Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Роль генетических дефектов четвертого компонента комплемента в патогенезе системной красной волчанки у детей

На правах рукописи

0 3 СЕН 2009

КУЗЬМЕНКО

НАТАЛЬЯ БОРИСОВНА

РОЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДЕФЕКТОВ ЧЕТВЕРТОГО КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА В ПАТОГЕНЕЗЕ СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКИ У ДЕТЕЙ

14.00.09 - педиатрия

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2009

003476030

Работа выполнена в ФГУ ФНКЦ Детской гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоцразвития России

Научные руководители: Доктор медицинских наук, профессор Щербина Анна Юрьевна

Доктор медицинских наук, профессор Продеус Андрей Петрович

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор Козлов Иван Генрихович

Доктор медицинских наук, профессор Делягин Василий Михайлович

Ведущее учреждение: ФГУ Московский научно-исследовательский институт педиатрии и детской хирургии Росмедтехнологий

Защита состоится «_»_2009 года в «_» часов

На заседании диссертационного совета Д 208.050.01 при ФГУ ФНКЦ Детской гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоцразвития России по адресу 117997, Москва, Ленинский проспект, д.117, корпус 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ ФНКЦ ДГОИ Минздравсоцразвития России (117997, Москва, Ленинский проспект, д.117, корпус 2) и на сайте: www.niidg.ru

Автореферат разослан «_»_2009 г

Ученый секретарь диссертационного совета, д.м.н.,

профессор В.М.Чернов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Иммунная система — уникальная система человеческого организма, которая способна отличать «свое» от «чужого», тем самым обеспечивая защиту от инфекций (Roitt А., 2000). Аутоиммунные заболевания являются последствием активации аутореактивных Т- и B-клеток по неясным пока причинам. (Davidson А., 2001). Системная красная волчанка (СКВ) -прототип аутоиммунных заболеваний, при котором поражаются различные системы и органы (Davidson А., 2001; Petri М., 2006; Tsokos G.C., 2007). Большинство аутоиммунных заболеваний, в том числе и СКВ, рассматриваются как комплексные заболевания, в манифестации которых принимают участие факторы внешней среды и генетические факторы (Tsao В.Р., 2003; James J.A., 2006; Hunnangkul S., 2008). Терапия таких заболеваний не избирательна и крайне агрессивна, что не лучшим образом влияет на качество жизни пациентов.

Исследование генетических основ аутоиммунных заболеваний необходимо для понимания патогенетических механизмов и открытия новых путей для терапии более совершенного уровня - уровня генома.

Наследование СКВ происходит вопреки простым Менделевским законам, и имеет полигенную модель наследования (Rhodes В., 2008). В некоторых случаях СКВ связана с редкими, но высокоспецифичными мутациями (Yang Y., 2007). Например, с гомозиготным дефицитом ранних компонентов системы комплемента Clq, С2 или С4 (Hauptmann G., 1974; Walport M.J., 1998; Pickering М.С., 2000; Becker K.G., 2004; Manderson A.P., 2004). Известно, что при полном дефиците С4 компонента комплемента системная красная волчанка развивается более, чем в 75% случаев (Lewis M.J., 2006;Yu C.Y., 2007).

Однако работы, посвященные исследованию генетических основ дефицита ранних компонентов комплемента, в том числе и С4, не

многочисленны. Возможно, это связано с трудоемкостью исследований уникального участка генома, в котором расположены гены С4.

Результаты таких работ разнятся в зависимости от расовой принадлежности и этнической группы исследуемых (Härtung К., 1992; Barba G.M., Steinsson К., 1998; Lokki M.L., 1999; Dragon-Durey М.А., 2000; Blanchong C.A., 2001; Man X-Y, 2003; Arason G.J., 2004; Yang Y., 2007; Puah S.M., 2007). Российская популяция не была изучена на предмет дефектов генов С4.

Кроме того, большинство исследований проводилось на группах взрослых пациентов с СКВ, с использованием взрослого контроля. Работы с участием детей, больных СКВ единичны (Clemenceau S., 1990; Man X-Y, 2003; Arason G.J., 2004; Wu Y-U, 2006). Как правило, дети включены в общую когорту пациентов вместе со взрослыми, страдающими волчанкой (Man X-Y, 2003; Arason G.J., 2004). В настоящее время опубликовано лишь несколько исследований с участием изолированных групп детей, однако в этих работах для сравнительного анализа не обследовались дети без аутоиммунной патологии (Clemenceau S., 1990; Wu Y-U, 2006).

Таким образом, на сегодняшний день нет единого мнения о роли дефектов генов С4 компонента комплемента в патогенезе СКВ у детей.

С учетом вышеизложенного определены цель и задачи данного исследования.

Цель исследования:

Изучение роли «нулевых» аллелей гена С4 компонента комплемента в патогенезе системной красной волчанки у детей российской популяции.

Задачи исследования:

1. Изучить частоту встречаемости «нулевых» аллелей генов С4А и С4В у детей, больных СКВ и в группах контроля в российской популяции.

