Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Роль холинергической и иммунной систем в регуляции воспаления при анафилактическом и эндотоксическом шоке

На правах рукописи

003467708

Владыкин Александр Львович

РОЛЬ ХОЛИНЕРГИЧЕСКОЙ И ИММУННОЙ СИСТЕМ В РЕГУЛЯЦИИ ВОСПАЛЕНИЯ ПРИ АНАФИЛАКТИЧЕСКОМ И ЭНДОТОКСИЧЕСКОМ

ШОКЕ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

о о; г °

Санкт-Петербург 2009

003467708

Работа выполнена в Отделе нейрофармакологии им. C.B. Аничкова Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН

Научный руководитель: Научный консультант:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Нежинская Галина Ивановна член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Сапронов Николай Сергеевич

академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Игнатов Юрий Дмитриевич

доктор биологических наук, профессор Сесь Татьяна Павловна

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение науки «Институт токсикологии» Федерального Медико-Биологического Агентства России

Защита состоится 2009 г. в « _» часов на заседании

диссертационного совета Д001.022.03 при НИИЭМ СЗО РАМН (197376, Санкт-Петербург, Каменноостровский пр., д. 69/71).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12)

Автореферат разослан «•?£?» 2009 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Оу/^'/ 1В. Пучкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Включение шоковых состояний атопической (анафилактический шок) и неатопической (эндотоксический шок) природы в ряд наиболее тяжелых ургентных клинических состояний связано с быстрой генерализацией системной воспалительной реакции (Sampson et al., 2006). Лекарственная терапия эндотоксического шока включает гемодинамические, антимикробные и дезинтоксикационные средства (Мальцева Л.А. и соавт., 2005; Hotchkiss, Karl, 2003), анафилактического шока - антигистаминные препараты, прессорные агенты, бронходилятаторы и системные глкжокортикоиды (Сумин С.А., 2006; Simons, Sheikh, 2007). Однако воздействие не только на эффекторные органы, но и на интегративные системы организма, в частности на нейроиммунные механизмы регуляции позволяет обеспечить как срочные, так и отсроченные адаптивные реакции при шоке (Мазуркевич Г.С., Багненко С.Ф., 2004). Вместе с тем известно, что в профилактике и интенсивной терапии шоковых состояний холинергические средства практически не используются (Tang, 2003), хотя дисфункция холинергической системы играет важную роль в патогенезе анафилактического и эндотоксического шока - поражении легких, сердца, кровеносных сосудов и др. (Pavlov et al., 2006; Gwilt et al., 2007). Попытка коррекции анафилактического и эндотоксического шока в эксперименте показала возможность модуляции активности М-холинорецепторов на уровне периферических эффектов, предупреждая таким образом развитие патохимической стадии анафилактического шока (Нежинская Г.И. и соавт., 2004), или стимуляцией эфферентов nervus vagus {п. vagus) при эндотоксическом шоке («холинергический противовоспалительный ответ») (Тгасеу, 2007).

Иммунный компонент в инициации шоковых состояний атопической и неатопической природы хорошо известен: продукция IgE, IgGl при анафилактическом шоке (Finkelman, 2007); активация афферентов п. vagus медиаторами воспаления IL-lß, TNFa и др. (Pavlov et al., 2006). Однако роль иммунной системы в реализации проявлений шоковой реакции остается недостаточно изученной. Попытки десенсибилизации организма при анафилактическом шоке малоэффективны (Owen, 2007). Об иммунологической стадии эндотоксического шока известно, что в этот период усиливается продукция иммуноглобулина класса IgM (Reid et al., 1997), а денервация селезенки, связанная с нарушением целостности п. vagus, приводит к увеличению продукции провоспалительных цитокинов и смертности животных от шока (Huston et al., 2006).

Целью работы явилось изучение участия холинергической и иммунной систем в регуляции воспаления при анафилактическом и эндотоксическом шоке. Задачи исследования:

1. Оценка на моделях in vitro и in vivo иммунотропной активности холинергических препаратов центрального и периферического действия.

2. Исследование на модели гиперчувствительности замедленного типа с развитием реакции Артюса влияния холинергических препаратов на воспаление и уровень сенсибилизации организма к антигену.

3. Изучение влияния холинергических препаратов на анафилактический индекс реакции при их введении на иммунологической или патохимической стадии анафилактического шока.

4. Изучение влияния холинергических препаратов на изменение частоты сердечных сокращений, вызванное введением липополисахарида Salmonella typhi при индукции эндотоксического шока.

5. Исследование роли парасимпатической системы в развитии эндотоксического шока на модели денервированной селезенки, обусловленной пересечением абдоминальных ветвей п. vagus.

6. Изучение влияния холинергических препаратов на иммунный (уровень антителогенеза) и медиаторный (содержание серотонина) ответ интактной или денервированной селезенки.

Научная новизна работы. Установлено, что препараты центрального действия: антагонист мускариновых рецепторов атропин, агонист мускариновых и никотиновых рецепторов холина альфосцерат и антихолинэстеразный препарат галантамин, а также антагонист периферических мускариновых рецепторов ипратропий иммунологически активны в течение 28 суток и более. Препараты способны модулировать продукцию провоспалителыюго цитокина IL-lß, его рецепторного антагониста IL-lRa, IL-4, инициирующего переключение Thl- на ТЪ2-ответ, и влиять на реакцию гиперчувствительности замедленного типа, лежащую в основе развития воспаления.

Впервые доказана возможность предупреждения иммунологической стадии анафилактического шока с помощью атропина (0,08 мг/кг), ипратропия (6,2 мкг/кг) или его комбинации с неостигмином (0,04 мг/кг). Показано, что для купирования патохимической стадии анафилактического шока эффективно применение атропина (0,08 мг/кг) в комбинации с галантамином (0,4 мг/кг), что приводит к существенному снижению индекса анафилактической реакции.

Установлено, что эффекты периферического мускаринового антагониста метацина могут быть связаны с его фармакологически активным метаболитом холином или с эффектами альбумина, который существенно увеличивал антианафилактогенную активность препарата на иммунологической стадии и сам по себе снижал интенсивность патохимической стадии шока.

Впервые показано снижение тахикардии у крыс с эндотоксическим шоком, получивших за 30 мин до его индукции препараты центрального действия -агонист М- и Н-холинорецепторов холина альфосцерат (90 мг/кг) или антихолинэстеразный препарат галантамин (0,45 мг/кг).

Впервые показано, что, по сравнению с иннервированной селезенкой (интактные крысы), прерывание абдоминальных ветвей п. vagus на уровне

пищевода не влияет на уровень антителогенеза, но снижает в ней содержание серотонина. При эндотоксическом шоке и денервации селезенки холина альфосцерат (90 мг/кг) или галантамин (0,45 мг/кг) снижают функциональную активность В-лимфоцитов, нормализуют содержание серотонина, что свидетельствует о важной роли ненервных эффектов препаратов в реализации шока.

