Автореферат и диссертация по медицине (14.01.24) на тему:Применение мезенхимальных стромальных клеток костного мозга для коррекции фиброзирующего повреждения печени

На правах рукописи

005010713

ЛЮНДУП АЛЕКСЕЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ

ПРИМЕНЕНИЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ФИБРОЗИРУЮЩЕГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ПЕЧЕНИ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.01.24. - Трансплантология и искусственные органы 14.03.03. - Патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 0ЕЗ 20:2

Москва

2012

005010713

Работа выполнена в ФГБУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития России

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

Онищенко Нина Андреевна

доктор медицинских наук

Трубицына Ирина Евгеньевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Гальперин Эдуард Израилевич

член-корр. РАМН,

доктор медицинских наук, профессор

Поздняков Олег Михайлович

Ведущее учреждение: ФГУ "Институт хирургии им. А.В. Вишневского" Минздравсоцразвития РФ.

Диссертационного совета Д. 208.055.01 при ФГБУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ по адресу: 123182, Москва, ул. Щукинская, дом 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ.

Автореферат разослан: «___»_______________2012 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д. 208.055.01,

доктор медицинских наук, профессор Шевченко Ольга Павловна

Защита состоится «________»

2012 г. в

часов на заседании

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Проблема лечения хронической печеночной недостаточности до настоящего времени остаегся нерешенной проблемой [Voigt, 2005; Williams, 2006; Friedman,

2010], т.к. летальность при далеко зашедших диффузных поражениях печени с исходом в тяжелую печеночную и гепатоцеребральную недостаточность не снижается и колеблется в пределах от 50 до 70-90% [Шумаков В.И., Онищенко Н.А., 1994; Damen, 1995, Рахманова А.Г., 2006, Friedman 2008; Lee, 2010].

Установлено, что развитие хронического повреждения печени является результатом снижения регенерационного потенциала генатоцитов и уменьшения их массы, а также результатом избыточного образования компонентов внеклеточного матрикса.

Единственно эффективным методом лечения таких больных признана трансплантация печени [Williams, 2006; Lee, 2008; Готье С.В., Мойсюк Я.Г., 2010; Frei, 2011], которая, однако, не может быть осуществлена всем нуждающимся из-за дефицита донорских органов, который имеет место во всем мире [Чжао А.В., 2002; Perkins, 2007; Berg 2007; Kim, 2008; Alison, 2009].

Традиционно считается, что повреждения при циррозе печени необратимы. Тем не менее, исследования последних лет, выполненные на животных и в клинике, указывают на возможность, хотя бы частичного, регресса уже сформировавшегося фиброза [Arthur, 2002; Issa et al., 2004; Friedman, 2007; Zhang,

2011] с помощью клеточных технологий - трансплантации изолированных генатоцитов и стволовых (прогениторных) клеток из разных источников [Dhawan, 2006; Kallis, 2007; Enns, 2008; Lysy, 2008; Oertel, 2008, Alison, 2009; Almeida-Porada, 2010; Stutchfield, 2010], в том числе из костного мозга (КМ) -мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) [Quintanilha, 2008; Alison, 2009, Almeida-Porada, 2010]. В условиях эксперимента и клиники установлен факт антифиброзного действия стволовых/прогениторных клеток костного мозга [Fang et al., 2004; Di Vinicius, 2005; Zhao et al., 2005; Aziz et al., 2007; Dai et al., 2009]. Однако не все исследователи признают фибролитический эффект стволовых клеток и указывают даже на возможность усиления фиброза

при их использовании [Russo et al., 2006; Di Bonzo et al., 2008; Higashiyama et al., 2007].

Констатация диаметрально противоположных результатов может быть следствием недоучета роли типа используемых клеток и их биорегуляторной активности (гемопоэтические или стромальные клетки), а также степени тяжести и обратимости имеющихся повреждений в печени.

Для установления причин противоречивых результатов применения, в частности ММСК КМ, а также для выработки показаний к их применению для лечения хронической недостаточности необходимо иметь четкие представления: об особенностях динамики развития соединительной ткани в печени под влиянием трансплантированных клеток. Для этого необходимо использовать адекватную модель фиброзирующего повреждения печени без и на фоне применения клеток костного мозга, определить эффективные дозы и сроки для их применения с учетом степени выраженности предсуществующих процессов фиброзирования печени. Такие данные в литературе отсутствуют, и это позволило нам сформулировать цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования: изучить динамику развития соединительной ткани в печени при моделировании токсического фиброзирующего повреждения печени и трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток аллогенного костного мозга.

Задачи исследования

1. Оптимизировать способ моделирования устойчивого фиброзирующего повреждения печени у крыс для оценки терапевтических эффектов клеточной трансплантации.

2. Оценить динамику морфологических изменений в печени при ее токсическом фиброзирующем повреждении.

3. Установить способность мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток обеспечивать коррекцию процессов фиброзирования в печени.

4. Изучить эффект трансплантации мультипотситных мезенхимальных стромальных клеток на морфологические и функциональные нарушения печени при токсическом фиброзирукпцсм повреждении в зависимости от дозы (однократная и двукратная трансплантация клеток).

5. Установить эффективные сроки выполнения трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток для коррекции морфологических и функциональных нарушений в печени при хроническом фиброзирующем повреждении.

