Автореферат и диссертация по медицине (14.00.04) на тему:Клинико-иммунологические и молекулярно-генетические особенности течения гнойного риносинусита

На правах рукописи

ТАРАКАНОВА Елизавета Николаевна

КЛИНИКО - ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО -ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ТЕЧЕНИЯ ГНОЙНОГО РИНОСИНУСИТА

14 00 04 - Болезни уха, горла и носа 14 00 36 - Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2008

003446689

Работа выполнена на кафедре оториноларингологии ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им акад И П Павлова» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию, ФГУП Государственном НИИ особо чистых биопрепаратов ФМБА России, СПб ГУЗ «Городской поликлинике №112»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Лавренова Галина Владимировна доктор медицинских наук, профессор Симбирцев Андрей Семенович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Лиленко Сергей Васильевич доктор медицинских наук, профессор Москалев Александр Витальевич

Ведущая организация:

ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ»

Защита диссертации состоится «_»_2008 года в_часов на заседании Диссертационного Совета Д 208 090 04 при ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени акад И П Павлова» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию по адресу, 197022, ул. Л Толстого, 6/8, зал заседаний Ученого Совета

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке СПбГМУ имени акад И П Павлова

Автореферат разослан «_» _ 2008года

Ученый секретарь Диссертационного Совета

доктор медицинских наук, Дискаленко

профессор Виталий Васильевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Риносинусит - инфекционный воспалительным процесс бактериальной или вирусной этиологии слизистой оболочки полости носа и околоносовых пазух Риносинусит относится к числу самых распространенных заболеваний, что признается практически во всех научных работах последнего десятилетия в России острый риносинусит ежегодно диагностируется у 10 млн человек (Козлов С H, 2004, Лопатин А С , Овчинников А Ю , 2007) В настоящее время, когда изучены основные механизмы реализации иммунного ответа и разработаны схемы лечения и профилактики воспалительных заболеваний околоносовых пазух, заболеваемость синуситами продолжается увеличиваться, более того, наметилась отчетливая тенденция к увеличению заболеваемости рецидивирующими и хроническими формами синуситов (Пискунов С 3 , Пискунов Г 3, 2002, Козлов В С 2004, Плужников M С и соавт., 2005, Brook I, 2006) Синуситы значительно ухудшают «качество жизни» пациентов, установлено, что лица, страдающие риносинуслгами, имеют существенно худшие показатели болевой чувствительности и социальной активности. чем пациенты с коронарной недостаточностью и хроническими об-структивными заболеваниями легких (Козлов В С , 2003, Benninger M S , Kennedy D W ,1997)

В литературе последних лет активно обсуждается иммунопатогенез гнойного синусита и, в частности, роль провоспалительных цитокинов и факторов местной защиты в очаге воспаления (Азнабаева Л Ф , 2002, Катинас Е Б, 2003, Тимчук Л Э, 2007, Rudack С, Stoll W, Bachert С ,1998) Установлено, что при хроническом гнойном риносинусите возникает дисбаланс продукции белков семейства IL-1 и нарушение соотношения продукции IL-lß и IL-IRA в сторону увеличения доли последнего, в результате чего не происходит полной элиминации патогена Большое внимание в патогенезе риносинусита уделяется оценке фагоцитарной активности нейтрофилов Согласно большинству отечественных исследований (Говорун M И, 1992, Азнабаева Л Ф 2002, Гуломов 3 С, Ланцов А А, Симбирцев А С, 2002), функциональная активность фагоцитирующих клеток в очаге гнойного воспаления, как правило, оказывается сни-

3

женной, в то же время сделать однозначный вывод об активности фагоцитов периферической крови при локальном воспалении не представляется возможным, т к опубликованные данные весьма противоречивы

Более сложными исследованиями, объясняющими вариант развития воспаления слизистой оболочки околоносовых пазух, являются работы с генным материалом иммунокомпетентных клеток Показано, что хроническое течение воспалительного процесса может быть связано с дисбалансом в функционировании цитокиновой системы, обусловленным функциональным полиморфизмом генов, кодирующих белки семейства 1Ь-1 (Тимчук ЛЭ,2007, Шарипова Э Р ,2007) Данный полиморфизм представлен небольшими мутационными изменениями точечными заменами нуклеотидов, тандемными повторами частей гена Представляется важным дальнейшее изучение роли полиморфизма гена 1И р в патогенезе гнойных синуситов и его влияние на функциональную активность клеток фагоцитарного звена и продукцию других провоспалительных цитокинов Цель исследования

Изучение особенностей цитокиновой регуляции и функциональной активности фагоцитов в процессе формирования гнойного синусита, а также влияния полиморфизма гена 1Ь-1 р на предрасположенность к развитию острого и хронического гнойного риносинусита Задачи исследования

1 Оценить влияние полиморфизма гена 1Ь-1 ¡3 на продукцию провоспалительных цитокинов 1Ь-8) у больных острым и хроническим гнойным риносинуситом

2 Изучить особенности продукции 1И |3 у больных риносинуситом с различными вариантами клинического течения заболевания

3 Определить прогноз течения риносинусита в зависимости от клинико-иммунологического статуса и полиморфизма гена 1Ь-1 р (-511 С/Т) и (+3953С/Т)

4 Проанализировать зависимость фагоцитарной активности нейтрофилов у больных риносинуситом от продукции 1Ь-8 и уровня экспрессии гена 1Ь-1 р

Научная новизна исследования

1 Изучены особенности продукции провоспалительных цитокинов 1Ь-1р и 1Ь-8 лейкоцитами периферической крови у носителей полиморфных локусов гена И.-1Р (-511С/Т) и (+3953С/Т) Впервые проведена комплексная оценка и сравнение иммунологического и молекулярно-генетического статуса у больных острым и хроническим гнойным риносинуситом Выявлено, что пролонгация воспалительного отвега в околоносовых пазухах генетически обусловлена низким уровнем продукции 1Ь-1р