Впервые показана возможность регуляции холинергическими препаратами системного иммунного (активность В-лимфоцитов) и медиаторпого (содержание серотонина) ответа селезенки при анафилактическом и эндотоксическом шоке.

Научно-практическое значение работы. Изучение иммунотропной активности холинергических препаратов центрального действия показало наличие у них пролонгированного действия, что теоретически обосновывает возможность их применения в профилактике и лечении шоковых состояний атопической и неатопической природы. Установлена эффективность применения холинергических препаратов на иммунологической (атропин, ипратропий или его комбинация с неостигмином) и патохимической (атропин в комбинации с галантамином) стадии анафилактического шока, а также при эндотоксическом шоке (холина альфосцерат, галантамин), что может служить предпосылкой для поиска путей фармакологической инициации противовоспалительных механизмов с участием холинергической системы в клинической практике.

Подтверждена результативность применения реакции гиперчувствительности замедленного типа с развитием реакции Артюса для оценки влияния холинергических препаратов на воспаление и уровень сенсибилизации организма к антигену, что позволяет использовать ее для прогноза действия препаратов на иммунологическую стадию анафилактического шока. Показана эффективность модели денервации селезенки, обусловленной нарушением целостности п. vagus, для изучения ненервных эффектов холинергических препаратов. Установление структуры метаболитов метацина позволяет судить об их участии в терапевтических эффектах препарата, а также может иметь важное значение для теоретических и практических аспектов снижения числа побочных эффектов холинергических препаратов и повышения их безопасности.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Холинергические препараты центрального и периферического действия пролонгируют первичный иммунный ответ, модулируют продукцию цитокинов (IL-ip, IL-IRa, IL-4), иммуноглобулинов (IgM, IgG, IgA) и влияют на развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа и развитие реакции Артюса.

2. Формирование иммунологической стадии анафилактического шока можно предупреждать с помощью атропина, ипратропия и его комбинации с неостигмином, патохимической стадии анафилактического шока - введением атропина в комбинации с галантамином, а эндотоксического шока — применением холина альфосцерата или галантамина.

3.На антианафилактогенные эффекты мускаринового антагониста метацина могут влиять его фармакологически активный метаболит холин (метаболизм препарата может проходить по механизму гидролиза) и белки плазмы крови (альбумин, IgG).

4. Купирование холинергическими препаратами анафилактического и эндотоксического шока сопровождается нормализацией антитело- и серотонинпродуцирующей активности спленоцитов. Прерывание парасимпатической иннервации селезенки при эндотоксическом шоке приводит к усилению ненервных эффектов холинергических препаратов, связанных с их действием на спленоциты, модулируя иммунный и медиаторный ответ селезенки.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 5 статей в центральных журналах, рекомендованных перечнем ВАК.

Личный вклад диссертанта заключается в самостоятельном проведении большинства экспериментальных исследований, включая работу с лабораторными животными, проведение лабораторных тестов, статистическую обработку и интерпретацию полученных результатов. Электрокардиографические исследования и операция ваготомии проводились совместно с к.б.н. Н.Р. Евдокимовой (отдел нейрофармакологии им. C.B. Аничкова НИИЭМ СЗО РАМН), которой автор выражает искреннюю благодарность.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на 4-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2006); на 2-м Международном симпозиуме по ненейрональному ацетилхолину (Майнц, Германия, 2006), на III съезде фармакологов России «Фармакология -практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007), на XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008), на 3-м Китайско-Российском международном симпозиуме по фармакологии (Харбин, 2008), на заседании общества фармакологов (Санкт-Петербург, 2009), на заседании отдела нейрофармакологии НИИЭМ СЗО РАМН (2007 - 2009).

Структура и объем работы. Работа изложена на 138 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 35 таблицами и 8 рисунками. Библиографический указатель содержит 228 источников, из которых 27 отечественных и 201 зарубежных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Эксперименты проведены на самцах мышей-гибридов линий (CBAxC57BL/6)Fl массой 18-20 г («=570), на крысах-самцах линии Вистар массой 180-200 г (п=435)\ на цветных морских свинках самцах массой 320-370 г (п=270), полученных из питомника «Рапполово» РАМН. Животных содержали в условиях вивария на стандартном рационе со

свободным доступом к воде при 12 часовом световом режиме.

В работе использовали холинергические препараты центрального и периферического действия (табл. 1).

Таблица 1. Дозы холинергических препаратов для человека и животных._

Препарат

человек

Доза (мг/кг)

морская свинка

крыса

Препараты центрального действия

Атропина сульфат (мускариновый антагонист)

0,014

0,08

0,09

Холина альфосцерат {мускариновый и никотиновый агонист)_

14,3

80,0

90,0

Галантамина гидробромид (ингибитор ацетилхолинэстеразы)

0,072

0,4

0,45

Препараты периферического действия

Метоциния йодид (мускариновый антагонист)

0,029

0,16

0,18

Ипратропия бромид (мускариновый антагонист)

0,0011

0,0062

0,0072

Гексаметония бензолсульфонат (никотиновый антагонист)

0,36

2,0

Неостигмина метилсульфат (ингибитор ацетилхолинэстеразы)

0,0072

0,04

Примечание. Препараты применяли в терапевтических дозах для человека (Машковский М.Д., 2007), пересчитанных для конкретного вида животных (мыши, крысы, морские свинки) (Волчегорский И.А. и соавт., 2000).

Из белков плазмы крови в исследование были взяты альбумин человека в дозе 800 мг/кг - для мышей, 500 мг/кг - для морских свинок (Meziani et al., 2007) и нормальный донорский у-глобулин (98% IgG) (Машковский М.Д., 2007) в дозе 1,6 мг/кг - для мышей, 1 мг/кг - для морских свинок. В качестве белка сравнения использовали С-реактивный белок человека (CRP) (Нежинская Г.И. и соавт., 2004).

На моделях in vivo оценивали влияние препаратов на первичный иммунный ответ на эритроциты барана (ЭБ), связанный с антителопродуцирующей активностью клеток (АОК/106 спленоцитов) у мышей-гибридов линий (CBAxC57BL/6)Fl (1x106клеток/животное), крыс Вистар (1хЮ8клеток/животное), морских свинок (1х109 клеток/животное) (Jerne et al., 1974). Динамику АОК определяли в течение 28 суток у мышей после иммунизации ЭБ и введения им препаратов (атропин, холина альфосцерат, галантамин, ипратропий).

