что помимо экспрессии М- и Н-холинорецепторов в нервной ткани, эти рецепторы широко представлены на клетках ненервного происхождения, таких как эпителиальные и гладкомышечные клетки респираторного тракта, тучные клетки, макрофаги, лимфоциты и др. (Wessler et al., 2003). Эффективность профилактики «стрессовых язв», связанная с применением мускаринового антагониста метацина за 14 суток до водоиммерсионного стресса (Нежинская Г.И. и соавт., 2008), открытие «холинергического противовоспалительного ответа» (Borovikova et al., 2000) и «воспалительного рефлекса» (Тгасеу, 2007) позволили предположить участие нервных и ненервных холинергических механизмов в регуляции воспаления. Поэтому поиск путей инициации противовоспалительного ответа, связанного с применением препаратов, избирательно действующих на центральные и периферические М- и Н-холинорецепторы, способных модулировать иммунный и медиаторный ответ спленоцитов при анафилактическом и эндотоксическом шоке, является важной проблемой для разработки способов предупреждения шоковых состояний. Сопоставление клинических эффектов холинергических препаратов с их влиянием на малоизученный системный иммунный ответ В-лимфоцитов и медиаторный ответ селезенки позволит оценить роль и углубить представления о функциональных взаимодействиях между этими системами, взаимосвязи с белками плазмы крови, а также дополнить данные о механизме действия препаратов.

Собственные результаты, представленные в разделе 3.1, показали, что все холинергические препараты центрального (атропин, галантамин, холина альфосцерат) и периферического (ипратропий) действия влияли на содержание АОК в селезенке и оказывали иммунотропное действие в течение 28 суток и более (см. рис. 3.1.1). Полученные данные совпадают с результатами оценки иммунотропных эффектов периферических мускариновых и никотиновых агонистов и антагонистов (метацин, гексаметоний и др.), свидетельствующих об инициации ими первичного иммунного ответа и длительности иммунной реакции (Нежинская Г.И., 1999). Холинергические препараты (атропин, галантамин, холина альфосцерат, ацетилхолин, метацин, ипратропий, гексаметоний, неостигмин) снижали индуцированную митогеном лаконоса продукцию IgG в культуре мононуклеаров периферической крови человека, по сравнению с контролем (культуры, в которые не добавляли препараты) (см. табл. 3.1.4) и не влияли на спонтанную и митогениндуцированную продукцию IgM (см. табл. 3.1.3). Кроме того, галантамин, статистически достоверно подавлял спонтанный синтез IgG, а также спонтанный и митогениндуцированный синтез IgA (см. табл. 3.1.2 и 3.1.4). Холинергические препараты вызывали усиление на 3-4 порядка синтеза IL-lp в нестимулированных митогеном культурах мононуклеаров человека и стимулированных форболмиристацетатом культурах, по сравнению с контролем (см. табл. 3.1.5). Они также индуцировали синтез IL-IRa в нестимулированных культурах (см. табл. 3.1.6). Однако в митогениндуцированных культурах препараты не влияли на синтез IL-IRa, свидетельствуя тем самым об однонаправленном влиянии на синтез про- и противовоспалительных цитокинов, связанном с дополнительными воздействиями. Метацин усиливал митогениндуцированный синтез IL-4, участвующего в переключении Thl-ответа на Т112-ответ (см; табл. 3.1.7). Полученные результаты частично объясняются известными данными о том, что блокада или активация холинергических механизмов приводит к изменению переключения синтеза иммуноглобулинов с IgM на IgG класс (Skok et al., 2005, 2007) и изменению продукции Thl- и ТЪ2-цитокинов (Fujii et al., 2007а). Однако собственные и известные данные позволяют предполагать, что холинергические препараты не усугубят дисбаланса иммуноглобулинов и цитокинов при патологических процессах.

