Автореферат и диссертация по медицине (14.00.04) на тему:Роль функционального полиморфизма генов IL-1β и IL-1RA в иммунопатогенезе и лечении хронического гнойного риносинусита

На правах рукописи

иизи56825

ТИМЧУК Лола Эркиновна

РОЛЬ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ 1Ь-1Р И 1Ь-ША В ИММУНОГ1АТОГЕНЕЗЕ И ЛЕЧЕНИИ ХРОНИЧЕСКОГО ГНОЙНОГО РИНОСИНУСИТА

14.00.04 - Болезни уха, горла и носа 14.00.36 - Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург - 2007

003056825

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт уха, горла, носа и речи Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные руководители: Заслуженный врач РФ,

доктор медицинских наук, профессор Янов Юрий Константинович доктор медицинских наук, профессор Симбирцев Андрей Семёнович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Ревской Юрий Константинович доктор медицинских наук, профессор Калинина Наталья Михайловна

Ведущая организация: Военно-медицинская академия им.С.М.Кирова

Защита диссертации состоится 2007г. в часов на заседании

Диссертационного Совета Д 208.091.01 при ФГУ «Санкт-Петербургский НИИ уха, горла, носа и речи Росздрава» (190013, Санкт-Петербург, ул. Бронницкая, дом 9).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Санкт-Петербургский НИИ уха, горла, носа и речи Росздрава»

Автореферат разослан

года

Учёный секретарь Диссертационного Совета кандидат медицинских наук,

старший научный сотрудник ^^^^^^^^^¿^^роздова М. В.

Актуальность проблемы. Самыми распространёнными заболеваниями JIOP-органов как среди взрослых так и детей считаются риносинуситы (Т.И.Гаращенко, 1996; М.Р.Богомильский, 2001; В.Т.Пальчун, 2002; Г.З.Пискунов, С.З.Пискунов, 2006). В настоящее время изучены основные механизмы развития и разработаны схемы лечения риносинуситов, однако удельный вес больных, госпитализированных по поводу риносинуситов, увеличивается ежегодно на 1,5-2% (А.А.Седикин, М.Н.Шубин, 2000). От 5 до 15% всего населения страдают различными формами риносинуситов (А.И.Крюков, М.Н.Шубин, 2001). Воспалительные заболевания околоносовых пазух нередко являются причиной тяжелых опасных для жизни осложнений. Отмечается постоянное увеличение хронических форм заболевания (А.С.Лопатин, 2002; Г.З.Пискунов, С.З.Пискунов 2006). Стандартная антибактериальная терапия зачастую неэффективна при хронических заболеваниях околоносовых пазух (H.S.Gold, H.S.Moellering, 1996;

A.И.Крюков, М.Н.Шубин, 2001; Klossek et all, 2001).

Особенности течения воспалительных заболеваний в околоносовых пазухах определяются во многом формированием иммунной системы уже в детском возрасте под воздействием генной регуляции (Д.В.Стефани, Ю.Е.Вельтищев, 1996). Поэтому лечение и профилактика воспаления в околоносовых пазухах является одной из важных проблем уже в детском возрасте (М.С.Плужников, Г.В.Лавренова, 1990; Б.В.Шеврыгин, 1998; Л.М.Ковалёва, 2001; Э.А.Цветков, 2005;). Большое значение уделяется изучению системного и местного иммунитета при этой патологии. Одним из факторов, определяющих иммунопатогенез хронического гнойного риносинусита (ХГРС), является несостоятельность местных факторов защиты в очаге воспаления (P.Brandtzaeg et al., 1998; И.С.Фрейдлин, 1999; Л.Ф. Азнабаева, 2002; С.В.Рязанцев, 2005;).

Как известно, равновесие между продукцией, экспрессией и ингибицией синтеза белков семейства интерлейки на-1 (IL-1 ) играет одну из ключевых ролей в развитии, регуляции и исходе воспалительного процесса (С.А.Кетлинский, 1988). При ХГРС возникает дисбаланс продукции цитокинов семейства IL-1 и нарушение соотношения продукции IL-ip и рецепторного антагониста IL-ip(IL-lRA) в сторону увеличения доли последнего в очаге воспаления (Л.Ф.Азнабаева, 2002). Изменение соотношения продукции IL-ip и IL-IRA в сторону увеличения доли IL-1RA на системном уровне и в очаге воспаления способствует торможению эффектов IL-lp и может служить признаком хронизации воспалительного процесса.

В настоящее время показано — приводить к дисбалансу биологического действия IL-1 может функциональный полиморфизм генов, кодирующих белки семейства IL-1, несущих небольшие мутационные изменения (точечные замены нуклеотидов, тандемные повторы частей гена). Дисбаланс в продукции белков семейства IL-1 может влиять на характер протекания воспалительных заболеваний и являться одним из пусковых моментов для генерации патологических процессов.

В России применение рекомбинантных аналогов цитокинов в клинической практике стало возможным благодаря клонированию генов семейства IL-1 (С.А.Кетлинский, В.Г.Конусова, А.С.Симбирцев и др., 1988; А.С.Симбирцев,

B.Г.Конусова, Е.А.Варюшина и др., 1995). Рекомбинантный IL-ip под

коммерческим названием Беталейкин (БЛ) разрешен Минздравом РФ к клиническому применению (№97/51/6). Применение БЛ в комплексном лечении ЛОР-больных показало, что этот препарат высокоэффективен как при системном, так и местном его применении (Н.А.Арефьева, 1997; И.И.Чернушевич, 2000; Л.Ф.Азнабаева, 2002; О.Б.Бродовская, 2004 и др.). Терапия рекомбинантным IL-ip оказывает стимулирующее воздействие на функции иммунной системы больных хроническим гнойным риносинуситом, регулирует соотношение IL-IRA и IL-ip, активирует функциональное состояние иммунного ответа непосредственно в очаге воспаления и способствует ускоренному завершению воспалительного процесса. Однако степень эффективности лечения этим препаратом у больных различается. Остаётся не выясненным вопрос о низкой способности лейкоцитов периферической крови продуцировать эндогенный IL-ip и о высокой продукции рецепторного антагониста IL-1(IL-1RA) у больных ХГРС (Л.Ф.Азнабаева, 2002).