Содержание серотонина в селезенке морских свинок и крыс определяли в депротеинизированных образцах ткани органа (Rogausch et al., 2004) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе «Beckman System Gold» (США), оснащенным колонкой SphereCione 5 ц ODS 2 (250x4,60 мм) с предколонкой SecurityGuard (ODS 4x3,0 мм) и электрохимическим

детектором LC-4C. Идентификацию и количественную оценку медиатора осуществляли в сравнении с внешним стандартом серотонина. Концентрацию серотонина выражали в нг на 1 мг белка в ткани селезенки. Содержание белка определяли по методу Лоури (Досон Р. и соавт, 1991)

На моделях in vitro оценивали продукцию цитокинов (IL-1|3, IL-IRa, IL-4) и иммуноглобулинов (IgM, IgG, IgA) мононуклеарными лейкоцитами периферической крови человека с помощью соответствующих коммерческих наборов («Вектор-Бест», Россия), согласно прилагаемой инструкции. Измерение оптической плотности проводили на микропланшетном ридере Synergy 2 (BioTek, США).

Гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ), лежащую в основе развития реакции Артюса, моделировали подкожной инъекцией в основание хвоста мышей-гибридов линий (CBAxC57BL/6)Fl сенсибилизирующей дозы (0,02 мл) полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) (Sigma, Германия) (Медуницин Н.В., 1983). Холинергические препараты - атропин, галантамин, холина альфосцерат, метацин, ипратропий, гексаметоний, неостигмин вводили внутрибрюшинно одновременно с сенсибилизирующей дозой ПАФ. Комбинацию атропина с галантамином вводили за 30 и 15 мин соответственно, ипратропия с неостигмином - за 40 и 15 мин соответственно до инициации ГЗТ. Развитие реакции ГЗТ оценивали по отеку хвоста через 30 мин, 3, 6 и 24 ч после введения ПАФ и препаратов (Jacysyn et al., 2001).

Содержание АОК в ответ на введение сенсибилизирующей дозы ПАФ (0,02 мл) определяли на уровне локального (5 сутки) и системного (14 сутки) иммунного ответа.

Реакцию Артюса, позволяющую оценивать влияние препаратов на развитие воспаления, и являющуюся моделью иммунологической стадии анафилактического шока, инициировали через 2 недели после сенсибилизации мышей путем введения им в основание хвоста разрешающей дозы ПАФ (подкожно 0,02 мл) (Медуницин Н.В., 1983). Интенсивность воспаления оценивали по степени повреждения кожных покровов (сроки появления язв, характер и площадь поражений) ежедневно в течение 21 суток после введения разрешающей дозы ПАФ.

Анафилактический шок вызывали у морских свинок, предварительно сенсибилизированных подкожным введением 0,1 мл нормальной лошадиной сыворотки (ЛС) («Микроген», Россия), которым через 14 дней внутрисердечно вводили разрешающую дозу ЛС (0,5 мл). Анафилактический индекс (АИ) развития шока оценивали по четырехплюсовой системе Weigle через 1-3 мин после введения разрешающей дозы (Хаитов P.M. и соавт., 2005). Холинергические препараты - атропин, галантамин, холина альфосцерат, ипратропий, гексаметоний, неостигмин, или белки плазмы крови - альбумин или IgG вводили внутрибрюшинно одновременно с сенсибилизирующей дозой ЛС (оценка влияния препаратов на иммунологическую стадию шока) или за 30

Kl и н до индукции шока (оценка влияния препаратов на патохимическую стадию шока). Комбинацию атропина с галантамином вводили за 30 и 15 мин соответственно, а ипратропия с неостигмином - за 40 и 15 мин соответственно, метацина с альбумином или IgG - за 40 мин до инъекции разрешающей дозы ЛС. Через 24 часа после перенесенного шока у морских свинок (получили разрешающую дозу ЛС в объеме 0,3 мл) определяли количество АОК и содержание серотонина в селезенке.

Эндотоксический шок воспроизводили у крыс линии Вистар путем внутрибрюшинного введения в сублетальной дозе (20 мг/кг в 0,5 мл физиологического раствора) липополисахарида Salmonella typhi (S. typhi) штамм ty-4441 (ЛПС) (НИИ вакцин и сывороток, Россия) (Strunk et al., 2001). Атропин, галантамин, холина альфосцерат или ипратропий инъецировали внутрибрюшинно за 30 мин до индукции шока. Оценку действия препаратов на течение шока проводили через 2 часа после их введения по характеру изменения частоты сердечных сокращений (ЧСС) на электрокардиограмме (ЭКГ) (Wu et al., 1998), которую регистрировали во втором стандартном отведении на приборе ЭК1Т-03М2. Количество АОК и содержание серотонина в селезенке крыс также определяли через 24 часа после перенесенного ими шока.

Субдиафрагмалъную еаготомию, связанную с пересечением дорсальной и вентральной ветвей п. vagus, идущих вдоль пищевода (Huston et al., 2006), проводили с целью выяснения роли селезенки, основного защитного органа иммунной системы (Rogausch et al., 2004), в развитии эндотоксического шока (регистрация ЧСС) и реализации ненервных эффектов холинергических препаратов (оценка антитело- и серотонинпродуцирующей функций спленоцитов). Пересечение п. vagus, иннервирующего селезенку проводили за 24 часа до введения крысам сублетальной дозы ЛПС. За 30 мин до введения ЛПС крысы также получали атропин, галантамин, холина альфосцерат или ипратропий внутрибрюшинно. Через 24 часа у крыс определяли содержание серотонина в селезенке, а через 5 суток - количество АОК. Идентификацию метаболитов мешанина проводили через 30, 60, 90, 120 и 150 мин после внутрибрюшинной инъекции препарата в дозе 0,18 мг/кг. Гепаринизированную кровь центрифугировали при 200g в течение 10 мин, отделяли плазму. Наличие метаболита 2-гидрокси-2,2-дифенилуксусной кислоты в плазме определяли хромато-масе-спектрометрическим методом (Mass spectrometry..., 2007) на установке Agilent 6890N (США) (температура источника 230° С, энергия ионизации - 70 эВ). Определение метацина в плазме крови осуществляли методом ВЭЖХ с использованием подвижной фазы ацетонитрил.фосфатный буфер (pH3,5) в соотношении 55:45, колонки Nucleosi) С18 (150x4,6 мм, зернение 5мкм) на хроматографе «Shimadzu-10A» (Shimadzu, Япония), при длине волны УФ-детектора 252, 258 и 264 нм (Poole, 2003). Статистическую обработку экспериментальных данных проводили в пакете программ Statistica 6.0 (StatSoft, США) с помощью t-критерия Стьюдента.

Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Различия считали достоверными прир<0,05 - 0,001.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка иммунотуопной активности холинергических препаратов. Изучение влияния холинергических веществ на развитие первичного иммунного ответа (5 сутки после иммунизации ЭБ и введения мышам-гибридам (CBAxC57Bl/6)Fl препаратов) показало, что препараты по-разному действуют на него. Так, применение атропина (2501±20б; п=6, р<0,001), галантамина (862±32; п=б, р<0,001), холина альфосцерата (3374±171; л=6, р<0,001) или гексаметония (980±32; п=б, р<0,001) приводило к существенному увеличению количества АОК/Ю6 спленоцитов, в отличие отметацина (560±30/ п=6, р<0,001), ипратропия (453±10; п=6, р<0,05) или неостигмина (507±18; п=6, р<0,05), где данные незначительно отличались от контроля (408±13; п~6) (иммунизированные ЭБ животные, не получавшие препараты).