Результаты опытов по изучению влияния холинергических препаратов на формирование гиперчувствительности замедленного типа и развитие реакции Артюса, позволили обосновать возможность их применения для регуляции воспаления, а также судить об их влиянии на уровень сенсибилизации организма к антигену. Показано (см. рис. 3.1.2), что среди препаратов периферического действия введение неостигмина или метацина при индукции ГЗТ сопровождалось через 24 часа полным угасанием отечной реакции. Протективное действие длительного увеличения концентрации ацетилхолина в периферических тканях (эффект неостигмина) на развитие отека, по-видимому, может объясняться известными данными о том (Saeed et al., 2005), что ацетилхолин способен снижать продукцию хемокинов и экспрессию молекул адгезии эндотелиоцитами кровеносных сосудов в очаге воспаления. В наших экспериментах введение ацетилхолина снижало развитие отечной реакции, вызванное ПАФ, только на сроках 30 мин, что может быть связано с быстрым разрушением препарата в организме (Харкевич Д.А., 2003). Сопоставляя эффекты метацина и ипратропия (см. рис. 3.1.2), а также данные о метаболизме метацина по гидролитическому механизму (см. рис. 3.2.1 и 3.2.2) можно предположить, что более выраженное стабилизирующее действие метацина на развитие воспалительной реакции, может быть связано не только с блокадой М-холинорецепторов, но и с эффектами его фармакологически активного метаболита холина. Как известно, холин является агонистом М- и Н-холинорецепторов (Cansev et al., 2007), в отличие от фармакологически неактивных метаболитов ипратропия (Restrepo, 2007). Полученные данные об отсутствии влияния гексаметония на развитие отечной реакции, частично подтверждаются имеющимися в литературе сведениями об аналогичном эффекте антагониста Н-холинорецепторов мекамиламина на развитие отека, воспроизведенном на модели локальной реакции Шварцмана (Moccia et al., 2004; Saeed et al., 2005). Оценка влияния атропина и галантамина на развитие ГЗТ показала (см. рис. 3.1.3), что эти препараты, хотя увеличивали интенсивность реакции в ранние сроки (0,5 — 6 ч), однако в этом промежутке времени не наблюдалось прогрессирования отека, а через 24 часа отечная реакция полностью угасала. Напротив, введение холина альфосцерата или комбинации атропина с галантамином приводило к увеличению отека основания хвоста не только на сроках развития ГЗТ, но и спустя 24 часа (см. рис. 3.1.3). Из данных литературы, объясняющих противовоспалительные свойства холина, видно, что у холина альфосцерата наряду с протективными эффектами холина, проявляются метаболические эффекты глицерофосфатного остатка молекулы, способствующие синтезу провоспалительных медиаторов (Cansev et al., 2007; Mehta et al., 2007), по-видимому, усиливающих развитие реакции ГЗТ. Сопоставление влияния атропина или галантамина с влиянием комбинации этих препаратов, а также влияния комбинации ипратропия с неостигмином на развитие отека при ГЗТ (см. рис. 3.1.2 и 3.1.3), по-видимому, может указывать на конкурентные взаимодействия периферических и центральных эффектов мускариновых антагонистов и антихолинэстеразных средств в предупреждении воспалительной реакции. Протективное действие никотина на развитие инициированного введением ПАФ отека через 24 часа (см. рис. 3.1.3), согласуются с известными данными о противовоспалительном его эффекте, полученном на модели «воздушного пузыря» (Saeed et al., 2005).