6. Установить связь коррекции морфологических нарушений в печени при трансплантации мезенхимальных стромальных клеток со снижением активации звездчатых клеток - регуляторов фиброгеиеза и ускорением процессов пролиферации паренхиматозных клеток.

Научная новизна

Разработана схема введения ССЦ для моделирования устойчивого фиброзирующего повреждения печени, которая исключает возможность спонтанной реверсии возникших морфо-функциональных нарушений.

Изучена динамика процесса фиброзирования печени после введения ССЦ. Впервые установлено, что процесс фиброзирования имеет фазный характер и приобретает прогрессирующее течение в отдаленные сроки - 60 и 90 сутки после курсового применения ССЦ. Исследование экспрессии маркеров активации звездчатых клеток печени - десмина и а-ГМА, позволило подтвердить, что процесс фиброзирования печени осуществляется при участии активированных звездчатых клеток. С помощью маркеров клеточной пролиферации и апоптоза (АФП, РСКА, Вс12, каспазы-3 и касиазы-9) было подтверждено, что развитие соединительной ткани в печени происходит на фоне замедления восстановительной регенерации гепатоцитов.

Установлено, что аллогенные мультииотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга (ММСК КМ) от здорового донора при

трансплантации животным с хроническим фиброзирующим повреждением печени способны перепрограммировать процессы регенерации поврежденной печени и предотвращать формирование соединительной ткани в печени, если ММСК КМ используются в достаточной дозе и на ранних сроках развития процессов фиброзирования.

Впервые установлено, что применение ММСК в терапевтически эффективной дозе (двукратная трансплантация) и на ранних сроках развития фиброзирующего повреждения печени характеризуется двухфазной динамикой воздействия на развитие соединительной ткани: первоначально происходит достоверное увеличение удельной площади соединительной ткани (более выраженное, чем в контроле), а затем в отдаленные сроки наступает уменьшение площади и общего объема соединительной ткани (резорбции соединительной ткани печени; однократная трансплантация ('Л эффективной дозы на 3 сутки после затравки) была малоэффективна. Динамика корригирующего эффекта ММСК при воздействии эффективной дозы клеток коррелирует с убылью содержания активированных звездчатых клеток (по экспрессии десмина и а-ГМЛ), и с более ранней активацией пролиферации гепатоцитов (по экспрессии альфа-фетопротеина). Отсроченная трансплантация ММСК в терапевтически эффективной дозе (на 30 и 37 сутки после затравки) на фоне разрастания соединительной ткани неэффективна, т.к. не предотвращает разрастание соединительной ткани. Сформулирована гипотеза, согласно которой для реализации терапевтического эффекта ММСК и перепрограммирования регенерационного процесса в ткани печени с фиброзирующего на восстановительный должны быть сохранены адаптационные резервы восстановительной регенерации, которые еще сохранены на ранних сроках после повреждения печени и которые отсутствуют на поздних сроках регенерационного процесса.

Практическая значимость работы

Предложена новая схема введения СС14 для моделирования устойчивого фиброзирующего повреждения печени и проведения доклинических испытаний

безопасности и терапевтических возможностей клеточных биотехнологий. Установлено, что применение ММСК КМ должно проводиться п терапевтически эффективных дозах на начальных этапах развития соединительной ткани в печени, когда еще сохранены местные адаптационные механизмы для перепрограммирования процессов фиброгенеза (фиброзирующей регенерации). Предотвращение развития соединительной ткани находится в непосредственной и прямой зависимости от суммарной дозы ММСК и достигается за счет раннего применения ММСК в эффективной дозе. Введение ММСК снижает функциональную активность синусоидных клеток (звездчатых клеток) и повышает пролиферативную активность гепатоцитов, что восстанавливает нарушенное межклеточное взаимодействие паренхиматозных и непаренхиматозных клеток и способствует резорбции соединительной ткани.

Полученные результаты могут стать основой для применения аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга в клинической практике у больных с хронической печеночной недостаточностью.

Положения, выносимые на защиту

1. Новая схема введения ССЦ для создания модели устойчивого фиброзирующего повреждения печени у крыс эффективна и может использоваться для оценки доклинических результатов коррекции фиброзирующих процессов с помощью ММСК КМ.

2. Выраженность корригирующего антифиброзирующего эффекта аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга здоровых доноров находится в прямой зависимости от дозы (кратности введения клеток) и степени тяжести фиброзирующих изменений в печени (срока введения).

3. ММСК КМ, примененные в достаточной терапевтической дозе (двукратная трансплантация) на раннем этапе фиброзирования способствуют перепрограммированию процессов регенерации, что находит отражение в резорбции соединительной ткани (фибролиз).

4. ММСК КМ, примененные в той же терапевтической дозе, но на этапе развернутого фиброзирования печени (отдаленные сроки), не способствуют редукции соединительной ткани в печени.

Апробация диссертации

Апробация диссертации состоялась 23 июня 2011 г. на заседании объединённой межлабораторной научной конференции ФГБУ «ФНЦТИО им. академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ.