Цель исследования. Изучение влияния полиморфизма генов цитокинов семейства IL-1 на предрасположенность к хроническому гнойному риносинуситу, а также на эффективность местной терапии рекомбинантным IL-ip.

Задачи исследования:

1. Проанализировать распределение аллельных вариантов генов IL-ip(+3953) и IL-1RA*2 у больных ХГРС и здоровых доноров.

2. Оценить влияние полиморфизма генов IL-ip(+3953) и IL-1RA*2 на предрасположенность к ХГРС.

3. Изучить влияние рекомбинантного 1Ь-1Р(БЛ) при местном введении на показатели системного и местного иммунитета.

4. Исследовать влияние функционального полиморфизма генов семейства IL-1 на эффективность терапии рекомбинантным IL-ip.

Научная новизна исследования.

Согласно проведенному генетическому скринингу, ХГРС ассоциируется с полиморфизмом гена IL-1 RA*2(VNTR), а также с сочетаниями вариантов генов « 1 /1 »IL-1 P+«2/2»IL-1RA и «l/2»IL-ip+«2/2»IL-]RA, ответственными за функционирование системы IL-1.

Установлено, что наличие полиморфизма гена «2/2»IL-lRA статистически достоверно (р<0,05) влияло на уровень спонтанной и индуцированной продукции IL-ip, а также на индуцированную продукцию IL-8 клетками периферической крови и уровень IL-1RA в сыворотке крови больных хроническим гнойным риносинуситом.

Дисрегуляция продукции IL-ip/IL-IRA у больных ХГРС на системном уровне приводит к более продолжительному воспалительному ответу и его хронизации на местном уровне - в околоносовых пазухах, где соотношение экспрессии IL-ip/IL-lRA существенно сдвинуто в сторону выработки IL-IRA.

У носителей генотипов «l/2»IL-ip+«2/2»IL-lRA воспаление, более продолжительное, и более интенсивное, что соответствует полученным результатам тестирования спонтанной и индуцированной продукции IL-ip

клетками крови у больных хроническим гнойным риносинуситом, являющихся носителями таких генотипов.

Генетически обусловленная дисрегуляция воспаления может являться причиной иммуно-опосредованной хронизации риносинусита вследствие изменения уровня продукции и соотношения белков семейства IL-1.

Применение рекомбинантного IL-ip в лечении больных хроническим гнойным риносинуситом, резистентным к терапии антибиотиками, показало, что препарат высокоэффективен для больных с генотипом IL-1RA*2. Следует отметить, что 73,2% обследованных пациентов являлись его носителями.

Данная работа представляет собой первое сообщение о том, что ХГРС значительно ассоциируется с определенным генотипом, влияющим на предрасположенность и характер течения этого заболевания.

Практическая значимость работы:

Полученные иммуногенетические данные позволяют прогнозировать характер течения и проводить коррекцию индивидуальных нарушений воспалительного ответа в околоносовых пазухах в результате мутаций в генах IL-10 и IL-IRA.

Расшифровка механизмов влияния полиморфизма генов цитокинов на характер течения воспалительного ответа может позволить разработать новые методы иммунотерапии и иммунопрофилактики, направленные на коррекцию (компенсацию) непосредственной причины дисрегуляции.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Хронический гнойный риносинусит - самостоятельная нозологическая форма, ассоциирующаяся с вариантом гена IL-1RA*2 и сочетанием гетерозиготного полиморфного гена IL-ip(+3953) и гомозиготного полиморфного гена IL-1RA*2 (VNTR).

2. Полиморфизм генов IL-ip(+3953) и IL-1RA*2(VNTR) является одной из главных причин дисрегуляции и хронизации воспалительного ответа на системном уровне и в очаге воспаления у больных ХГРС.

3. Полиморфизм генов семейства IL-1 определяет индивидуальную эффективность терапии препаратом рекомбинантного IL-1(3(EJI).

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 50-й и 52-й Всероссийских научно-практических конференциях молодых учёных-оториноларингологов (г.СПб, 2003, 2005), на VII Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии» в Санкт-Петербурге, на Санкт-Петербургском медицинском обществе оториноларингологов (май, 2006)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, получен патент Российской Федерации на изобретение №2271827 А61К 38/20 C12Q 1/68.

Реализация результатов исследования. Основные положения диссертации используются в практической работе клиник СПб НИИ ЛОР.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы содержащей описание использованных в работе материалов и методов, двух глав собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического списка использованной литературы. Работа изложена на 153 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы и 41 рисунок. Указатель литературы содержит 264 наименования источников, из них 140 работ на русском языке, 124 - на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Отбор больных для исследования проводился на базе НИИЛОР клиники патологии верхних дыхательных путей г. Санкт-Петербурга в период с 2001 по 2006 гг. Нами было обследовано 123 больных ХГРС и 104 здоровых донора возрасте от 18 до 60 лет. Всего 227 человек, из них 106 мужчин и 121 женщина. Большинство отобранных для исследования больных имели давность заболевания от 5-ти до 10-ти лет. Следовательно, заболевание имело достаточно длительное течение. Благодаря этому, можно оценить результаты предлагаемого клинического и иммуногенетического исследования больных и их лечения. В зависимости от получаемой дозы препарата БЛ больные ХГРС в стадии обострения были разделены на три основные группы и одну контрольную. В верхнечелюстные пазухи 1-ой группы больных вводился препарат БЛ в дозе 10 нг, во 2-ой 15 нг, в 3-ей группе 20 нг и в 4-ой группе сравнения лечение проводилось по общепринятым традиционным методикам.