Динамика АОК в спленоцитах мышей, получивших холина альфосцерат, атропин, галантамин или ипратропий характеризовалась тем, что препараты усиливали антителогенез в течение 28 и более суток. Установлено, что холина альфосцерат, в отличие от атропина или ипратропия, существенно усиливал системный иммунный ответ (14 сутки), связанный с активностью В-лимфоцитов (табл. 2). Полученные данные совпадают с результатами оценки динамики АОК, инициированной периферическими мускариновыми и никотиновыми агонистами и антагонистами (метацин, гексаметоний и др.), свидетельствующих об инициации ими длительности иммунной реакции (Нежинская Г.И., 1999). На моделях in vitro в нестимулированных митогеном культурах мононуклеаров крови человека и стимулированных форболмиристацетатом культурах холинергические препараты вызывали усиление на 3-4 порядка синтеза IL-ip, по сравнению с контролем (культуры, в которые не добавляли препараты). Препараты также индуцировали синтез IL-IRa в нестимулированных культурах. Однако в митогениндуцированных культурах препараты не влияли на синтез IL-IRa, свидетельствуя тем самым об однонаправленном влиянии на синтез про- и противовоспалительных цитокинов. Эти препараты не влияли на продукцию IL-4, который, как известно, обеспечивает переключение иммунной реакции с Thl- на ТЬ2-ответ (Elenkov et al., 2005). Показано, что атропин, галантамин, холина альфосцерат, ипратропий снижали индуцированную митогеном лаконоса продукцию IgG в культуре мононуклеаров периферической крови человека, по сравнению с контролем (культуры, в которые не добавляли препараты) и не влияли на спонтанную и митогениндуцированную продукцию IgM. Кроме того, галантамин статистически достоверно подавлял спонтанный синтез IgG, а также спонтанный и митогениндуцированный синтез IgA.

Оценка характера формирования гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), лежащей в основе развития реакции Артюса, показала, что препараты периферического действия (метацин, ипратропий, гексаметоний, неостигмин) мало влияли на фазу инициации ГЗТ (30 мин, 1 ч, 6 ч).

Таблица 2. Оценка иммунотропных свойств холинергических препаратов.

Препарат

Уровень антителогенеза в селезенке (сутки)'

5

14

21

28

Мононуклеарные клетки периферической крови человека

Цитокины

Иммуноглобулины

Атропин (0,13 мг/кг)

ТТТ

тт

ТТТ

|1Ир спонт., стим. Т1Ь-1Яа спонт.

стим.

Холина альфосцерат (130 мг/кг)_

ТТТ

ТТТ

ТТ

тт

|1Ь-ф спонт., сгам. Т1Ь-1Яа спонт.

|1§0 стим.

Галантамин (0,65 мг/кг)

ТТ

тт

тт

Т1Ь-1р спонт., стим. |1Г-1Яа спонт.

7IgA спонт., стим, спонт., стим.

Ипратропий (0,01 мг/кг)

ТТ

|1Ь-1р спонт., стим. ]ГЬ-Ща спонт.

ДбО стим.

Примечание. ТТТ, ТТ, Т - увеличение, [ - уменьшение, <-* - отсутствие значимых изменений показателя; 1 - влияние препаратов на число АОК сравнивали с уровнем антителогенеза у мышей, иммунизированных ЭБ и не получавших препараты (5 сутки - Т, 14 сутки - 21 и 28 сутки -«-»); спонт. (спонтанная) или стим. (стимулированная) продукция цитокинов (индуктор синтеза - форболмиристацетат) и иммуноглобулинов (индуктор синтеза - митоген лаконоса).

При их введении в эти сроки отек основания хвоста снижался (на 0,10 - 0,59±0,09 мм), по сравнению с контролем (сенсибилизированные ПАФ мыши, не получавшие препараты). Через 24 часа отечная реакция отсутствовала у мышей, получивших метацин или неостигмин, по сравнению с пролонгирующими эффектами других периферических антагонистов (ипратропий, гексаметоний) (п=6, р<0,05). Применение препаратов центрального действия - холина альфосцерата или комбинации атропина с галантамином, в отличие от атропина или галантамина, введенных самих по себе, приводило к увеличению отека не только на сроках развития ГЗТ, но и спустя 24 часа (и=6, р<(), 05).

Развитие сенсибилизации, вызванное введением ПАФ, сопровождалось значительным увеличением числа АОК/Ю6 спленоцитов на 5 сутки (локальный иммунный ответ) и 14 сутки (системный иммунный ответ) (1020±138 и 1076±79 соответственно), по сравнению с контролем (иммунизация ЭБ интактных животных; 480±45 и 320±37 соответственно) {п=6, р<0,05). Применение ипратропия или метацина, но не гексаметонкя или неостигмина, приводило к существенному снижению локального и системного ответа В-лимфоцитов, в отличие от галантамина или холина альфосцерата, которые не влияли на содержание АОК, по сравнению с

сенсибилизированными животными, не получавшими препараты. Введение атропина приводило к увеличению локального иммунного ответа и снижало системный ответ, инициированный введением ПАФ.

Оценка развития реакции Артюса (появление язв в основании хвоста мышей) показала, что ипратропий полностью предупреждал наступление реакции Артюса, в отличие от метацина, гексаметония, неостигмина или галантамина, которые не влияли на её развитие: язвы, как и в контроле (введение разрешающей дозы ПАФ через две недели после сенсибилизации), появлялись на 3 сутки. В отличие от этих препаратов, холина альфосцерат, комбинация атропина с галантамином отодвигали сроки появления язв на 5 сутки, атропин -на 7 сутки, комбинация ипратропия с неостигмином - на 14 сутки. Кроме того, атропин или ипратропий в комбинации с неостигмином также существенно снижали площадь язвенных поражений и частоту их появления (рис. 1).

35

30

5 25

£ 20 Л

3 15

3

о с; С

10

29%

38%

3

сутки

*

«Щ 4.

17%

*

100%

100%

5

сутки

100%

100%

7

сутки

17%

14 сутки

23.% I

Рис. 1. Влияние холинергических препаратов на развитие реакции Артюса. 1 - контроль (сенсибилизированные ПАФ мыши, не получавшие препараты), 2 - метацин, 3 -гексаметоний, 4 - галантамин, 5 - неостигмин, 6 - атроиин+галантамин, 7 - холина альфосцерат, 8 - атропин, 9 - ипратропий+неостигмин; сутки - сроки появления язв, % - количество мышей в группе с язвами в основании хвоста. Каждая группа включала б животных. * - р<0,05 по сравнению с контролем.