2. Выяснить, предрасполагает ли наличие «нулевых» аллелей генов С4 к развитию системной красной волчанки.

3. Оценить концентрацию белка С4 в сыворотке крови у пациентов с

дефектами генов С4.

4. Охарактеризовать особенности дебюта и течения СКВ у пациентов с

дефектами генов С4.

Научная новизна исследования

Впервые в России изучена частота встречаемости «нулевых» аллелей генов С4А и С4В в гомозиготном и гетерозиготном состоянии у детей, больных СКВ, и детей без клинических признаков аутоиммунных заболеваний. Выявлено, что наличие «нулевых» аллелей генов С4А и С4В не является определяющим фактором для развития СКВ в российской детской популяции. Доказано, что первичные дефекты С4 компонента комплемента не влияют на ранний дебют СКВ и тяжесть клинических проявлений заболевания. Подтверждено, что низкая концентрация белка С4 в сыворотке крови не является маркером первичного дефицита С4.

Практическая значимость работы

Изменения концентрации белка С4 в сыворотке крови может показывать активность процесса СКВ, но не является маркером первичного дефекта.

Наличие первичного дефекта С4 компонента комплемента не предрасполагает к более тяжелым клиническим проявлениям при СКВ у детей.

Внедрение результатов в практику

Основные положения диссертации внедрены в практическую работу отделения иммунопатологии ДГКБ № 9 им. Г.Н.Сперанского и специализированного отделения диффузных заболеваний соединительной ткани клиники детских болезней ММА им. И.М.Сечепова.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Частота гомозиготных дефицитов С4А/В в Российской популяции ниже, чем было опубликовано в большинстве исследований, проведенных среди представителей европеоидной расы.

2. «Нулевые» аллели гена С4А в гетерозиготном состоянии встречаются с одинаковой частотой среди детей с СКВ (13,89%) и в группе контроля детского возраста (18%).

3. «Нулевые» аллели генов С4А и С4В не являются предрасполагающим фактором возникновения СКВ среди детей в российской популяции.

4. Возраст дебюта и тяжесть клинических проявлений СКВ у пациентов с первичными дефектами С4 компонента комплемента не отличаются от таковых у детей с нормальным функционированием генов С4.

Апробация работы

Материалы диссертации изложены на Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии; иммунодиагностика и иммунотерапия», (Курск, 2006), XII съезде Европейского общества иммунодефицитов (ЕБГО) ('5-Нег1*^епЬо5с11, Нидерланды, 2008), на конференции Европейского общества генетиков (ЕНвС) (Вена, Австрия, 2009).

Публикации

Материалы диссертации отражены в 7 печатных работах. Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 106 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 20 таблицами и 15 рисунками и включает введение, обзор литературы, характеристику обследованных пациентов и методов исследования, 2 главы результатов собственного исследования, заключение, 2 клинических примера, выводы, практические рекомендации, указатель литературы, включающий отечественные и зарубежные источники.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования, характеристика обследованных пациентов

Работа выполнена на базе ФГУ ФНКЦ Детской гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоцразвития России.

Общая характеристика пациентов и здоровых в исследуемых группах.

В ходе данной работы было обследовано 86 детей и 26 взрослых. Всего было выделено 3 группы: I группа, основная, включала 36 детей (11 мальчиков и 25 девочек), больных системной красной волчанкой. II группа, сравнения, составила 50 детей (26 мальчиков и 24 девочки) без клинических признаков аутоиммунной патологии. III группа, сравнения, составила 26 взрослых добровольцев (3 мужчин и 23 женщины), также без клинических признаков аутоиммунной патологии и не имеющих родственников с таковой.

Диагноз СКВ устанавливался на основании диагностических критериев американского ревматологического колледжа (Tan ЕМ, Cohen AS, Fries JF, 1982). Медиана возраста пациентов на момент настоящего исследования составила 15,0 [13,5;16,0] лет. Девочки представляли 69,4% (25/36), мальчики 30,6% (11/36) больных. Медиана возраста пациентов к моменту дебюта заболевания составила 13,0 [10,0;14,0] лет.

Характеристика основной (I) группы

Родители 29 пациентов (80,56%) относят себя к славянской языковой группе. Среди семи оставшихся больных с СКВ (19,44%) встречаются представители тюркской группы (казахи, татары), армянской (армяне), картвельской (грузины) и нахско-дагестанской групп (ингуши, чеченцы).

Пять детей (13,89%) имели родственников, больных аутоиммунными заболеваниями. У 11 (30,5%) детей был выявлен неблагополучный преморбидный фон (патология беременности, родов, отягощенный акушерский и ранний анамнез). У 12 (33,3%) детей в период, предшествовавший дебюту СКВ, выявлены инфекционные заболевания (стоматиты, ангины, пневмонии). У 25 детей (около 70%) на дебют СКВ

повлияли факторы окружающей среды, такие, как инсоляция, стресс, травма, инфекционные заболевания, вакцинация, менархе. Среди провоцирующих факторов преобладали инфекционные заболевания - 22 человека (61,1%) и инсоляция - 10 человек (27,7%). У 11% детей (4 человека) отмечено сочетание нескольких факторов.