Введение разрешающей дозы ПАФ через две недели после сенсибилизации приводило к развитию реакции Артюса (появление язв в основании хвоста мышей). Холинергические препараты (атропин, комбинация ипратропия с неостигмином), введенные одновременно с сенсибилизирующей дозой ПАФ, отодвигали появление язв, заживление которых происходило в короткие сроки, по сравнению с контролем (см. табл. 3.1.8 и 3.1.9), что может свидетельствовать о влиянии их на уровень сенсибилизации организма к адъюванту. Хорошо известно, что сенсибилизация является основным фактором патогенеза большинства иммунопатологических состояний, включая анафилактический шок (Медуницин Н.В., 1983; Grabbe, Schwarz, 1998; Jacysyn et al., 2001). Сопоставление влияния холинергических препаратов на реакцию Артюса с уровнем антителогенеза в селезенке показало, что её развитие сопровождалось увеличением содержания АОК. Однако у мышей с отсроченным появлением язв, получивших при сенсибилизации ацетилхолин, никотин или ипратропий с неостигмином, но не холина альфосцерат или атропин, активность В-лимфоцитов была ниже по сравнению с сенсибилизированными животными, которым вместо препаратов вводили физиологический раствор. Протективный эффект ипратропия при развитии реакции Артюса также сопровождался снижением уровня системного иммунного ответа В-лимфоцитов, инициируемого введением адъюванта (см. табл. 3.1.11 и 3.1.12). По-видимому, активация центральных и периферических холинергических механизмов (галантамин, холина альфосцерат) увеличивает выраженность сенсибилизации, в то время как блокада центральных или периферических М-холинорецепторов (атропин, ипратропий), или активация центральных и периферических Н-холинорецепторов (никотин) — снижает ее. Подтверждается это тем, что гексаметоний не предупреждает появление язв, в отличие от комбинации ипратропия с неостигмином, которая полностью блокирует развитие реакции Артюса (см. табл. 3.1.8). Сопоставление влияния холинергических препаратов с влиянием цитостатических препаратов (доксорубицин, циклофосфан) на развитие реакции Артюса, уровень антителогенеза (см. табл. 3.1.14 и 3.1.15), подтверждает метаботропные эффекты холинергических препаратов в регуляции воспаления. Полученные данные, свидетельствующие о возможности предупреждения сенсибилизации, связанной с развитием воспаления, могут служить прогностическими маркерами для выбора холинергических препаратов, способных регулировать иммунологическую стадию анафилактического шока. Кроме холинергических препаратов IgG и альбумин тоже способны отодвигать наступление и снижать развитие реакции Артюса (см. табл. 3.1.10), однако механизм подобного действия остается неизвестным.

Изучение влияния холинергических препаратов на иммунологическую стадию анафилактического шока подтвердило, что введение атропина, ипратропия или его комбинации с неостигмином одновременно с сенсибилизирующей дозой лошадиной сыворотки приводило к статистически достоверному снижению индекса анафилактической реакции, по сравнению с контролем (сенсибилизированные морские свинки, не получавшие препараты) (см. табл. 3.2.1 и 3.2.2). Анализ данных литературы (Gwilt et al., 2007) и собственные данные позволяют предположить, что непосредственная блокада М-холинорецепторов (атропин, ипратропий), или их блокада с одновременной стимуляцией Н-холинорецепторов ацетилхолином (комбинация ипратропия с неостигмином) приводят к нарушению процесса формирования пула сенсибилизированных лимфоцитов, прерывая таким образом формирование иммунологической стадии. Косвенным подтверждением является то, что применение на стадии сенсибилизации метацина или его комбинации с неостигмином не влияло на развитие анафилактической реакции (Нежинская Г.И. и соавт., 2004), что может свидетельствовать о различном действии мускариновых антагонистов, связанном с их метаболитами. Так, метацин, но не ипратропий, распадающийся на фармакологически неактивные N-изопропилтропин, тропин и фенилгликолевую кислоту (Restrepo, 2007), образует метаболит холин (см. рис. 3.2.2), который в качестве мускаринового и никотинового агониста (Cansev et al., 2007) способен усиливать системный ответ В-лимфоцитов, связанный с сенсибилизацией. Подтверждается это тем, что холина альфосцерат или метацин, в отличие от ипратропия (см. рис. 3.1.1) существенно увеличивают системный ответ В-лимфоцитов (14 сутки после иммунизации эритроцитами барана и введения препарата). В пользу этого предположения могут служить данные (см. табл. 3.2.1) об отсутствии антианафилактогенного эффекта у холина альфосцерата на иммунологической стадии анафилактического шока: индекс реакции составил 3,1=Ь0,4 балла.

Введение метацина в комбинации с альбумином, но не с IgG, перед введением сенсибилизирующей дозы лошадиной сыворотки (см. табл. 3.2.4). снижало индекс анафилактической реакции в 2 раза, по сравнению с контролем (сенсибилизированные морские свинки, не получавшие препараты). Аналогичные результаты были получены ранее при применении метацина в комбинации с CRP (Нежинская Г.И. и соавт., 2004), что, вероятно, связано с тем, что альбумин (Hansen et al., 2002) и CRP (Назаров П.Г. и соавт., 2006), обладая неспецифическими связывающими свойствами, могут влиять на эффекты метацина, изменяя, по-видимому, его иммунотропное действие. Подтверждается это тем, что увеличение концентрации альбумина при сенсибилизации не снижает анафилактическую реакцию, в отличие от IgG (см. табл. 3.2.4). Судя по данным литературы, не исключается, что IgG, введенный при сенсибилизации, образует неактивные комплексы с чужеродным белком, предупреждая потенцирующее действие компонентов лошадиной сыворотки на реагинпродуцирующую активность В-лимфоцитов (Strait et al., 2006).

Таким образом, полученные результаты подтверждают возможность применения атропина, ипратропия или его комбинации с неостигмином для десенсибилизации при анафилактическоком шоке, кроме того, в развитии сенсибилизации к антигену важную роль играют белки плазмы крови, усиливая (альбумин) или снижая (IgG) её выраженность.

Оценка влияния холинергических препаратов на патохимическую стадию анафилактического шока показала (см. табл. 3.2.1 и 3.2.2), что среди изученных веществ (метацин, ипратропий или неостигмин, > АИ=2,2—2,3±0,2 балла), введение атропина в комбинации с галантамином (за 30 и 15 мин до индукции шока) наиболее существенно подавляло анафилактическую реакцию (АИ=1,5±0,3 балла). Комбинация ипратропия с неостигмином (за 40 и 15 мин до индукции шока) не влияла на шок (АИ=3,8±0,4 балла), в отличие от комбинации метацина с неостигмином, введенном в том же временном режиме (АИ=0,4±0,02 балла) (Нежинская Г.И. и соавт., 2004). Отсутствие антианафилактогенного эффекта у комбинации ипратропия с неостигмином, возможно, связано с тем, что ипратропий, обладая высоким аффинитетом к пресинаптическим М2-холинорецепторам, может потенцировать выброс ацетилхолина волокнами п. vagus (Hirose et al., 2003), способствуя накоплению избыточных его концентраций на фоне действия неостигмина, и отменяет таким образом бронхолитическое действие комбинации препаратов. Более низкая эффективность комбинации атропина с галантамином, по сравнению с антианафилактогенным действием метацина с неостигмином, может быть связана с тем, что атропин не может полностью блокировать активацию центральных М-холинергических механизмов вызываемую галантамином, приводящую, как известно, к увеличению тонической активности п. vagus, потенцирующей бронхоконстрикцию (Pavlov et al., 2006).

Купирование шоковой реакции комбинацией атропина с галантамином, в отличие от комбинации ипратропия с неостигмином, приводило к существенному снижению числа АОК (см. табл. 3.2.3) и нормализацией содержания серотонина (см. табл. 3.2.6) в селезенке морских свинок. Не исключено, что препараты, изменяя активность М- или Н-холинорецепторов В-лимфоцитов, участвующих в воспалении (Mizoguchi, Bhan, 2006) и продуцирующих серотонин (Yang et al., 2004), модулируют синтез аллергенспецифических антител и интенсивность анафилактической реакции. Косвенно это подтверждается тем, что блокирование шоковой реакции комбинацией метацина с неостигмином сопровождалось нормализацией иммунной (активность В-лимфоцитов) и медиаторной (содержание серотонина в лимфоидных органах) систем (Nezhinskaya et al., 2007).

Таким образом, для подавления патохимической стадии анафилактического шока среди холинергических препаратов центрального действия может быть использован атропин в комбинации с галантамином. Эффективность комбинации зависит от эффектов блокады М-холинорецепторов и холиномиметического действия антихолинэстеразного препарата.

Увеличение концентрации основных фракций белков плазмы крови альбумина или IgG перед индукцией анафилактического шока приводило к снижению анафилактической реакции (альбумин - АИ=1,0±0,1; IgG — АИ=2,3±0,2 балла) (см. табл. 3.2.4). Ограничение анафилаксии альбумином может свидетельствовать о его мембраностабилизирующем действии на клетки воспаления (Beck et al., 1998), или конкурентном взаимодействии препарата IgG и патогенных иммуноглобулинов за связывание с регуляторными FcyR на клетках-мишенях анафилаксии, что предупреждает дегрануляцию тучных клеток, базофилов и активацию В-лимфоцитов (Samuelsson et al., 2001). Однако введение метацина с альбумином или с IgG по-разному влияло на шок. Комбинация метацина с IgG практически полностью предупреждала его (АИ=0,5±0,1 балла) (см. табл. 3.2.4), что может свидетельствовать о суммации нервных - эффекты блокады холинергических эфферентных путей метацином, и ненервных механизмов — снижении системного иммунного ответа, связанного с развитием анафилаксии. При применении комбинации метацина с альбумином отменялись антианафилактические свойства препарата и белка (АИ=4,0±0,5 балла) (см. табл. 3.2.4). Аналогичные данные были получены при применении комбинации метацина с CRP (АИ=3,8±0,1 балла) (Нежинская Г.И. и соавт., 2005). Возможно, что альбумин, обладая неспецифической связывающей функцией (Hansen et al., 2002) и слабой эстеразной активностью (Liederer et al., 2006), как и CRP (Назаров П.Г. и соавт., 2006) может связываться с холинергическим антагонистом. Известно, что при анафилактическом шоке концентрация альбумина в крови существенно снижается (Wood et al., 2000; Chen et al., 2001), а концентрация CRP, напротив, - резко возрастает (Lin et al., 2001; Qian et al., 2008). Можно предположить, что еще одним механизмом действия метацина, снижающим анафилаксию, является связывание им белка острой фазы воспаления, провоспалительные эффекты которого могут сопровождаться активацией клеток воспаления, в частности, тучных клеток (Fujimoto et al., 2003).

Таким образом, полученные данные расширяют представления о функциях белков плазмы крови, связанных с их влиянием на препараты: IgG усиливает антианафилактогенное действие метацина, а альбумин отменяет его.

Результаты предупреждения эндотоксического шока, где маркером его развития служило нарушение сердечного ритма, относящееся к числу ранних признаков расстройств гемодинамики, инициируемых ЛПС (Rudiger, Singer, 2007), показали, что введение галантамина или холина альфосцерата за 30 мин до индукции шока приводило к урежению частоты сердечных сокращений, предупреждая тахикардию, вызванную ЛПС, в отличие от атропина или ипратропия, которые снижали развитие тахикардии, но частота сердечных сокращений оставалась на 10 и 17% выше от исходного уровня (см. табл. 3.3.1). Известно, что холина альфосцерат метаболизируется на холин и глицерофосфатный остаток (Clarke's analysis., 2004). При этом показано, что стимуляция холином Н-холинорецепторов супраоптических ядер гипоталамуса и активация холинергической нейротрансмиссии в зоне вентральной поверхности продолговатого мозга и латеральной области перегородки мозга, сопровождается увеличением плазменной концентрации вазопрессина, который способен устранить нарушения сердечного ритма и гипотензию при шоке (Cavun et al., 2004). Подтверждается это также тем, что введение холина в IV желудочек мозга купирует тахикардию и гипотензию у крыс с эндотоксическим шоком (Savci, Ulus, 1997). Кроме того, отрицательное хронотропное действие холина альфосцерата может быть обусловлено периферическими эффектами холина, который, как известно (Savci et al., 2003), стимулируя М2-холинорецепторы в пейсмейкерах и усиливая холинергическую передачу по парасимпатическим нервным волокнам, иннервирующим миокард, устраняет тахикардию. В эффектах галантамина, проявляющихся в нивелировании тахикардии при эндотоксическом шоке, задействованы аналогичные механизмы, опосредуемые ацетилхолином, накапливающимся в структурах ЦНС и миокарде в результате блокады ацетилхолинэстеразы (Lazartigues et al., 1998).