2 Изучена роль ключевого хемокина 1Ь-8 в патогенезе гнойных риносинуси-тов Показано, что функциональная активность нейтрофилов по показателям фагоцитоза положительно коррелирует с уровнем продукции 1Ь-8 и связана с уровнем экспрессии гена 11^-1 р

3 Установлено, что носительство генотипа 1Ь-1р (-511С/Т)(1/1)+ (+3953С/Т)(1/1) ассоциировано с благоприятным течением острого риноси-нусита, а сочетание аллелей гена 1Ь-1р (-511С/Т)(1/1) и (+3953С/Т)(1/2) более благоприятно для лиц, страдающих хроническим воспалением слизистой оболочки околоносовых пазух

Практическая значимость работы

Разработаны и апробированы критерии диагностики и прогнозирования течения гнойного риносинусита с позиции иммунологических и молекулярно-генетических методов исследования Развитие представлений об иммунопато-генезе риносинуситов и детальное изучение механизмов влияния полиморфизма генов цитокинов на предрасположенность к типу течения воспалительной реакции в будущем позволит расширить возможности практических врачей в лечении и профилактике острых и хронических форм заболевания Положения диссертации, выносимые па защиту

1 Полиморфизм гена 1Ь-1р является одним из главных факторов, определяющих выраженность островоспалительных реакций и диерегуляцию механизмов иммунного ответа в процессе формирования гнойного синусита

2 Генетически детерминированная недостаточность продукции 1Ь-1р обуславливает пролонгацию воспалительного ответа, увеличение частоты рециди-

bob и обострений гнойного риносинусита 3 Уровень продукции IL-8 связан с уровнем экспрессии гена IL-lp и напрямую определяет фагоцитарную активность нейтрофилов. Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на XVII съезде оториноларингологов России (Н Новгород, 2006), И научно - практической конференции оториноларингологов Южного федерального округа (Сочи, 2006), Всеармейской научно - практической конференции, посвященной 130-летию со дня рождения В И Воячека (СПб, 2006), 54-ой конференции молодых ученых (СПб, 2007) Внедрение результатов исследования в практику

Основные положения диссертации внедрены в учебный процесс и клиническую работу кафедры оториноларингологии ГОУВПО СПбГМУ им акад И П Павлова и в работу практических отоларингологов СПб ГУЗ «Городская поликлиника №112» Публикации

По теме диссертационного исследования опубликовано 9 научных работ, в том числе - 2 в журналах, рекомендованных ВАК Объем и структура работы

Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста Она построена по традиционному плану и состоит из введения, обзора литературы, главы, содержащей описание использованных в работе материалов и методов исследовашш, двух глав собственных наблюдений, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического списка использованной литературы Работа содержит 9 рисунков и 26 таблиц Указатель литературы содержит 219 наименований источников, в том числе 83 работы принадлежат иностранным авторам

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Нами обследовано 126 человек Из них - 40 практически здоровых лиц (ПЗЛ) и 86 больных гнойным риносину-ситом 46 человек - с острым гнойным синуситом (ОГРС) и 40 - с хроническим гнойным риносинуситом (ХГРС) Обследование здоровых доноров и группы б

больных проводилось на базе клиники оториноларингологии ГОУВПО СПбГМУ им акад И П Павлова и оториноларингологическою отделения СПб ГУЗ «Городская поликлиника №112» при непосредственном участии лаборатории клинической иммунологии ФГУП Гос НИИ особо чистых биопрепаратов в период с 2004-2006 гг Среди больных было 32 мужчины и 54 женщины, средний возраст пациентов составил 41,5 ± 3,75 лет

В зависимости от клинического течения заболевания все больные были разделены на две группы

1 группа (погрс =16, Пхгрс=16) - больные с «активным» течением острого или обострением хронического синусита, имевшие выраженные признаки островоспалительной реакции лихорадка, головная боль, интоксикация

2 группа (погрс = 30, пХГРС=24) - больные с «ториидным» течением синусита, у которых островоспалительные симптомы были не выражены или отсутствовали (табл 1)

Таблица 1

Критерии распределения больных на группы в зависимости от типа

клинического течения синусита

Критерии Острый гнойный синусит Обострение хронического гнойного синусита

«активное» течение «торпидное» теченне «активное» течение «торпидное» течение

Длительное хь заболевания (в случае хронического -длительность обострения) до 10 суток (6,9±2Д2) до 10 суток (8,4±2,4) более 10 сут (14,2+2,2) более 10 суток (18,1+3,4)

Лихорадка (при поступлении в стационар) фебрилыгая субфебрильная субфебрильная чаще нормотермия

Головная боль выраженная незначительная невыраженная жалобы отсутствовали

Перкуссия и пальпация проекции околоносовых пазух болезненная малоболезненная малоболезненная / чувствительная чувствительная

Вид слизистой оболочки полости носа яркая гиперемия невыраженная гиперемия невыраженн гиперемия выраженная цианотнчность

Отечность слизистой оболочки полости носа выраженная умеренная умеренная невыраженная

Затруднение носового дыхания выраженное невыраженное умеренное умеренное

Отделяемое из носа гнойное гнойное, слизисто- гнойное слизисто -гнойное слизисто -гнойное

Такое распределение больных было проведено с целью изучения особенностей патогенеза и определения прогноза заболевания у больных с различными клиническими формами течения гнойного синусита с позиции иммуноге-нетических предпосылок

Для постановки диагноза использовались комплексные клинико-лабора-торные методы обследования, включающие изучение анамнеза заболевания, жалоб, объективный осмотр ЛОР - органов, рентгеноскопию околоносовых пазух, исследование транспортной функции мерцательного эпителия слизистой оболочки носа с определением мукоцилиарного транспортного времени

Лечение больных проводилось по общепринятой схеме и состояло из назначения системных антибактериальных препаратов, местных деконгенсантов и лекарственных средств с муколитическим, секретомоторным и секретолити-ческим эффектом Всем больным, имеющим гнойный процесс в верхнечелюстной пазухе, для эвакуации гнойного отделяемого проводилось пункционное лечение

С целью определения прогноза заболевания оценивалось течение воспалительного процесса, частота обострений хронического синусита, состояние больных в межрецидивньш период при плановом осмотре больных через один и три года от начала заболевания (обострения)

Материалом для иммунологического исследования являлась сыворотка крови Концентрацию 1Ь-1|). ГЬ-8 определяли в выделенных лейкоцитах с помощью диагностических тест-систем (ООО «Цитокин», Санкт-Петербург, Россия) методом твердофазного иммуноферментного анализа

Оценку функциональной активности фагоцитов периферической крови проводили по продукции активных кислородных метаболитов в реакции лю-минол зависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ).