У 15 (41,67%) больных отмечено подострое начало возникновения СКВ, у 20 человек (55,56%) острое начало, у одного (2,77%) - первично-хроническое. У большинства больных (35 детей, 97,22%) в дебюте заболевания отмечалось полисиндромное начало, не зависимо от возраста начала заболевания. У одного пациента (2,77%) - моносиндромный дебют.

В клинической картине дебюта заболевания у пациентов с СКВ преобладали кожный синдром, лихорадка, цитопения, суставной синдром и АФС. В табл. 1 представлены основные препараты, использованные в лечении наблюдаемых пациентов с СКВ.

Таблица 1. Препараты, использованные в лечении пациентов с СКВ

Терапия п - 36 %

глюкокортикостероиды 36 100

цитостатики 10 27,8

синхронная терапия 8 22,2

Характеристика контрольных (II и III) групп

Родители 45 (90%) детей контрольной группы относят себя к славянам. Среди пяти оставшихся детей (10%) встречаются представители тюркской группы (татары) и нахско-дагестанской группы (ингуши, чеченцы).

В контрольной группе встречаются дети, страдающие нетяжелыми хроническими заболеваниями, такими, как аллергические заболевания (атопический дерматит, аллергический ринит, бронхиальная астма в легкой степени тяжести), гастродуоденит, пиелонефрит, хронический тонзиллит, астеноневротические реакции. Средняя частота заболеваний верхних дыхательных путей в этой группе составила 4,3 раза в год.

88,5% (23 человека) взрослых здоровых добровольцев относят себя к славянской группе; еще трое (11,5%) взрослых - представители армянской (армяне) и тюркской группы (татары).

Методы лабораторных исследований.

С4 фракция комплемента определялась методом турбодиаметрии на аппарате TURBOX (Origon Diagnostica, США).

Геномная ДНК выделялась из периферической крови согласно протоколу при использовании наборов компании Quagen, США для выделения ДНК из образцов периферической крови.

Для определения дефектов генов С4А и С4В использовалась полимеразная цепная реакция с сиквенс-специфическими праймерами. Общий список праймеров, использованных в работе, представлен в табл.2, компоненты и условия для ПЦР 1,2,3 описаны в табл.3, компоненты и условия для ПЦР 4 - в табл.4. ПЦР проводили на РТС-200 DNA Thermal Cycler, MJ Research, Великобритания.

Таблица 2. Список праймеров для определения «нулевых» аллелей генов С4 и их причин

№ Наименование олигонукпеотида Sequence (5'-3') Длина

1 Ado AGGACCCCTGTCCAGTGTTAGAC 23

2 Bdo AGGACCTCTCTCCAGTGATACAT 23

3 Е29.3 TTGGGTACTGCGGAATCCCC 20

4 Aup-1 CCCTGCATGCTCCTGTCTAA 20

5 Bup-1 CCCCTGCATGCTCCTATGTAT 21

6 L3-1 GGATCCAGCAGTTTCGGAAG 20

7 Gil GCTTCAGTACTTCCAGCCTGT 21

8 C4Adcl TGACACAAAATACCAGGATGTGA 23

9 C4Anon-del CCAACATGTCTGTG СATGCTG 21

10 C4Norm29 TTGCTCTGAGAACCAGTGAC 20

11 C4Ins29 AGAACCAGTGACTGAGAGC 19

12 C4int28.1 TTAGGATCCCTGAGTGTGCC 20

ПЦР1 на наличие/отсутствие C4AQQ/C4BQ0 аллелей в гомозиготном состоянии в исследуемом образце ДНК.

Для определения «нулевых» аллелей генов С4А/В в гомозиготном состоянии использовалась полимеразная цепная реакция с сиквенс-специфическими праймерами: Е29.3 + Ado, Е29.3 + Bdo, L3-1 + Aupl, L3-1 + Bupl. Температурный режим: при 95 С - 7 с; при 66°С - 20 с; при 72°С -40 с. Общее число циклов -29.

ПЦР2 на наличие/отсутствие 30 kb делеции гена С4А.

С помощью метода «long distance» ПЦР образцы ДНК были проанализированы на наличие/отсутствие 30 kb делеции гена С4А. Использовались праймеры: C4Adel + Gil, C4Anon-del + Gil. Температурный режим: при 95 С - 7 с; при 66°С - 20 с; при 72°С -40 с. Общее число циклов -36.

ПЦРЗ на наличие/отсутствие двунуклеотидной вставки (ТС) в 29 экзоне генов С4А и С4В.

Нами были подобраны праймеры (C4norm29 + Ado, C4norm29 + Bdo) и отработан метод аллель-специфического ПЦР, который позволяет выявлять точечную мутацию - двунуклеотидную вставку (ТС) в 29 экзоне - генов С4А/В. Температурный режим: при 95 С - 7 с; при 62°С - 20 с; при 72°С -40 с. Общее число циклов -28.