Таким образом, холинергические препараты, обладающие разным механизмом действия, обладают иммунотропной активностью и обеспечивают пролонгированный иммунный ответ, связанный с В-лимфоцитами, в течение 28 и более суток. Реакция ГЗТ с развитием реакции Артюса в качестве модели развития иммунологической стадии шока, может служить прогностическим маркером для выбора холинергических препаратов, способных десенсибилизировать организм, предупреждая таким образом анафилактический шок. Влияние холинергических препаратов на анафилактический шок. Введение атропина, ипратропия или его комбинации с неостигмином вместе с сенсибилизирующей дозой ЛС (подкожно 0,1 мл) приводило к снижению АИ до 2,2-2,4±0,2, по сравнению с 4,0±0,0 баллами в контроле (сенсибилизированные морские свинки, не получавшие препараты) («=5; р<0,001), что свидетельствует

о десенсибилизирующем эффекте препаратов. Известно, что применение метацина или его комбинации с неостигмином по той же схеме не влияло на развитие анафилактической реакции (Нежинская Г.И. и соавт., 2004), что косвенно свидетельствует о различном действии мускариновых антагонистов, связанном с их метаболитами. В частности, показано, что ипратропий метаболизируется на фармакологически неактивные 1Ч-изопропилтрошш, тропин и фенилгликолевую кислоту (ИевЦ-еро, 2007). Собственными исследованиями установлено, что через 30-40 мин после введения метацина из крови крыс выделяется 2-гидрокси-2,2-дифенилуксусная кислота (рис. 2), что может свидетельствовать о разрыве сложноэфирной связи в молекуле препарата и образовании в качестве второго метаболита холина.

I.« 100

W

60

40

20

0

105

11

-V-4-

163

JL

Основные осколочные ионы:

m/z 105 - [C6HsCO]+ m/z 183 - [(C6H5)2COHf m/z 77 - [C6H5]+ m/z 51 - [C4H3]+

10 40 60 SO 100 120 HO 1(0 ISO 205 220 sh

Рис. 2. Масс-спектр 2-гидрокси-2,2-дифенилуксусной кислоты, выделенной из плазмы крови крыс, получивших метацин.

По оси ординат - относительная интенсивность пика иона (I, %); по оси абсцисс - отношение массы иона к его заряду (m/z).

Можно предположить, что метацин, образуя метаболит холин, который способен влиять на системный ответ B-лимфоцитов, потенцирует развитие сенсибилизации. Подтверждается это тем, что холина альфосцерат, в отличие от ипратропия, существенно увеличивает системный ответ В-лимфоцитов (табл. 2). Введение холина альфосцерата вместе с сенсибилизирующей дозой ЛС не отменяет анафилаксию (АИ=3,1±0,4 балла). Кроме того, на эффекты препаратов могут влиять белки плазмы крови (рис. 3). Увеличение концентрации IgG, но не альбумина, на иммунологической стадии шока приводило к снижению анафилактической реакции. Объясняется это тем, что IgG, введенный при сенсибилизации, образует неактивные комплексы с чужеродным белком, предупреждая потенцирующее действие компонентов лошадиной сыворотки на реагинпродуцирующую активность В-лимфоцитов (Strait et а!., 2006), Однако применение метацина с альбумином, но не с IgG, в этих условиях снижало АИ в 2 раза, по сравнению с контролем (морскими свинками, не получавшими препараты).

Рис. 3. Влияние альбумина и IgG на антианафилактогенные эффекты метацина. I - иммунологическая стадия; II - патохимическая стадия.

1 - контроль сенсибилизированные морские свинки, не получавшие препараты), 2 -метацин+альбумин, 3 - метация+IgG, 4 - альбумин, 5 - IgG, б - метацин. Каждая группа включала 5 животных. * - р<0,05 по сравнению с контролем.

Вместе с тем, введение метацина с альбумином на патохимической стадии не влияло на развитие шока, что может, как известно, свидетельствовать о неспецифическом связывании препарата белком (Hansen et al., 2002) или способности разрушать его: альбумин обладает слабой эстеразной активностью (Liederer, Borchardt, 2006), изменяя таким образом иммунотропные и бронхолитические свойства мускаринового антагониста. Протективное действие метацина с IgG на патохимической стадии может свидетельствовать о суммации эффектов блокады холинергических эфферентных путей и снижении системного иммунного ответа, связанного с развитием анафилаксии. Показано, что конкурентные взаимодействия препарата IgG и патогенных иммуноглобулинов за связывание с регуляторными FcyR на клетках-мишенях анафилаксии, предупреждают дегрануляцию тучных клеток, базофилов и активацию В-лимфоцитов (Samuelsson et al., 2001). Увеличение концентрации альбумина перед индукцией анафилактического шока приводило к снижению анафилактической реакции, что может свидетельствовать о мембрано-стабилизирующем действии альбумина на клетки воспаления (Beck et al, 1998).

Оценка влияния холинергических препаратов на патохимическую стадию анафилактического шока показала (рис. 4), что среди них (метацин, ипратропий или неостигмин, АИ=2Д-2,3±0,2 балла) наиболее существенно подавляли анафилактическую реакцию атропин с галантамином (АИ=1,5±0,3 балла). Комбинация ипратропия с неостигмином (за 40 и 15 мин до индукции шока) не влияла на шок (АИ=3,8±0,4 балла), в отличие от комбинации метацина с неостигмином, введенной в том же временном режиме (АИ=0,4+0,02 балла) (Нежинская Г.И. и соавт., 2004).

Отсутствие антианафилактогенного эффекта у комбинации ипратропия с неостигмином, возможно, связано с тем, что ипратропий, обладая высоким сродством к пресинаптическим М2-холинорецепторам, способен потенцировать

выброс волокнами п. vagus ацетилхолина (Hirose et al., 2003), способствуя накоплению избыточных его концентраций на фоне действия неостигмина, усиливая таким образом бронхоконстрикцию. Более низкая эффективность комбинации атропина с галантамином, по сравнению с антианафилактогенным действием метацина с неостигмином, может быть связана с тем, что атропин не может полностью блокировать активацию центральных М-холипергических механизмов, вызываемую галантамином, приводящую, как известно, к увеличению тонической активности п. vagus, потенцирующей бронхоконстрикцию (Pavlov et al, 2006).

Рис. 4. Влияние холинергических препаратов на патохимическую стадию анафилактического шока у морских свинок.

1 - контроль (сенсибилизированные морские свинки, не получавшие препараты), 2- встроит. 3 - галаятамин, 4 - холина альфосцерат, 5 - атропин+галантамин, 6 - метацин, 7 - ипратропий, 8 -неостигмин, 9 - ипратропий+неостигмин. Каждая группа включала 5 животных. *.$*.*** _ р<д о5 . о,001 по сравнению с контролем.

Введение холина альфосцерата на патохимической стадии не влияло на развитие шока (АИ=4,0±0,0 балла) (рис. 4), что может быть связано, как известно (Cansev et al, 2007), с усилением центральной и периферической холинергической нейротрансмиссии, свидетельствуя таким образом о важности снижения активности п. vagus и блокады периферических М-холинорецепторов. Снижение анафилаксии (атропин+галантамин, метацин+igG) сопровождалось существенным снижением числа АОК и содержания серотонина в селезенке у морских свинок (табл. 3).

Известно, что B-лимфоциты, участвуя в воспалении (Mizoguchi, Bhan, 2006), могут быть источником серотонина (Yang et al., 2004). Не исключено, что препараты, изменяя активность М- или Н-холинорецепторов В-лимфоцитов, модулируют эффекты серотонина, регулируя таким образом продукцию аллергенспецифических антител и интенсивность анафилактической реакции. Подтверждается это известными данными (Nezhinskaya et al., 2007) о том, что купирование шоковой реакции комбинацией метацина с неостигмином

сопровождалось нормализацией иммунной (активность В-лимфоцитов) и медиаторной (содержание серотонина в лимфоидных органах) систем.

Таблииа 3. Влияние холинергических препаратов на содержание антителообразующих клеток (АОК) и серотонина (нг/мг белка) в селезенке морских свинок, перенесших анафилактический шок._

Препарат Число АОК/Ю6 спленоцитов1 Концентрация серотонина2

Контроль 1 100129 1,532±0,004

Контроль 2 880+22*** 0,443±0,005*

Атропин (0,08 мг/кг) 806±151*** 2,182±0,004*'*

Галантамин (0,4 мг/кг) 797±68*** 3,385±0,005*'#

Холина альфосцерат (80 мг/кг) 1066±98*** 3,527±0,005*'"

Атропин (0,08 мг/кг)+ галантамин (0,4 мг/кг) 210±10**'х 1,512±0,005*'#

Метацин (0,16 мг/кг) 188±20*,х 1,452±0,004*>#

Ипратропий (6,2 мкг/кг) 483±12***'х 0,717±0,005*'#

Неостигмин (0,04 мг/кг) 250±70" 1,093±0,005*'#

Ипратропий (6,2 мкг/кг) + неостигмин (0,04 мг/кг) 983±97*** 0,322±0,005*'#

Примечание. Препараты вводили за 30 мин до индукции анафилактического шока. Комбинацию атропина с галантамином применяли за 30 и 15 мин до шока соответственно, а комбинацию ипратропия с неостигмином - за 40 и 15 мин соответственно. Каждая группа включала 5 животных. 1 - *■**•*** - р<0,05 - 0,001 по сравнению с контролем 1 (интактные морские свинки, иммунизированные ЭБ), * - р<0,001 по сравнению с контролем 2 (сенсибилизированные морские свинки, не получавшие препараты); 2 - * - р<0,001 по сравнению контролем 1 (базальная концентрация серотонина у интактных морских свинок), * - р<0,001 по сравнению с контролем 2 (концентрация серотонина у сенсибилизированных морских свинок, не получавших препараты).

Таким образом, для предупреждения развития иммунологической стадии анафилактического шока могут быть использованы атропин, ипратропий или его комбинация с неостигмином, а патохимической стадии - атропин в комбинации с галантамином. Антаанафилактогеннные эффекты препаратов могут быть связаны с эффектами их метаболитов или белков плазмы крови (альбумин, IgG). Влияние холинергических препаратов на эндотоксический шок. Результаты исследований показали (табл. 4), что индукция эндотоксического шока сопровождалась развитием тахикардии: через 2 часа после внутрибрюшинной инъекции ЛПС S. typhi в дозе 20 мг/кг ЧСС возрастала на 21,6±0,4% от базального уровня. Введение за 30 мин до эндотоксического шока галантамина, атропина или ипратропия снижало развитие тахикардии, но ЧСС оставалась на 2,1±0,1%, 9,5±0,1% и 16,7±0,2% выше от исходного уровня. Введение холина альфосцерата приводило к отрицательному хронотропному действию, вызывая урежение ЧСС на 4,2±0,2% от исходного уровня, что существенно

предупреждало тахикардию, инициированную ЛПС. На основании известных данных (Ьагаг^иеэ е1 а1., 1998; БауЫ & а1., 2003; Сауип ^ а!., 2004) можно предположить, что протективные эффекты холила альфосцерата или галантамина при эндотоксическом шоке могут быть связаны со стимуляцией Н-холинорецепторов нейронов супраоптических ядер гипоталамуса и активацией холинергической нейротрансмиссии в зоне вентральной поверхности продолговатого мозга и латеральной области перегородки мозга, что приводит к увеличению продукции вазопрессина, который способен устранить нарушения сердечного ритма и гипотензию, а также - с возбуждением М2-холинорецепторов в миокарде, предупреждающим развитие тахикардии.

Развитие эндотоксического шока сопровождалось существенным увеличением количества АОК, по сравнению с контролем (крысы, иммунизированные ЭБ). Введение атропина, галантамина или холина альфосцерата, но не ипратропия, за 30 мин до индукции шока подавляло антителогенез (табл. 4).

Таблица 4. Влияние холинергических препаратов на содержание АОК (на 106 спленоцитов), серотонина (нг/мг белка) и частоту ритма сердца (уд/мин) у крыс при эндотоксическом шоке.

Препарат Число АОК' Концентрация серотонина2 ЧСС3

Контроль 350±82 5,4б5±0,005 -

Крысы, не получавшие препараты 746±16* 58,436±0,00бх +76±8

Атропин (0,09 мг/кг) 108±10* 3,319±0,005х +34±7*

Галантамин (0,45 мг/кг) 145±10* 5,453±0,005х

Холина альфосцерат (90 мг/кг) 151±10* 5,387±0,004х -15±3Й

Ипратропий (7,2 мкг/кг) 448±21 2,167±0,006х +66±7#

контролем - итактными крысами, иммунизированными ЭБ; - * — р<0,001 по сравнению с контролем - итактными крысами, не получавшими препараты;3 - величина разности частоты сердечных сокращений (ЧСС) между действием препарата и исходным уровнем (до введения препарата)," - р<0,001 по сравнению с крысами, не получавшими препараты.

Полученные данные частично согласуются с результатами работ (Skok et al., 2005; Fujii et al., 2008), в которых показано, что ацетилхолин и антагонисты М-холинорецепторов способны регулировать пролиферативный ответ В-лимфоцитов, находящихся на разных стадиях дифференцировки, в ответ на введение ЛПС в качестве митогена. Известно, что нормализация В-клеточного ответа может играть важную роль в предупреждении развития диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови, так как высокие концентрации IgM-антител при эндотоксемии способны активировать каскад реакций коагуляции (Marshall, 2001) и потенцировать поражение эндотелиоцитов, вызываемое введением ЛПС (Weber, 2003; Aird, 2006). Кроме того, показано, что фармакологическая модуляция антителогенеза может

оказаться важным элементом в терапии сепсиса (Ьаспмх-Везтагез е1 а1., 2005; Ьаир1апс1 еХ а!., 2007). Развитие эндотоксического шока приводило к значительному увеличению уровня серотонина в селезенке. Введение препаратов снижало его концентрацию, при этом холина альфосцерат или галантамин наиболее эффективно приближали содержание медиатора к базальному уровню (интактные животные) (табл. 4). Принимая во внимание важную роль серотонина в качестве паракринного медиатора, регулирующего уровень перфузии лимфоидных органов и обеспечивающего их основную защитную роль (Кх^ашсЬ а1., 2004), можно предположить, что холинергические препараты, регулирующие уровень серотонина, могут применяться для успешной элиминации антигенного материала при септических состояниях.

Таким образом, полученные данные показывают, что холинергическими препаратами центрального и периферического действия можно нивелировать тахикардию и снижать иммунный ответ, опосредующие эндотоксический шок, а также нормализовать активность серотонинергических механизмов селезенки.

Оценка роли парасимпатической иннервации селезенки в эффектах холинергических препаратов показала, что если у крыс с эндотоксическим шоком и денервированной селезенкой наблюдалось увеличение частоты сердечных сокращений, то введение галантамина, холина альфосцерата, атропина или ипратропия приводило к снижению тахикардии, вызванной эндотоксином (табл. 5). Показано также, что сама по себе парасимпатическая денервация селезенки не влияла на кардиотропное действие препаратов. Введение атропина или ипратропия сопровождалось положительным хронотропным эффектом: через 2 часа после введения препаратов ЧСС возрастала при ваготомии - на 11,1±0,2% и 11,9±0,3% соответственно, у ложнооперированных животных - на 10,8±0,2% и 12,4±0,3% соответственно, по сравнению с ЧСС у интактных животных. Введение галантамина или холина альфосцерата сопровождалось урежением сердечного ритма на 5,2±0,1% и 4,7±0,1% соответственно - у крыс с ваготомией и на 5,2±0,2% и 5,0±0,1% от исходных значений соответственно - у ложнооперированных крыс (п=5;р<0,001). Установлено, что у крыс с эндотоксическим шоком при иннервированной и денервированной селезенке наблюдалось существенное повышение содержания АОК, а введение атропина, холина альфосцерата, галантамина или ипратропия значительно снижало уровень АОК, по сравнению с животными, не получавшими препараты. В отличие от этих данных, отсутствие парасимпатических влияний на селезенку у интактных животных мало влияло на антителопродуцирукяцую активность В-лимфоцитов. Однако введение атропина сопровождалось снижением, а холина альфосцерата или ипратропия -увеличением содержания АОК, по сравнению с контролем (крысы, иммунизированные ЭБ).

■Таблица 5. Влияние денервации селезенки на ЧСС (уд/мин), и содержание в ней АОК (на 10б спленоцитов) и серотонина (нг/мг белка) у крыс с эндотоксическим шоком.

Препарат Число АОК1 Концентрация серотонина2 ЧСС3

п. vagus Денервация п. vagus Денервация п. vagus Денервация

Контроль 452± 13 345± 13 5,318± 0,005х 1,564± 0,005х'п - -

Крысы,не получавшие препараты 824± 47* 1676± 172*'" 56,588± 0,006х'а 0,060± 0,004х'п +76± 8 +114± 11

Атропин (0,09 мг/кг) 113± 16* 416± 64*'* 3,413± 0,005*'° 9,338± 0,004х° +34± 7* +26± 7°

Галантамин (0,45 мг/кг) 163± 24* 611± 5,441± 0,005х'° 5,743± 0,004х'" +9± 2* +26± 8°

Холина альфосцерат (90 мг/кг) 165± 19* 366± 61*'# 5,250± 0,004х'° 5,451± 0,005° -16± 3♦ +19± 6°

Ипратропий (7,2 мкг/кг) 468± 35* 600± 28*'" 2,307± 0,006X,D 6,719± 0,006х'° +66± Г +54± 8°

Примечание. Интактный п. vagus - ложнооперированные животные, денервация - крысы с субдиафрагмальной ваготомией. Каждая группа включала 5 животных.

1 - * - р<0,001 по сравнению с крысами, иммунизированными ЭБ (число АОК - 350±82/106 спленоцитов), ® - р<0,001 по сравнению с крысами с эндотоксическим шоком, не получавшими препараты, * - р<0,001 по сравнению с ложнооперировапными крысами с эндотоксическим шоком, не получавшими препараты; 2 - х - р<0,001 по сравнению с базальным уровнем - содержанием серотонина в селезенке итактных крыс, не получавших препараты (5,465±0,005 нг/мг белка), ° - р<0,001 по сравнению с ложнооперировапными крысами; 3 - величина разности частоты сердечных сокращений (ЧСС) между действием препарата и исходным уровнем (до введения препарата); 0 - р<0,001 по сравнению с крысами, не получавшими препараты.

Полученные результаты дополняют известные данные (Huston et al., 2006) о важной роли парасимпатической иннервации в протективных эффектах селезенки при сепсисе, а также могут свидетельствовать о наличии нервных и ненервных механизмов в иммунотропных эффектах холинергических средств, что позволяет использовать их для регуляции иммунного ответа, опосредующего эндотоксический шок. Денервация селезенки у крыс с эндотоксическим шоком приводила к снижению содержания серотонина в ней, однако введение холина альфосцерата или галантамина сопровождалось нормализацией концентрации медиатора (табл. 5). Кроме того, показано, что само по себе нарушение целостности эфферентов п. vagus сопровождалось снижением содержания серотонина в селезенке в 3,5 раза по сравнению с базальной концентрацией (интактные животные), однако введение холинергических препаратов вызывало мобилизацию серотонинергической системы органа {п=5, р<0,001). Полученные результаты позволяют заключить, что препараты, механизм действия

которых связан с усилением холинергической нейротрансмиссии (холина альфосцерат, галантамин), оказывая разнонаправленное влияние на содержание серотонина в норме и при денервации, способны восстанавливать активность серотонинершческой системы селезенки при различном исходном уровне нервных влияний, реализуемых с участием п. vagus. Кроме того, с позиций имеющихся в настоящее время сведений (Yang et al., 2004; Cloez-Tayarani, Changeux, 2007) не исключается, что модуляция медиаторного ответа селезенки холинергическими препаратами может затрагивать также серотонинергическую систему B-лимфоцитов, являясь одним из альтернативных механизмов регуляции их функций при воспалении.

Таким образом, полученные результаты показывают, что холинергические препараты обладают иммунотропными свойствами и иммунологически активны в течение 28 суток и более, а также способны влиять на развитие гиперчувствительности замедленного типа и реакции Артюса, что свидетельствует о возможности предупреждения ими формирования сенсибилизации организма к антигену при воспалении. Препараты способны оказывать протективное действие на стадию развития сенсибилизации и патохимическую стадию анафилактического и эндотоксического шока. Антианафилактогенная активность мускаринового антагониста метацина определяется эффектами его метаболита холина и взаимодействием препарата с белками плазмы крови. Эффективное предупреждение анафилактического и эндотоксического шока сопровождается нормализацией функций B-лимфоцитов и серотонинергических механизмов селезенки. Важная роль п. vagus в регуляции иммунного и медиаторного ответа лимфоидных органов при воспалительных процессах и ненервные эффекты, связанные с влиянием препаратов на лимфоциты, подтверждают возможность использования холинергических средств в терапии шоковых состояний.

ВЫВОДЫ

1. Холинергические препараты центрального и периферического действия изменяют уровень антителогенеза и его длительность, продукцию цитокинов (IL-lß, IL-lRa, IL-4); оценка их влияния на развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа и реакции Артюса позволяет прогнозировать уровень сенсибилизации организма и развитие воспаления.

2. Мускариновыми антагонистами или их комбинациями с антихолинэстеразньши препаратами можно обеспечить десенсибилизирующий эффект (атропин, ипратропий, ипратропий с неостигмином) и предупреждать патохимическую стадию анафилактического шока (атропин с галантамином).

3. Фармакологическая коррекция холинергическими препаратами центрального действия (атропин, холина альфосцерат, галантамин) эфферентов nervus vagus при эндотоксическом шоке приводит к снижению тахикардии, вызванной введением липополисахарида Salmonella typhi.

4. Купирование анафилактического и эндотоксического шока, связанное с активацией центральной холинергической системы, приводит к нормализации иммунной (антителопродуцирующая активность В-лимфоцитов) и медиаторной активности (уровень серотонина) спленоцитов.

5. Целостность nervus vagus селезенки определяет активность сё серотонинергических механизмов; парасимпатическая денервация органа изменяет влияние холинергических препаратов на иммунный и медиаторный ответ селезенки.

6. Прерывание nervus vagus при эндотоксическом шоке приводит к увеличению тахикардии и ненервных эффектов холинергических препаратов, связанных с их действием на В-лимфоциты и серотонинпродуцирующую активность селезенки.

7. На бронхолитические эффекты мускарицового антагониста метацина могут влиять белки плазмы крови: IgG усиливает протективное действие препарата, а альбумин отменяет его.

8. Метаболизм метацина может протекать по механизму гидролиза сложноэфирной связи в молекуле препарата с образованием фармакологически активного холина и фармакологически неактивной 2-гидрокси-2,2-дифенилуксусной кислоты.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Статьи:

1. Степанова E.H., Нежинская Г.И., Куклин В.Н., Владыкин A.JI. Химико-токсикологическое и фармакологическое изучение свойств метацина // Разработка, исследование и маркетинг фармацевтической продукции. - Пятигорск, 2006. - Вып. 61. - С. 386 - 388.

2. Нежинская Г.И., Владыкин А.Л., Сапронов Н.С. Фармакологический анализ неканонических лигандов никотиновых холинорецепторов // Психофармакология и биологическая наркология. - 2007. - Т. 7, Вып. 2. - С. 1526 - 1530.

3. Нежинская Г.И., Владыкин А.Л., Сапронов Н.С. Эффекты модуляции холинергической системы при воспалении // Эксперим. и клин, фармакол. -2008.-Т. 71, №2.-С. 65 -69.

4. Нежинская Г.И., Сапронов Н.С., Владыкин А.Л., Шепелева В.В. Эффекты холинотропных и цитостатических препаратов в развитии реакции Артюса // Бюлл. экспер. биол и мед. - 2008. - Т. 145, № 1. - С. 61 - 63.

5. Нежинская Г.И., Владыкин А.Л., Сапронов Н.С. Модуляция белками плазмы крови бронхолитических эффектов мускаринового антагониста // Бюлл. экспер. биол и мед. - 2008. - Т. 146, № 12. - С. 654 - 656.

6. Сапронов Н.С., Нежинская Г.И., Владыкин А.Л. Взаимодействие белков плазмы крови с холинергической системой при воспалении // Мед. академ. журн. - 2008. - Т. 8, № 2. - С. 28 - 39.

7. Нежинская Г.И., Сапронов Н.С., Владыкин А.Л. Роль метаболитов мускаринового антагониста метацина в регуляции воспаления // Мед. академ. журн. - 2009. - Т. 9, № 1. - С. 28 - 32.

8. Nezhinskaya G.I., Vladykin A.L., Sapronov N.S. Cholinergic modulation of anaphylactic shock: plasma proteins influence // Life Sciences. - 2007. - Vol. 80, №24-25.-P. 2342-2346.

Тезисы.

9. Сапронов H.C., Нежинская Г.И., Байрамов А.А., Назаров П.Г., Евдокимова Н.Р., Владыкин А.Л., Лосев Н.А. Влияние ацетилхолина и серотонина на анафилактический шок // 4-я Международная конференция «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам». - Москва, 2006. - С. 64.

Ю.Нежинская Г.И., Владыкин А.Л., Сапронов Н.С. Эффекты антагониста М-холинорецепторов и белков плазмы крови при анафилактическом шоке // Психофармакология и биологическая наркология. - 2007. - Т. 7, спец. выпуск.-С. 1872 - 1873.

11.Нежинская Г.И., Шепелева В.В., Владыкин А.Л., Сапронов Н.С. Эффекты антагонистов Н-холинорецепторов и цитостатика при гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) // Психофармакология и биологическая наркология. - 2007. - Т. 7, спец. выпуск. - С. 1873 - 1874.

12.Владыкин А.Л., Нежинская Г.И., Сапронов Н.С. Влияние центральных холияергических агонистов и антагонистов на функции В-лимфоцитов при эндотоксическом шоке // XV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство».- Москва, 2008. - С. 532.

13.Nezhinskaya G.I., Vladykin A.L., Sapronov N.S. Non-neuronal effects of muscarinic antagonist methacine in anaphylactic shock // Second International Symposium on Non-neuronal Acetylcholine, August 31 - September 2, Academy of Science and Literature, Program and Abstract Book. - Mainz, Germany, 2006. - P. 30.

14.Nezhinskaya G.I., Vladykin A.L., Petrova N.N., Sapronov N.S. Neiroimmunoregulation of endotoxic shock // The 3rd China-Russia International Symposium on Pharmacology. - 2008. - P. 7 - 8.

Подписано в печать 02.04.09. Формат 60*84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ 39 .

Отпечатано с готового оригинал-макета. ЗАО "Принт - Экспресс" 197101, С.-Петербург, ул. Большая Монетная, 5 лит. А