Материалы и основные положения работы доложены и обсуждены: на IV Всероссийском съезде трансплантологов (г. Москва, 9-10 ноября 2008 г.); Конференции «Клеточные технологии и регенеративная медицина в хирургии и трансплантологии» (г. Москва, 2009 г.); на Всероссийской конференции «Клеточные исследования и технологии в современной биомедицине» (г. Тула, 910 ноября 2009 г.); на II Международной конференции «Мезенхимальные стволовые клетки в органной трансплантации» (г. Роттердам, Нидерланды, 17-18 января 2010 г.); на 45-м Конгрессе Европейского общества хирургических исследований (г. Женева, Швейцария, 9-12 июня 2010 г.); на VI Европейской гастроэнтерологической конференции (г. Прага, Чехия, 24-26 июня 2010 г.); на V Всероссийском съезде трансплантологов (г. Москва, 8-10 октября 2010 г.); на IV Конгрессе регенеративной биологии и медицины (г. Штутгарт, Германия, 13-15 октября 2010 г.); на XVIII Объединенной европейской гастроэнтерологической неделе (г. Барселона, Испания, 23-27 октября 2010 г.); на XIII Международной конференции азиатской тихоокеанской ассоциации хирургических банков ткани (г. Букиттингги, Индонезия, 26-30 октября 2010 г.); на XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 11-15 апреля 2011 г.); на III Международной конференции «Мезенхимальные стволовые клетки в органной трансплантации» (г. Лювен, Бельгия, 17-18 апреля 2011 г.); на XXXVIII Конгрессе Европейского общества искусственных органов (г. Порту, Португалия, 9-12 октября 2011 г.); на Всероссийской научной конференции «Регенеративная биология и медицина» (г. Москва, 14-15 октября 2011 г.); на XXV Ежегодной

конференции австрийского общества трансплантологии, трансфузиологии и генетики (г. Грац, Австрия, 19-22 октября 2011 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 4 в центральных рецензируемых журналах и 9 в зарубежных изданиях.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 146 страницах печатного текста. Состоит из введения, 5 глав, выводов, списка цитированной литературы. Работа иллюстрирована 70 рисунками и 5 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Для решения поставленных задач была создана модель устойчивого фиброзирующего повреждения печени, отработан протокол получения клеточного препарата ММСК из КМ и изучена эффективность коррекции функциональных и морфологических проявлений фиброзирующего повреждения печени с помощью аллогенных ММСК, выделенных из костного мозга здоровых доноров.

Общая характеристика работы

Исследование проведено на 255 белых крысах-самцах породы Вистар весом 230-250 г, содержащихся в виварии ФГЬУ ФНЦ ТИИО им. акад. В.И. Шумакова Минздравсоцразвития на смешанном рационе питания со свободным доступом к воде, при температуре 18-20°С. При планировании экспериментов на животных мы руководствовались этическими принципами гуманного использования животных в экспериментах. Работа состоит из трех разделов (рис. 1).

В 1 разделе работы отрабатывалась новая схема введения ССЦ для создания модели устойчивого токсического фиброзирующего повреждения печени (ТФП). Проведены биохимические и морфологические исследования, подтверждающие создание такой модели (таблица 1). Во II разделе работы отрабатывалась технология получения первичных культур ММСК КМ здоровых доноров, оптимизировались сроки культивирования выделенных клеток и количество пассирований для получения достаточной дозы клеточного препарата;

применялись гистохимические методы, подтверждающие присутствие ММСК в культуре; проводилось сравнение пролиферативной активности культур клеток ММСК КМ, полученных от крыс с моделью хронического фиброзирующего повреждения печени и от интактных крыс. В III разделе работы, в 5 сериях опытов, были изучены терапевтические эффекты трансплантации ММСК КМ интактных доноров при моделировании ТФП у крыс.

Рис. 1. Распределение животных по разделам проведенной работы

Введение ММСК КМ во всех сериях опытов осуществляли внутривенно (в хвостовую вену) сразу после окончания их культивирования при достижении необходимой дозы клеточного препарата.

В первой серии опытов моделировали ТФП без введения ММСК КМ. Вместо ММСК производилось одно - или двукратное введение физиологического раствора в равных объемах с опытными сериями (1 или 2 мл).

Во второй серии опытов создавалась модель ТФП и вводился клеточный препарат однократно в дозе 2,5x106 клеток на 3 сутки после окончания затравки.

В третьей серии опытов создавалась модель ТФП и вводился клеточный препарат двукратно: в дозе 2,5х106 клеток на 3 сутки после окончания затравки и в дозе 2,5х106 клеток на 10 сутки после окончания затравки.

В четвертой серии опытов аллогенные ММСК КМ также вводили дважды крысам с моделью ТФП, но по измененной схеме: первое введение в дозе 2,5х106 клеток на 30 сутки после окончания затравки, а второе введение в той же дозе проводили на 37 сутки после окончания затравки, т.е. па фоне формирующегося фиброза печени.

В пятой серии опытов интактные животные без ТФП получали ММСК КМ в вышеуказанных дозах (2,5х106 и 5х10б клеток).

Длительность наблюдения за экспериментальными животными всех серий опытов III раздела работы достигала 90 суток после окончания затравки. В первой контрольной серии с ТФП без клеточной терапии погибло 6 крыс. В остальных опытных сериях и в пятой контрольной серии все животные были живы в течение всего срока наблюдения.

Техника проведения экспериментов и методы исследования Моделирование токсического фиброзирующего повреждения печени

выполняли у крыс путем длительной затравки четыреххлористым углеродом (СС14) по оптимизированной схеме. Манипуляции проводили под кратковременным эфирным наркозом в интервале между 9-ю и 12-ю часами дня, что исключало суточные колебания митотической активности клеток печени.