Таблица 3. Компоненты и условия ПЦР 1,2,3

Геномная ДНК Юнг

1 х Encyclo Taq reaction buffer (Evrogen)

дНТФ 200 цМ

Праймер Dir 0.2 цМ

Праймер Rev 0.2 цМ

1 x Encyclo Taq Polymerase mix (Evrogen)

Общий объем реакционной смеси 25 ц!

ПЦР4 с заглублением (матрица — продукт ПЦРЗ)

Наличие двунуклеотидной вставки было подтверждено прямым секвенированием с праймера C4rnt28.1 продуктов амплификации 3 после очистки ПЦР продукта (QIAquick PCR Purification Kit, Qiagen). Использованные праймеры: C4Ins29 + C4Int28.1. Температурный режим: при 95°С - 7 с; при 60°С - 20 с; при 72°С -40 с. Общее число циклов -15.

Определение нуклеотиднон последовательности проводилось на секвенаторе MegaBACE 500 Amersham Biosciences, США.

Таблица 4. Компоненты и условия ПЦР4

Продукт ПЦРЗ 25 пг

1 х Encyclo Taq reaction buffer (Evrogen)

дНТФ 200 цМ

Праймер Dir 0.2 цМ

Праймер Rev 0.2 цМ

1 x Encyclo Taq Polymerase mix (Evrogen)

Общий объем реакционной смеси 25 ц1

Статистический анализ

Статистическая обработка материала сделана с использованием программы STATISTIC A v 6.0.

Оценка достоверности различий показателей проводилась с помощью непараметрических статистических методов (х2, точного критерия Фишера, критерия Манна-Уитни). Возраст пациентов представлен в виде медианы (Me) и шггерквартильного размаха. Достоверными считали различия при уровне значимости р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

В настоящем исследовании мы проанализировали связь «нулевых» аллелей генов С4 компонента комплемента с СКВ в детской группе пациентов и в контроле. Поскольку большинство опубликованных исследований были выполнены во взрослой популяции, мы также в качестве

контроля проанализировали группу взрослых, не имеющих клинических признаков аутоиммунной патологии. 16,66% детей с СКВ имели первичные дефициты С4 компонента комплемента. В группе контроля у 20% детей были обнаружены дефекты генов С4, среди взрослых здоровых добровольцев - у 11,5%. Мутации генов С4 распределились в исследуемых группах следующим образом.

Гомозиготный дефицит гена С4А

В нашем исследовании среди детей с СКВ не обнаружено ни одного гомозиготного, т.е. полного, дефицита гена С4А. В труппе контроля среди взрослых также не найдено гомозиготного дефицита гена С4А. Среди детей без признаков аутоиммунных заболеваний один ребенок имел полный С4А дефицит (табл.5). Известно, что некоторые европейские и американские, а также китайские исследователи показали достоверную связь дефектного гена С4А с системной красной волчанкой у взрослых, по сравнению с контрольной группой здоровых индивидуумов из той же географической области. Было заявлено, что гомозиготные дефициты гена С4А встречаются с частотой 6-20% среди пациентов с СКВ в белой популяции. В популяции здоровых - лишь 2-4%. Наши результаты разительно отличаются от данных американских и некоторых европейских исследователей, что может быть связано с генетическими особенностями российской популяции и/или детским возрастом исследуемой группы пациентов.

Гомозиготный дефицит гена С4В

Нами был обнаружен один ребенок с гомозиготным дефицитом гена С4В среди пациентов с СКВ. Также один гомозиготный дефицит гена С4В найден среди взрослого контроля (табл.5). Никто из детей контрольной группы не имел такого дефекта. Полный, или гомозиготный, дефицит гена С4В среди здоровых взрослых встречается с частотой около 1%. О роли нулевого аллеля С4В при СКВ имеется всего несколько сообщений. При исследованиях больших когорт пациентов и контрольных групп среди белых, азиат и афро-американцев не подтверждается повышенная частота встречаемости С4ВСЮ аллеля при СКВ. Результаты нашей работы совпадают

с большинством данных, полученных в мировом научном сообществе. Гомозиготный дефицит гена С4В не играет изолированной роли в патогенезе СКВ у детей российской популяции.

Таблица 5. Частота встречаемости двух С4СЮ аллелей у детей с СКВ и среди контрольных групп

Аллели I гр. - СКВ пациенты,п II гр. - контроль (дети), п III гр. - контроль (взрослые), п

C4AQ0 аллель гомозиготы 0 1 0

C4BQ0 аллель гомозиготы 1 0 1

Гетерозиготный дефицит гена С4А

На долю гетерозиготных, или частичных, дефицитов гена С4А по данным большинства авторов приходится более 50 % случаев в популяции больных СКВ по сравнению с 20-30% в контроле.

В некоторых популяциях наиболее частой причиной дефицита гена С4А является большая делеция, захватывающая ген С4А и псевдоген 21CYP. Однако, например, среди японцев такой дефект не обнаруживается.