Для постановки диагноза в условиях клиники нами были использованы комплексные клинико-лабораторные методы обследования, включающие в себя изучение жалоб, анамнеза заболевания, объективный осмотр ЛОР-органов, компьютерная томография (KT) околоносовых пазух. Эндоскопическими методами получалась дополнительная информация о состоянии полости носа. Жесткими эндоскопами производства «Karl Storz» с углами обзора 30° и 90° оценивали состояние слизистой оболочки и внутриносовых анатомических структур.

Материалом для молекулярно-генетического анализа полиморфизма генов семейства IL-1 служили образцы высокомолекулярной ДНК, выделенные из клеток промывной жидкости верхнечелюстных пазух и периферической крови, больных с использованием реагента для выделения ДНК (TriReagent «Sigma»).

Варианты аллелей гена IL-lß, нормальные и несущие точечные замены нуклеотидов С/Т в районе 5-го экзона в позиции +3953, определялись методом ПДРФ-анализа продуктов ПЦР-амплификации специфических участков генома. ПЦР-реакцию проводили в 10 мкл реакционной смеси, с использованием TE-Taq-ДНК-полимеразы и соответствующего готового буфера («Сибэнзим»), праймеров 5' - GTT GTC АТС AGA СТТ TGA СС-3\ 5' - TTC AGT ТСА TAT GGA CCA GA - 3', синтезированных в НПО «Литех». Генотипирование IL-IRA проводили в тех же условиях методом ПЦР: амплифицировался участок ДНК, содержащий

тандёмные повторы по 86 п.о. в районе интрона 2, аллельиый тип определялся по длине получаемого продукта амплификации при электрофоретическом разделении.

Нормальный вариант гена 11,-1 К А содержит четыре таких повтора (размер получаемого фрагмента 4! О и.о.), наиболее значимым из полиморфных вариантов является аллель П,1 КА*2, несущий два повтора (240 п.о.) (рис. 1).

Аллели

Аллели 1Ь

AjmamlL-lRa

KSJ'Kp 20. 1/2 m т

ШШ Щ

|Р mm •шит **mt

ж ¡Si ' '*•«* WW mm

Рис. 1.

Аллель не несущий мутацию, как наиболее часто встречающийся, в дальнейшей работе будет называться нормальным гит низкопродуцирующим (цифра 1). Мутантный аллель гена, ассоциированый с более высокой продукцией белка, будет называться высокопродуцирующим (в таблицах и рисунках обозначается цифрой 2).

Метод иммуноферментного анализа использовали для определения концентрации цитокинов.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием стандартного пакета программ прикладного статистического анализа Microsoft Excel 97 для Windows, а также программы «STATIST1KA» версия 6.0 и предусматривала вычисление среднеарифметического значения показателя, среднего квадратичного отклонения (о), ошибки репрезентативности среднеарифметических значений (т). Достоверность различий показателей оценивали с помощью критерия Стьюдента. Различие считалось достоверным при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение.

Результаты проведённого исследования больных ХГРС и здоровых доноров выявили клинические и иммуногенетические особенности заболевания в зависимости от носительства вариантов сочетаний генов IL-IJJ и H,-i RА. Основной причиной развития обострения в околоносовых пазухах 41,5% (51) больных

являлся фактор переохлаждения. Причины развития обострения представлены в таблице 1.

Таблица 1

Причины развития обострения заболевания у исследуемых больных (число случаев, данные анамнеза)

Причина 1группа (п=30) Пгруппа (п=32) Шгруппа (п=31) ТУгруппа (п=30) Всего

Переохлаждение 13 14 13 И 51

ОРВИ 6 9 8 7 30

Тонзиллит 5 4 4 5 18

Острый бронхит 3 1 1 3 8

Обострение заболевания - целиакия 0 0 1 0 1

Причина не установлена 3 4 4 4 15

Среди других причин развития обострения были отмечены острая вирусная инфекция, острый тонзиллит, острый бронхит. У одной больной рецидив ХГРС был связан с обострением симптомов заболевания — целиакия установленный впервые в процессе обследования.

Число рецидивов обострения хронического воспаления в пазухах колебалось от 2-х до 5-ти раз в год, продолжительность обострения составляла от 3-х недель до 1,5 месяцев. Симптомы в межрецидивный период частично сохранялись в виде умеренной пиоринореи.

Из всего спектра сопутствующих патологий ЛОР-органов доминирующими оказались искривление носовой перегородки и хронические воспаления лимфоидных образований глотки - хронический тонзиллит и хронический фарингит (табл. 2). Искривление носовой перегородки не влияло на функцию дыхания и не нарушало дренажной функции естественных соустий околоносовых пазух. Однако хроническая патология лимфоглоточного кольца не могла остаться без внимания, так в 1-ой группе у 83,3%, во П-ой у 84,4%, в Ш-ей у 83,9% и в ГУ-ой у 90%. Полученные данные могли указывать на системное снижение защитных сил лимфоидного звена иммунитета.

Хроническая патология среднего уха встречалась: в 1-ой группе 26,6%, во П-ой 31,3%, в Ш-ей 20,03% и в 1У-ой 36,6%. Больные страдали хроническим средним отитом с детства. Известно, что в детском возрасте для развития среднего отита могут иметь значение анатомическая близость полости носа и околоносовых пазух с носоглоточным устьем слуховой трубы, а также её возрастные особенности. Нарушение вентиляции барабанной полости приводит сначала к развитию экссудативного отита и с присоединением патогенной флоры - гнойному отиту, который может перейти в хроническую форму.

Таблица 2.