Анализ данных литературы о механизмах действия центральных М-холиноблокаторов (Wray et al., 2001; Cho et al., 2005) позволяет заключить, что снижение выраженности тахикардии, наблюдаемое при введении атропина перед инициацией эндотоксического шока, обусловлено его ваготоническими эффектами, которые могут быть связаны с блокадой пресинаптических М2-холинорецепторов в центральных холинергических синапсах, приводящей к усилению суммарной импульсации от нейронов ядер п. vagus в составе сосудодвигательного центра продолговатого мозга. Блокада центральных Мхолинорецепторов также может иметь важное значение в нивелировании гипотензии при эндотоксическом шоке, так как показано, что введение Н-холиноблокатора мекамиламина в желудочки мозга перед индукцией шока не предотвращало снижение артериального давления, тогда как применение атропина, значительно снижало интенсивность гипотензивной реакции (Savci, Ulus, 1997). Неэффективность ипратропия при эндотоксическом шоке, по-видимому, может быть обусловлена выраженной блокадой периферических М-холинорецепторов, что препятствует осуществлению кардиопротективных эффектов, реализуемых с участием эфферентов п. vagus. Косвенным подтверждением этого предположения могут служить данные о том, что отрицательный хронотропный эффект холина и его сложноэфирных производных, снижается на фоне действия антагониста периферических М-холинорецепторов атропина метилнитрата (Savci et al., 2003).

Таким образом, полученные собственные результаты и имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о том, что эффекты агонистов М- и Н-холинорецепторов (холина альфосцерат, галантамин) и центральных М-холиноблокаторов (атропин), обуславливающие различные варианты усиления центральной холинергической нейротрансмиссии, могут рассматриваться в качестве потенциальных фармакологических средств для предотвращения гемодинамических расстройств при эндотоксическом шоке.

Развитие эндотоксического шока сопровождалось существенным увеличением числа АОК, по сравнению с контролем (крысами, иммунизированными ЭБ). Введение атропина, галантамина или холина альфосцерата, но не ипратропия, за 30 мин до индукции шока супрессировало антителогенез (см. табл. 3.3.5). Полученные данные частично согласуются с результатами работ (Skok et al., 2005; Fujii et al., 2008), в которых показано, что ацетилхолин и антагонисты М-холинорецепторов способны регулировать пролиферативный ответ В-лимфоцитов, находящихся на разных стадиях дифференцировки при воздействии ЛПС в качестве митогена. Известно, что нормализация В-клеточного ответа при эндотоксическом шоке может играть важную роль в предупреждении развития диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови, так как высокие концентрации IgM-антител при эндотоксемии способны активировать каскад коагуляции (Marshall, 2001) и потенцировать поражение эндотелиоцитов, инициированное ЛПС (Weber, 2003; Aird, 2006). Кроме того, показано, что фармакологическая модуляция антителопродуцирующей функции В-лимфоцитов может оказаться важным элементом в терапии сепсиса (Cohen, 2002; Lacroix-Desmazes et al., 2005; Laupland et al., 2007).

Оценка роли селезенки в эффектах холинергических препаратов показала, что у крыс с эндотоксическим шоком и денервированной селезенкой наблюдалось увеличение частоты сердечных сокращений, а введение галантамина, холина альфосцерата, атропина или ипратропия приводило к снижению тахикардии, вызванной эндотоксином (см. табл. 3.3.3). В контроле показано, что денервация органа (субдиафрагмальная ваготомия) и введение препаратов интактным крысам не влияло на их кардиотропное действие, по сравнению с животными с сохраненным п. vagus (см. табл. 3.3.2 и 3.3.4).