Материалом для молекулярно-генетического исследования служили образцы ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической крови пациентов с помощью набора реагентов «ВектоДНК - экстракция» (ЗАО «Вектор-Бест») Для выявления точечных однонуклеотидных замен (5№) гена 1Ь-1 Р(-511С/Т) и 1Ь-1 Р(+3953С/Т) использовался метод анализа длины фрагментов рестрикции

ПЦР продукта ПЦР - реакцию проводили в 30 мкл реакционной смеси, содержащей буфер (Снбэнзим, Новосибирск), смесь dNTP (Сибэнзим, Новосибирск); 50пМ каждого праймера, 1 ед Taq-полимеразы (Силекс, Москва) ПЦР-продукт подвергался рестрикции с помощью специфических рестриктаз (Есо881 (Aval), Taq I), продукты рестрикции разделяли электрофоретически и визуализировали в УФ-свете на трансиллюминаторе Аллель, не несущий мутацию, как наиболее часто встречающийся, обозначался цифрой 1, для обозначения мутантного аллеля гена использовалась цифра 2

Статистическая обработка данных проводилась с использованием стандартного пакета программ прикладного статистического анализа MS Excel для Windows ХР и статистического пакета SPSS 15 0 и предусматривала вычисление среднеарифметического значения показателя, среднеквадратического отклонения Оценка достоверности различия показателей проводилась с помощью параметрического критерия Стьюдента, непараметрического критерия Манна-Уитнн и дисперсионного анализа с поправкой Бонферрони Для сравнения качественных признаков применяли точный критерии Фишера. Различие считалось достоверным при р<0,05

Результаты исследования и их обсуждение. Основной причиной развития риносинусита у больных обследуемой группы явилась острая респираторная внрусная инфекция, ОРВИ предшествовала заболеванию в 34,5% случаев, фактор переохлаждения стал причиной развития PC у 28% больных, 37,5% больных не смогли связать воспаление с какими - либо внешними причинами

Длительность заболевания острым синуситом составила 7,7±2,26 дня, у больных хроническим синуситом продолжительность обострения была 16,2±2,8 дней, частота обострений ог 1-го до 4-х раз в год, давность заболевания от 3-х до 10 лет

При изучении локализации воспалительного процесса установлено, что у больных острым синуситом чаще встречался односторонний гнойный гайморит, а среди больных с хроническим воспалением слизистой оболочки ОНП преобладали лица с двусторонним гнойным гаймороэтмоидитом (рис 1)

Ш ОГРС

;и хгрс

двустор. гаиморит одпост. гаймороэтмояцит двуст. гаймороэтмоидит гемисинусит

пансинусит

¿.____,_!______

15

Рис. 1. Распределение больных с гнойными синуситами по локализации воспалительного процесса (%)

При этом только у трети больных острым синуситом и менее чем у половины больных хроническим синуситом наблюдались выраженные симптомы острофазного воспаления, характерные для «активного» течения воспалительного процесса. Мы изучили различные варианты клинического течения заболевания с иммунологических и молекулярно-генетических позиций.

Известно, что ГЬ-ф является основным провоспалительным цитокином, он обеспечивает пролиферативный и экссудативный компоненты воспаления, индуцирует большинство известных местных и системных проявлений воспаления (Фрейдлин И.С., Тотолян А.А., 2001). Была изучена спонтанная продукция 1Ь-1р лейкоцитами периферической крови у больных риносинуситом (рис. 2 и 3).

повышенная продукция П.-1 34%

66%

нормальная продукция П.-1

Рис. 2. Спонтанная продукция IЬ-1 (3 у больных острым синуситом

повышенная продукций

Д.-1

нормальная продукция

ЯЛ

Рис. 3. Спонтанная продукция 1Ь-1р у больных хроническим риносинуситом

Достоверность различий между группами доказана при р<0,01

Установлено (рис.2 и 3), что у 34% больных острым риносинуситом и у 40% лиц с обострением хронического синусита спонтанная продукция IL-ip превышала контрольные показатели (р<0,01). Причем в абсолютном большинстве случаев клинически «активное» течение гнойного синусита сопровождалось повышенной спонтанной продукцией IL-ip (в 93,75% случаев для ОГРС и в 94% случаев для ХГРС). А «торпидное» течение синусита характеризовалось исходно нормальными концентрациями IL-ip (96,7% случаев для ОГРС и 95,8% случаев для ХГРС).

Уровень спонтанной продукции цитокинов in vitro может говорить о пре-активации клеток иммунной системы антигеном in vivo. Индуцированная продукция цитокина, т.е. ответ на индуктор in vitro отражает способность лимфоцитов/моноцитов отвечать in vivo на антигенную стимуляцию (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008). Была проанализирована способность клеток крови к индуцированной продукции IL-lp (рис.4).

активное течение PC

торпидное течение PC

Рис.4. Медианы значений индуцированной продукции 1Ь-1р у больных риносинуситом *- достоверность различия с показателями ПЗЛ доказана при р<0,01

Выявлено (рис.4), что у лиц с «активным» течением воспалительного процесса медианы значений 1Ь-1риндуц достоверно превышали показатели практически здоровых лиц (р<0,01), причем в группе ХГРС этот показатель был максимальным.

Таким образом клинически «активное» течение синусита характеризовалось высоким уровнем как спонтанной, так и индуцированной продукции 1Ь-1р (р<0,01), а у больных с «торпидным» течением воспалительного процесса ри-носинусит протекал с нормальной продукцией ЦЬ-1р.

В литературе описаны две наиболее известные однонуклеотидные замены гена IL-1 ß в районе пятого экзона (+3953С/Т) и в промоторном регионе гена (-511 С/Т) Согласно современным представлениям (Коненков ВИ, Смольникова М В , 2003, Шарипова Э Р , 2007), наличие полиморфного аллеля гена 1L-Iß (+3953 С/Т) ассоциировано с повышенной экспрессией указанного гена и, соответственно, с повышенной продукцией IL—Iß Роль замены в регу-ляторном участке гена (-5 И С/Т) остается не до конца изученной Мы проследили частоту встречаемости нормальных и полиморфных локусов гена IL-lß (+3953С/Т) и (-511С/Т) у больных обследуемой группы (табл 2)

Таблица 2

Частота носительства полиморфных и нормальных локусов гена IL—lß

(-511 С/Т), (+3953 С/Т) у больных риносинуситом

Аллели гена IL-lß (-511 С/Т) Р= Аллели гена 1И ß (+3953С/Т) Fishei's Exact Test, P=

1/1 1/2 2/2 0,177 1/1 1/2 2/2 Pl,1/1,2/2,2= 0,053* Pu/i 2 == 0,026**

ОГРС п= 26 12 8 34 8 4

% 61,9 40,0 57,1 63,0 33,3 50,0

ХГРС п= 16 18 6 20 16 4

% 38,1 60,0 42,9 37,0 66,7 50,0

* Рилдод- точный критерий Фишера, оцененный в группах больных с генотипами 1/1,1/2, 2/2

* *р! )л 2 -точный критерий Фишера, оцененный в группах больных с генотипами 1/1,1/2

Из данных, представленных в табл 2, следует, что зависимости клинического течения заболевания от частоты встречаемости полиморфного локуса гена IL-lp (-511 С/Т) не выявлено (р>0,05) Однако с вероятностью (р=0,053) можно говорить о роли однонуклеотидной замены (+3953С/Т) в течение воспалительного процесса Если анализировать только распространенные в популяции генотипы 1/1 и 1/2, исключая редко встречающийся вариант 2/2 (мутантную гомозиготу), то с высокой долей вероятности (р=0,026) можно утверждать, что генотип 1/1 полиморфного локуса гена IL-lp (+3953С/Т) ассоциирован с острым течением риносинусита (63% наблюдений), а генотип 1/2 гена IL-ip (+3953С/Т) - с хроническим воспалением слизистой оболочки околоносовых пазух (66,7% наблюдений)

На рис 5 представлены уровни индуцированной продукции IL-ip лейкоцитами крови у больных исследуемой группы с разными аллелями поли-12

морфвых локусов гена 1Ь - 1(3. Установлено, что для больных, страдающих ри-Егосинуситом. носительство генотипа 1/2 гена 11.-1(3 (+3953С/Т) ассоциируется с повышенной продукцией 1Ь-1(3 (р<0,05) по сравнению с лицами, имеющими генотип 1/1 и 2/2 (+3953С/Т). Статистически значимых различий средних значений индуцированной продукции 1Ь-1р у больных с разными аллелями гена 1Ь-1р (-511 С/Т) найдено не было (р>0,05).

(-511 С/Т) (+3953 С Я)

ХГРС ХГРС

1/1 1/2 2/2 1/1 1/2 2/2 1/1 1/2 2/2 1/1 1/2 2/2

Рис. 5. Медианы значений индуцированной продукции И. - 1 ¡3 лейкоцитами крови у больных риносинуситом с разными аллелями гена ф(-51! С/Т) и (+3953С/Т) * достоверность различия значений в группе доказана при р<0,05

Поскольку ген 1Ь-1р имеет несколько полиморфных локусов. нам представляется важным их совместное влияние на конечную продукцию 1Ь-1р. Совокупный анализ возможных ассоциаций обоих полиморфизмов гена 1Ь-1р в позициях (-511С/Т) и (+3953С/Т) и типа течения риносинусита представлен в таблице 3. Согласно данным табл.3, сочетание полиморфных локусов гена 1Ь-1р (-511С/Т)(1/1) и (+3953С/Т)(1/1) ассоциировано с «активным течением» острого синусита и встречалось у 75% больных (р=0,041). А носительство генотипа (-511С/Т)(1/1) и (+3953С/Т)(1/2) предрасполагало (р=0.004) к «активному» течению обострений хронического риносинусита и носителями его были 75% больных ХГРС.

Таблица 3

Распределение частот генотипов полиморфных локуеов гена II , - 1 ¡5 (+3953С/Т) и (-511С/Т) у больных риносинуситом с разным типом

клинического течения заболевания

Рино- Аллели гена Аллели гена «торпидное» «активное»

синусит 1Ь-1(3 жлр течение РС течение РС

(-511 С/Т) (+3953С/Т) 11= % п= %

ОГРС 1/1 8 44.4% 6 75%*

1/1 1/2 8 44.4% 0 0%

2/2 2 11,2% 2 25%

1/2 1/1 6 100% б 100%

2/2 1/1 6 100% 2 100%

ХГРС 1/1 4 50% 2 25%

1/1 1/2 0 0% 6 75%**

2/2 4 50% 0 0%

1/2 1/1 6 37,5% 2 100%***

1/2 10 62,5% 0 0%

2/2 1/1 2 100% 4 100%

* р=0,041, тест Манна - Уитни, ** р=0,004, тест Манна - Уитни ***р=0,183, тест Манна - Уитни

Имели место другие варианты сочетаний аллелей полиморфных локуеов гена 1Ь-1|), но статистически данный факт подтвердить не удалось (р>0,05). В частности, для больных, имеющих «торпидное» течение риносинусита, характеризующих их генотипов установлено не было.

Была изучена продукция 1Ь-8 у больных - носителей нормальных и полиморфных локуеов гена 1Ь-1 р (рис.6).

1/1 (-511)4 1/1 (-511)+ 1/1 (-511)+ 1/2(-511)+ 1Е(-611)+ 2/2(-511)+ 1/1 (+3953) 1/2(+3953) 2/2(+3953) 1/Ц+3953) 1/2(+3953) 1/1 (+3953)

Рис.6. Медианы значений индуцированной продукции 1Ь-8 лейкоцитами крови у больных риносинуситом с разными вариантами аллелей гена 1Ь- 1р (-511 С/Т) и (+3953 С/Т) * достоверность различия значений в группе доказана при р<0,05

Согласно рис. 6 у лиц, носителей «нормальных» аллелей гена 1Ь-1|3 1/1 (-511С/Т)+1/1(+3953С/Т) гнойный синусит протекал на фоне невысоких значе-

ний индуцированной продукции Я--8 (11834,9±2562,43 пг/ш), р=0,027 А сочетание аллелей гена 1/1 (-511 С/Т) и 1/2(+3953С/Т) достоверно (р=0,05) ассоциировалось с высокой продукцией 1Ь-8 (21780,4±5042,21 пг/мл) Таким образом, можно констатировать, что полиморфизм гена 1Ь-1р обуславливает уровень продукции 1Ь-8

Завершенность воспалительного процесса зависит от скорости элиминации патогена Основная роль в киллинге микробной клетки принадлежит фагоцитам макрофагам и нейтрофилам Мы щучили фагоцитарную активность нейтрофилов в реакции люминол зависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) во взаимосвязи с уровнем продукции 11,-8, основного хемокина нейтрофильных гранулоцитов (табл 4)

Таблица 4

ЛЗХЛ крови у больных ринослнуситом с «активным» и «торпедным»

типом течения воспалительного процесса

Уровень Спонтанная ЛЗХЛ, индуци- ЛЗХЛ, индуци-

IL-8, ЛЗХЛ, рованная РМА, рованная зимоза-

пг/мл M + ш, мВ/30 M ± ш, мВ/30' ном,

мин М ± т, мВ/30'

«активное» т. 11410± 52521 • 5,2 ±0,36 24,8 ± 16,76 •• 32,7+21,19

ОГРС (п=1б)

ХГРС (п=1б) 21950 ±7042'*• 42 ±1,84 262,4± 22,04*« 142,7 ± 10738

«торпидное»

ОГРС (11=30) 1181± 953 2 5,3 ± 0,25 17,3+4,48 23,8 ± 6,07 •

ХГРС (11=24) 2206+922*2 5,5 ± 0,29 24,4 ± 13,23 90,6 ±49,71 *•

ПЗЛ (п= 40) 7211 +1410,51 5,6 ±0,2 21,4 + 1,14 30,2 ±2

382±166,52

Достоверность различия с показателями ПЗЛ доказана при р<0,05 •достоверность различия значений в группе доказана при р<0,05 •• досюверность различия значений в 1-руппе доказана при р<0,01 1 - уровень индуцированной продукции 1Ь-8, 2 - уровень спонтанной продукции 1Ь-8

Из данных, представленных табл 4 следует, что при высоком уровне продукции 1Ь-8, функциональная активность фагоцитов значительно превышает показатели практически здоровых лиц (г=0,59), при недостаточной продукции 1Ь-8, показатели ЛЗХЛ балансирую! в пределах значений здоровых доноров (г=0,44) Положительная корреляция ЛЗХЛ и уровня продукции 1Ь-8 подтверждает функциональное назначение 1Ь-8 как основного хемокина фагоцитирующих клеток

Обращает на себя внимание, что у больных хроническим синуситом как уровень 1Ь-8, так и функциональная активность фагоцитов (ЛЗХЛИНД) значительно (р<0,05) превышала аналогичные показатели в группе ОГРС Причем у лиц, страдающих хроническим синуситом с высокой продукцией провоспали-тельных цитокинов, показатели ЛЗХЛ достигали уровня «респираторного» взрыва (262,4+22,04 мВ/30, при норме 21,4±1,14 мВ/30), что, видимо, отражает «функциональный резерв» иммунокомпетентных клеток - их способность к максимально возможному синтезу активных кислородных метаболитов

У больных с острым синуситом уровень синтеза 1Ь-8 и значения ЛЗХЛ незначимо (р>0,05) отличались от показателей здоровых доноров, причем для больных с «торпидным» течением ОГРС было характерно некоторое снижение показателей фагоцитоза относительно практически здоровых лиц

Анализ всех изученных иммуногенетических показателей в зависимости от клинического течения риносинусита приведен в табл5 Сводный анализ данных (табл 5) показал, что характер и течение воспалительного ответа обусловлено генегаческими различиями и разным уровнем продукции 1Ь-1{5. Так, носительство нормальных аллелей гена 1Ь-1р (-511С/Т)(1/1) и (+3953С/Т)(1/1), чаще всего встречающихся в популяции, ассоциировано с «активным» течением острого гнойного риносинусита Такой тип воспалительного ответа характеризовался выраженными реакциями острофазного воспаления, высоким уровнем продукции 1Ь-1р, нормальными значениями 1Ь-8 и фагоцитарной активности нейтрофилов Данный тип воспаления слизистой оболочки околоносовых пазух имел наименьшую продолжительность

Носительство аллелей гена 1Ь-1|3 (-511С/Т)(1/1)и(+3953С/Т)(1/2) предрасполагало к «активному» течению обострений хронического синусита и определяло гиперэргаческий тип воспалительного ответа с высоким уровнем синтеза провоспалительных цитокинов (1Ь-1(3,1Ь-8) и показателей фагоцитоза, достигающих уровня «взрыва» реакций метаболической активности Это, возможно, объясняется дисрегуляцией механизмов иммунного реагирования у больных, годами находящихся в условиях хронического воспаления и постоянной бактериальной персистенции 16

Таблица 5

Клинические н нммуногснетичсскне характеристики гнойных риносинусптов

11,-10 СПОК г и.-1р внд 11,-8 си ОН Г 11,-8 ивд лзхл СПОЙ г ЛЗХЛ ИОД. мцт, мин Длитмь-ность заб Примем (генотип)

ОГРС «актив ное» т й т N N 19,89 +1,19 6,9±2,12 дни 1/1 (-511С/Т) + 1/1 (+3953С/Т)

«тор- пид ное» 0 N N / А И N / 22,4 ± 2,4 8,4 ± 2,4 дни высокая частота рецидивов (32,3%)

ХГРС «актив нос» т й ф ф ш 24,1± 1,18 14,2+2,2 дин 1/1 (-51 ЮТ) + 1/2 (+3953С/Т)

«торпидное» 0 N 1} N £ 28,15 ±1,25 18,1±3,4 ЛИИ | качества ▼ жизии пац-ов

Для лиц, имеющих «торпидное» течение сггнусита, генетических маркеров, характеризующих их, выявить не удалось Клинически для этой группы больных было характерно нормэргическое воспаление, увеличение сроков заболевания и частоты рецидивов, у лиц с ХГРС сохранялись жалобы на слизи-сто-шойное отделяемое из носа, снижение обонятельной и вкусовой чувствительности, слабость, общее недомогание в межрецидивный период, что значительно ухудшало качество жизни таких пациентов. В иммунологическом статусе только уровень продукции 1Ь-8 и ЛЗХЛИВД значимо (р<0,05) превышали показатели ПЗЛ У больных с острым воспалением, имеющих «торпидное» течение, изученные иммунологические показатели не отличались от значений здоровых доноров, но имелась тенденция к некоторому снижению показателей фагоцитоза Очевидно, именно данный факт обуславливает неполноценную элиминацию патогена и склонность данной группы больных к рецидивам острого синусита

выводы

Характер и течение воспалительного ответа у больных гнойным риносину-ситом обусловлены генетическими различиями и разным уровнем продукции провоспалительных цитокинов (1Ь-1р, 1Ь-8)

Клинически «активное» течение риносинусита характеризуется гиперэрги-ческим воспалением и сопровождается высоким уровнем синтеза 1Ь-1 р лейкоцитами крови, напротив, «торпидное» течение синусита проявляется нор-мэргическим типом воспалительного ответа и ассоциировано с низкой спонтанной продукцией 1Ь-1р

При остром гнойном риносинусите прогностически наиболее благоприятным является носительство полиморфных аллелей гена 1Ь-1р (-511С/Т)(1/1) и (+3953С/Г)(1/1), ассоциированного с высокой продукцией 1Ь-1р Сочетание аллелей гена 1Ь-1р (-511С/Т)(1/1) и (4-3953С/Т)(1/2) оказалось более благоприятным для больных хроническим синуситом с «активным» течением процесса Функциональная активность нейтрофилов по показателям фагоцитоза положительно коррелирует с уровнем продукции 1Ь-8 и связана с уровнем экспрессии гена 1Ь-1 р

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

У больных с длительными и вялотекущими формами синусита с целью выявления этиологического фактора пролонгации воспалительного ответа целесообразно проведение иммунологического обследования с определением уровня сывороточных 1Ь-1р и 1Ь-8

Проведение генотипирования для выявления полиморфизма гена ГЬ-1{? позволяет спрогнозировать тип течения гнойного синусита и может способствовать разработке новых методов иммунотерапии и иммунопрофилактики воспалительных заболеваний

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Лавренова Г В , Симбирцев А С , Тараканова Е Н, Гурьева И А, Кучерова Л Р Особенности иммунного воспаления у больных острым и хроническим синуситом // Тез докл Всеармейской науч-практ конф., посвящ 130-летию со дня рождения В И Воячека - СПб, 2006 - С 68-69

Гурьева И А , Кучерова ЛР , Тараканова Е Н , Лавренова Г В, Симбирцев А С Сравнительная оценка фагоцитарной функции нейтрофилов у больных острыми синуситами, осложненными тубоотитами, и больных с другими формами синуситов // Материалы XVIJ съезда оторинолар России -Н Новгород. 2006 - С 267-268

Лавренова Г В , Симбирцев А С , Тараканова Е Н, Кучерова Л Р Определение уровней цитокинов сыворотки крови у больных риносинуситом II Материалы XVII съезда оторинолар России - Н Новгород, 2006 - С 299-300 Тараканова Е Н, Гурьева И А, Кучерова Л Р Оценка показателей общего иммунитета и фагоцитарной активности нейтрофилов у больных риносинуситом //Рос оторинолар -2007 - № 1 (26) - С 173-176 Тараканова ЕН Особенности фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов у больных риносинуситом // Folia Otorhinolaryngologia -2007 -Vol 13. № 1-4 - С 109-115

Тараканова Е Н, Демьянов А В , Лавренова Г В , Симбирцев А С Анализ полиморфных локусов -511 и +3953 гена IL-1 р у больных риносинуситом // Вестник оторинолар -2008 - №3 - С 46-55

у>

Подписано в печать 01.07 2008 Формат 60x84 1/16 Бума1 а офсетная Уел печ листов 0,93 Тираж 100 шт. Заказ № 497

Отпечатано в типографии «Полиграф экспресс» 194223, Санкт-Петербург, ул Курчаюва, 9 Тел (812)702-14-15,297-48-97

Актуальность проблемы.