Сопутствующая патология ЛОР - органов у исследуемых больных в

Патология I группа (п=30) II группа (п=32) III группа (п=31) IV группа (п=30)

Искривление носовой перегородки 24/ 80% 25/78,1% 24/77,4% 27/90%

Вазомоторный ринит 13/43,3% 11/34,4% 7/22,6% 8/26,6%

Вазомоторный ринит с гипертрофией задних концов нижних носовых раковин 4/13,3% 3/9,4% 7/22,6% 3/10%

Хронический тонзиллит, хронический фарингит 25/83,3% 27/84,4% 26/83,9% 27/90%

Острый средний отит 2/6,6% 1/3,1% 3/9,7% 1/3,3%

Хронический средний отит, адгезивный средний отит 8/26,6% 10/31,3% 9/20,03% 11/36,6%

Хроническая сенсоневральная тугоухость 3/10% 6/18,7% 4/12,9% 2/6,6%

Острый ларинготрахеит 1/3,3% 0 2/6,5% 0

Отмечались и острые отиты на фоне обострения ХГРС. В 1-ой группе в 6,6% случаев, во И-ой в 3,1%, в Ш-ей в 9,7% и в 1У-ой в 3,33%. Стоит отметить, что развитие острого отита всегда сопровождалось острой респираторной вирусной инфекцией.

В группе сравнения и основных группах у пациентов отмечалась хроническая сенсоневральная тугоухость 1-П степени. Возраст пациентов колебался от 50 до 60 лет. Наличие данной патологии связано вероятнее всего с пресбиакузисом. Так по данным А.И.Лопотко, (2006) в возрасте 50-60 лет отмечается некоторое понижение слуха, закономерное ограничение порога воспринимаемых частот. У людей старших возрастных групп сенсоневральная тугоухость может свидетельствовать о таких заболеваниях как церебральный атеросклероз, гипертоническая болезнь и о других проявлениях «патологической» старости. И лишь у 3-х больных был зарегистрирован острый ларинготрахеит, который также как и острый средний отит манифестировал ОРВИ.

Наряду с иммунологическим анализом у больных ХГРС в данной работе анализировалось распределение нормальных и полиморфных вариантов генов 1Ь-1Р(+3953)и1Ь-ША*2.

Оценивалось влияние полиморфизма этих генов на экспрессию и продукцию соответствующих белков в мононуклеарах периферической крови и в клетках

промывной жидкости верхнечелюстных пазух больных ХГРС.

У обследованных пациентов наличие гомозиготного варианта IL-1RA*2 определялось в 5,5 раз чаще, чем у доноров. Тогда как нормальный вариант этого гена (IL-1RA*1) в гомозиготном виде у обследованных пациентов присутствовал в 2,1 реже, чем в группе здоровых лиц (табл.3).

Кроме того, у больных в 1,5 раз реже, чем у доноров, встречался гомозиготный вариантIL-lp*l.

Таблица 3.

Частота носительства полиморфных и нормальных вариантов генов IL-

1Р и IL-1RA у исследуемых больных и здоровых доноров

Частота %

Аллели

IL-16 (+3953) IL-1RA*2

Группы 1/1 1/2 2/2 1/1 1/2 2/2

Доноры 45,1 51 3,8 57,6 35,5 6,7

Больные 30,7 | 58,5 9,7 26,8 36,6 36,6

Гомозиготный полиморфный вариант гена 1Ь-1р у доноров встречался в 3,8% случаев, а в обследованной группе больных этот вариант гена имели 9,7% пациентов. У больных ХГРС являвшихся носителями «2/2»1Ь-1р при детальном обследовании был установлен диагноз круглогодичный аллергический ринит.

Таблица 4.

Носительство сочетаний вариантов генов 1Ь-1р и ТЬ-ША в группах _больных ХГРС и здоровых доноров (число больных,%)_

Сочетание генов Всего

IL-ip (+3953) IL-1RA I гр. п=30 II гр. п=32 III гр. п=31 IV гр. п=30 больных п=123 Доноры п=104

1/1 1/1 3 2 2 3 10/8,1% 22/21,2%

1/1 1/2 5 3 4 3 15/12,2% 20/19,2%

1/1 2/2 2 3 5 4 14/11,4% 5/4,8%

1/2 1/1 3 3 2 3 11/8,9% 34/32,7%

1/2 1/2 8 8 7 7 30/24,4% 17/16,3%

1/2 2/2 7 7 9 8 31/25,2% 2/1,9%

2/2 1/1 2 6 2 2 12/9,7% 4/3,8%

Носительство

варианта IL-1RA*2 22 17,9% 21 17,1% 25 20,3% 22 17,9% 90 73,2% 44 42,1%

Иммунный статус и частота носительства вариантов 1Ь-1Р(+3953) и 1Ь-1 ЯА(1Ь-1ЯА*2) определялась у 123-х больных хроническим гнойным риносинуситом и у 104-х доноров в возрасте от 17 до 60 лет (табл. 4).

Из представленных в таблице данных видно, что больший процент больных (73,2%) являлись носителями варианта 1Ь-1ЯА*2.

При анализе гаплотипов IL-lp+IL-IRA установлено, что индивидуумы с сочетанием гомозиготных нормальных вариантов этих генов среди больных ХГРС встречаются в 2,2 раза реже, чем в группе доноров. В 2,8 раза чаще у пациентов определяется сочетание гомозиготного варианта IL-ip*l и гомозиготного варианта IL-1RA*2 («1/1 »IL-1 P+«2/2»IL-1RA).

Сочетание «2/2»IL-ip+«l/l»IL-lRA встречается y 9,7% больных. Кроме того, почти в 2 раза больше среди пациентов лиц с сочетанием гетерозиготных вариантов этих генов «l/2»IL-ip+«l/2»IL-lRA

Однако, наиболее обращает на себя внимание носительство гаплотипа IL-1P*2+IL-1RA*2, который встречался у 1,9% доноров в виде сочетания гетерозиготного гена IL-1Р* 1/IL-1 р*2 и гомозиготного по полиморфному аллелю гена IL-1RA*2 («l/2»IL-ip+«2/2»IL-lRA) Среди обследованных больных носительство такого гаплотипа и сочетания генов встречалось в 15,5 раз чаще, чем у доноров.

Согласно полученным данным, среди больных и доноров ни разу не встречалось совместное носительство гомозиготных вариантов «2/2» генов IL-iP(+3953) и IL-1RA*2 («2/2»IL-1 p+«2/2»IL-IRA) и сочетание гаплотипов IL-lp*2+IL-lRA*2 и IL-1P*2+IL-1RA*1 («2/2»IL-lp+«l/2»IL-lRA). Однако утверждать, что гаплотипов «2/2»IL-ip+«2/2»IL-lRA, «2/2»IL-ip+«l/2»IL-lRA не существует в природе не правомочно т.к. выборка 123 пациента ХГРС и 104 здоровых донора недостаточна, для того чтобы говорить о популяции в целом. Необходимо продолжить исследование с расширением групп больных с различными патологиями как воспалительного так и не воспалительного генеза

Носителями варианта IL-1RA*2 как в гомо-, так и в гетерозиготном виде являются почти 73,2% больных ХГРС. Таким образом, хронический гнойный риносинусит ассоциируется с вариантом 2 гена IL-IRA и гаплотипами «1/1»IL-ip+«2/2»IL-lRA и «l/2»IL-ip+«2/2»IL-lRA

Носительство вариантов сочетаний генов IL-ip и IL-IRA влияло на клиническую симптоматику ХГРС. У носителей одинаковых сочетаний отмечалась схожесть клинических проявлений этого заболевания. Наиболее агрессивно по сумме клинических показателей ХГРС протекал у носителей полярных генотипов «1/1 »IL-1 р+«2/2»IL-1 RA, «1/2»IL-1 p+«2/2»IL-1 RA и «2/2»IL-lp+«l/l»IL-lRA. У носителей гетерозиготных вариантов этих генов отмечалось более лёгкое течение ХГРС. Носители генотипа «1/2»IL-1 P+«2/2»IL-lRA болеют ХГРС с детства

У больных носителей вариантов «l/l»IL-ip+«l/l»IL-lRA, «l/2»IL-ip+«l/l»IL-1RA, «2/2»IL-ip+«l/l»IL-lRA отмечалась выраженная клиническая картина В периоды обострения ХГРС температура тела достигала 38,5°С, усиливался отёк в полости носа и как следствие нарушалось носовое дыхание.

При проведении цитокиновой терапии у больных отмечалось усиление местной воспалительной реакции. Данный феномен можно объяснить механизмом действия IL-ip. Манифестация провоспалительного действия IL-lp возможно обусловлена высоким уровнем цитокина местно в очаге воспаления и в сыворотке крови. Однако данный факт требует дальнейшего исследования с расширением групп носителей высокопродуцирующего гена IL-ip с учетом сопутствующей патологии.

Рйр,2, Уровень спонтанной продукции 1L.-I |1 лейкоцитами крови у исследуемы* больных с разными аллелями генов IL-Ip и IL-1 RA

По сравнительным данным полиморфизм гена IL-1RA оказывал влияние на уровень спонтанной продукции IL-ip клетками периферической крови больных до терапии: по мере нарастания признака полиморфизма гена IL-IRA наблюдалась тенденция к увеличению среди больных лиц, имеющих уровень спонтанной продукции IL- 1р выше, чем у здоровых индивидуумов (рис.2).

Однако, у лиц, имеющих варианты «1/1» и «1/2» гена IL-lp, отмечалась обратная тенденция: у носителей варианта «1/2» в 5 раз чаще определялось низкое значение спонтанной продукции II.-1 р в сравнении с носителями варианта «1/1» гена IL-ip. Значения спонтанной продукции выше нормы у носителей гаплотипов «1/1»1L-1|Vh<2/2»1L-1R/\ и «l/2»lL-l{5+«2/2»lL-lRA встречались примерно в 2.5 раза чаще, чем нормальные значения.

По результатам исследования выявлены достоверные различия в уровнях сывороточной и индуцированной продукции 11.-!р (р<0.05), Индуцированная продукция IL-ip у больных с гнойным процессом в пазухах носа была снижена 1199,131165,5 относительно здоровых доноров 1 678,9±313,76. Снижение уровня IL-lp является значимым при ХГРС и по данным Н.М. Калининой. (2002) наглядно характеризует длительно текущие хронические процессы инфекционного генеза.

Проводимый иммунологический анализ индуцированной продукции IL-1 [i у больных хроническим гнойным риносицуситом с учётом распределения нормальных и полиморфных вариантов reirá IL-1 RA*2 выявил зависимость продукции цитокина от выеокоггродупирующего мутантного аллеля гена.

Нос.ительство полиморфизма гена i I -113(+3953) достоверно не коррелировало с уровнем миюген-индуцированпой продукции IL-1 [1 тогда как носительство варианта «2/2» гена 11.-1 RA ассоциировалось с достоверно (в 1,8 раз) более высоким уровнем индуцированной продукции IL-lfi (р<0.05), чем носительство варианта «1/1» этого гена (рис.3).

Рис .3. Медианы значений нндуни рованной продукции 11,-1 ¡5 н лейкоцитах периферической крови больных ХГРС с разными вариантами аллелей гена [Ц ЙА (иг/мл)

Обращает на себя внимание, что медианы значений индуцированной продукции в лейкоцитах периферической крови также распределились но нарастающей в зависимости от гаплотима.

У носителей гагтлотипов «I /2»1Ь-1«1/1 »11,-1ЯА показатели индуцированной продукции 1Ь-8 оказались самыми низкими (рис.4).

