Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Влияние вновь синтезированных производных индола на цитоскелет-зависимые механизмы развития системной анафилактической реакции

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМПШ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ ИМЕНИ ПОЧЕТНОГО АКАДЕМИКА Н.Ф.ГАМАЛЕИ

На правах рукописи Для служебного пользования

:; • '-.Л

к. - иь

ЗАЗУЛИН Сергей Константинович

ВЛИЯНИЕ ВНОВЬ ¿ИНТЕЗИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ИНДОЛА НА ЦИТОСКЕЛЕТ-ЗАВИСИМЫЕ МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ СИСТЕМНОЙ АНАФИЛАКТИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ

14.00.36 - иммунология и аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1995

Работа выполнена в Московском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательской институте педиатрии и детской хирургии МЗ МПр РФ (директор - академик РАМН, профессор Ю. Е.Вельтшцев).

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Д. В. СТЕФАНИ

Официальные оппоненты:

член-корресподент РАМН, доктор медицинских наук, профессор А.Я.КУЛЬБЕРГ,

доктор медицинских наук, профессор И.С.ГУЩИН

Ведущее учреждение:

/

Российский государственный медицинский университет им. Н. Й.Пирогова

Защита состоится " ¿я " ¿¿¿/¿¿¿¿■■'"К^

______________^_ 1995 г.

в у/--/ час, на заседании Специализированного ученого совета К 001.07.01 в научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи по адресу: 123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

.. £« ¿¿¿I

Автореферат разослан

1995 Г.

Ученый секретарь Специализированного ученого совета, доктор медицинских наук

Е.И. Коптелова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Важное место в клинической практике анимают заболевания аллергического генеза, частота и клини-еская тяжесть которых в последние годы возросла вследствие овышенкя уровня активности ряда патогенетических факторов, го привело к повышения вероятности развития таких опасных для кзни осложнений, как анафилактический шок.

Проблема поиска средств патйгенетической терапии, спо-эбствувдих снижении летальности при развитии анафилактическо-э^шока. является одной из наиболее актуальных в клинической илергологии. Практически важно изучение механизма действия эепаратов, обеспечивающих адекватную модуляцию систем, участ-дзщих в патогенезе анафилактических реакций, в частности, по-шляющих высвобождение медиаторов аллергий путей воздействия Г Структурную организацию цитоскелета. Иеобхсдимо подчерк-пъ. что цитох&лазаны, антианафилактическая активность кото-н в эксперименте in vivo достаточно высока, оказывают выра-iHHoe токсическое воздействие на биологические объекты, и. тдовательно. не мсгут быть использованы в клинике. Поэтому

4

¡обходимым с практической точки зрения является решение Bonica создания соединений, воздействие на структуру цитоскелета iTopbK не снижает яизнеспособносги клеток.

В конце 80-х годов были синтезированы два соединения, яв-■сщиеся производными индола (препараты К 5*и К 19). с молйу-рной структурой, в значительной пере отличающейся от струк-ры молекул цитохалазинов (ЦХ), но содержащей ряд активных уппировок. присутствующих в них. Значительное сходство днна-ки подавления цитоскелет-зависимых функций клеток и развития стемкой анафилаксии на модели In vitro ЦХ и вновь синтезиро-нными производными индола (Семенов A.B.. 1990) позволило

предположить, что механизм деПсхвия препаратов II 5 и II 19,. и и митотоксинов. опосредуется их взаимодействием с актиновы} филаиентами цитоскелета.

Таким образом, многие вопросы, касаюдаеся данной пробл( мы, до настоящего времени оставались нерешенными, что послуяо до основанием для проведения настоящей работы, позволило сфоц нулировать цель и задачи исследования.

. Цель настоящей работы заключалась в изучении влияния i патогенез системной анафилаксии вновь синтезированных прои: водных индола, определении механизмов их действия и возможное ти использования для снинения летальности при развитии онаф; лактического шока.

Реализация цели предусматривала решение .следующих зада'

1. Изучить воздействие вновь синтезированных производных индола (препаратов IJ 5 н И 19) на течение и исход систе* ной анафилаксии при моделировании анафилактического шока.

2. Разработать модификацию метода определения концем раций гистамина (Гт) и серотонина (Ст). заключающуюся в аде^ ватном моделировании патохимической стадии -анафилаксии In vit го.

3. Исследовать влияние вновь синтезированных произво; иых индола на количественные показатели медиаторов аллергш выйюбоэдаемих клетками периферической крови при инициирован* дегрануляцин в системе.In vitro.