Частота встречаемости большой делеции гена С4А и псевдогена CYP21 среди пациентов с СКВ в данной работе составила 11,11% (4/36) по сравнению с 18,00% (9/50) в группе контроля среди детей, что не имеет достоверных различий (р=0.37 по критерию х2). Во взрослой группе контроля только один индивидуум имел частичный дефицит гена С4А по причине наличия большой делеции гена С4А (рис.1).

Помимо генной делеции, дефицит С4А может возникать в результате образования «молчащего», или неэкспрессирующего белок гена. Одной из причин отсутствия экспрессии гена С4А является точечная мутация — двунуклеотидная (ТС) вставка в 29 экзоне, наличие которой ведет к образованию стоп-кодона в 30 экзоне этого же гена и, как следствие, к невозможности синтеза белка. Эта мутация встречалась чаще у пациентов с СКВ по сравнению с группой контроля и более характерна для популяции белых по сравнению с афро-американцами. Однако в некоторых этнических

группах, в особенности среди азиат, такая мутация не обнаруживается совсем. Этот же дефект описан и как причина «молчащего» гена С4В.

Деления С4АОО

Рис.1. Частота встречаемости делеции гена С4А среди пациентов с СКВ (I группа) и среди детей II группы сравнения (р=0.37)

В нашей группе наблюдения гетерозиготные дефициты гена С4А, причиной которых явилась двунуклеотидная вставка в 29 экзоне гена С4А, обнаружены у одного ребенка с СКВ и одного здорового взрослого. Среди детской группы контроля ни один ребенок не имел этого дефекта (табл.6).

Таблица 6. Частота встречаемости точечной мутации в 29 экзоне гена С4А

Мутация I гр. - СКВ пациенты,п II гр. - контроль (дети), п III гр,- контроль (взрослые), п

ТС вставка в 29 экзоне гена С4А 1 0 1

Отличия частоты встречаемости делеции гена С4А и точечной мутации в 29 экзоне этого гена в различных популяциях говорит о том, что, возможно, есть некоторые другие причины нулевых аллелей генов С4, присущие определенным этническим группам, в том числе и нашей. Предположение о специфической роли гена С4А в патогенезе СКВ возникло из-за того, что белок С4А способен ингибировать иммунную преципитацию и принимает участие в клиренсе иммунных комплексов, тогда как С4В более активен при инфекционных процессах.

По результатам, полученным в данном исследовании, можно говорить об отсутствии специфической роли гетерозиготного дефицита гепа С4А при СКВ в детской популяции россиян.

Гетерозиготный дефицит гена С4В

Описанная ранее точечная мутация в 29 экзоне гена С4В, не была обнаружена ни среди обследованных нами пациентов с СКВ, ни среди участников групп контроля.

Соотношение по полу детей с дефектами генов С4 в двух группах

Известно, что системной красной волчанкой чаще заболевают девочки пубертатного периода и женщины детородного возраста. Возникновение СКВ у мальчиков часто свидетельствует о наличии того или иного предрасполагающего генетического фактора. Соотношение между мальчиками и девочками, имеющими «нулевые» аллели генов С4, было 1:2. Среди детей в группе контроля соотношение мальчиков и девочек с «нулевыми» аллелями генов С4 - 1:1.5. При сравнении количества мальчиков, имеющих дефекты генов С4, среди пациентов и в группе контроля достоверных различий обнаружено не было (р=0,78 по критерию X2). Таким образом, наличие «нулевых» аллелей генов С4А/В не связано с полом.

Особенности исследования группы здоровых взрослых

Необходимо отметить, что большинство опубликованных исследований проводились с участием взрослых пациентов и соответствующего контроля. Дети же обычно обследовались в общей когорте со взрослыми. В исследованиях с участием изолированных групп детского возраста отсутствовала группа сравнения. Интересно, что в нашей работе ни у кого из здоровых взрослых не найден гомозиготный дефицит гена С4А, и только у одного обследуемого определялся гомозиготный дефицит гена С4В. Частичный дефицит гена С4А среди взрослой группы сравнения был

обнаружен лишь у двоих: один человек с делецией и один с двунуклеотидной

вставкой в 29 экзоне (табл.7).

Таблица 7. Дефектные гены С4 компонента комплемента в исследуемых группах

ГОМОЗИГОТЫ ГЕТЕРОЗИГОТЫ

Группы Полный дефицит С4АО0 Полный дефицит С4ВО0 Частичный дефицит генаС4А (делецияи нонэкспрессия)

I - дети СКВ, п 0 1 5 (13.89%)

II - дети контроль, п 1 0 9 (18%)

III - взрослые контроль, п 0 1 2

Хотя разницу частоты мутаций в контрольных группах взрослых и детей на данном этапе исследования статистически оценить невозможно (т.к. группа взрослых слишком мала), предварительные данные свидетельствуют о том, что в группе взрослого контроля частота С4А(}0 аллелей ниже, чем в группе детского контроля. Есть предположение, что С4А(20 аллели играют роль при дебюте СКВ у взрослых, в отличие от детей. Для подтверждения этой гипотезы необходимо обследование когорты взрослых пациентов с СКВ, заболевших после пубертатного периода, и сравнение частоты встречаемости дефектов генов С4А и С4В в различных возрастных группах среди пациентов с СКВ и здоровых.