У крыс с эндотоксическим шоком при иннервированной и денервированной селезенке наблюдалось существенное повышение содержания АОК, а введение атропина, холина альфосцерата, галантамина или ипратропия значительно снижало уровень АОК, по сравнению с животными, не получавшими препараты (см. табл. 3.3.5 и 3.3.6). В отличие от этих данных, отсутствие парасимпатических эффектов на селезенку у интактных животных мало влияло на антителопродуцирующую активность В-лимфоцитов (см. табл. 3.3.7). Однако введение атропина сопровождалось снижением, а холина альфосцерата или ипратропия — увеличением содержания АОК, по сравнению с контролем (иммунизация эритроцитами барана). Полученные результаты дополняют известные данные (Huston et al., 2006) о важной роли парасимпатической иннервации в протективных эффектах селезенки при сепсисе, а также могут свидетельствовать о наличии нервных и ненервных механизмов в иммунотропных эффектах холинергических средств, что позволяет использовать их для регуляции иммунного ответа, опосредующего эндотоксический шок.

Изменения иммунного ответа, связанного с активностью В-лимфоцитов, вызванного введением ЛПС, сопровождались существенным возрастанием^ содержания серотонина в селезенке, по сравнению с базальным уровнем (интактные животные). Как известно, увеличение содержания серотонина может быть связано с усилением выброса медиатора в результате агрегации тромбоцитов (Durk et al., 2005) и увеличением активности симпатических нейронов селезенки (Straub, 2004). Введение холина альфосцерата или галантамина за 30 мин до индукции эндотоксического шока приближало концентрацию серотонина в селезенке к базальному уровню (см. табл. 3.3.8). На основании известных данных о роли серотонина. в качестве паракринного медиатора, регулирующего уровень перфузии лимфоидных органов и обеспечивающего их основную защитную роль, связанную ^ с элиминацией антигенного материала (Rogausch et al., 2004), можно полагать, что нормализация активности серотонинергической системы селезенки, вызываемая холина альфосцератом и галантамином, может также вносить вклад в их протективное действие при эндотоксическом шоке.

Денервация селезенки у крыс с эндотоксическим шоком приводила к снижению содержания серотонина в ней, однако введение холина альфосцерата или галантамина сопровождалось нормализацией концентрации медиатора (см. табл. 3.3.8). Полученные результаты позволяют заключить, что, препараты, механизм действия которых связан с усилением холинергической нейротрансмиссии (холина альфосцерат, галантамин) (Машковский М.Д., 2007), оказывая разнонаправленное влияние на содержание серотонина в норме и при денервации, способны восстанавливать активность серотонинергической системы селезенки при различном исходном уровне нервных влияний, реализуемых с участием п. vagus. Кроме того, с позиций имеющихся, в* настоящее время сведений (Yang et al., 2004; Cloez-Tayarani, Changeux, 2007) не исключается, что модуляция медиаторного ответа селезенки холинергическими препаратами может затрагивать также серотонинергическую систему В-лимфоцитов, что представляется одним из альтернативных механизмов регуляции их функций при воспалении.

Таким образом, полученные результаты показывают, что холинергические препараты иммунологически активны в течение 28 суток и более, а также способны влиять на выраженность гиперчувствительности замедленного типа и развитие реакции Артюса, позволяя прогнозировать стадию формирования сенсибилизации организма к антигену и интенсивность воспаления. Антагонисты мускариновых холинорецепторов или их комбинации с антихолинэстеразными препаратами способны оказывать протективное действие на иммунологическую (атропин, ипратропий, ипратропий с неостигмином) и патохимическую (атропин с галантамином) стадию анафилактического шока; холинергическими препаратами можно также предупреждать тахикардию, вызванную эндотоксическим шоком (атропин, холина альфосцерат, галантамин). Антианафилактогенная активность препаратов, в частности, мускаринового антагониста метацина, определяется эффектами его метаболита холина и взаимодействием препарата с белками плазмы крови (альбумин, IgG). Эффективное предупреждение анафилактического и эндотоксического шока сопровождается нормализацией функций В-лимфоцитов и серотонинергических механизмов селезенки. Оценка влияния парасимпатической нервной системы на уровень иммунного (функциональная активность В-лимфоцитов) и медиаторного (содержание серотонина) ответа селезенки свидетельствует о важной роли парасимпатической иннервации лимфоидных органов при воспалительных процессах и указывает на возможность использования нервных и ненервных эффектов холинергических препаратов в терапии шока.

113