4. Оценить эффект воздействия препаратов II 5 и H 19 i морфологические особенности » структуру сета .актиновых Филе нентов в клеточной культуре In vitro.

Научная новизна. Дано теоретическое обоснование разрабо!

ки адекватной модели патохимической стадии анафилаксии In vitro (технические трудности получения полноценного биологического материала после введения животному разрешающей дозы причинно-значимого антигена). Применение модели, заюяочаюи-зйсн в том, что взаимодействие клеток цельной крови экспериментальных животных со специфическим антигеном осуществляется в системе In vitro, позволило установить, что максимальное подавление высвобождения Гт наблюдается при введении препарата N 5 за 30 мин до развития анафилактической реакции In vitro й что эффект значительно снижается при инъецировании его за 90 минут. Эффективность препарата N 19 высока и мало различается при введений его за 30, 60 и 90 минут до начала аллергической реакции в системе In-vitro.'

Впервые предложена концепция механизмов действия препара- . тов N 5 и N 19, демонстрирующая зависимость эффекта того или иного препарата.как от природы обьекта-мишени, так и от времени включения соответствую!!?« структур или субстратов в патоге-. нетический процесс. При этом предполагается, что периоды эффективного действия препаратов N 5 и N 19 последовательно сменяют друг друга. Диметилсульфоксид (DMS0), не снижая смертности животных от анафилактического шока, выступает, по-видимому, а. качестве синергиста при реализации эффекта вновь синтезиро-занных производных индола.

Впервые представлены результаты, отражающие динамику цействия вновь синтезированных производных индола (препаратов i 5 и Н 19) на течение и исход анафилактического шока на моде-и In vivo. На основании данных сравнительного анализа эффек-гавности исследуемых препаратов показано, что максимальное ¡начение выживаемости наблюдалось при использовании препарата I 5 при введении его за 30 минут, а препарата N 19 за 30. 60 н Ю минут до разрешения анафилактического шока.

Впервые на основании исследования морфологических типов клеток, формирующихся вследствие воздействия исследуемых соединений на культуру In vitro, а также данных регрессионного анализа кривых, отражающих концентрационную зависимость частоты встречаемости различных форм клеток, показано, что клеточные структуры-мишени для каждого из вновь синтезированных соединений различны. Кроме того, выявлены принципиальные особенности характера действия каждого из исследованных вновь синтезированных производных индола: относительно меньшая токсичность препарата К 19: возможность кумуляции обоих препаратов в культуре клеток; различие путей и динамики реализации модифицирующих эффектов вновь синтезированных соединений.

Практическая значимость работы. В результате проведенного исследования выделены показатели, наиболее информативные для характеристики эффективности исследуемых препаратов: максимальный процент выживаемости после завершения анафилактической реакции: длительность периодов эффективного действия препаратов: длительность атонального периода в случае гибели животного; коэффициент К. отражающий тяжесть клинических проявлений системной анафилаксии.

Введен коэффициент А, отражающий взаимосвязь между степенью высвобождения биогенных аминов и выживаемостью экспериментальных животных, показатели которого имеют существенную информационную значимость для оценки клинической эффективности исследуемых соединений.

Впервые на основании анализа совокупности морфологических признаков и морфометрических параметров выделен ряд морфологических типов клеток в культуре in vitro, формирующихся вследствие воздействия исследуемых соединений, количественное соотношение которых позволяет судить о специфическом и токсическом

действии препаратов.

Разработана собственная модификация метода определения концентраций Гт и Ст, позволяющая адекватно моделировать пато-химическую стадию анафилаксии In vitro.

Апробация работы и публикации. По теме диссертации опубликовано 3 печатных работы и получено 3 свидетельства на рационализаторское предложение.

Основные положбния работы доложены'на межинститутской научно-практической конференции по актуальным вопросам аллергии в педиатрии (МНИИПиДХ МЗ РФ. 1993)'.

' Работа прошла апробацию на совместном методическом заседании лаборатории иммунологии и иммунохимии, кпинико-диагнос-тического отделения и отдела клинической патоморфологии МНИИ педиатрии и детской хирургии МЗ МПр РФ 28 февраля 1995 года.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 188 ■ страницах машинописного текста, иллюстрирована 23 таблицами. 18 рисунками, состоит из введения, обзора литературы. 4 глав описания и анализа результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, включающего 52 отечественных и 180 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ. ,

В основу работы положены результаты, полученные в ходе следующих этапов исследования: 1) изучения действия вновь синтезированных производных индола (препаратов N 5 и N 19) на характер течения системной анафилаксии при биологическом моделировании анафилактического шока; 2) изучения влияния указанных

препаратов, внутрисердечно инъецированных сенсибилизированным ЛС морским свинкам, на количество Гт и Ст. выбрасываемых клетками периферической крови экспериментальных швотных при дег-рануляции этих клеток в системе In vitro, содержащей специфический антиген; 3) изучения действия препаратов М 5 и N 19 на морфологические параметры и распределение актиновых филаментов культивируемых фибробластов в системе "In vitro.'

. Материалы исследован^. Запланированные исследования проводили с использованием 413 беспородных морских свивок (самцов) в возрасте от 8 до 10 недель весом 200-230 грамм, полученных из питомника "Столбовая" РАМН.

Для изучения влияния препаратов N 5 и Н 19 на морфологические параметры и распределение актиновых филаментов в системе In vitro использоезли стандартные культуры нормальных мышиных фибробластов.

Б экспериментах применяли следующие препараты: ЦХ В и D, DMS0, родамин-фаллоидин, гистамина дигидрохлорид и 5-гидрок-ситриптамина гидрохлорид. Синтез экспериментальных препаратов - новых производных индола под лабораторными номерами 5 и 19 -был осуществлен в лаборатории органического синтеза (зав. лаб.- доктор химических наук, профессор Толкачев Б.Н.) НИИ ЭДиТО ВОНЦ РАМН.

Работы по биологическому моделированию анафилактического шока у морских свинок проводились на базе лаборатории иммуно-токсикологии и аллергологии ВДЦ биотехнологии и безопасности лекарственных средств Министерства медицинской и биологической промышленности РФ (зав. лаб. - кандидат биологических наук Кудрина Г. П.).

Определение концентрации биогенных аминов проводилось на базе лаборатории биохниии ИНКИ уха, горла, носа МЗ РФ (зав.

таб. - кандидат биологических наук Логунов А. И.).

Действие препаратов N 5 и N 19 в культуре фибробластов in rltro изучали на базе лаборатории механизмов канцерогенеза НИИ канцерогенеза ВОНЦ РАМН (зав. лаб. - доктор биологических наук, профессор Васильев D.M.).

Методы исследования. Экспериментальная часть работы включала следующие модели и методы исследования: 1) биологическое моделирование анафилактического шока (Л.Кестюш. 1966); 2) метод совместного определения биогенных аминов (Гг и Ст) в крови экспериментальных животных {Меньшиков В. В.. 1987) в собственно» модификации; 3) флюоресцентное исследование морфологии микрофиламентной сети культивируемых фибробластов по Тззака К. et al., 1988, Senda Т. eral., 1992; 4) цитоморфометрическая оценка параметров клеток по Автандилову Г.Г., 1990; 5) статистический анализ, полученных данных с использованием вариационной статистики. ( вычислением среднего арифметического (М), среднеквадратичного отклонения (б), ошибки среднего (т), критерия достоверности Стьюдента (Т). критерия Уайта (W) и проведением регрессионного анализа (ЛакинГ.Ф., 1968. Плохинский H.A., 1970, 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Г. Воздействие исследуемых препаратов на течение и исход анафилактического шока у морских свинок. На первом этапе исследований проводилось изучение действия вновь синтезированных производных индола (препаратов Н 5 и Л 19) на характер течения системной анафилаксии при биологическом моделировании анафилактического шока у сенсибилизированных ЛС морских свинок.

Для этой цели были сформированы 7 контрольных и 4 опытные

группы экспериментальных животных.

Тестирование, проведенное на животных контрольных груш (табл. 1) показало, что LD100 nln ЛС. вызывавшая гибель живот ных через 3-5 минут после ее введения при выраженных клинических проявлениях анафилактического шока и выбранная в качестве рабочей, составила 0,5 мл, a LDl00 вЬз, приводящая i гибели особей контрольной группы.через 1 - i,5 минуты поот инъекции с резко выраженной клинической симптоматикой системной анафилаксии, -0,7 мл.

Для определения степени тяаести анафилактического шокг применяли критерии Безредка A.M. с незначительными модификациями. При этом визуально учитывались динамика и тяжесть клинических проявлений системной анафилаксии, оцениваемых полуколичественным методом по 3-балльной шкале.

Изучение возможности влияния фиксированных доз препаратон на время гибели животных показало, что в подгруппах If и If (табл. 1) оно незначительно отличалось от контрольного показателя (подгруппа 1с).

При инъецировании LD100 в1п ЛС. растворов DMS0. препаратов N 5 и N 19, а также ЦХ D интакткым животным контрольны* групп каких-либо реакций не отмечалось.

Эффективность препаратов оценивалась при использовании таких показателей, как максимальный процент выживаемости после завершения анафилактической реакции; длительность периода эффективного действия препарата; период времени от введения разрешающей дозы релевантного антигена до момента гибели животного; коэффициент К, отраясавдий степень тяжести клинических проявлений системной анафилаксии: Сравнительный анализ эффективности препаратов позволил выявить ряд закономерностей:

1. Максимальный процент выживаемости бол соизмеримым для препаратов N 5, Н 19 и ЦХ D (табл. 2. 3. 4. соответственно) и

Таблица 1.

Тестирование разрешающих доз лошадиной сыворотки

Группа для определения разрешающих доз ЛС (I) Число жи-. вот-ных в подгруппе Введение Физ. раствора Время до введения разрешающей дозы ЛС. мин. Объем ЛС, мл Время смерти животных, . мин. (М+т) Число животных с различной степенью клинических проявлений системной анафилаксии, % Вы-жи-вае-мо- сть. %

10 30 ео 90 1 2 ' 3

П 1а 5 - - - - - 0.2 6-, 2+0. 4 80,0 0.0 20.0 60.0

о Из 8 - - - - - 0.4 5.1+0,4 37.5 50,0 12.5 25,0

д 1с 10 - - - - - 0.5 3,4+0.1 10,0, 40.0 50,0 0.0

г 1(1 8 - - - , — - 0.6 2.9+0. 3 12.5 37.5 50,0 0.0

Р 1е 7 - - - - 0.7 1.3+0.1 0.0 14,3 85,7 0,0

У И 10 + - - - 0,5 4.4+0,3 10.0 50,0 40,0 0,0

п 1е 10 + - + - 0.5 4.0+0,1 30,0 30,0 40.0 0.0

п т 10 4 - - + - 0.5 3. 8+0,2 30.0 40.0 30.0 0.0

ы и 10 + - - - + 0.5 3.7+0,2 10.0 40,0 50.0 0.0

Таблица 2.

Характеристика протекания и исхода анафилактического шока у экспериментальных еивотных в зависимости от времени введения препарата Н 5

Показатели течения и исхода системной анафилактический реакции в опытных подгруппах Время до введения разрешающей дозы ЛС. мин

10 ШИа подгруппа) 30 шпь подгруппа) ' 60 (УШс подгруппа) 90 (ШИ подгруппа)

Отношение числа выживших животных к общему числу швотных в подгруппе 6/12 7/10 5/11 2/11

% выживаемости 50.0 70.0 45.5 18,2

Значения коэффициента К 0,7 5,0 4,0 1,3

Таблица 3.

Характеристика протекания и исхода анафилактического шока у экспериментальных кивотных в зависимости от времени введения препарата N 19

Показатели течения , и нехода системной анафилактический реакции в опытных подгруппах Время до введения разрешающей дозы ЛС, мин

10 (1Ха под-, группа) 30 (1ХЬ подгруппа) 60 (1Хс подгруппа) 90 (Ш ' подгруппа)

Отношение числа выливших швотных к общему числу кивотных в подгруппе 3/10 6/9 6/9 5/9 ,

% выживаемости 30,0 66,7 66.7 55,6

Значение коэффициента К 1.0 3.0 5.0 2.0

Таблица 4.

арактеристика протекания и исхода анафилактического шока у кспериментальных животных в зависимости от времени введения итохалазина р

Показатели течения и исхода системной анафилактический реакции в опытных под- ' группах Время до введения разрешавшей ДОЗЫ ЛС. М1Н

10 (Ха подгруппа) 30 ДО подгруппа) €0 (Хс пол-группа) 90 да подгруппа)

Отношение числа вшивших животных к общему числу • животных в подгруппе 1/8 3/8 6/8 5/9

% выживаемости 12,5 37,5 75,0 55,6

Значение коэффициента К 0,0 0,0 2,0 0.5

Таблица 5.

(арактеристика протекания и исхода анафилактического шока у »кспериментальных животных в зависимости от времени введения даметилсульфоксида

Показатели течения - и исхода системной анафилактический реакции в опытных подгруппах Время до введения разрешающей фззы ЛС, Айн

10 Ша подгруппа) 30 (Х1Ь подгруппа) 60 (Х1с подгруппа) 90 (ХМ подгруппа)

% выживаемости 0,0 0.0- 12'. 5 0.0

Отношение числа выживших животных к общему числу животных в подгруппе 0/50 0/9 1/8 0/9

Значение коэффициента К 0.2 0.2 3.0 0.7

значительно меньшим для ОМБО (табл. 5), однако динамика эффективного действия была различной" максимальное значение выживаемости (70% от числа швотных опытной группы) наблюдалось прз введении препарата Н 5 за 30 минут до разрешения анафилактического шока. Значения показателя, соответствующие 10 и 60 минутам. составили 0.70 и 0.65 от максимального значения, т.е. период эффективного действия можно охарактеризовать как "ранний" и "короткий". При использовании препарата N 19 максимальный процент выживаемости (66.7%) наблюдался не только за 30. но в за 60 минут до разрешения анафилактической реакции. Достаточно высокое значение показателя (55.6%) наблюдалось при введении его за 90 минут, т.е. эффект действия был более поздним и длительным. При использовании.ЦХ Б шксвмальная шаявае-мость (75%) наблюдалась при введении его за 60 минут до разрешения системной анафилаксии, величины показателя при инъецировании препарата за 30 и 90 минут составили 0.50 и 0,74 от максимального, т.е. эффект был "поздним" и "коротким".

2. Интересным для понимания механизма воздействия исследуемых соединений на патогенез анафилактического шока представляется анализ зависимости длительности агонального периода от сроков введения препарата. При моделировании графиков, отражающих действие препаратов (рис. 1), путем перемещения кри; вой динамики эффекта препарата И 19 параллельно оси ординат до совмещения уровня экстремальных точек кривых I и II. становится очевидной симметрия их графического изображения (рис. 2). Это позволяет предположить различие структур- или субстратов-мишеней для вновь синтезированных производных индола, причем. по-видимому, эффект препарата может зависеть как от природы мишени, так и от периода включения соответствующих структур или субстратов в патогенетический процесс анафилаксии, а такае от времени, требующегося для реализации взаимодействия

5>

o

каа о ы я •'он Ф ¡o*-* & ы ta sua к ^аз о рг -о о р pj !

м >H>3a о м о

O S ►ä S aSHía о

и о«|„«в s ао tie о я s»

ьяэ О НО H

M tá

r¿ pfi a

/•Sw^VÍ » О

p as

Длительность атонального периода , мин

М Ы СЛ СП ^ св

Рис. 2. Графическая модель (3) зависимости длительности атонального периода от интервала времени ыезду введением препаратов I 5 (I) и й 19 (2) и разрешением анафилактической рэакщш.

.их с препаратом.

3. Максимальные значения коэффициента К. отражающего тя-несть клинических проявлений системной анафилаксии и представлявшего собой соотношение частоты встречаемости в пределах опытной подгруппы легкой формы клинической симптоматики анафилактического шока (1 балл) к тяжелой (3 балла), одинаковы для препаратов N 5 и Н 19 и составлявт 5,0. но для препарата К 5 максимум значения этого показателя отмечался при введении его за 30 минут, а Для препарата N 19 - за 60 минут до разрешения аллергической реакции (табл. 2, 3). Клиническая эффективность препаратов N 5 и N 19 выше, чем .ЦХ D. максимальное значение коэффициента К для которого составило 2,0 (табл. 4).

Таким образом, все полученные результаты подгверздают наши предположения о соизмеримой клинической эффективности вновь синтезированных производных индола, превышающей по большинству параметров эффективность ЦХ D при выраженном различии длительности периодов эффективного действия. Кроме того, роказано. что DMS0, не снижая смертности животных от анафилактического шока, выступает, по-видимому, в качестве синергиста при реализации их биологического эффекта.

высвобождение биогенных аминов из клеток периферической крови,.

Исследование механизма действия вновь синтезированных производных индола на патогенез системной анафилаксии вызвало необходимость изучения влияния исследуемых препаратов (I! 5, ti 19 и DMS0) на степень либерации биологически активных веществ (Гт и Ст) из клеток крови.

Для решения поставленной задачи было сформировано 6 контрольных и 3 экспериментальных группы животных.

На основании результатов тестирования разретаздк доз ЛС з качестве LDl00 йЯЗ Сил гнбран объем сыворотки, равный 0.7

мл. а в качестве LD,00 и» ~ MJI- *

Растворы препаратов Н 5. К 19 н DMS0 вводили виутрисер-дечно за 10, 30. 60 и 90 мин до забора периферической крови.

Стремительное развитие анафилактической реакции в экспериментальной модели анафилактического шока In vivo сопровождается резким падением артериального давления и изменением-реа-логических свойств крови, обусловленных ее сгущением. Это делает практически невозможным забор крови у экспериментальных животных после введения разрешающих доз релевантного антигена, вследствие чего нами был разработан-метод определения концентраций Гт н Civ позволяющий моделировать патохимическую стадию акафилашш In vitro. Разрешение анафилактических реакций производили посредством добавления разрешавшей лозы (LD100 Bln) ЛС непосредственно в цельную кровь швотных. '

л-

Результата исследования позволили прийти к следующий заключениям:

-1. Максимальная задержка Гт в клетках периферической крови наблвдалась при введении еивоткьш препарата Н 5 за 30 мин до начала развития анафилактической реакции in vitro (рис. 3). Эффе£ст. препарата значительно сшшапся при инъецировании его за 90 минут, т.е. характер действия исследуемого соединения можно отпределить как "быстрый" и "кратковременный".

2, При введении препарата Н 19 за 30. 60 и 90 кинут до начала аллергической реакции не найдено достоверных различий в содершш внутриклеточного Гт (ряс. 3). а при времени эффективного действия, равном 10 иин. оно было существенно меньшим, т.е. действие препарата N 19 манио определить как "медленное" и "пролонгированное".

3. Попарное 'сравнение динамики количественных показателей внутриклеточного Ст и Гт для одного и того же препарата (рис. 3) выявило значительное сходство характера кривых, в то же

0.4 —,—г

о к «5 0! К

<0 а

ж

Щ ЕГ

а о х

0.3

0.2

0.1

1—1—I—>—I—1—I—>—I—1—1—>—т

------

К

3

А_I_1_I_I_' ■ ' ■_1...1 . I „. I_I_I_I_I I

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

I, мин

Рис. 3. Концентрация гистмлзша (1,2) и серотонина (3,4) в периферической крови экспериментальных животных в зависимости от длительности временного периода меаду введением прэ-дарагов Я 5 (1,3) я В 19 (2,4) и разрешени-6м анафилактической реакции в .системе кн витро.

время при сопоставление динамики эффективности препаратов К 5 и М 19 отмечались существенные отличия. >

4. Анализ динамики значений введенного нами коэффициента А. отражающего взаимосвязь между степенью высвобождения биогенных аминов и выживаемостью экспериментальных животных, позволил подтвердить наличие особенностей механизма действия "каж; дого из исследуемых препаратов. Максимальные значения коэффициента А при использовании препарата N 5 (рис. 4) наблюдались при введении его за 30 минут до разрешения анафилактической реакции, а препарата N 19 (рис. 5) - за 30 и 60 минут.

5. Исследования In vitro подтвердили, что DMS0 играет роль синергиста. способствуя повышению клинической эффективности вновь синтезированных производных индола за счет дополнительного блокирования биогенных аминов в клеточных депо. '

III. Воздействие исследуемых препаратов на морфологические параметры микроФиламектной сети культивируемых Фиброблас-Тов. Поскольку результаты исследования позволили предположить наличие цитотропных свойств изучаемых препаратов, представлялся целесообразным поиск структур (структуры), являющихся мишенями для исследуемых соединений. Для решения поставленной задачи оценивали влияние препаратов на морфологические параметры цитоскелетных структур культивируемых фибробластов в системе In vitro.

Анализ результатов исследования позволил прейти к ряду заключений, .отражающих возможный механизм действия вновь синтезированных производных индола:

1. При воздействии каждого из вновь синтезированных производных индола помимо неизмененных клеток (I тип) выявлено по два типа модифицированных клеток. Взедение в систему препарата И 5 вызывало формирование И и III типов клеточных элементов.

с£

Ф

с: 1.0

о

>> 0.9

о.е

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

( ' I Г—

-Т-1-1-1-г

. 1 ,. .1., , I

10 20 30 40 50 60 70 60 30

I, мин

Рис. 4. Зависимость относительных показателей выживаемости экспериментальных яивотшх (I), внутриклеточного содержания тистамина (5) и значений коэффициента А (2) от длительности 'временного периода между инъецированием препарата И 5 п разрешением анафилактической реакции ин витро.

I—>—

1____._ I

О 10 -20 30 40 50 60 70 80 90

1, пин

Рис. 5. Зависимость относительных показателей выга-ваемости экспериментальных животных (1), внутриклеточного содержания гистамикз СЗ) и значений коэффициента А (2) от длительности временного периода между инъецированием препарата # 19 и разрешением анафилактической реакции ин витро.

II тип клеток незначительно отличается от контрольного по значениям таких параметров, как число ламеллолодий, их длина, а также длина шипов, однако, при этом наблюдаются значительные изменения структуры сети шкрофиламентов. Для III типа клеток характерно выраженное, часто многократное уменьшение всех размеров по сравнении с морфометрическими параметрами фиброблас-тов других типов, при этом выявляются признаки практически полной редукции микрофиламентной сети. Воздействие препарата N 19 приводит к формированию III и IV типов клеток. Последний в значительной мере отличается от всех вышеописанных типов фиб-робластов. Формирование II и IV типов фибробластов. различающихся по ряду морфологических и морфометрических показателей, являлось, по-видимому, результатом специфического "действия вновь синтезированных соединений, что- вновь указывает на различие клеточных структур-мишеней для каждого из вновь синтезированных соединений. III тип клеток был определен нами как токсически измененный.

2. В результате действия ЦХ В формировался единственный, не отличающийся от литературных описаний, специфический тип клеток, условно обозначенный, нами как V тип и практически не наблюдалось неизмененных клеток. Хотя ряд параметров II и V типов клеток совпадает, необходимо подчеркнуть, что действие препарата N 5 приводит к формированию' "дендро видно го" контура фибробластов. а при использовании ЦХ В наблюдается хаотичная изрезанность краевой зоны клеток.

3. Применение ОМБО приводило к появлению в системе еще одного (VI) типа кодифицированных клеток, возмошо, соответствующего ускорению локомоции клеточных элементов при инкубации их с ОМБО.

А. Введение коэффициентов, характеризующих токсичность и специфичность вновь синтезированных производных индола, проде-

монстрировало. что. при Солее низком "Токсическом и специфическом эффектах препарата N 19 в исследованном диапазоне ^онцент-' раций, он обладает большей относительной специфичностью.

5. Проведение регрессионного анализа параметров кривйх. отражающих концентрационную зависимость частоты встречаемости различных форм клеток при введении в систему препаратов N б ц N 19. позволило выявить принципиальные особенности характера действия каждого из вновь синтезированных производных индола: относительно меньшую токсичность препарата II 19; возможность кум15ляции обоих препаратов в культуре клеток; различие путей и дин&\шки реализации модифицирующих эффектов вновь синтезированных соединений.

Таким образом, исследование антианафилактической эффективности вновь синтезированных производных индола на различных уровнях (оргакизмекном, клеточном и субклеточном), а также изучение механизмов их действия в различные стадии анафилаксии (патохимическув и патофизиологическую) ползало, что снижение летальности и выраженности клинических проявлений при использовании препаратов К 5 и N 19 обусловлено, по-видимому, инги-бированием либерации биогенных аминов, которое, в свою очередь, является следствием подавления цитоскелет-зависимых стадий экзоцитоза. Проведенные исследования показывают значительную роль изменений архитектоники сета актиновых филэкентоа е реализации достигнутого эффекта.

ВЫВОДЫ

I. Влияние препаратов'К 5 и К 19 на степень тяжести клинических проявлений системной анафилаксии соизмеримо, при это: для препарата- N 5 клинический эффект максимален при введени

зго за 30 минут до разрешения аллергической реакции, а для трепарата N 19 - за 60 минут. Эффект воздействия ЦХ D ниже, шм каждого из вновь синтезированных производных индола.

2. Максимальный процент выживаемости при анафилактическом юке соизмерим при использовании препаратов Н 5. N 19 и ЦХ D -и >тмечается при введении препарата Н 5 за 30 кинут, препарата N .9 - за 60 и 90 мин. ЦХ D за 60 мин до разрешения анафилаксии.

3. Степень влияния исследуемых препаратов на длительность зонального периода неодинакова и зависит от сроков их введе-:ия, что позволяет предположить, что периода их эффективного :ействия и структуры-мииени для препаратов N 5 и Я 19 различье

4. Выявлены параллели динамики клинического течения сис-емной анафилаксии in vivo и высвобождения биогенных аминов из леток периферической крови при моделировании патохимической тадии анафилаксии in vitro, при этой прямое действие препара-ов. блокирующее процесс высвобождения биологически .активных еществ, свидетельствует об их цнтотропности.

5. Максимальное подавление выброса гистамина из клеток эриферической крови наблюдается при введении препарата N 5 за Э мин до развития, анафилактической реакции In vitro, при инь-цировании его за 90 минут эффект значительно снижается. При зедении препарата N 19 за 10 минут до начала развития аллер-1ческой реакции в системе In vitro его эффективность отнсси-гльно низка, а при инъецировании за 30, 60 и 90*минут сравни-1 с действием препарата N 5.

6. Воздействие препаратов N 5 и N 19 приводит к появлению культуре in v'ltro двух различных типов специфически модифи-

[рованных клеток, соответственно, II и IV, при этом II тип по 1ДУ морфологических параметров и строению сети актиновых фи-.ментов соответствует V типу клеток, формирующемуся при дейс-

твии ЦХ В. Для образующегося в присутствии вновь синтезированных производных индола III типа клеток характерны признаки токсических изменений внутриклеточных -структур.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Наиболее информативными для характеристики эффективности исследуемых препаратов in vivo являются следующие показатели: максимальный процент выживаемости экспериментальных животных после завершения анафилактической реакции; длительность периодов^эффективного действия препаратов; длительность

t

агонального периода в случае гибели кивотного; значения коэффициента К. отражающего тяжесть клинических проявлений системной анафилаксии.

2. Для определения концентраций Гт и Ст рекомендуется использовать модификацию метода, моделирующую патохимическую стадию-анафилаксии In vitro, подробно описанную в работе. Разрешение анафилактических реакций при этом производится путем добавления релевантного Аг непосредственно в цельную кровь животных. . Предложенная модификация метода определения биогенных аминов в периферической крови, оценивающая абсолютное количество Гт и Ст в клеточных депо, позволяет судить о степени подавления выброса биологически активных веществ, участвуют в патогенезе анафилактического шока. Ее использование объективизирует оценку динамики патохимической стадии анафилактической реакции в. системе la vivo, необходимую для определения механизмов действия исследуемых препаратов.

3. Для оценки клинической эффективности исследуемых соединений следует использовать коэффициент А. отражающий взаимосвязь между степенью высвобождения биогенных аминов и выживаемостью экспериментальных животных и позволяющий выявит!

особенности механизмов действия каядого из исследуемых препаратов на патогенез анафилаксии.

4. Для характеристики основных свойств вновь синтезированных производных индола информативны коэффициенты К,, Кг и К3, отражающие количественные показатели неизмененных, а также специфически и токсически модифицированных клеток .в системе In vl tro.

5. Для выявления принципиальных особенностей характера модифицирующего действия препаратов в культуре клеток In vitro целесообразно проведений регрессионного анализа параметров кривых, отражающих концентрационную зависимость частоты встречаемости различных типов клеток.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Семенов А.В.. Зазулин С.К., Толкачев В.Н.. Кудрина Г.П., Стефани Д.В.. Подавление анафилактического шока у сенсибилизированных морских свинок новыми производными индола Н 5 и N 19 // Тез. докл. I Конгресса иммунологов России. - Новосибирск. 1992. - С. 424-425.

2. Semyonov А. V.. Zazulln S.K.. Stefanl D.V. Suppression of anaphylactic shock In sensitized guinea pigs: the new way and tne new Indol compounds // Int. J. Irmunorehabllltatlon: Abstr. of First Int. Congr. of lmramorehabllltatlon.- 1994.-Sochl, Dagomys!- 1994,- H 1, suppl.- P.312

. 3. Semyonov A.V.. Zazulln S.K.. Stefanl D.V.. Inhibition of histamine and serotonlne'release from blood се11з of guinea pigs by new cytoskeletal-nodulatlng lndol compounds« // Abstr. of XVI European Congress of allergology and clinical lnsnunolo-jy. - Madrid. - 1995.

СПИСОК РАЦИОНАЛИЗАТОРСКИХ 'ПРЕДЛОЖЕНИЙ

1. Способ оценки количественных параметров фагоцитарной

а

активности нейтрофилов в иикротесте. Стефани Д.В., Семенов A.B.. Зазулнн С.К. // Удостоверение N 986 от 21.09.1993.

2. Способ оценки достоверных отличий иммунологических' по-» казателей у больных с иымунопатологиями. Зазулин С.К.. Семенов A.B.. Стефани Д.В., Ружицкая Е.А. и др. //Удостоверение К 1017 от 12.09.1994.

3. Способ количественной оценки высвобождения биогенных аминов из клеток периферической крови при моделировании анафилактического шока в системе in vivo. Зазулин C.K.. Стефани Д. В. // Удостоверение К 1018 от 23.09.1994.

н