Таким образом, нами была обнаружена низкая частота встречаемости гомозиготных дефицитов генов С4А и С4В среди пациентов с СКВ по сравнению с данными многих исследований европеоидной расы. Частота встречаемости гетерозиготного дефицита гена С4А по данным нашей работы также ниже, чем заявлено в большинстве предыдущих исследований, и сравнима с частотой встречаемости этого дефицита в группе контроля среди

детей. Такие результаты могут объясняться особенностями генетического фона российской гетерогенной популяции и детским возрастом исследуемой группы. Наличие дефектных генов С4 не связано с полом пациентов.

Концентрация белка С4 у пациентов с дефектами генов С4 и без В группе пациентов с СКВ было выделено две подгруппы: 1) дети в стадии обострения заболевания и 2) дети, поступившие для контрольного обследования (вне обострения). Первую подгруппу составили 15 человек, из которых 7 (47%) детей имели значительное снижение белка С4 (ниже 0.09 мг/дл), лишь у четверых обнаружился генетический дефект гена С4. Во вторую подгруппу включен 21 ребенок, только у одного из них отмечалось значительное снижение белка С4. При этом дефект гена С4 у этого пациента не обнаружен.

0.4т

О

из

аэ о

* о.И

0.0-

*

• ••

обострение неактивная фаза

Рис.2. Концентрация белка С4 в активной фазе и вне обострения у пациентов с СКВ (р=0,01)

При анализе концентрации белка С4 у пациентов в активной фазе заболевания и вне стадии обострения мы подтвердили данные наших предыдущих исследований (Петрова У.Н., 2003) о том, что при манифестации заболевания и в периоды обострений СКВ концентрация белка С4 может снижаться, что, по всей видимости, связано с его активным потреблением (р=0,01 по критерию Манна-Уитни) (рис.2).

Однако концентрация белка С4 в сыворотке крови не отличались среди пациентов с дефектами генов С4 и без (р=0.85 по критерию Манна-Уитни). Нами не было обнаружено связи между низкой концентрацией белка С4 в сыворотке крови и наличием «нулевых» аллелей генов С4А и С4В в группе пациентов (рис.3).

0.4-1

0.3 ч

о

л

о 0.2л о

0.Ц

0.0-

С4С)0 Остальные СКВ

Рис.3. Концентрация белка С4 у пациентов с дефектами генов С4 и без (Р=0,85)

Таким образом, по концентрации белка С4 в сыворотке крови невозможно судить о наличии первичного дефицита С4.

Клинические проявления СКВ у пациентов с дефектами генов С4 и без

Заболеваемость системной красной волчанкой среди женщин детородного возраста выше, чем среди детей. Исследуя группу пациентов детского возраста, мы предполагали, что у детей с генетическими дефектами СКВ дебютирует раньше, чем у детей без таковых дефектов. Однако при сравнении средних рангов возраста дебюта заболевания в группе детей с «нулевыми» аллелями и без, выяснилось, что среди пациентов, имеющих «нулевые» аллели генов С4А и С4В, медиана возраста дебюта составил 13,5 [11; 14] лет. Медиана возраста дебюта СКВ среди пациентов без «нулевых» аллелей генов С4А/В - 12,5 [10; 13] лет. Достоверных различий между сравниваемыми группами не было обнаружено (р=0,29 по критерию Манна-Уитни), следовательно, возраст дебюта СКВ не связан с дефектами генов С4А/В.

При анализе основных клинических синдромов (рис. 4), проявившихся при манифестации СКВ, было обнаружено, что кожный синдром в виде характерной сыпи «бабочка» на лице и дискоидной сыпи на теле обнаруживался у 66,67% пациентов, имеющих дефект генов С4 и у 83,33% детей, не имеющих дефект генов С4, что не имеет достоверных отличий (р=0.57 по точному критерию Фишера). Проявления слизистого синдрома в виде эритематозных пятен и эрозивных очагов на слизистой ротовой полости и носа встречались у 16,67% пациентов, имеющих дефект генов С4 и у 40,00% детей, не имеющих дефект генов С4, что также не имеет достоверных отличий (р=0.38 по точному критерию Фишера). Суставной синдром встречался в дебюте СКВ у 100,00% пациентов, имеющих дефект генов С4 и у 70,00% детей, не имеющих дефект генов С4, что не имеет достоверных отличий (р=0.30 по точному критерию Фишера). Проявления серозитов отмечались у 16,67% пациентов, имеющих дефект генов С4 и у 46,67% детей, не имеющих дефектов генов С4, что не имеет достоверных отличий (р=0.36 по точному критерию Фишера). Нефриты встречались с одинаковой частотой (по 50%) в обеих группах (р=1.00 по точному критерию Фишера).