Риносинусит-инфекционный воспалительный процесс бактериальной или вирусной этиологии слизистой оболочки носа и околоносовых пазух. Синусит относится к числу самых распространенных заболеваний, что признается практически во всех научных работах последнего десятилетия (Пискунов Г.З., Косяков С.Я., 2005; Рязанцев С.В., 2006; Лопатин А.С., 2007). В настоящее время в России острый риносинусит ежегодно диагностируется у 10 млн человек (Козлов С.Н., 2004; Лопатин А.С., 2007), а удельный вес больных риносинуситом среди пациентов, госпитализированных по поводу патологии ЛОР-органов, составляет от 40 до 50% (Морозов С.А., Казначеева С.В., Новикова Н.В. и др., 2002; Лопатин А.С., 2007). Похожие тенденции характерны и для других стран. Ежегодно риносинусит регистрируется у 16% взрослого населения США (Anand V.K., 2004). По оценкам экспертов Американского национального бюро исследования здоровья (United States National Health Interview Survey), риносинуситы являются наиболее частой причиной посещений врача в США (141,3 на 1000 населения) (Benson V, Marano MA., 1998). В Канаде распространенность риносинусита достигает 135 на 1000 населения (Durr D.G., Desrosiers M.Y., Dassa , 2001). Синуситы широко распространены среди всех возрастных групп, но наибольшее число больных попадает на возраст от 18 до 55 лет, то есть на наиболее активную и трудоспособную часть населения (Хрусталева Е.В, 1993; Тарасов Д.И., 1998).

Хронические риносинуситы являются одной из наиболее частых причин таких серьезных осложнений, как церебральные арахноидиты, хронические гнойные средние отиты, орбитальные осложнения, V рецидивирующие и хронические заболевания бронхолегочной системы (Плужников М.С., Лавренова Г.В., 1990; Быкова В.П, 1993; Гайворонский А.В., Деньков Д. А., 2001). Частота риногенных орбитальных и внутричерепных осложнений при хроническом синусите за последние двенадцать лет не обнаруживает заметной тенденции к снижению и колеблется от 6,6 до 12,4% (Пискунов С.З., Тарасов И.В., 1995; Дерюгина О.В., Чумаков Ф.И., 2001).

Важно подчеркнуть не только медико-биологическую, но и социально-экономическую значимость данной проблемы. Исследования по влиянию симптомов риносинусита на качество жизни пациента выявили, что оно снижается значительнее, чем при хронической обструктивной болезни легких и даже при ишемической болезни сердца (Benninger M.S., Kennedy D.W.,1997). Актуальность проблемы риносинусита связана и с наносимым этим заболеванием экономическим ущербом. По данным американских экспертов в США только прямые затраты на лечение одного больного хроническим риносинуситом, включающие стоимость базового набора медикаментов, достигают 1220-1539 дол. США в год (Kim YK, Uno М, Hamilos DL et al. 1999; Hsueh PR, Huang WK, Shyr JM et al., 2004). Полные расходы, связанные с риносинуситами, составляют 5,8 млрд дол. США в год. При этом 30,6% экономических издержек связаны с лечением больных риносинуситом детей в возрасте до 12 лет, а 58,7% всех расходов, т.е. 3,5 млрд дол. США, обусловлены впервые выявленным острым или хроническим риносинуситом (Ray NF, Baraniuk JN, Thamer M. J, 1999).

В последние годы в литературе активно обсуждается иммунопатогенез данного заболевания и, в частности, роль провоспалительных цитокинов и несостоятельности факторов местной защиты в очаге воспаления (Тимчук Л.Э., Громова А.Ю., Симбирцев А.С., Янов Ю.К., 2005; Rudack С., Stoll W., Bachert С., 1998). По данным Коршикова В.Н. (1999), Азнабаевой Л.Ф. (2002) у больных с гнойно-воспалительными заболеваниями околоносовых пазух имеется снижение активности некоторых местных факторов специфической и неспецифической резистентности, в результате чего не происходит полной элиминации патогена.

Более сложными исследованиями, объясняющими вариант развития воспаления околоносовых пазух, являются работы с генным материалом иммунокомпетентных клеток. В настоящее время показано, что хроническое течение воспаления может быть связано с дисбалансом в функционировании цитокиновой системы, обусловленным функциональным полиморфизмом генов, кодирующих белки семейства IL-1. Данный полиморфизм представлен небольшими мутационными изменениями в кодирующих и некодирующих участках гена: точечными заменами нуклеотидов, тандемными повторами частей гена (Громова А.Ю., Тимчук Л.Э., Янов Ю.К. и др. 2005; Шарипова Э.Р., 2007).

Проблема лечения больных риносинуситом до настоящего времени остается одной из актуальных в оториноларингологии. Снижение иммунологической реактивности при хронических риносинуситах требует назначения средств эффективной коррекции возникающего иммунодефицита и иммунореабилитации. На сегодняшний день основным в лечении риносинуситов является использование местной и системной антибиотикотерапии в сочетании с пункционным (принудительным) дренированием околоносовых пазух. Однако приходится признать, что далеко не во всех случаях эта схема является эффективной, избавляющей больного от рецидивов гайморита. Причины тому широкая распространенность устойчивых штаммов, невозможность их быстрой идентификации, все возрастающий риск развития побочных реакций, в том числе аллергических на прием антибиотиков, трудности проведения дифференциального диагноза между бактериальной и вирусной природой заболевания, увеличивающееся количество грибковых синуситов и, наконец, высокая стоимость препаратов (Лопатин А.С., 2001). Поэтому современный поиск высокоэффективных схем терапии обращен в сторону иммунотерапии.

Вышеизложенное свидетельствует о широкой распространенности гнойных риносинуситов и зависимости течения данной патологии от состояния иммунологической резистентности и генетической предрасположенности. Развитие представлений об иммунопатогенезе риносинуситов имеет первостепенное значение для лечения и, главное, профилактики острых и хронических форм заболевания, что определило актуальность настоящего исследования, выбор цели и постановку задач данной работы.

Цель исследования

Изучение особенностей цитокиновой регуляции и функциональной активности фагоцитов в процессе формирования гнойного синусита, а также влияния полиморфизма гена IL-lp на предрасположенность к развитию острого и хронического гнойного риносинусита.

Задачи исследования

1. Оценить влияние полиморфизма гена IL-ip на продукцию провоспалительных цитокинов (IL-lp, IL-8) у больных острым и хроническим гнойным риносинуситом.

2. Изучить особенности продукции IL-ip у больных риносинуситом с различными вариантами клинического течения заболевания.

3. Определить прогноз течения риносинусита в зависимости от клинико-иммунологического статуса и полиморфизма гена IL-ip.

4. Проанализировать зависимость фагоцитарной активности нейтрофилов у больных риносинуситом от продукции IL-8 и уровня экспрессии гена IL-1р.

Научная новизна исследования

1. Изучены особенности продукции провоспалительных цитокинов IL-ip и IL-8 мононуклеарами периферической крови у носителей полиморфных локусов гена IL-ip (-511С/Т), расположенном в промоторном регионе и в кодирующей части гена IL-ip (+3953С/Т). Впервые проведена комплексная оценка и сравнение иммунологического и молекулярно - генетического статуса у больных острым и хроническим гнойным риносинуситом.

Выявлено, что пролонгация воспалительного ответа в околоносовых пазухах генетически обусловлена низким уровнем продукции IL-1J3.

2. Изучена роль ключевого хемокина IL-8 в патогенезе гнойных риносинуситов. Показано, что функциональная активность нейтрофилов по показателям фагоцитоза положительно коррелирует с уровнем продукции IL-8 и связана с уровнем экспрессии гена IL-ip.

3. Выделены клинически благоприятное и неблагоприятное течение гнойного риносинусита. Установлено, что носительство генотипа IL-1(3 (-511С/Т)(1/1) и (+3953С/Т)(1/1), ассоциировано с благоприятным течением острого процесса, а сочетание аллелей гена IL-lp (-511С/Т)(1/1) и (+3953С/Т)(1/2) более благоприятно для лиц, страдающих хроническим воспалением околоносовых пазух.

Практическая значимость работы

Разработаны и апробированы критерии диагностики и прогнозирования течения гнойного риносинусита с позиции иммунологических и молекулярно- -генетических методов исследования. Развитие представлений об иммунопатогенезе риносинуситов и детальное изучение механизмов влияния , полиморфизма генов цитокинов на предрасположенность к типу течения воспалительной реакции в будущем позволит расширить возможности практических врачей в лечении и профилактике острых и хронических форм заболевания.

Положения, выносимые на защиту

1. Полиморфизм гена IL-1J3 является одним из главных факторов, определяющих выраженность островоспалительных реакций и дисрегуляцию механизмов иммунного ответа в процессе формирования гнойного синусита.

2. Генетически детерминированная недостаточность продукции IL-ip обуславливает пролонгацию воспалительного ответа, увеличение частоты рецидивов и обострений гнойного риносинусита.

3. Уровень продукции IL-8 связан с уровнем экспрессии гена IL-1(3 и напрямую определяет фагоцитарную активность нейтрофилов.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на XVII съезде оториноларингологов России (Н.Новгород, 2006); II научно-практической конференции оториноларингологов Южного федерального округа (Сочи, 2006); Всеармейской научно-практической конференции, посвященной 130-летию со дня рождения В.И.Воячека (СПб, 2006); 54-ой конференции молодых ученых (СПб, 2007).

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты исследования внедрены в практику клиники оториноларингологии ГОУВПО Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. И.П.Павлова и в работу практических отоларингологов СПб ГУЗ «Городская поликлиника №112».

Основные положения диссертационного исследования включены в учебной процесс кафедры оториноларингологии ГОУВПО Санкт- t Петербургского государственного медицинского университета им. И.П.Павлова.

Публикации

По теме диссертационного исследования опубликовано 9 научных работ, в том числе-2 в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста. Она построена по традиционному плану и состоит из введения, обзора литературы, главы, содержащей описание использованных в работе материалов и методов исследования, двух глав собственных наблюдений,

выводы

1. Характер и течение воспалительного ответа у больных гнойным риносинуситом обусловлены генетическими различиями и разным уровнем продукции провоспалительных цитокинов (IL-ip, IL-8).

2. Клинически «активное» течение риносинусита характеризуется гиперэргическим воспалением и сопровождается высоким уровнем синтеза IL-ip моноцитами крови, напротив, «торпидное» течение синусита проявляется нормэргическим типом воспалительного ответа и ассоциировано с низкой спонтанной продукцией IL-ip.

3. При остром гнойном риносинусите прогностически наиболее благоприятным является носительство полиморфных аллелей гена IL-ip (-511С/Т)(1/1) и (+3953С/Т)(1/1), ассоциированного с высокой продукцией IL-ip. А сочетание аллелей гена IL-ip (-511С/Т)(1/1) и (+3953С/Т)(1/2), оказалось более благоприятным для больных хроническим синуситом с «активным» течением процесса.

4. Функциональная активность нейтрофилов по показателям фагоцитоза положительно коррелирует с уровнем продукции IL-8 и связана с уровнем экспрессии гена IL-ip.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. У больных с длительными и вялотекущими формами синусита с целью выявления этиологического фактора пролонгации воспалительного ответа целесообразно проведение иммунологического обследования с определением уровня сывороточных IL-1J3 и IL-8.

2. Проведение генотипирования для выявления полиморфизма гена IL-1(3 позволяет спрогнозировать тип течения гнойного синусита и может способствовать разработке новых методов иммунотерапии и иммунопрофилактики воспалительных заболеваний.