Рис.4. Медианы значений индуцированной продукции 11,-8 в лейкоцитах периферической крови больных с разными гаплотннами 11,-1 [)/1 1_,-1 КА

Наиболее высокий уровень индуцированной продукции 1Ь-8 регистрировался у носителей гаплотипа «1/2»1Ь-1р+«2/'2»1Ь-1 ЯА. Таким образом, наличие полиморфизма гена «2/2»1Ь-1КА прямо статистически достоверно влияло (р<0,05) на уровень спонтанной и индуцированной продукции 1Ь-1р, а также на уровень индуцированной продукции 1Ь-8 клетками периферической крови.

Таким образом, мы имели исходный иммуногенетический статус больных и здоровых доноров. В ходе исследования нас интересовал вопрос о влиянии препарата БЛ при местном его использовании на уровень провоспалительных цитокинов в сыворотке крови на седьмые сутки лечения, в сравнении с группой контроля и группой здоровых доноров.

Больные основных групп после лечения оценивались одной группой, так как статистически достоверных различий в полученных результатах выявлено не было, возможно, из-за малой разницы в дозе препарата (5нг) Уровень цитокинов в периферической крови исследуемых больных и здоровых доноров представлен в таблице 5.

После проведенного местного лечения препаратом БЛ отмечается незначительное, но повышение сывороточной продукции 1Ь-1р 6,8±3,83 и снижение уровня спонтанной до 23,1±6,67.

Возможно, уменьшение воспалительной реакции в придаточных пазухах носа на ранней стадии выздоровления приводит к попытке иммунной системы нормализовать уровень сывороточной и спонтанной продукции 1Ь-1р, однако уровень индуцированной остается практически неизменным 1140,6± 178,3

Таблица 5.

Сравнительные данные уровня сывороточной, спонтанной и индуцированной продукции цитокинов крови у больных ХГРС на седьмые

сутки лечения (пг/мл)

Больные до Основные группы Группа сравнения Здоровые

лечения после лечения после лечения доноры

п=123 (БЛ) п=93 п=30 п=104

1Ы(Зсыв 2,92±1,5* 6,8±3,84* 2,72±1,99* 32,18±19,63

ИЛРспон 57,07±25,7 23Д0±14,7 32.08±32,91 28,86± 19,64

1Ыринд 1199,13±165,5* 1140,66± 178,35* 891,32±297,9* 1678,9±313,76

1Ь8сыв 3,87±3,37* 25,03±48,2 86,96±173,97 35,5±31,04

1Ь8спон 1905,78±866,49* 966,16±538,3 1816,36±1692,8* 482,8±266,54

1Ь8инд 19067,6±3289,08 16131,64±2683 1669,64±5 629,36 18734,3±2839,5

*- достоверность различия с показателями здоровых доноров доказана при р<0,05

В результате исследования выявили достоверное различие сывороточной продукции 1Ь-8 у больных ХГРС 3,87±3,37 в сравнении с группой здоровых доноров 35,5±31,04 (р<0,05) Сам факт низких показателей 1Ь-8 указывал на снижение функциональных свойств нейтрофилов в крови, а соответственно пролонгирование недостаточности лимфоцитарного звена иммунитета и расценивался как проявление иммунодефицита у больных с хроническим гнойным

процессом и околоносовых пазухах. Однако после проведенного лечения больных основных групп и группы сравнения мы получили интересные результаты. У больных получавших месгно рекомбинантный 1Ь-]р показатели 1Ь-8 увеличились до 25,03*48,2 приближаясь к показателям здоровых доноров, а в группе сравнения медиана значений достигала 86,96^173,97 с высоким доверительным интервалам, указывающим на большой разброс цифровых показателей, что при воспалительном процессе указывает на разбалансировху в иммунном ответе.

Спонтанная продукция 11,-8 у больных 1905,78+866,49 до лечения достоверно (р<0,05) отличалась от показателей здоровых доноров 482,8+266,54 и отражала активацию нейтрофилов в периферической крови на внедрение бактериального антигена. После проведенною лечения у больных основных групп спонтанная продукция хемокина резко снизилась 966,16*538,3, в то время как в группе сравнения оставалась достаточно высокой 18 !6,36+1692,8.

Снижение спонтанной продукции !Ь-ф и 1Ь-8 у больных основных групп указывает на уменьшение активационной способности цитокинов вследствие элиминации патологического антигена и завершение воспалительного процесса в о кол о носовых пазухах.

Кроме того, изучалось влияние полиморфизма генов 1Ь-1 р и 1Ь-ША на экспрессию этих генов на уровне мРНК непосредственно в очаге воспаления в клетках промывной жидкости верхнечелюстных пазух (рис.5).

Ьолее высокие значения индексов экспрессии генов 11.-1 р определялись у носителей гаплотипов « 2/2» 1Ь-1 р+« 1/1»ГЬ-1К А, «1/2»Н.-1р+«]/2»1Ь-1КА и «1/2»1Ь-1р+«2/2»1Ь-ША, а наименьшие - у пациентов с сочетаниями «1/1»П,-!£}+«2/2»Ц,-(КЛ, «!/(»[£.-1(3+« 1/2»{Ь-1 КА и «1/ШЫр +«Г/Ы[,- 1ЙА.

1,60 1,40 1.20 1.00 0,80 0.60 0,40 0,20 0,00

Рис.5. Соотношение экспрессии 1Ь-1р/1Ь-( НА в клетках промывной жидкости до лечения в зависимости от носительства сочетаний вариантов генов 1Ир и 1Ь-ША (пг/мл)

Ь1/1 Ка 2/2

Ы /1 М /1 Ы /2 Ы /2 Ь2/2 Ы /2 КаМ2 НаЛГ2 НаЛП Иа1/1 КаЗ/2

У носителей промежуточных гаплотиттов индексы распределялись s диапазоне этих значений. Наиболее низкий индекс экспрессии M.-1RA до лечения имели носители гаплотипов «l/b>II.-1p+«l/l»ÏL-1 RA, «2/2»lL-l р+« [/[»II,-1 RA и «I/2»IL-1 р +«1/I»IL-1RA, наиболее высокий больные с сочетаниями «1/î»[I.-ip+«2/2»IL-ÎRA и «1/2»ÎL-lp +«2/2»IHRA.

Таким образом, носители наиболее часто встречающихся среди больных ХГРС сочетаний «l/l»[L-ip+«2/2»H,-l RA и «1/2»1L-1 p+«2/2»ll -1 RA имели наибольший индекс экспрессии IL-1RA в очаге воспаления, однако у пациентов с генотипом «l/2»ïl,-ip +«2/2»Il.-1RA индекс экспрессии IL-ip был выше, чем при генотипе «l/1»IL-ip+«2/2»IHRA.

При оценке индексов экспрессии других цитокинов в клетках промывной жидкости околоносовых пазух (рис. 6), было установлено, что у носителей варианта «2/2»IL-l RA в сравнении с носителями варианта « l/l»IL-[RA достоверно выше уровни экспрессии IL-2 и [I,-10 (р<0,05).

га н_-т

SI IL-8 □ il-4 О tt_- 2

суммарный

vi идо КС

экспрессии

4.50 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1 ,50 1.00 0.50 0,00

Рис. 6. Суммарная экспрессия цитокинои в клетках промывной жидкости у больных ХГРС в зависимости от носительства варианта IL-1RA

Таким образом, проведённое исследование больных ХГРС в сравнении со здоровыми донорами на системном и местном уровне свидетельствовало о разнонаправленности изменений иммунного ответа при различных методах лечения. У больных основных групп на фоне лечения повьпиался уровень IL-îp и IL-8, которые в свою очередь обеспечивали равновесие в продукции IL-1RA,

Введение экзогенного If-ip у больных с генетическим Перевесом в сторону выработки JL-1RA, по всей видимости, способно восстановить необходимый баланс IL-lp и IL-1RA в очаге воспаления, приводя в кратчайшие сроки к адекватному завершению воспалительного ответа и выздоровлению пациентов.

Известно, что в условиях иммунодефицита медленно и дефектно идёт процесс регенерации клеток слизистой оболочки полости носа и околоносовых пазух.

Коррекция иммунных нарушений малыми дозами БЛ ускоряет процесс восстановления структурного гомеостаза воспалённой слизистой оболочки полости носа и околоносовых пазух, а также не вызывает клинического обострения заболевания.

Косвенными признаками восстановления могут служить чистая промывная жидкость верхнечелюстных пазух при последующих пункциях, данные опроса пациентов — отсутствие гнойного отделяемого в течение суток и более, данные компьютерной томографии придаточных пазух носа.

Критериями эффективности терапии служили регресс симптомов ХГРС. Прежде всего, нас интересовала переносимость и клиническая эффективность БЛ. Анализ результатов, полученных нами при тестировании продукции цитокинов клетками крови пациентов с ХГРС свидетельствует в пользу последнего утверждения: при тестировании спонтанной, индуцированной продукции IL-lp и уровня IL-1RA установлено, что носительство варианта «2/2»IL-lRA влияет на уровни этих показателей (р<0,05). Генетически обусловленная дисрегуляция продукции IL-Ip/IL-1RA у больных ХГРС на системном уровне приводит к более продолжительному воспалительному ответу и его хронизации на местном уровне -в околоносовых пазухах, где соотношение экспрессии IL-ip/IL-IRA существенно сдвинуто в сторону выработки IL-IRA.

Результат терапии ХГРС рекомбинантным IL-lp является значительно более успешным в сравнении с методами стандартной терапии этого заболевания. Препарат БЛ позволяет купировать обострение заболевания у пациентов с ХГРС за максимально короткий срок до 5 дней, тогда как лечение антибактериальными препаратами может затягиваться до 1 месяца и более. Согласно полученным данным, этот факт связан со значительной ассоциацией этого заболевания с генетически обусловленным перевесом в сторону выработки IL-IRA. Для больных ХГРС (73,2%), являющихся, согласно проведенному генотипированию, носителями полиморфного варианта гена IL-IRA, а также - нормального или гетерозиготного варианта гена IL-ip, терапия рекомбинантным IL-lp является, на сегодняшний день, одним из наиболее эффективных способов лечения. Кроме того, по-видимому, для лиц, чувствительных к терапии после первого применения, этот препарат является одним из главных средств иммунокоррекции при рецидивах этого заболевания.

В данной работе впервые показано, что ХГРС ассоциируется с определенным генотипом, влияющим на предрасположенность и характер течения этого заболевания. В целом, влияние функционального полиморфизма генов IL-1P и IL-1RA, по-видимому, можно описать в виде следующих закономерностей:

- носительство нормальных вариантов этих генов определяет адекватную продукцию соответствующих белков и регуляцию функционирования системы IL-1;

- у носителей генетически обусловленного перевеса в сторону продукции IL-lp воспаление протекает более остро и с высокими значениями температуры тела, так как IL-1 является ключевым медиатором развития лихорадки;

- у носителей генетически обусловленного перевеса в сторону выработки 1Ь-1ЯА воспалительный ответ снижен за счет блокады 1Ь-1 его антагонистом, что может являться причиной хронизации воспаления.

Расшифровка механизмов влияния полиморфизма генов цитокинов на характер протекания воспалительного ответа может позволить разработать методы иммунотерапии и иммунопрофилактики, направленные на коррекцию (компенсацию) непосредственной причины дисрегуляции. Главными препаратами для такой терапии являются препараты на основе рекомбинантных аналогов цитокинов, а также блокаторов воспаления или стимуляторов продукции цитокинов.

В последнее время наблюдается переход от терапии массовой к терапии индивидуальной, направленной на лечение конкретного больного, в том числе, путем коррекции индивидуальных нарушений иммунитета экзогенным введением рекомбинантных аналогов медиаторов иммунного ответа. Однако отсутствие значимых прогностических факторов эффективности делает такую терапию, зачастую, непредсказуемой. Согласно выше изложенному материалу, гено-типирование цитокинов может стать одним из критериев назначения тех или иных лекарственных средств, а также дать возможность индивидуально корректировать реакции иммунитета.

19

ВЫВОДЫ

1. Хронический гнойный риносинусит ассоциируется с полиморфизмом гена 1Ъ-ША, который встречался у больных ХГРС в 73,2%.

2. Полиморфизм генов 1Ь-1р(+3953) и 1Ь-ША(\ГНТК) является одной из главных причин дисрегуляции воспалительного ответа в очаге воспаления у больных хроническим гнойным риносинуситом, т.к. у носителей генетически обусловленного перевеса в сторону выработки 1Ь-ША воспалительный ответ более продолжителен, что может являться причиной хронизации воспаления.

3. Генотипирование по признакам носительства полиморфных вариантов генов 1Ь-1р(+3953)+ и 1Ь-111А*2 позволяет достоверно прогнозировать степень эффективности и выраженность побочных эффектов при терапии препаратом Беталейкин у больных хроническим гнойным риносинуситом (р<0,05).

4. Применение препарата БЛ в лечении больных хроническим гнойным риносинуситом, резистентным к терапии антибиотиками, показало, что этот препарат высокоэффективен для больных с генотипом 1Ь-1ЯА*2 (р<0,05). Введение экзогенного 1Ь-1р оказывает стимулирующее воздействие на функции иммунной системы, регулирует соотношение продукции 1Ь-1ЯА и 1Ь-1р, активирует функциональное состояние иммунного ответа непосредственно в очаге воспаления и тем самым способствует ускоренному завершению воспалительного процесса.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Дисбаланс в иммунной системе у больных хроническим гнойным риносинуситом, является одним из факторов хронизации воспаления и обязывает проводить иммунологические исследования этих пациентов для выявления этиологических причин индивидуально в каждом конкретном случае.

2. При оценке функционального состояния иммунной системы больных хроническим гнойным риносинуситом необходимо для определения тактики лечения проводить генотипирование с целью выявления полиморфизма генов 1Ь-1р(+3953) и 1Ь-1КА(УШТ1), который является одной из главных причин дисрегуляции воспалительного ответа.

3. Основанием для применения препарата Беталейкин в терапии больных хроническим гнойным риносинуситом следует считать носительство варианта генов 1Ь-1(3(+3953)+ и 1ЫЯА*2.

4. Местный способ введения препарата Беталейкин высокоэффективен и показан больным хроническим гнойным риносинуситом с вариантом гена 1Ь-ША*2 и сочетанием гетерозиготного полиморфного гена 1Ь-1Р(+3953) и гомозиготного полиморфного гена 1Ь-1ЛА*2 (УШИ).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Тимчук Л.Э. Местное применение Беталейкина для лечения больных хроническим гнойным риносинуситом / Л.Э.Тимчук // Рос. оторинолар. -2004. -№1. -С.101-102.

2. Влияние функционального полиморфизма генов семейства интерлейкина-1 на предрасположенность и характер течения хронического гнойного риносинусита и эффективность терапии рекомбинантным-1 бета (Беталейкин). I. Ассоциация полиморфизма генов семейства интер-лейкина-1 с заболеваемостью хроническим гнойным риносинуситом и дисрегуляцией воспалительного ответа / А.Ю.Громова, Л.Э.Тимчук, Ю.К.Янов, А.С.Симбирцев, А.А.Козаков, В.Е.Бокованов, С.А.Синёва // Рос. оторинолар. - 2005. - №2. - С.5-12.

3. Влияние функционального полиморфизма генов семейства интерлейкина-1 на предрасположенность и характер течения хронического гнойного риносинусита и эффективность терапии рекомбинантным-1 бета (Беталейкин). II. Влияние полиморфизма генов семейства интерлейкина-1 на степень эффективности местной терапии рекомбинантным интерлейкином-1 бета (Беталейкин) / Л.Э.Тимчук, А.Ю.Громова, Ю.К.Янов, А.С.Симбирцев // Рос. оторинолар. - 2005. - №2. - С.84-87.

4. Успешная компенсаторная терапия рекомбинантным IL-lß (Беталейкин) индивидуальных нарушений воспалительного ответа вследствие функциональных мутаций в генах IL-lß и IL-IRA при хроническом гнойном риносинусите / Л.Э.Тимчук, А.Ю.Громова, Ю.К.Янов, А.С.Симбирцев // Рос. оторинолар. - 2005. - №4. - С.105-108.

5. Susceptibility to chronic bacterial purulent rhinosinusitis is associated with the combination of interleukin-1 beta and interleukin-1 receptor antagonist gene polimorphik alleles / A.S.Simbirtsev, A.J.Gromova, L.E.Timchuk [et al.] // European Respiratory J., Copenhagen, Septem. 17-21, - 2005. - P.406s.

6. Функциональные мутации в генах IL-1 р и IL-IRA при хроническом гнойном риносинусите как индивидуальные нарушения воспалительного ответа / Ю.К.Янов, Л.Э.Тимчук, А.Ю.Громова, А.С.Симбирцев [и др.] // Материалы ХУЛ съезда оториноларингологов России. - 2006. - С.347.

7. Иммуногенетические подходы к анализу больных хроническим гнойным риносинуситом / Л.Э.Тимчук, Ю.К.Янов, А.Ю.Громова, А.С.Симбирцев // Материалы II научно-практической конференции оториноларингологов Южного федерального округа. - 2006. - С.188-190.

8. Способ определения тактики лечения рекомбинантным цитокином, регулирующим воспаление: Патент Российской Федерации на изобретение №2271827 А61К 38/20 C12Q 1/68 / Ю.К. Янов, А.Ю. Громова, А.С. Симбирцев, Л.Э. Тимчук, Н.И. Кузнецов, И.В. Князькин. -опубликован 2006.03.20.