Цсрсброваскулиты проявлялись у 36,67% детей с СКВ без мутаций в С4 геиах и отсутствовали у пациентов с мутациями, однако достоверных различий также не было обнаружено (р=0.14 по точному критерию Фишера). Цитопения была диагностирована у всех больных с дефектами генов С4 и у 80% детей без мутаций, что не имеет достоверных отличий (р=0.56 по точному критерию Фишера). Лимфаденопатия обнаруживалась у 50,00% пациентов, имеющих дефект генов С4 и у 30,00% детей, не имеющих дефект генов С4, что не имеет достоверных отличий (р=0.37 по точному критерию Фишера). Лихорадка в дебюте заболевания была диагностирована у всех больных с дефектами генов С4 и у 73,33% детей без мутаций, что не имеет достоверных отличий (р=0.30 по точному критерию Фишера). Антифосфолипидный синдром проявлялся у 83,33% пациентов, имеющих дефект генов С4 и у 76,67% детей, не имеющих дефектов генов С4, что не имеет достоверных отличий (р=1.00 по точному критерию Фишера). Миалпга отмечались у 50,00% пациентов, имеющих дефект генов С4 и у 40,00% детей, не имеющих дефектов генов С4, что также не имеет достоверных отличий (р=0.67 по точному критерию Фишера). Спленомегалия наблюдалась у 16,67% пациентов, имеющих дефект генов С4 и у 20,00% детей, не имеющих дефектов генов С4, что не имеет достоверных отличий (р=1.00 по точному критерию Фишера). В отличие от всех остальных синдромов, при дебюте СКВ кардит встречался чаще у пациентов, не имеющих мутаций в генах С4 (70,00%), по сравнению с теми, кто имел генетические дефекты этих генов (16,67%) (р=0.02 по точному критерию Фишера). Легочный васкулит не был зафиксирован ни у кого из детей с мутациями генов С4 и проявлялся у 16,67% пациентов без дефектов С4. Однако достоверных отличий не было (р=0.56 по точному критерию Фишера). Проявления поражений печени отмечались у 33, 33% детей с СКВ без мутаций в С4 генах и отсутствовали у пациентов с мутациями, однако достоверных различий также не было обнаружено (р=0.15 по точному критерию Фишера).

□ пациенты, не имеющие дефекты гена С4 О пациенты, имеющие дефекты гена С4

Рис.4. Ведущие клинические синдромы при дебюте СКВ у детей с мутациями в гене С4 и без

Таким образом, у всех пациентов с СКВ, имеющих генетический дефект гена С4, в клинической картине дебюта заболевания преобладали лихорадка, цитопения и суставной синдром; отсутствовали проявления цереброваскулита, легочного васкулита и поражения печени.

Некоторые исследования, проведенные ранее, отмечают корреляцию клинических проявлений при СКВ с «нулевыми» аллелями гена С4А, предполагая более тяжелое течение процесса при врожденном дефекте. Однако в процессе нашей работы не обнаружено связи между тяжестью клинических проявлений в дебюте СКВ и наличием нулевых аллелей гена С4А. Это касается и вовлечения почек в волчаночный процесс, в отличие от некоторых исследований, которые предполагают, что С4АО0 является фактором риска для развития волчаночных нефритов.

Клиническая характеристика детей группы контроля с дефектами генов С4.

В группе сравнения у 10 детей были обнаружены дефекты генов С4. Среди них 1 ребенок имел гомозиготный дефицит гена С4А, 9 человек -гетерозиготный дефицит гена С4А за счет делеции гена С4А и псевдогена 21CYP. Дефекты гена С4В среди детей этой группы не были обнаружены.

Все дети группы контроля, имеющие дефекты генов С4, за исключением одного, вступили в пубертатный период на момент обследования.

Таблица 9. Сравнительная характеристика возраста дебюта СКВ среди пациентов, имеющих дефекты генов С4, и возраста детей группы контроля с дефектами генов С4 на момент обследования (лет)

Ме возраста СКВ пациентов с дефектами генов С4 Ме возраста детей группы контроля с дефектами генов С4 р (по критерию Манна-Уитни)

13,5 [11;14] 14 [11;14] 0,66

Медиана возраста детей с мутациями гена С4 в группе контроля не имеет достоверных различий с медианой возраста пациентов, имеющих дефекты генов С4 (табл.9). Следовательно, дети с дефектами генов С4 из контрольной группы не проявили клинических признаков аутоиммунной патологии к тому же возрасту, в котором дети основной группы с мутациями генов С4 уже были больны СКВ.

Никто из детей группы контроля, включая детей с выявленными мутациями, не имел клинических признаков аутоиммунной патологии.

Частота аллергических заболеваний, гастродуоденитов, пиелонефритов, хронических тонзиллитов, астеноневротических реакций, встречающихся в контрольной группе детей, не отличалась у детей с мутациями генов С4 и без (рис.5).