Подкожные инъекции 60% раствора СС14 на персиковом масле проводили 2 раза в неделю (понедельник, четверг) в течение 6 недель (42 суток) в дозе 0,3 мл раствора на 100 г веса животного. Первая инъекция проводилась в дозе 0,5 мл 60% раствора СС14 на 100 г веса животного. Суммарная курсовая доза чистого ССЦ составляла 3,5 мл на 100 г веса животного. С помощью описанного метода была создана модель устойчивого фиброзирования печени без спонтанной реверсии вызванных изменений в течение 5 месяцев исследования.

Технология выполнения культуральных исследований (получение и культивирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток

костного мозга)

Моноиуклеарную фракцию клеток получали из аспирата костного мозга (КМ) животных. Для этого под эфирным наркозом из костномозгового канала большеберцовых и бедренных костей получали клетки костного мозга путем аспирации шприцем с иглой 18G, содержащим среду для забора (0,5 мл фосфатно-буферного раствора с 50 ЕД/мл гепарина и 0,25 мг/л гентамицина). Суспензию клеток КМ центрифугировали при 1500 об/мин (350g) 5 минут, осадок клеток ресуспевдировали в растворе для лизиса эритроцитов (114 мМ NH4C1, 7,5 мМ КНСОз, 100 мкМ EDTA) в течение 3 мин и повторно центрифугировали. Гемолизированный супернатант удаляли отсасыванием, а клеточный осадок ресуспендировали в среде DMEM (ПанЭко, Россия), содержащей 10% телячью эмбриональную сыворотку («HyClone gold», USA), инсулин 0,4 мкМ и 0,25 мг/л гентамицина. Выделенные клетки, представляли собой первичную культуру, преимущественно мононуклсарных клеток КМ, которые затем высевали в культуральные флаконы и помещали в С02-инкубатор с 5% концентрацией С02 и 95% содержанием атмосферного воздуха с повышенной влажностью. Через 2 суток после выделения первичной культуры неприкрепившуюся клеточную взвесь удаляли, а оставшиеся клетки с фибробластоподобной морфологией продолжали культивировать. Замену культуральной среды на свежую, осуществляли каждые 3-4 суток. После образования субконфлюэнтного монослоя клетки однократно отмывали раствором Версена, затем снимали раствором

Версена с 0,25% трипсина, рссуспендировали в ростовой среде и разливали в новую культуральную посуду. Для эксперимента использовали клетки 1 и 2-го пассажа.

Клеточный материал, представляющий собой прикрепившиеся к пластику распластанные фибробластоподобные клетки (мезенхимальные стромальные клетки), считался пригодным для трансплантации, так как сохранял популяционную активность и не содержал погибшие клетки. Стромальное происхождение ММСК КМ было подтверждено иммуногистохимически в культуре путем выявления в них коллагена I типа с помощью кроличьих моноклональных АТ («Имтэк»).

Методы исследования

В работе применен комплекс клинических, биохимических, морфологических и иммунофермснтных методов исследования. Общий объем специализированных исследований, выполненных в динамике при проведении работы, представлен в таблице 1.

Таблица 1. Количество выполненных специализированных исследований

Методы исследования (исследования проводили на 1, 7,14,21,28,60,90 сутки) Кол-во.

Морфологические исследования Гистологическое исследование печени 95

Морфометрическое исследование печени:

1. Подсчет двуядерных гепатоцитов 95

2. Определение удельной площади соединительной ткани 95

Иммуногистохимические исследования:

1. С использованием АТ к десмину 40

2. С использованием АТ к РСЫА 40

3. С использованием АТ к альфа-фетопротеину 40

4. С использованием АТ к а-ГМА 40

5. С использованием АТ к каспазе-3 40

6. С использованием АТ к каспазе-9 40

7. С использованием АТ к Вс1-2 40

Биохимический анализ Определение уровней ферментов в крови: АлАТ, АсАТ, ГТТ, билирубина, щелочной фосфатазы 95

Пммуноферментный анализ Определение про- и противовоспалительных цитокинов: ФНО-О..ИНФ-7. ИЛ-10, ИЛ-4 40 40

Итого: 740

Биохимические методы исследования. Для изучения содержания АлАТ, АсАТ, билирубина, ГГТ и щелочной фосфатазы у крыс под эфирным наркозом надсекали кончик хвоста, пипеткой забирали 28-32 мкл крови, наносили на специальные тест-полоски Reflotron™, которые сразу же устанавливали в биохимический анализатор Reflotron™ («Roche», Швейцария).

Гистологические и гистохимические методы исследования. Изучение структурных нарушений в паренхиме печени проводили морфологическими методами. Аутопсию проводили на 3, 7, 14, 21,28, 60 и 90 сутки после окончания курса затравки; после ревизии брюшной полости извлекали фрагмент средней доли печени. Ткань печени разрезали на кусочки размерами 3x4x5 мм, помещали в раствор Буэна (через 24 часа раствор Буэна меняли на 70% этанол) для фиксации. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, а также по Маллори для выявления соединительной ткани.

Морфометрическое исследование ткани печени. Морфометрический анализ срезов фрагмента средней доли печени был произведен тремя исследователями с помощью морфометрической программы ImageScopeM (ООО «Системы для микроскопии и анализа», Россия). Исследуемые изображения получены с использованием микроскопа LeicaDMlООО и камеры Leica

LTDCH9435 DFC 295 (LeicaCamera AG, Германия).

Данным методом определяли: наличие цирроза (подсчет количества ложных долек); долю соединительной ткани (в процентном соотношении к общей площади среза П); выраженность жировой дистрофии (оценивали 10 полей зрения среза каждого образца); внутридольковый фиброз (оценивали 10 полей зрения среза каждого образца); количество двуядерных гепатоцитов (на 10 полей зрения среза при увеличении *400).

Иммуногистохимический метод исследования. Иммуногистохимическое исследование проводили стрептавидин-биотиновым методом. Метод

иммуногистохимического окрашивания основан на выявлении какого-либо

антигена на срезе ткани с помощью специфически с ним связывающихся меченых антител [Нолак Дж., 1987], то есть на исследуемом срезе фактически происходит реакция связывания антигена и антитела. В настоящее время визуализация продукта реакции чаще всего осуществляется с помощью ферментной метки (пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза), которая “пришита” (конъюгирована) к молекуле антитела. При выявлении активности фермента в субстрат добавляют хромоген, который в процессе реакции фермент/субстрат образует цветной нерастворимый осадок, выпадающий в местах локализации антигена. В настоящей работе были использованы коммерческие моноклональные антитела фирм DAKO и Abeam: к десмину - маркеру промежуточных филаментов звездчатых (перисинусоидальных) клеток; а-ГМА - маркеру миофибробластов и миофибробластоидной дифференцировки звездчатых клеток печени; к каспазам (Caspase 3 и Caspase 9) - белкам протеолитической системы, являющихся центральным звеном в механизме апоптоза (Caspase 9 - одна из каспаз обратимого апоптоза, необходимая для узнавания и передачи сигнала клеточной гибели; Caspase 3 - вовлекается в процесс необратимого расщепления структурных компонентов жизнеобеспечения клетки, участвует в регуляции межгенных взаимодействий, восстановлении ДНК и ядерной мембраны) [Guicciardi, 2005]; к Вс12 - антиапоптотическому маркеру (Вс12 - один из основных регуляторов апоптоза, может останавливать апоптоз, опосредуемый белком р53 или иными механизмами. Вс12 белок локализован в митохондриях, эндоплазматическом ретикулуме и перинуклеарпой мембране. Он подавляет естественно происходящую клеточную гибель предположительно путем регуляции транспорта кальция в клетке); к альфа-фетопротеину (АФП) - маркеру пролиферирующих гепатоцитов, который выявляется во взрослой печени во время регенерации [Abelev, 1963]; к PCNA - ядерному антигену пролиферирующих клеток (Proliferating Cell Nuclear Antigen). Этот антиген является кофактором ДНК-полимеразы и может быть обнаружен в клетках, находящихся в S-фазе клеточного цикла и некоторое время после ее окончания) [Lee, Hurwitz, 1990].

Определение жизнеспособности культивированных ММСК КМ проводили перед транснлантацией по окраске трипановым синим, которая составляла 95±2%.

Исследование цитокинового статуса в сыворотке крови включало определение содержания про- и противовоспалительных цитокинов (ФНО-а, ИНФ-у, ИЛ-4, ИЛ-10) в сыворотке крови животных после моделирования ТФП без и на фоне применения ММСК. Содержание цитокинов определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест-систем «Протеиновый контур» (С-Петербург), «Вектор-Бест» (Новосибирск), результаты фиксировали на анализаторе ChemWell® («Awareness Technology», США).

Методы статистической обработки. Статистическую обработку результатов производили на персональном компьютере с использованием специального статистического пакета Biostat; достоверность различий между сравниваемыми группами оценивали по критерию t-Стьюдента с учетом поправки Бонферонни. В таблицах приведены средние значения величин, где ± стандартное отклонение (SD). Различия считали достоверными при р<0,05 (Статистический пакет рекомендованный ВОЗ Epilnfo 5.0).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Было установлено, что в первой серии опытов с моделированием токсического фиброзирующего повреждения печени (ТФП) после кратковременного и не сильно выраженного усиления процессов фиброзирования в печени (до 7 суток) с 14-х суток наступал период стабилизации в образовании соединительной ткани (рис. 2). Однако, начиная с 28 суток, процессы фиброзирования печени начинали неуклонно прогрессировать. Во второй серии опытов с моделированием ТФП и однократным введением ММСК КМ (на 3 сутки) на 14 сутки, по сравнению с первой контрольной серией, наблюдали более высокий уровень развития фиброза в печени при морфометрическом исследовании удельной площади сосдинительно-тканных структур в этом органе; в дальнейшем происходило небольшое снижение этого показателя, но на 60-90

сутки имело место вновь усиление фиброза, которое, однако, не достигало контрольных значений. В третьей серии опытов с двукратным введением ММСК КМ на ранних сроках развития ТФП (3 и 10 сутки) наблюдалась более высокая степень нарастания доли соединительной ткани в печени к 14 суткам (р<0,05), затем уровень фиброзирования печени начинал неуклонно снижаться на каждом последующем сроке наблюдения.

В четвертой серии опытов с двукратным введением ММСК КМ на стадии развернутого фиброзирования печени (30 и 37 сутки после моделирования ТФП) динамика процессов фиброзирования в печени практически не отличалась от контрольной (первой) серии опытов. Это дало нам основание считать, что через месяц после моделирования ТФП тканевые резервы адаптации, обеспечивающие предотвращение развития соединительной ткани, практически израсходованы, и перестройка метаболизма в печени с помощью той же дозы клеток, что и в третьей серии опытов, становится невозможной.

гистологических срезах печени животных с моделью ТФП без и с последующей трансплантацией ММСК КМ на ранних сроках фиброзирования печени. Среднее значение показателя у интактных животных - 1,4±0,2%. * р<0,05 по сравнению с контролем на том же сроке наблюдения

Динамическое исследование экспрессии десмина - маркера ранней активации звездчатых клеток показало, что при ТФП без применения ММСК КМ (первая серия) отмечается повышенная экспрессия этого маркера в течение первого месяца (к 21 суткам), которая становилась отчетливо выраженной к 60 суткам наблюдения. Однако, однократное введение ММСК КМ при ТФП (вторая серия) способствовало отчетливому увеличению экспрессию десмина уже на 14 сутки, но затем к 60 суткам развития ТФП экспрессия этого маркера снижалась (рис. 3), что указывало на снижение в печени активированных звездчатых клеток. Двукратное введение ММСК при ТФП (третья серия опытов) приводило к особенно позитивному изменению динамики второго маркера активации звездчатых клеток - а-ГМА (рис. 4). Было установлено, что у животных с ТФП без применения ММСК КМ происходило сначала снижение а-ГМА (до 21 суток), которое сменялось его повышением на отдаленных сроках и такая динамика коррелировала с усилением процессов фиброзирования печени, являющихся финалом развития ТФП. При двукратном введении ММСК КМ происходило более резкое, чем в контроле, повышение этого показателя (к 7 суткам), который при дальнейшем динамическом исследовании начинал неуклонно снижаться, коррелируя со снижением фиброзирования печени в этой серии опытов (рис. 2).

Эти данные позволили нам прийти к заключению, что формирование фибролитического действия ММСК КМ при ТФП имеет двух фазную динамику, причем развитие фибролитического действия этих клеток проходит через фазу усиления процессов фиброзирования в печени и это следует учитывать при проведении клеточной терапии.

Динамическое изучение экспрессии маркера необратимого апоптоза (каспазы-3) в первой контрольной серии - позволило установить начало активации каспазы-3 на 7 сутки, усиление к 14 суткам и достижение максимума активации на 3 и 4 неделе после затравки. Применение ММСК КМ (во второй и третьей серии опытов) способствовало более ранней и выраженной экспрессии каспазы-3 на 7 сутки по сравнению с контрольной серией, причем при двукратном

60 суток

| Я контроль |» СС14>2,5 млн ММСК

18 сам мл» ммсн

Рис. 3. Динамика изменения количества звездчатых клеток печени, экспрессирующих десмин, при ТФП без и на фоне раннего введения ММСК КМ

Рис. 4. Динамика изменения количества звездчатых клеток печени, экспрессирующих а-ГМА, при ТФП без и на фоне раннего введения ММСК КМ

введении клеток экспрессия каспазы-3 была особенно выражена на 14 сутки и превосходила значения экспрессии этого показателя по сравнению с контролем и однократным применением ММСК (рис. 5). Начиная с 21 суток экспрессия каспазы-3 в обоих группах с применением ММСК начинала снижаться и во все сроки наблюдения была ниже, чем в контроле. Особенно выраженное снижение экспрессии каспазы-3 в печени отмечалось на 60 сутки после в опытах с ТФП и двукратным введением ММСК.

При исследовании экспрессии маркера обратимого клеточного апоптоза -каспазы-9 мы отметили большую выраженность экспрессии этого маркера в опытах с введением ММСК, но особенно выраженная экспрессия этого маркера была отмечена нами на всех сроках при двукратном введении ММСК (рис. 6). Мы отметили также, что во всех сериях опытов экспрессия маркера необратимого апоптоза - каспазы-3 в течение первых 3-х недель была выше, чем экспрессия каспазы-9, но на 28 сутки и 60 сутки в опытах с двукратным введением ММСК -экспрессия каспазы-9 - маркера обратимого апоптоза (см. рис. 6) начинала преобладать. По нашему мнению, этот факт свидетельствовал о сохраняющейся и поддерживаемой в печени с помощью ММСК адаптивной перестройки метаболизма, за счет которой происходит перепрограммирование процессов регенерации в печени с фиброзирующей на восстановительную. Динамика экспрессии антиапоптотичсского маркера - Вс1-2 показывает, что более выраженная адаптивная перестройка и более раннее завершение перепрограммирования процессов регенерации в печени с помощью ММСК, очевидно, связано с более ранней, чем в контроле, экспрессией антиапоптотических генов, и это должно было бы, по нашему мнению, коррелировать с ранней активацией процессов клеточной пролиферации.

0 7 суток 14 суток 21 сутки 28 суток 60 суток

■ контроль 0 2,75 3 3 2

■ СС14+2,5 млн ММСК 2 2,75 2,25 1,5 1,5

й С&4+5 млн ММСК 2 3 2,75 1,6 0

Рис. 5. Динамика количества клеток печени, экспрессирующих каспазу-3, при моделировании ТФГТ без и на фоне раннего введения ММСК КМ

■ контроль

■ Са.4+2,5 млн М СС14+5 МЛН ММСК

Рис. б. Динамика количества клеток печени, экспрессирующих каспазу-9, при моделировании ТФП без и на фоне раннего введения ММСК КМ

Действительно, в течение первых 3-х недель после моделирования ТФП и применения ММСК (вторая и третья серии опытов) нами выявлено усиление экспрессии маркера пролиферации гепатоцитов альфа-фетопротеина (АФП),

особенно выраженное в серии с двукратным введением клеток. Мы обратили также внимание на тот факт, что под влиянием ММСК КМ процесс активации пролиферации гепатоцитов ускоряется (более выраженная экспрессия АФП), но уже к концу 1-го месяца этот процесс угнетается.

Полученные нами результаты позволяют заключить, что перепрограммирование процессов регенерации в токсически поврежденной печени с фиброзирующего типа на репаративный тип регенерации с помощью ММСК является следствием нормализации взаимодействия паренхиматозных и стромальных структур печени за счет ингибирования фиброзирующей активности звездчатых клеток и ранней индукции пролиферации гепатоцитов в условиях реализации сохранившихся резервов адаптации в ткани печени.

ВЫВОДЫ

1. Модель токсического фиброзирующего повреждения печени у крыс, созданная путем оптимизации схемы введения ССЦ пригодна для изучения влияния мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток на процессы фиброгенеза в печени, т.к. воспроизводит гистологические признаки усиленного разрастания соединительной ткани в печени.

2. Динамика морфологических нарушений в печени при фиброзирующем повреждении характеризуется двухэтапным накоплением соединительной ткани (незначительное увеличение-стабилизация и неуклонное разрастание соединительной ткани), а также увеличением количества активированных звездчатых клеток печени и пролиферации преимущественно непаренхиматозных клеток (более высокая экспрессия РСИА, чем экспрессия АФП).

3. Культивированные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки аллогенного костного мозга обладают способностью корригировать процессы фиброзирования в токсически поврежденной печени, однако

выраженность корригирующего антифибротического эффекта этих клеток находится в прямой зависимости от дозы (кратности введения клеток), а также от срока их применения (степени тяжести прсдсуществующих фиброзирующих изменений в печени).

4. Однократная трансплантация аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга здоровых доноров на начальном этапе развития хронического фиброзирующего повреждения печени (на 3 сутки) снижает интенсивность развития фиброзной ткани в поврежденной печени по сравнению с контролем (5,9% против 8,1%, т.е. в 1,4 раза), но не устраняет этот процесс. Удвоение дозы клеток за счет двукратной трансплантации аллогенных мезенхимальных стромальных клеток на начальном этапе развития хронического фиброзирующего повреждения печени (на 3 и 10 сутки) ведет к более выраженному регрессу фиброзной ткани в поврежденной печени как по сравнению с контролем (1,7% против 8,1%, т.е. в 4,7 раза), так и с однократным введением ММСК (1,7% против 5,9%, т.е. в 3,4 раза).

5. Двукратная отсроченная трансплантация мультипотентпых мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, на стадии развернутого фиброзирующего повреждения печени (на 30 и 37 сутки), в тех же дозах, которые использовались на ранних сроках его коррекции, не сопровождается снижением интенсивности развития фиброзной ткани в хронически поврежденной печени.

6. Развитие антифибротического эффекта ММСК КМ, примененных в эффективных дозах (двукратное применение) на начальном этапе развития фиброзирующего повреждения печени, характеризуется двухфазной динамикой: первоначальным усилением процессов фиброзирования П, которое затем сменяется резорбцией соединительной ткани. Двухфазная динамика развития фибролитического эффекта ММСК сопровождается первоначальным повышением экспрессии маркеров активации звездчатых

клеток - десмииа и а-ГМА, маркеров апоптоза - каспазы-3, клеточной пролиферации - РСЫА и пролиферации гепатоцитов - АПФ, которое затем сменяется выраженным снижением экспрессии этих показателей.

7. Развитие антифибротического эффекта ММСК КМ, примененных в эффективных доза (двукратное применение) на начальном этапе развития фиброзирующего повреждения печени происходит за счет сохранившихся резервов адаптации структурных элементов печеночной ткани и регуляторных систем организма (более выраженное восстановление баланса про- и противовоспалительных цитокинов в крови по сравнению с контролем и с однократным введением ММСК КМ).

Практические рекомендации

1. Модель токсического фиброзирующего повреждения печени может быть использована в качестве модели устойчивого ТФП для отработки новых способов лечения и профилактики фиброзирования печени, в том числе мегодами клеточной терапии.

2. Для проведения терапии клегками костного мозга могут быть использованы методики выделения и культивирования клеток костного мозга, отработанные в настоящем исследовании.

3. Для эффективной коррекции патогенетических нарушений, возникающих при фиброзирующем повреждении печени, трансплантацию культивированных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга необходимо проводить в достаточной дозе (терапевтической) на начальных стадиях развития заболевания, когда сохранены адаптационные резервы регуляции восстановительных процессов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Люпдуп А.В., Крашенинников М.Е., Онищенко Н.А. Применение аллогснных мезенхимальных клеток костного мозга в лечении хронических заболеваний печени (экспериментальная работа) //Сборник материалов Всеросийской конференции «Клеточные исследования и технологии в современной биомедицине». Тула 2009.- С.6-8.

2. Shagidulin М., Krasheninnikov М., Lyundup A., Iljinsky I., Mogeiko N., PetrovaN., Sevastjanov V., Onishchenko N., Gautier S. Transplantation of raultipotent mesenchymal stromal cells seeded on biodegradable heterogenous carrier for stimulation of reparative processes in damaged organs. //Mesenchymal stem cells in Solid Organ Transplantation. MISOT 2nd Expert Meeting.-2010.-P.23.

3. Lyundup A.V., Krasheninnikov M.E., Shagidulin M.Y., Onischcnko N.A. Application of mesenchymal bone marrow stem cells to liver regenerative medicine. //Mesenchymal stem cells in Solid Organ Transplantation. MISOT 2nd Expert Meeting.-2010.-P.24.

4. Люндуп A.B., Оннщенко H.A., Крашенинников M.E., Шагидулин М.Ю. О роли синусоидальных клеток печени и клеток костного мозга в обеспечении регенераторной стратегии здоровой и поврежденной печени. (Аналитический обзор) /'/Вестник трансплантологии и искусственных органов.-2010,- №1.-Т.ХП,- с.78-85.

5. Люндуп А.В., Онищенко Н.А., Шагидулин М.Ю., Крашенинников М.Е. Стволовые/прогениторные клетки печени и костного мозга как регуляторы восстановительной регенерации поврежденной печени //Вестник трансплантологии и искусственных органов,-2010.-№2.-Т.ХИ.- с. 100-107.

6. Lazebnik L, Onishchenko N.A., Lyundup A.V., Trubitsyna I.E., Knyazev O.V., Deev R.V., Krasheninnikov M.E., Shagidulin M.Y. Regeneration of toxic damaged liver in rats after introduction of mesenchymal stromal bone marrow cells. //6th Central European gastroenterology meeting. Book of Abstracts. -2010. -P36.

7. Shagidulin М., Onishchenko N., Krasheninnikov М., Iljinsky I., Mogeiko N.. Lyundup A., Nemets E., Sevastjanov V., Gautier S. Transplantation liver cells and multipotent mesenchymal stromal cells for correction and treatment of hepatic failure //Book of Abstracts ESSR. -2010.- P. 149150.

8. Shagidulin М., Onishchenko N., Krasheninnikov М., Iljinsky I., Mogeiko R, Lyundup A., Nemets E., Sevastjanov V., Gautier S. Transplantation liver cells and multipotent mesenchymal stromal cells for correction and treatment of hepatic failure//British J. of Surgery. -2010. -Vol.94(S4). -P.37-38.

9. Shagidulin М., Onishchenko N., Krasheninnikov М., Iljinsky I., Mogeiko N., Lyundup A., Shemerko N.. Andriyanova A., Nemets E., Sevastjanov V., Gautier S. Transplantation liver cells and

multipotent mesenchymal stromal cells for correction and treatment of hepatic failure //Medimond. International Proceedings. -2010. - P.83-86.

10. Люндуп Л.В., Деев P.B., Трубицына И.Е., Князев О.В., Крашенинников М.Е., Шагидулин М.Ю., Онищенко Н.А. Роль мезенхимальных стромальных клеток костного мозга в регенерации токсически поврежденной печени крыс. //Вестник трансплантологии и искусственных органов,-2010,- Приложение.-T.XII.- с.291-292.

11.Lyundup A.V., Shagidulin M.Y., Krasheninnikov М.Е., Onischenko N.A. The using of mesenchymal bone marrow stem cells for recovery liver regeneration. //APASTB 2010 Congress. -Book of Abstracts 13th International Conference of Asia Pacific Association of Surgical Tissue Banks-2010, -p.7-8.

12. Shagidulin М., Onishchenko N., Krasheninnikov М., Iljinsky 1., Mogeiko N., Lundup A., Nemets E., Sevastjanov V., Gautier S. Long-term surviving mesenchymal bone marrow stem cells as an active part of intracorporeal support units //Tissue Engineering: Part A. 2011.-Vol. 17 (N 3,4).-p.544-545.

13. Люндуп А.В., Деев P.B., Трубицина И.Е., Шагидулин М.Ю., Онищенко Н.А. Использование мезенхимальных клеток костного мозга для коррекции структуры и функции печени при хроническом гепатите //Сборник материалов XVIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство».-2011.-с.459.

14. Lyundup A., Shagidulin М., Trubitsyna I., Deev R., Onishchenko N., Krasheninnikov M. Using bone marrow mesenchymal stem cells for treatment of toxic damaged liver in rats //Mesenchymal stem cells in Solid Organ Transplantation. MISOT 3nd Expert Meeting.-2011.-p.28.

15. Онищенко H.A., Люндуп A.B., Шагидулин М.Ю., Крашенинников М.Е. Синусоидальные клетки печени и клетки костного мозга как компоненты единой функциональной системы регуляции восстановительного морфогенеза в здоровой и поврежденной печени. //Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. -2011. -№2.-T.VI. -с.73-87.

Список основных сокращений

ССЦ- четыреххлористый углерод PCNA - proliferating cell nuclear antigen а-ГМА - гладкомышечный альфа-актин АФП - альфа-фетопротеин ККМ - клетки костного мозга КМ - костный мозг

ММСК - мультипотентные мезенхимальные сгромальные клетки ТФП - токсическое фиброзируюшее повреждение печени ХПН - хроническая печеночная недостаточность

Заказ № 6535 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru