Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Роль генетических и иммунологических факторов в патогенезе лейомиомы матки

На правах рукописи

МОРОЗОВА Елена Борисовна

РОЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ В ПАТОГЕНЕЗЕ ЛЕЙОМИОМЫ МАТКИ

14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика 14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2009

003485752

Работа выполнена в Научно-методическом центре по молекулярной медицине на базе Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Санкт-Петербургского государственного университета им. акад. И.П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научные руководители - доктор медицинских наук

ЧУХЛОВИН Алексей Борисович доктор медицинских наук профессор ТОТОЛЯН Арег Артемович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

профессор СЛОЗИНА Наталия Михайловна доктор биологических наук профессор СЕСЬ Татьяна Павловна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «17» декабря 2009 года в /17 часов на заседании диссертационного совета Д 205.001.01 при Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М.Никифорова» МЧС России по адресу: 194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 4/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М.Никифорова» МЧС России.

н

Автореферат разослан ноября 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

М.В. Санников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из актуальных проблем сохранения репродуктивного здоровья женщин является поиск прогностических маркеров развития осложненной лейомиомы матки (JIM). Данное хроническое заболевание является доброкачественным новообразованием миометрия. ЛМ встречается у 20-40% женщин. В последние годы отмечено существенное повышение частоты ЛМ у женщин репродуктивного возраста, что определяет социальную значимость данного заболевания. В процессе развития JIM встречаются такие клинические осложнения как: быстрый рост, развитие многоузловых форм с нарушениями функций окружающих тканей и органов, что часто приводи^ к необратимому бесплодию [Айламазян Э.К. и соавт., 2004]. Патогенез быстрого и многоузлового роста ЛМ изучен недостаточно. В связи с этим актуален поиск ьорых биологических маркеров для раннего прогноза возможных осложнений ЛМ

Ведущую роль в патогенезе ЛМ играет гормональный дисбаланс. Вследствие тогэ, что гормональные сдвиги не вполне информативны в плане прогноза течения ЛМ, а гормональное лечение не всегда эффективно и сопряжено с развитием побочных эффектов, необходим поиск других механизмов генеза осложненных форм заболевания. В частности, актуален анализ регуляции процессов ремоделирования соединительной ткани - ключевого фактора прогрессии опухолей. Ремоделирование и распад коллагенового матрикса тканей осуществляется при активном участии матриксных металлопротеиназ (ММР). ММР являются ферментами, осуществляющими деградацию межклеточного матрикса как в норме, так и при патологических процессах. Ферменты семейства ММР выполняют особую роль в процессах неоангиогенеза, в частности, при росте опухолей. Генные варианты ММР могут различаться по уровням продукции белков-энзимов. Для генаММР-1 (коллагеназы-1) известен полиморфизм в области промотора, связанный с наличием 1G или 2G в позиции 1607. Наличие 2G"1607 создает дополнительный сайт для транскрипционного фактора Ets и ведет к усилению продукции про-ММР. Другой патогенетически значимый ген кодирует ингибитор активатора плазминогена (РАН) и регулирует уровень экспрессии ММР. Для гена РАН характерен полиморфизм в области промотора 4G/5G"673. Наличие 5G аллеля гена PAI-1 приводит к сниженной продукции мРНК РАМ, относительной активации системы ММР, усилению деградации межклеточного матрикса в зоне роста опухоли и активному распространению ее клеток в подлежащие ткани, тогда как более активный вариант (4G) связан с более интенсивной продукцией PAI-1 и ингибированием систем фибринолиза и коллагенолиза [Cuiry Т.Е., 2003; Ding L., 2004]. Таким образом, актуально исследование полиморфизма генов ММР-1 и PAI-1 у больных с лейомиомой матки и, возможно, с другими опухолями.

Активация ММР связана с привлечением лейкоцитов и активацией системы хемокинов. Хемокины являются низкомолекулярными белками. В последнее время активно изучается также их влияние на процессы ангиогенеза. По наличию или отсутствию ELR-последовательности (глютамат-лейцин-аргинин), хемокины подразделяются на ангиогенные (стимулирующие ангиогенез) и ангиостатические (ингибирующие ангиогенез). СХС - хемокины, содержащие ELR-последовательность, являются ангиогенными факторами, индуцирующими хемотаксис эндотелиальных клеток в зоны ангиогенеза, в частности, при росте опухолей [Cha S.T., 2009; Hrycek А., 2000]. В эту группу входят CXCL8/IL-8, CXCLl/GRO-a (Growth-related oncogene-alpha), CXCL5/ENA-78 (Epithelial cell-derived neutrophil-activating peptide-78), CXCL6/GCP-2 (Granulocyte chemotactic peptide-2). СХС - хемокины, не содержащие ELR-последовательность, обладают выраженными ангиостатическими свойствами. В их числе - CXCL10/IP-I0 (interferon-inducible protein), CXCL9/MIG (monokine induced by IFN-Y).

Таким образом, изучение генетической предрасположенности к развитию патологии соединительной ткани позволит классифицировать больных лейомиомой матки по степени риска развития осложнений для того, чтобы проводить их своевременную профилактику.

Цель работы

Выявление генных и иммунологических маркеров для прогнозирования осложненных клинических форм лейомиомы матки.

Задачи работы

1. Определить частоты функциональных вариантов генов ММР-1 (1G/2G 1607), ММР-3 (5А/6А"600), РАН (4G/5G"673) и MTHFR (С/Т ) у больных лейомиомой.

2. Выявить взаимосвязи между полиморфными вариантами генов, основной симптоматикой и сопутствующими патологическими состояниями (аденомиозом, гиперплазией эндометрия и др.) при JIM и определить генетические маркеры повышенного риска патологической пролиферации тканей репродуктивной системы.

3. Оценить экспрессию мРНК ММР-1 и TIMP-1 в тканях JIM и прилежащего миометрия, выявить взаимосвязи между локальной экспрессией данных генов и клиническими особенностями течения ЛМ.

4. Выявить и оценить уровни экспрессии генов следующих хемокинов: CCL11/эотаксина, ССи4/эотаксина-2, CXCL8/IL-8, CCL3/MIP-l<x, CCL4/MIP-lß, CCL5/RANTES, CXCLl/GROa, CXCL5/ENA-78, CXCL6/GCP-2, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, CXCL13/BCA, CXCL12/SDF-1, CX3CL-1 и рецепторов к ним - CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CX3CR1 в тканях ЛМ и прилежащем миометрии.

5. Определить взаимосвязи между локальной продукцией ангиогенных и ангиостатических хемокинов, экспрессией генов ММР -1 и TIMP-1 в ткани лейомиомы, и индивидуальной симптоматикой ЛМ.

6. Определить содержание IL-2,IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-J3, GM-CSF, IFN-y, TNF-a в перитонеальной жидкости больных ЛМ и в группе сравнения.

Научная новизна

Впервые проведена оценка частоты встречаемости полиморфных вариантов генов ММР-1 (1G/2G1607), ММР-3 (5А/6А"600), РАМ (4G/5G 675), MTHFR (С/Г677) у больных лейомиомой матки. Выявлено преобладание гиперактивного аллеля 2G"1607 гена матриксной металлопротеиназы ММР-1 в подгруппах больных ЛМ с быстрым темпом роста опухоли, многоузловыми формами JIM и с сопутствующим аденомиозом, а также достоверная ассоциация между наличием аллеля 5G PAI-i 675 и быстрым ростом лейомиомы матки. Обнаружена достоверная корреляция между повышенной экспрессией генов ангиогенных хемокинов CXCL6/GCP-2 и CXCL12/SDF-1 в миометрии и усилением экспрессии гена ММР-1 в ткани лейомиомы матки. Установлено, что экспрессия генов ангиогенных хемокинов - CCL11/эотаксина, CCL3/MIP-la, CCL4/MIP-lß и рецептора CCR5 достоверно повышена в ткани миометрия по сравнению с тканью лейомиомы, причем экспрессия генов CCL2/MCP-1, CX3CR1 в миометрии более выражена при быстром темпе роста ЛМ.

Теоретическая значимость работы

Выявленная взаимосвязь между наличием у больных лейомиомой матки гиперактивного промоторного аллеля 2G"1607 гена ММР-1 и выраженной пролиферацией миометрия, а также аденомиозом, подтверждает универсальный

характер стимулирующего влияния матриксных металлопротеиназ на процессы ремоделирования внеклеточного матрикса, связанного с нормальным и эктопическим ростом тканей репродуктивной системы.

Сниженная экспрессия гена тканевого ингибитора металлопротеиназ (TIMP-1) в ткани опухоли приводит к усилению процессов деградации коллагена в ткани лейомиомы.

Обнаруженная достоверная корреляция между повышенной экспрессией гена ММР-1 в ткани лейомиомы матки и внеопухолевой экспрессией ангиогенных хемокинов CXCL6/GCP-2 и CXCL12/SDF-1 в миометрии, а также усиленная экспрессия других ангиогенных хемокинов (CCLll/эотаксина, CCL3/MIP-loc, CCL4/MIP-lß) и CCR5 в миометрии по сравнению с опухолевой тканью, допускает патогенетическую связь между активацией коллагенолиза в опухоли и усилением ангиогенеза в прилегающих областях миометрия.

Практическая значимость работы

Предложенный и внедренный в клиническую практику набор генетических маркеров (ММР-Г1607 и PAI-Г675) дает возможность уточненного прогнозирования осложнений лейомиомы матки в целях планирования индивидуальной терапии, а также для предотвращения и снижения риска развития осложнений при данном заболевании.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Гиперакгивный аллель 2G"1607 гена ММР-1 достоверно чаще встречается при тяжелых формах JIM (быстрый темп роста, многоузловые формы, кровотечения), и, напротив, наличие генотипа 1G/1G" гена ММР-1 ассоциировано с благоприятным прогнозом заболевания. Быстрый темп роста ЛМ взаимосвязан с сочетанным генотипом ММР-1 2G"1607 /РАМ 5G'675.

2. Повышенная экспрессия ангиогенных хемокинов в тканях миометрия и JIM свидетельствует об усилении ангиогенных и пролиферативных процессов в тканях опухоли.

3. Генотипирование ММР-1 1G/2G"1607 у пациенток с ЛМ на начальных стадиях развития заболевания позволяет предупредить развитие осложненных форм ЛМ (быстрый темп роста, многоузловые формы, кровотечения) и использовать менее инвазивные операции (лапароскопия, эмболизация маточных артерий) до клинического проявления заболевания.

Личный вклад автора

Автором выполнены все этапы оптимизации аллель-специфической ПЦР, проведена оценка частоты встречаемости гиперактивных вариантов генов ММР-1 (1G/2G 1607), ММР-3 (5А/6А 600), PAI-I(4G/5G 675), MTHFR (С/Г*77) в крови больных ЛМ, проведена полуколичественная оценка экспрессии мРНК генов хемокинов, ММР-1, TIMP-1 в тканях JIM и миометрия, а также соответствующие клинико-лабораторные сопоставления по комплексу полученных результатов. Комплексное клиническое обследование пациентов с ЛМ производилось д.м.н. Н.В. Кулагиной. Оценка содержания цитокинов была проведена к.м.н. К.А. Сысоевым.

Апробация работы

Основные положения диссертационного исследования были доложены на VII, VIH, XIII Всероссийских научных форумах с международным участием имени акад. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2003, 2004, 2009), на

межвузовской конференции Общества Молодых Ученых СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова «Санкт-Петербургские научные чтения - 2005, 2006», на научном совете СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова в качестве победителя конкурса «Стипендия года 2006» (цикл статей, посвященных изучению патогенеза JIM). Диссертационная работа поддержана грантами Правительства Санкт-Петербурга в 2008,2009 гг.

Методы диагностики информативных генетических маркеров, исследованных в данной работе, внедрены в клиническую практику СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, городского центра планирования семьи и репродукции (ГЦПСиР).

Публикации

По теме диссертационного исследования опубликовано 12 научных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации основных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 143 страницах, включает список сокращений, введение, обзор литературы, раздел «Материалы и методы», три главы результатов собственных исследований, заключение, выводы и практические рекомендации. Список литературы содержит 145 источников, в том числе 21 отечественный и 124 зарубежных. Текст содержит 21 таблицу и 19 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клиническая характеристика обследованных больных. При выполнении настоящей работы проведено клиническое обследование 170 пациенток, имевших лейомиому матки, в возрасте от 26 до 71 года (средний возраст 46,б±б,7 года) с морфологической верификацией диагноза у оперированных больных. У 122 (71,7%) женщин имелась симптомная лейомиома, проявлявшаяся гиперполименореей, быстрым темпом роста опухоли, нарушением функции смежных органов, что потребовало хирургического лечения. У 48 (28,3%) - лейомиома матки была без клинических проявлений. По данным анамнеза, длительность заболевания до 5 лет отмечена у 100 женщин (58,9%); от 6 до 10 лет - у 43 (25,2%), более 10 лет - у 27 (15,9%) пациенток. Подбрюшинная локализация миомаггозных узлов обнаружена у 12 (7,9%) больных, межмышечная - у 43 (28,3%) и подслизистая - у девяти (5,9%) женщин. Сочетание подбрюшинной и межмышечной локализации миоматозных узлов выявлено у 88 (57,9%) пациенток. Единичные миоматозные узлы отмечены у 42 (24,7%) больных; по 2 миоматозных узла выявлено у 44 (25,9%), от 3 до 5 узлов - также у 44 пациенток (25,9%) и более 5 узлов - у 40 (23,5%). Быстрый рост опухоли отмечен у 41 (29,3%) пациентки, медленный - у 69 (49,3%) и регресс миоматозных узлов - у 30 (21,4%). Из гинекологических заболеваний наиболее часто лейомиоме матки сопутствовал аденомиоз, отмеченный у 93 (54,7%) больных. Доброкачественные опухоли яичников (кисты) обнаружены у 23 (13,8%) обследованных больных. Группу контроля составили 200 человек, женщины без лейомиомы матки, сходные по возрастному критерию с основной группой, проходящие обследование в СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова в связи с донорством костного мозга.

Методы исследования. С целью изучения молекулярно-биологических аспектов патогенеза лейомиомы матки проводилось генотипирование промоторных аллелей генов ММР-1 (1G/2G1601), РАМ (4G/5G"675', ММР-3 (5А/6А"600', а также гена MTHFR (С/Т617). Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов крови больных и доноров с

применением набора «ДНК-Сорб» (Литех, Москва). Варианты промоторного полиморфизма генов ММР-1 (1G/2G"1607), ММРЗ (5А/6А"600) и MTHFR (С/Г677), РАМ (4G/5G ) определяли с помощью аллель-специфической ДНК ПЦР [Чухловин А.Б. и соавт., 2003]. Специфические праймеры конструировали с помощью программы Primer Express (Applied Biosystems, Германия), причем искомый точечный полиморфизм располагали на З'-конце передних праймеров. Продукты ПЦР оценивали после электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле при окраске этидий-бромидом. Визуализацию специфических продуктов осуществляли с помощью УФ-трансиллюминатора. Изображения фиксировали с помощью цифровой фотокамеры Canon PowerShot А70.

Кроме того, в ходе исследования проводили оценку экспрессии ряда патогенетически значимых генов в тканях лейомиомы и прилегающего миометрия у 24 больных. Начальный этап выделения нуклеиновых кислот включал в себя обработку биоматериала в лизирующем растворе ультразвуком на установке Finnsonic (Финляндия) с последующей очисткой РНК сорбентным методом («Рибосорб», Интерлабсервис, Москва). Полуколичественное определение относительного содержания мРНК ММР-1, TIMP-1, CCL11/эотаксина, ССЬ24/эотаксина-2, CXCL8/IL-8, ССЬЗ/МПЧа, CCL4/MIP-lß, CCL5/RANTES, CXCLl/GRO-а, CXCL5/ENA-78, CXCL6/GCP-2, CXCL9/M1G, CXCLIO/IP-IO, CXCL13/BCA, CXCL12/SDF-1, CX3CL-1 и рецепторов к ним - CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CX3CR1 в тканях ЛМ и нормального миометрия проводили по оценке интенсивности сигналов геноспецифической ПЦР, регистрируемых при электрофорезе в агарозе. Количественные результаты исследований учитывали относительно экспрессии гена бета-актина с использованием программы Gel-Pro.

Помимо этого, в ходе исследования была проведена оценка уровня цитокинов в перитонеальной жидкости у 20 пациенток с лейомиомой матки и у 7 пациенток, составивших группу контроля. Материалом для иммунологического исследования являлась перитонеальная жидкость, полученная в ходе оперативного вмешательства при лапароскопии или лапаротомии. Полученные пробы перитонеальной жидкости подвергались исследованию с помощью мультиплексного определения цитокинов на установке «Bio-Plex» (Bio-Rad, США). Использовалась стандартная ТЫ/ТЬ2-панель, состоящая из 9 показателей: IL-2, IL-4,1Ь5, IL-10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN-y и TNF-а.

Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью пакета SPSS (Версия 13.0). При проведении генотипирования больных с ЛМ статистический анализ проводился путем непараметрического анализа (тест хи-квадрат, критерий корреляции Спирмена). При оценке экспрессии мРНК хемокинов и содержания цитокинов использовались следующие критерии: непараметрический анализ двух переменных (критерий Манна-Уилкоксона-Уитни), корреляционный анализ (критерии Спирмена и Пирсона). Различия между выборками считались достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Генотипирование промоторных аллелей генов ММР-1"1607, ММР-3"600, PAI-1"67S, MTHFR"677 в периферической крови больных лейомиомой матки и группы контроля. С целью изучения молекулярно-биологических аспектов патогенеза лейомиомы матки проводили оценку распространенности генных вариантов ММР-1 (IG/2G"1607), ММР-3 (5А/6А~60°), PAI-1 (4G/SG"675), MTHFR (С/Т677) у больных ЛМ. Анализ распределения изученных генных вариантов показал относительно равномерное распределение альтернативных аллелей генов ММР-1"'407, ММР-3"600, РАМ и MTHFR"677 у обследованных больных. Частоты аллелей этих генов в данной группе достоверно не отличались от частоты встречаемости промоторных аллелей перечисленных генов в группе популяционного контроля.

Выявлено, что быстрый рост лейомиомы достоверно чаще наблюдался у больных с высокой частотой встречаемости аллеля гс1607 гена ММР-1 (табл.1). Указанные различия были достоверными при р=0,02, что говорит о существенной связи между наличием высокоактивного аллеля ММР-1"1607 и темпами роста новообразования. Соответственно, выявление аллеля 2С1607 связано с повышенным риском быстрого роста опухоли.

Таблица 1

Распределение больных по генотипам ММР-1'1607 в зависимости от темпов роста лейомиомы матки

Подгруппы больных Больные ЛМ Генотип ММР-1

аллель IG гена ММР-1 1G/1G 1G/2G 2G/2G аллель 2G гена ММР-1

1 Больные с отсутствием роста ЛМ (п=30) 83% (25/30) 46,7 % (14/30) 36,7 % (11/30) 16,7% (5/30) 53,3%* (16/30)

2 Больные с медленным ростом ЛМ (п=69) 73% (51/69) 27,5 % (19/69) 46,4 % (32/69) 26,1 % (18/69) 72,5% (50/69)

3 Больные с быстрым ростом ЛМ (п=41) 78% (32/41) 17,1% (7/41) 61,0 % (25/41) 22,0 % (9/41) 82,9%* (34/41)

Примечание: приведены данные по группе из 140 больных, для которых имелась информация о динамике роста лейомиомы матки. Число случаев указано в скобках. * -различия между подгруппами 1 и 3 (отличия достоверны при р<0,05).

Кроме того, частота выявления аллеля 2G~16f17 гена матриксной металлопротеиназы 1 (ММР-1) оказалась более высокой у больных с многоузловыми формами JIM (р=0,04, табл.2). Это наблюдение не противоречит ранее упомянутой взаимосвязи данного генного маркера с темпами роста опухоли и, исходя из клонального роста лейомиомы, предполагает усиленную склонность к диссеминации данного новообразования у больных с гиперакгивным аллелем 2G"1607 гена ММР-1. Таким образом, проведенное исследование показало, что аллель 2G"1607 гена ММР-1 достоверно чаще встречается у больных с быстрым темпом роста лейомиомы матки и многоузловыми формами (табл. 1,2). Эта зависимость, возможно, связана со специфическими функциями ММР-1 в модификации межклеточного матрикса в зонах опухолевого роста. Ключевыми факторами роста лейомиомы являются ее митотическая активность, клеточная гипертрофия и изменения в структуре межклеточного матрикса. Известно, что уровень экспрессии мРНК коллагена -1 и -3 значительно выше в тканях ЛМ, по сравнению с миометрием [Puistola U., 1990]. Деградацию молекул коллагена типов 1 и III осуществляет ММР-1. Исследования [Bodner-Adler В., 2004] показали, что белок ММР-1 экспрессируется при лейомиоме в 90% случаев.

Таблица 2

Распределение больных по генотипам ММР-Г1607 в зависимости от числа выявленных узлов опухоли_

Подгруппы больных Больные ЛМ Генотип ММР-1

аллель 1G гена ММР-1 1G/1G 1G/2G 2G/2G аллель 2G гена ММР-1

1 Больные с 1-2 узлами ЛМ (п=86) 81,4% (70/86) 34,0 % (29/86) 47,7 % (41/86) 18,6% (16/86) 66,3%* (57/86)

2 Больные с 3-4 узлами ЛМ (п=44) 77,3% (34/44) 25,0 % (11/44) 52,3 % (23/44) 22,7% (16/44) 73% (33/44)

3 Больные с более чем 5 узлов ЛМ (п=40) 70,0% (28/40) 12,5 % (5/40) 57,5 % (23/40) 30,0% (12/40) 87,5%* (35/40)

Примечание: число случаев указано в скобках. * - различия между подгруппами 1 и 3 (отличия достоверны при р<0,05).

Отмечено, что в 54,7% случаев лейомиоме матки сопутствовал аденомиоз. Обнаружено, что достоверно чаще аллель 2С1607 гена ММР-1 встречался у больных с аденомиозом (р=0,008). Как показано в табл. 3, аллель 2С1607 гена ММР-1 встречался среди больных с аденомиозом в два раза чаще, чем у пациентов без признаков аденомиоза (р=0,008). Как и в ситуации с многоузловыми формами лейомиомы матки, данный факт может свидетельствовать о повышенной диссеминации клоногенных клеток, что в данном случае приводит к эктопическому росту эпителиальных тканей. Кроме того, у этого же контингента больных изучались частоты аллелей 5А/6А"600 гена ММР-3, тесно сцепленного с геном ММР-Г1607 на хромосоме 11, а также гена МТНРК (С/Т-От), полученные частоты аллелей ММР-3 и МТН№677 не отличались существенно от ранее опубликованных выборок для Северной Европы, и не было выявлено статистически достоверных различий между подгруппами с различной клинической симптоматикой. Этот результат подтверждает особую значимость отмеченных взаимосвязей между аплелем 2С1607 гена ММР-1 и клиническими характеристиками лейомиомы матки.

В ходе исследования была обнаружена существенная связь между наличием аллеля 5С^75 РАН и быстрым ростом лейомиомы (р=0,04). При анализе полиморфных вариантов изучавшихся генов у больных выявлено, что сочетание генотипов ММР-1/2С"1607 и РА1-1/5а675 достоверно чаще (р=0,005) встречалось у больных с быстрыми темпами роста ЛМ (табл. 4).

Таблица 3

Распределение генотипов ММР-Г1607 у больных лейомиомой матки с сопутствующим аденомиозом и без него

Больные JIM Генотип ММР-1

Аллель Югена ММР-1 1G/1G 1G/2G 2G/2G Аллель 2G гена ММР-1

Больные с аденомиозом (п=93) 16,3% (71/93) 18,3% (17/93) 58,1 % (54/93) 23,7 % (22/93) 81,7%* (76/93)

Больные без аденомиоза (п=77) 79,2% (61/77) 36,4 % (28/77) 42,9 % (33/77) 20,8 % (16/77) 63,6%* (49/77)

Примечание: число случаев указано в скобках. * - различия между подгруппами (отличия достоверны при р<0,05).

Таблица 4

Распределение больных с комбинацией ММР-1/2С1{07/ РАМ /бС675 в группах с разл ичными темпами роста опухоли

Подгруппы Больные ЛМ

больных Наличие сочетанного

генотипа ММР-1 /2G"1607 / PAI /5G"675

1 Нет роста 30,0%*

(п=30) (9/30)

2 Медленный рост 49,3%

(п=69) (34/69)

3 Быстрый рост 75,0%*

(п=40) (30/40)

Примечание: * - различия между подгруппами 1 и 3 (отличия достоверны при р<0,05).

Была также оценена экспрессия мРНК ММР-1, TIMP-1 относительно экспрессии гена актина в тканях JIM и миометрия. Между экспрессией ММР-1 в тканях JIM и ммометрня не было выявлено достоверных различий. В то же время экспрессия TIMP-1 оказалась повышенной (р=0,04) в миометрии по сравнению с тканью JIM (рис.1). Таким образом, снижение экспрессии TIMP-1 в JIM по сравнению с миометрием может являться фактором повышения активности ММР-1 в миоматозных тканях.

I

I

Рис. 1. Экспрессия мРНК ММР-1 и TIMP-1 в тканях лейомиомы и миометрия. * -различие между подгруппами (отличия достоверны при р<0,05).

Механизмы активации и подавления экспрессии ММР играют важную роль в регуляции гомеостаза внеклеточного матрикса. Снижение экспрессии мРНК Т1МР-1 в тканях лейомиомы приводит к усилению экспрессии мРНК ММР-1, что запускает процессы фиброзирования соединительной ткани.

Таким образом, динамика роста лейомиомы матки и развитие аденомиоза могут быть ассоциированы с носительством гиперактивного функционального варианта гена ММР-1"'607, что является предпосылкой для усиленной перестройки межклеточного матрикса Судя по известной нам литературе, этот факт обнаружен впервые, и, тем самым, обнаружена связь между генным полиморфизмом в системе матриксных металлопротеиназ и развитием доброкачественных новообразований. Этот физиологический механизм следует учитывать в изучении патогенеза и выбора лечения этих состояний. Следовательно, больные, у которых выявлен вариант 2G"16117 гена ММР-1, составляют группу риска по развитию симптомной (осложненной) лейомиомы матки (быстрый темп роста опухоли, множественное узлообразование, большие размеры опухоли, меноррагии), а также по возникновению аденомиоза.

Полученные результаты позволяют составить индивидуальный прогноз развития лейомиомы с применением консервативных и малоинвазивных методов терапии (эмболизация или лапароскопическая перевязка маточных артерий), с целью предотвращения развития осложненных форм заболевания.

Оценка экспрессии хемокинов в тканях лейомиомы и окружающего миометрия. С целью изучения молекулярно-биологических аспектов патогенеза лейомиомы матки была проведена оценка экспрессии хемокинов в тканях JIM и окружающего миометрия. Была выявлена достоверная корреляция между повышенной экспрессией генов ММР-1 в ткани лейомиомы и CXCL6/GCP-2 в прилежащем миометрии (г=0,6; р=0,002).

CXCL6/GCP-2 является ангиогенным хемокином, стимулирует клетки эндотелия к пролиферации и образованию сосудов. Возможно, усиление процессов ангиогенеза в миометрии, окружающем JIM, приводит к усилению сосудообразования в тканях опухоли. Была выявлена взаимосвязь между повышенной экспрессией генов ММР-1 в ткани лейомиомы и CXCR4 в прилежащем миометрии (r=0,6; р=0,01). CXCR4 является рецептором ангиогенного хемокина CXCL12/SDF-1.

0.6 ч I015 > 0.4 -0.3. г 0.2 • 0.1 о

1

0 MMP-1/Actinj i ЕЭТ1МР-1/Actin

миометрии

Помимо этого, экспрессия ангиогенных хемокинов CCL3/MIP-la, CCL4/MIP-lß и CCL11/эотаксина была повышена в тканях миометрия по сравнению с ЛМ (табл.5). Таким образом, в тканях миометрия происходит усиление экспрессии генов хемокинов с ангиогенными свойствами, что может способствовать формированию микрососудистой сети в тканях ЛМ. По-видимому, повышение экспрессии ангиогенных хемокинов является фактором риска для развития ЛМ.

Таблица 5

Экспрессия мРНК ряда хемокинов и их рецепторов в тканях ЛМ и миометрия (п=24)

Хемокин/рецептор Лейомиома матки Миометрий

CCL1/1-3 09 24,7±14,6 30,9+20,8

CCL2/MCP-1 24,7±14,6 30,9+20,8

CCL3/MIP-lcx 6,5±7,0* 10,7±9,0

CCL4/MIPlß 1,7±1,5* 6,5 ±4,7

CCL5/RANTES 3,0±6,8 3,6+6,5

CCL11/Эотаксин 1,5+1,9* 4,2+5,9

ССЬ24/Эотаксин-2 4,5±5,7 5,1±5,5

CXCLl/GRO-alpha 14,1+20,1 42,1±24,6

CXCL5/ENA-78 17,1+20,1 43,1 ±24,6

CXCL6/GCP - 2 25,7±14,б 31,9+20,8

CXCL8/IL-8 3,4±4,5 5,9+7,3

CXCL9/MIG 42,7±19,3 46,3±23,6

CXCL10/1P-10 44,9±20,8 53,4+21,5

CXCLI2/SDF 4,0+6,8 5,6±6,5

CXCL13/ВСА 23,7+14,6 29,9+20,8

СХЗСЫ/фракталкин 23,7+14,6 32,9±20,8

CCR1 47,9±20,8 55,4±21,5

CCR3 40,7±19,3 48,3±23,6

CCR4 24,7+14,6 30,9+20,8

CCR5 44,7+23,1* 58,9±23,0

CXCR1 17,1±20Д 45,1 ±24,6

CXCR2 19,7±12,6 23,9±13,8

CXCR4 22,7±14,6 33,9+18,8

CX3CRI 22,7±10,6 30,9± 14,8

Примечание: * - различия достоверны между показателями в тканях лейомиомы

матки и миометрия (отличия достоверны при р<0,05).

Кроме того, была проведена оценка экспрессии хемокинов и их рецепторов в зависимости от клинической симптоматики ЛМ (темпы роста, многоузловые формы). Выявлено, что экспрессия ангиогенного хемокина ССЬ2/МСР-1 и рецептора СХЗСК1 была повышена в миометрии по сравнению с тканью лейомиомы при быстром росте опухоли (р=0,002 и р=0,003 соответственно). Помимо этого, обнаружено, что экспрессия мРНК СХСЁ4 была повышена в ткани лейомиомы по сравнению с тканью миометрия при многоузловых формах (р=0,003).

Таблица б

Экспрессия мРНК ряда хемокинов и их рецепторов в тканях JIM и миометрия в зависимости от темпов роста опухоли.

Хемокин Быстрый Быстрый Медленный Медленный Р

рост, рост, ткань рост/нет рост/нет (2 и 4)

ткань ЛМ миометрия роста. роста,

(п=8) ткань ЛМ ткань

(п=11) миометрия

Подгруппы 1 2 3 4

CX3CR1 25,4+6,5 46,3+2,9* 32,3+3,7 31,9±6,4* 0,009

CCL2/MCP-1 0 22,8±11,9* 11,4±5,1 6,8+5,0* 0,038

Примечание: * - различия достоверны между показателями в тканях лейомиомы матки и миометрия в подгруппах 2 и 4 (отличия достоверны при р<0,05).

Оценка содержания цитокинов в перитонеальной жидкости больных лейомиомой матки. Были выявлены достоверно повышенные уровни 1Ь-10, ОМ-С5Р, 1НЧ-у и Т№-а у пациенток с длительностью течения заболевания более 5 лет по сравнению с пациентками, у которых миома матки существовала менее 5 лет (р<0,05) (рис. 2). Показатели остальных цитокинов достоверно не различались.

Содержание цитокинов в перитонеальной жидкости в зависимости от длительности течения лейомиомы

1000

pg/ml

—Р IFN-gamma С TNF-alpha

менее 5 лет

Рис. 2. Содержание цитокинов в перитонеальной жидкости у больных лейомиомой матки с различной длительностью заболевания. * - различия достоверны - между подгруппами пациенток, ** - с группой сравнения (отличия достоверны при р<0,05).

Указанные различия свидетельствуют о том, что длительность опухолевого процесса в миометрии обусловливает выраженность активации иммунной системы в большей степени по ТЫ-пути. ШМ-у - это цитокин, продуцируемый активированными Т-лимфоцитами и ЫК-клетками, стимулирующий моноциты и макрофаги. Наблюдаемый в нашем исследовании достоверно повышенный уровень !РЫ-у у пациенток с длительным (5 и более лет) анамнезом заболевания очевидно связан с тем, что продолжительная антигенная нагрузка в виде патологически измененного коллагена миоматозных узлов ведет к

активации иммунной системы по ТЫ-пути. Известно, что в перитонеальной жидкости в норме присутствуют как СВ4+ и С08+-лимфоциты (Т-клетки), так и С056+-лимфоциты (ИК-клетки). Все перечисленные субпопуляции лимфоцитов в активированном состоянии способны продуцировать 1НМ-у. Повышенное содержание 1Ь-10 у женщин с длительным анамнезом заболевания (5 и более лет), возможно, является следствием активации по принципу отрицательной обратной связи: большая выраженность иммунного ответа по ТЫ-типу обусловливает повышенную продукцию 1Ь-10.

При изучении содержания 1Ь-10 был обнаружен его повышенный уровень у пациенток с сопутствующим лейомиоме матки аденомиозом (р<0,05), быстрым (р<0,01) и медленным (р<0,05) ростом опухоли, а также у больных с простой и пролиферирующей формами лейомиомы матки (р<0,05) по сравнению с группой контроля (рис. 3.).

0,1 0,01 0,001

- -1-

щ ш ......

и Просгая

□ Лролиферирующэя

□ Группа сравнения

П Нет роста ЕЗ Медианный рост

Быстрый рост Еэ Котропь

-

ш

о Есть аденомиоз а Нет аденомиоза а Контроль

Рис. 3. Особенности содержания 1Ь-10 в перитонеальной жидкости у больных лейомиомой матки в зависимости от: А - формы лейомиомы матки; Б - темпа роста лейомиомы матки; В - наличия или отсутствия аденомиоза * - различия достоверны между подгруппами; ** - различия с группой сравнения (отличия достоверны при р<0,05).

1Ь-10 - цитокин, опосредующий ТЬ2-тип иммунного ответа. Кроме того, 1Ь-10 является противовоспалительным цитокином. Отмеченный нами повышенный уровень 1Ь-10 у пациенток с сопутствующим лейомиоме матки аденомиозом, быстрым ростом

опухоли, а также в связи с ее пролиферирующей формой может свидетельствовать о неблагоприятной роли ТЬ2-типа иммунного ответа в развитии лейомиомы матки.

ВЫВОДЫ

1. Частоты полиморфных вариантов генов ММР-1 (1G/2G.1607) и ММР-3 (5А/6А"*0), PAl-1 (4G/5G"675) и MTHFR (С/Г677) не различаются достоверно между общей группой больных с лейомиомой матки и популяционным контролем.

2. Частота гиперактивного аплеля 2G"1607 гена матриксной металлопротеиназы (ММР-1) и сочетанного генотипа ММР-1 2G"I6OT/PAI-1 5G"675 значительно повышена в подгруппах больных с быстрым ростом лейомиомы, что говорит о возможности влияния этих генов на процессы пролиферации и диссеминации опухолевых клеток. Частота аллеля 2G"1607 повышена при многоузловых формах лейомиомы и аденомиозе, что указывает на значимость этого аллеля как фактора риска развития осложненных форм патологии эндометрия и миометрия.

3. Выявлено снижение экспрессии гена TIMP-1 в миоматозной ткани, что согласуется с усилением коллагенолиза в ткани лейомиомы.

4. Экспрессия гена ММР-1 в тканях опухоли коррелирует с экспрессией генов проангиогенных хемокинов CXCL6/GCP-2 и CXCL12/SDF-1 в тканях окружающего миометрия. Экспрессия мРНК CXCL12/SDF-1 достоверно повышена в тканях ЛМ при многоузловых формах опухоли, что отражает роль этих факторов в ремоделировании ткани матки.

5. В тканях прилежащего миометрия экспрессия генов ангиогенных хемокинов -CCLI 1/эотаксина, CCL3/MIP-la, CCL4/MIP-lß и рецептора CCR5 достоверно выше по сравнению с опухолевой тканью. Экспрессия генов CCL2/MCP-1, CX3CR1 в тканях миометрия достоверно повышена при быстром темпе роста ЛМ, что подтверждает участие факторов ангиогенеза в развитии доброкачественных новообразований.

6. Выявлены достоверно повышенные уровни IL-10, GM-CSF, IFN-y и TNF-a у пациенток с длительностью течения заболевания более 5 лет по сравнению с пациентками, у которых ЛМ существовала менее 5 лет. Показатели остальных цитокинов достоверно не различались. При изучении содержания IL-10 был обнаружен его повышенный уровень у пациенток с сопутствующим лейомиоме матки аденомиозом, быстрым и медленным ростом опухоли, а также у больных с простой и пролиферирующей формами лейомиомы матки по сравнению с группой сравнения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты исследования предназначены для использования специалистами в области клинической лабораторной диагностики, гинекологии и онкологии в медицинских учреждениях.

1. Рекомендуется использовать в качестве лабораторного критерия генотипирование полиморфизмов ММР-1 1G/2G"1607 и PAI-1 4G/5G"675 у женщин с ЛМ для своевременного прогнозирования быстрорастущих и многоузловых форм опухоли.

2. Рекомендуется проводить генотипирование промоторного полиморфизма ММР-1 1СЗ/2С1601 с целью выявления групп повышенного риска по развитию аденомиоза.

3. Рекомендуется диагностика комбинированного генотипа 20 ММР-1'1607/ 5С675 РАМ, позволяющая уточнить индивидуальный прогноз развития ЛМ, а также предупреждать развитие осложненных форм опухолевого заболевания с применением малоинвазивных методов лечения (лапароскопия, эмболизация маточных артерий) и сохранением репродуктивной функции у женщин с ЛМ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в периодических научных изданиях, рекомендованных ВАК

1. Морозова Е.Б. Прогностическая значимость генного полиморфизма ММР-1, ММР-3 и MTHFR в развитии лейомиомы матки / Е.Б. Морозова, А.Б. Чухловин, Н.В. Кулагина, Арег А. Тотолян // Журн. акушер, и Жен. болезн. - 2005. - Том 54, Вып. 3. - С.54-59.

2. Морозова Е.Б. Ассоциация промоторных генотипов ММР-1 и PAI-l с патологией клеточной пролиферации у больных лейомиомой матки / Е.Б. Морозова, А.Б. Чухловин, Н.В. Кулагина, Арег А. Тотолян // Молекул, медиц. - 2006. - №1. - С.52-58.

3. Чухловин А.Б. Изучение роли иммунологических и генетических факторов в патогенезе лейомиомы матки / А.Б. Чухловин, Н.В. Кулагина, К.А. Сысоев, Е.Б. Морозова, Е.Е. Зуева, Л.С. Комарова, Арег А. Тотолян // Молекул, медиц. -2007. - №1 - С.42-50.

4. Сысоев К.А. Экспрессия мРНК хемокинов и хемокиновых рецепторов в тканях миометрия и лейомиомы матки / К.А. Сысоев, Н.В. Кулагина, А.Б. Чухловин, Е.Б. Морозова, Арег А. Тотолян // Бюл. эксперимент, биол. и медиц,- 2008. - Т.145,№1. - С.91-96.

Тезисы конференций

5. Кулагина Н.В. Ассоциация аллеля 2G гена ММП-1 с параметрами роста при лейомиоме матки / Н.В. Кулагина, Е.Б. Морозова, А.Б. Чухловин, Арег А. Тотолян // Russian Journal of Immunology - 2005. - Том 9, №2. - C.202.

6. Морозова Е.Б. Взаимосвязь между субпопуляционным составом лимфоцитов, полиморфизмом матриксных метаплопротеиназ и типом роста при миоме матке / Е.Б. Морозова, Л.С. Комарова, Е.Е. Зуева, Н.В. Кулагина, А.Б. Чухловин, Арег А. Тотолян // Медицинская Иммунология. - 2005. - Том.7, № 2-3. - С.188.

7. Кулагина Н.В. Роль генного полиморфизма генов ММР-1, PAI-1 в прогнозе развития гиперпластических процессов в миометрии / Н.В. Кулагина, Е.Б. Морозова, А.Б. Чухловин, Арег А. Тотолян // Мат. VII Рос. форума «Мать и Дитя». - М., 2005. - С.422-423.

8. Кулагина Н.В. Экспрессия мРНК хемокинов и хемокиновых рецепторов в миометрии и миоматозных узлах у больных с различными клиническими вариантами течения миомы матки / Н.В. Кулагина, К.А. Сысоев, А.Б. Чухловин, Е.Б. Морозова, Арег А. Тотолян // Мат. I per. науч. форума «Мать и Дитя». -Казань, 2007. - С.283-284.

9. Кулагина Н.В. Роль системы хемокинов в развитии различных клинических вариантов течения миомы матки / Н.В. Кулагина, К.А. Сысоев, А.Б. Чухловин,

Е.Б. Морозова, Aper А. Тотолян // Мат. межрег. науч.-практ. конф., посвящ. 65-летию кафедры перинатологии, акушерства и гинекологии лечебного факультета «Актуальные вопросы акушерства и гинекологии» - Красноярск: Изд-во ООО «Версо», 2007. - С.83-89.

10. Кулагина Н.В. Иммунные и генетические механизмы роста миомы матки I Н.В. Кулагина, А.Б. Чухловин, Е.Б. Морозова, К.А. Сысоев, Е.Е. Зуева, Арег А. Тотолян // Мат. межрег. науч.-практ. конф., посвящ. 65-летию кафедры перинатологии, акушерства и гинекологии лечебного факультета «Актуальные вопросы акушерства и гинекологии» - Красноярск: Изд-во ООО «Версо», 2007. - С.89-97.

11. Морозова Е.Б. Выявление групп высокого риска по заболеваниям репродуктивной системы у женщин // Мат. Тринадцатой Санкт-Петербургской Ассамблеи молодых ученых и специалистов. - 2008. - с. 14.

12. Морозова Е.Б. Экспрессия мРНК хемокинов и хемокиновых рецепторов, регулирующих ангиогенез, в тканях миометрия при лейомиоме матки / Е.Б. Морозова, А.Б. Чухловин, Н.В. Кулагина, К.А. Сысоев, Арег А. Тотолян // Мат. XIII Всерос. науч. форума с международным участием имени академика В.И.Иоффе. - «Дни Иммунологии в Санкт-Петербурге» - 2009. - с.34.

Подписано в печать «13» ноября г. Формат 60x84/16 Бумага офсепда. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,3- Тираж 100 экз. Заказ № 3545

Типография «Восстания -1» 191036, Санкт-Петербург, Восстания, 1.

Лейомиома матки (ЛМ) встречается у 20-40% женщин. В последние годы отмечено существенное повышение частоты ЛМ у женщин репродуктивного возраста, что определяет социальную значимость данного заболевания. В процессе развития ЛМ часто встречаются такие клинические осложнения, как быстрый рост, развитие многоузловых форм с нарушениями функций окружающих тканей и органов, что часто приводит к необратимому бесплодию [1]. В связи с этим, поиск прогностических маркеров развития осложненной лейомиомы матки является одной из актуальных проблем сохранения репродуктивного здоровья женщин.

Данное хроническое заболевание является доброкачественным новообразованием миометрия. Патогенез быстрого и многоузлового роста ЛМ изучен недостаточно.

Ведущую роль в патогенезе ЛМ играет гормональный дисбаланс [15]. Однако, вследствие того; что гормональные сдвиги не вполне информативны в плане прогноза течения ЛМ, а гормональное лечение не всегда эффективно и сопряжено с появлением побочных эффектов, необходимо изучение других механизмов генеза осложненных форм заболевания. В частности, представляется актуальным исследование факторов перестройки (ремоделирования) соединительной ткани - ключевого процесса, обусловливающего прогрессию опухолей. Распад коллагенового матрикса и последующее ремоделирование тканей матки осуществляется при активном-участии матриксных металлопротеиназ (ММР). ММР являются ферментами, осуществляющими деградацию межклеточного матрикса как в норме, так и при патологических процессах [104]. Ферменты семейства ММР выполняют особую роль в процессах неоангиогенеза, в частности, при росте опухолей.

Описаны функциональные варианты генов ММР, которые могут различаться по уровням продукции белков-энзимов. Для гена ММР-1 коллагеназы-1) известен полиморфизм в области промотора, связанный с наличием 1G или 2G в позиции 1607. Наличие 2G создает дополнительный сайт для транскрипционного фактора Est. и ведет к усилению продукции про-ММР [21]. Другой патогенетически значимый ген кодирует ингибитор активатора плазминогена (PAI-1) и регулирует уровень экспрессии ММР. Для гена PAI-1 характерен полиморфизм в области промотора 4G/5G. Наличие 5G аллеля гена PAI-1 приводит к сниженной продукции мРНК PAI-1, относительной активации системы ММР, усилению деградации межклеточного матрикса в зоне роста опухоли и активному распространению ее клеток в подлежащие ткани, тогда как более активный вариант (4G) связан с более интенсивной продукцией PAI-1 и ингибированием систем фибринолиза и коллагенолиза [46]. Таким образом, исследования связи между носительством функциональных полиморфизмов генов ММР-1 и PAI-1 и клиническими осложнениями лейомиомы матки весьма актуальны как для анализа патогенетических механизмов, так и в целях прогнозирования различных осложнений JIM.

Активация ММР связана с привлечением лейкоцитов и активацией системы хемокинов. Хемокины являются низкомолекулярными белками. В последнее время активно изучается также их влияние на процессы ангиогенеза. По наличию или отсутствию ELR-последовательности (глютамат-лейцин-аргинин), хемокины подразделяются на ангиогенные (стимулирующие ангиогенез) и ангиостатические (ингибирующие ангиогенез). СХС - хемокины, содержащие ELR-последовательность, являются ангиогенными факторами, индуцирующими хемотаксис эндотелиальных клеток в зоны ангиогенеза, в частности, при росте опухолей [39; 60]. В эту группу входят CXCL8/IL-8, CXCLl/GRO-a (Growth-related oncogene-alpha), CXCL5/ENA-78 (Epithelial cell-derived neutrophil-activating peptide-78), CXCL6/GCP-2 (Granulocyte chemotactic peptide-2). CXC -хемокины, не содержащие ELR-последовательность, обладают выраженными ангиостатическими свойствами. В их числе - CXCL10/IP-10 (interferon-inducible protein), CXCL9/MIG (monokine induced by IFN-T).

Таким образом, изучение генетических факторов предрасположенности к развитию патологии соединительной ткани позволит классифицировать больных лейомиомой матки по степени риска развития осложнений для того, чтобы проводить их своевременную профилактику. Анализ экспрессии генов хемокинов дает возможность оценить роль ангиогенных факторов в развитии отдельных клинических форм JIM. Таким образом, изучение молекулярно-генетических аспектов развития JIM определяет актуальность и теоретическую значимость данной работы

Цель работы

Выявление генных и иммунологических маркеров для прогнозирования осложненных клинических форм лейомиомы матки.

Задачи работы

1. Определить частоты функциональных вариантов генов ММР-1 (1G/2G), ММР-3 (5 А/6 A), PAI-1 (4G/5G) и MTHFR (С/Т) у больных лейомиомой матки.

2. Выявить взаимосвязи между полиморфными вариантами генов, основной симптоматикой и сопутствующими патологическими состояниями (аденомиозом, гиперплазией эндометрия и др.) при ЛМ и определить генетические маркеры повышенного риска патологической пролиферации тканей репродуктивной системы.

3. Оценить экспрессию мРНК ММР-1 и TIMP-1 в тканях JIM и прилежащего миометрия, выявить взаимосвязи между локальной экспрессией данных генов и клиническими особенностями течения ЛМ.

4. Выявить и оценить уровни экспрессии генов следующих хемокинов: CCL11/эотаксина, ССЬ24/эотаксина-2, CXCL8/IL-8, CCL3/MIP-lot,

CCL4/MIP-1(3, CCL5/RANTES, CXCLl/GROa, CXCL5/ENA-78, CXCL6/GCP-2, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, CXCL13/BCA, CXCL12/SDF-1, CX3CL-1 и рецепторов к ним - CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CX3CR1 в тканях JIM и прилежащего миометрия.

5. Определить взаимосвязи между локальной продукцией ангиогенных и ангиостатических хемокинов, экспрессией генов ММР -1 и TIMP-1 в ткани лейомиомы, и индивидуальной симптоматикой JIM.

6. Определить содержание IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN-у, TNF-a в перитонеальной жидкости больных JIM и в группе сравнения.

Научная новизна

Впервые проведена оценка частоты встречаемости полиморфных вариантов генов ММР-1 (1G/2G), ММР-3 (5А/6А), PAI-l (4G/5G), MTHFR (С/Т) у больных лейомиомой матки. Выявлено преобладание гиперактивного аллеля 2G гена матриксной' металлопротеиназы ММР-1 в подгруппах больных ЛМ с быстрым темпом роста опухоли, многоузловыми формами J1M и с сопутствующим аденомиозом, а также достоверная ассоциация между наличием аллеля 5G PAI-1 и быстрым ростом лейомиомы матки. Обнаружена достоверная корреляция между повышенной экспрессией генов ангиогенных хемокинов CXCL6/GCP-2 и CXCL12/SDF-1 в миометрии и усилением экспрессии гена ММР-1 в ткани лейомиомы матки. Установлено, что экспрессия генов ангиогенных хемокинов - CCLll/эотаксина, CCL3/MIP-la, CCL4/MIP-1(3 и рецептора CCR5 достоверно повышена в ткани миометрия по сравнению с тканью лейомиомы, причем экспрессия генов CCL2/MCP-1, CX3CR1 в миометрии более выражена при быстром темпе роста ЛМ.

Теоретическая значимость работы

Выявленная взаимосвязь между наличием у больных лейомиомой матки гиперактивного промоторного аллеля 2G гена ММР-1 и выраженной пролиферацией миометрия, а также аденомиозом, подтверждает универсальный характер стимулирующего влияния матриксных металлопротеиназ на процессы ремоделирования внеклеточного матрикса, связанного с нормальным и эктопическим ростом тканей репродуктивной системы.

Сниженная экспрессия гена тканевого ингибитора металлопротеиназ (TIMP-1) в ткани опухоли приводит к усилению процессов деградации коллагена в ткани лейомиомы.

Обнаруженная достоверная корреляция между повышенной экспрессией гена ММР-1 в ткани лейомиомы матки и внеопухолевой экспрессией ангиогенных хемокинов CXCL6/GCP-2 и CXCL12/SDF-1 в миометрии, а также усиленная экспрессия других ангиогенных хемокинов (CCL11/эотаксина, CCL3/MIP-la, CCL4/MIP-1(3) и CCR5 в миометрии по сравнению с опухолевой тканью, допускает патогенетическую связь между активацией коллагенолиза в опухоли и усилением ангиогенеза в прилегающих областях миометрия.

Практическая значимость работы

Предложенный и внедренный в клиническую практику набор генетических маркеров (ММР-1 и PAI-1) дает возможность уточненного прогнозирования осложнений лейомиомы матки в целях планирования индивидуальной терапии, а также для предотвращения и снижения риска развития осложнений при данном заболевании.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Гиперактивный аллель 2G гена ММР-1 достоверно чаще встречается при тяжелых формах JIM (быстрый темп роста, многоузловые формы, кровотечения), и, напротив, наличие генотипа 1G/1G гена ММР-1 ассоциировано с благоприятным прогнозом заболевания. Быстрый темп роста ЛМ взаимосвязан с сочетанным генотипом ММР-1 2G /РА1-1 5G.

2. Повышенная экспрессия ангиогенных хемокинов в тканях миометрия и ЛМ свидетельствует об усилении ангиогенных и пролиферативных процессов в тканях опухоли.

3. Генотипирование ММР-1 1G/2G у пациенток с ЛМ на начальных стадиях развития заболевания позволяет предупредить развитие осложненных форм ЛМ (быстрый темп роста, многоузловые формы, кровотечения) и использовать менее инвазивные операции (лапароскопия, эмболизация маточных артерий) до клинического проявления заболевания.

Личный вклад автора

Автором выполнены все этапы оптимизации аллель-специфической ПЦР, проведена оценка частоты встречаемости гиперактивных вариантов генов ММР-1 (1G/2G), ММР-3 (5А/6А), PAI-1(4G/5G), MTHFR (С/Т) в крови больных ЛМ, проведена полуколичественная оценка экспрессии мРНК генов хемокинов, ММР-1, TIMP-1 в тканях ЛМ и миометрия, а также соответствующие клинико-лабораторные сопоставления по комплексу полученных результатов. Комплексное клиническое обследование пациентов с ЛМ производилось д.м.н. Н.В. Кулагиной. Оценка содержания цитокинов была проведена к.м.н. К.А. Сысоевым.

Апробация работы

Основные положения диссертационного исследования были доложены на VII, VIII, XIII Всероссийских научных форумах с международным участием имени акад. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2003, 2004, 2009), на межвузовской конференции Общества Молодых Ученых СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова «Санкт-Петербургские научные чтения - 2005, 2006», на научном совете СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова в качестве победителя конкурса «Стипендия года 2006» (цикл статей, посвященных изучению патогенеза JIM). Диссертационная работа поддержана грантами Правительства Санкт-Петербурга в 2008, 2009 гг. Методы диагностики информативных генетических маркеров, исследованных в данной работе, внедрены в клиническую практику СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, городского центра планирования семьи и репродукции (ГЦПСиР).

Публикации

По теме диссертационного исследования опубликовано 12 научных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации основных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук.

Структура и объем диссертации

Результаты исследования предназначены для использования специалистами в области клинической лабораторной диагностики, гинекологии и онкологии в медицинских учреждениях.

1. Рекомендуется использовать в качестве лабораторного критерия генотипирование полиморфизмов ММР-1 1G/2G"1607 и PAI-1 4G/5G"675 у женщин с ЛМ для своевременного прогнозирования быстрорастущих и многоузловых форм опухоли.

2. Рекомендуется проводить генотипирование промоторного полиморфизма ММР-1 1G/2G"1607 с целью выявления групп повышенного риска по развитию аденомиоза.

3. Рекомендуется диагностика комбинированного генотипа 2G ММР-1" 1607/ 5G"675 PAI-1, позволяющая уточнить индивидуальный прогноз развития ЛМ, а также предупреждать развитие осложненных форм опухолевого заболевания с применением малоинвазивных методов лечения (лапароскопия, эмболизация маточных артерий) и сохранением репродуктивной функции у женщин с ЛМ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