□ дети, имеющие дефекты С4 О дети, не имеющие дефектов С

Рис.5. Частота встречаемости хронических заболеваний у детей группы контроля с дефектами генов С4 и без

Частота и выраженность инфекций верхних дыхательных путей у детей с дефектами генов С4 не отличается от таковой у детей без дефектов генов С4 (рис.6) (р=0,30 по критерию Манна-Уитни).

дети, имеющие дефекты С4

дети, не имеющие дефектов С4

Рис.6. Сравнение частоты встречаемости заболеваний верхних дыхательных путей среди детей (II) группы контроля с дефектами генов С4 и без.

Таким образом, наличие дефектных генов С4 не связано с аллергическими заболеваниями, хроническими заболеваниями ЖКТ и почек, астеноневротическими реакциями, а также с частотой и выраженностью инфекций верхних дыхательных путей в детском возрасте.

ВЫВОДЫ

1. «Нулевые» аллели гена С4А встречаются с частотой 13,89% среди детей с СКВ и с частотой 20% среди детей, не имеющих аутоиммунных заболеваний.

2. Первичные дефекты С4 компонента комплемента не связаны с ранним дебютом СКВ и тяжестью клинических проявлений при манифестации заболевания.

3. Низкая концентрация белка С4 в сыворотке крови не может являться маркером первичного дефицита С4.

4. Наличие «нулевых» аллелей генов С4А и С4В не является фактором риска для развития СКВ в российской детской популяции. Различия в полученных результатах с некоторыми исследованиями, опубликованными ранее, можно объяснить национальными особенностями российской популяции и детским возрастом исследуемой группы.

5. Наличие «нулевых» аллелей генов С4 у детей не предрасполагает к развитию хронических соматических и инфекционных заболеваний.

Практические рекомендации

1. Определение четвертого компонента системы комплемента в сыворотке крови у пациента детского возраста с системной красной волчанкой рекомендуется для оценки активности течения заболевания.

2. Наличие первичного дефицита С4 компонента комплемента не дает возможности прогнозировать тяжесть течения системной красной волчанки и агрессивность терапии заболевания.

3. Определение дефектов С4 компонента комплемента целесообразно в совокупности с исследованием дефектов других генов главного комплекса гистосовместимости (МНС) и генов за пределами МНС, участвующих в патогенезе СКВ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Кузьменко Н.Б., Петрова У.Н., Щербина А.Ю., Продеус А.П. Дефекты гена С4 как фактор развития СКВ // Российский иммунологический журнал // Вводные лекции и тезисы докладов Российской научно-практической конференции «Совремешше технологии в иммунологии; иммунодиагностика и иммунотерапия», 2006г, том 9, №3, с.122.

2. N.B.Kuzmenko, Y.N.Petrova, G.A. Lyskyna, N.A.Geppe, D.A.Shagin, I.A.Shagina, A.Shcherbina, A.P.Prodeus. Primary defects of C4 and Clq correlate with sever presentation of systemic lupus (SLE) in children // Abstracts XII Meeting of the European Society for Immunodeficiencies, Budapest, 2006, p.55.

3. N.B.Kuzmenko, I.A. Shagina, M.A. Kurnikova, N.A.Geppe, G.A.Lyskina, D.A. Shagin, A.P.Prodeus and A.Shcherbina. Genetic defects of C4 complement component in systemic lupus erythematosus (SLE) in children // Abstracts XII Meeting of the European Society for Immunodeficiencies, 's-Hertogenbosch, 2008, p.61.

4. N.B.Kuzmenko, I.A. Shagina, M.A. Kurnikova, N.A.Geppe, G.A.Lyskina, D.A. Shagin, A.P.Prodeus and A.Shcherbina. Genetic defects of C4 complement component in systemic lupus erythematosus (SLE) in children // Clinical & Experimental Immunology, 2008, Vol.l54:(l), p. 43-44.

5. I. Shagina, N. Kuzmenko, M. Kurnikova, A. Shcherbina, A. Prodeus, D. Shagin. Investigation of complement component C4 loci deficiencies in Russian children with Systemic Lupus Erythematosus (SLE) // Abstracts of the European Human Genetics Conference, Vienna, 2009, N 09, p. 119.

6. Кузьменко Н.Б., Шагина И.А., Курникова M.A., Геппе H.A., Лыскина Г.А., Шагин Д.А., Продеус А.П., Щербина А.Ю. Дефекты генов С4 компонента комплемента у детей с системной красной волчанкой в российской популяции // Вестник Уральской медицинской академической науки, №2/1 (24,2009), с.44-46.

7. Кузьменко Н.Б., Шагина И.А., Продеус А.П., Курникова М.А., Шагин Д.А. и Щербина А.Ю. «Нулевые» аллели генов С4 компонента

комплемента в патогенезе системной красной волчанки у детей в российской популяции // Российский иммунологический журнал, 2009, том 2, №2-3, с.122-135.

Список сокращений

СКВ - системная красная волчанка

ЕБГО - европейское общество иммунодефицитов ЕНОС — европейское общество генетиков ДГКБ — детская городская клиническая больница ФГУФНКЦ - федеральный государственный научно-клинический центр

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота