Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Роль эндогенных биорегуляторов (интерлейкина-1 и мелатонина) в регуляции функции костного мозга как источника стволовых кроветворных клеток

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ

На правах рукописи

ИСАЕВА Елена Николаевна

РОЛЬ ЭНДОГЕННЫХ БИОРЕГУЛЯТОРОВ (интерлейкина —I и мелатонина) В РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИИ КОСТНОГО МОЗГА КАК ИСТОЧНИКА СТВОЛОВЫХ КРОВЕТВОРНЫХ КЛЕТОК

14.00.16 — патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1993

Работа выполнена в Отделе общей патологии и патологической физиологии НИИ экспериментальной медицины РАМН (директор— академик Б. И. Ткаченко).

Научный руководитель

член-корреспондент РАМН, профессор Е. А. Корнева

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Н. Н. Петрищев доктор биологических наук С. А. Кетлинский

Ведущая организация: Военно-медицинская академия им. С. М. Кирова, г. Санкт-Петербург.

Защита состоится « » 1993 г. в « . » часов на заседании специализированного совета Д.001.23.03 при Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН (197376, С.-Петербург, ул. акад. Павлова, 12).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИ экспериментальной медицины РАМН.

Автореферат разослан « £4-. » . . 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Е. С. Петрова

Актуальность проблемы. Работами последних лет показана важная роль эндогенных биорегуляторов различного происхождения в координации реакций нейроэндокринной и иммунной систем (Ве-sedovsky et al. ,1966,1987; Teschemacher et al. ,1989; Fraschinl et al. ,1990; Stefano et al. ,1991).Основой этого взаимодействия является наличие обших рецепторов на нервных и иммунокомпе-тентных клетках и способность этих клеток продуцировать сходные лиганды (Coffey, Hadden.1985; Carr,1988; Blalock,1988).

Актуальность изучения механизмов взаимодействия нервной и иммунной систем заключается прежде всего в возможности использования естественно существующих в организме каналов регуляции для коррекции нарушенных защитных функций при патологии. Исходный потенциал и функционирование систем иммуно- и гемопо-эза, их адаптивные возможности зависят от способности костного мозга продуцировать и поставлять стволовые кроветворные клетки (Wu et al. ,1968), оценить которую in vivo можно методом коло-ниеобразования в селезенке облученных мышей (Till, MoCulloch,1961).

Известно, что клетки кроветворного микроокружения вырабатывают регуляторные пептиды (ШЬ1, миелопептиды, опиоиды и другие)(Fibbe et al. ,1988; Zucall et al. ,1987; Broudy et al., 1987; Михайлова с соавт. 1989). Однако это не исключает возможности их системной регуляции цитокииами, обладающими имуно- и нейротропными эффектами. Экспериментально показана возможность дистантных влияний на СКК гуморальных факторов костного мозга и тимуса (Мороз с соавт. ,1975; Безин с соавт.,1977; Михайлова,1987; Попов с соавт. ,1988), действие которых может опосредоваться клеточными элементами кроветворного микроокруяения и выделяемыми ими факторами. Примером такого механизма регуляции является обнаружение связи гормонального и Т-лимфоцитарного контроля функциональной активности СКК (Манько,1983; Безин, 1987).

Вопрос о роли ЦНС, в частности гипоталамуса, в регуляции функции костного мозга как источника СКК изучен недостаточно. В единичных работах показано влияние определённых структур ЦНС на процесс колониеобрззования (Hall, Goldstein, 1980; Kuci, Becker, 1987).

Повреждение заднего гипоталамического поля приводит к значительному угнетению эндогенного колониеобразования у мышей

через 8 суток, после операции (Когпеуа, 1езгикоу,1985; Лесников с соавт. ,1989), однако роль глюкокортикоидных.-. гормонов в данной модели не является определяющей (Аджиева,1988). Предполагается, что в данной ситуации нарушается работа стресс-лимитирующих систем, к которым прежде всго относятся опиоидные пептиды, а также другие биорегуляторы как нейрогенного (мелато-иин), так и лейкоцитарного происхождения (интерлейкин-1), оказывающие аналогичные эффекты.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в изучении влияния эндогенных биорегуляторов нейрогенного и лейкоцитарного происхождения на функцию костного мозга как источника стволовых кроветворных клеток и оценке возможности применения этих биорегуляторов для коррекции исследуемой функции при повреждении гипоталамических структур.

Основные задачи:

.1. Исследовать влияние мелатонина (Иг) и интерлейки-на-1(ИЛ-1) на процесс миграции КОЕс из костного мозга мышей.

2. Оценить действие ИЛ-1 и Мг на колониеобразующую активность КОЕс при краткосрочной инкубации этих биорегуляторов с клетками костного мозга

3. Исследовать влияние локальных повреждений структур гипоталамуса на селезеночное колониеобраэование и типы КОЕс.

4. Оценить возможность применения ИЛ-1 и Мг для коррекции сниженного колониеобразования при билатеральном электролитическом повреждении гипоталамических структур.

Научная новизна Впервые показана возможность фармакологической коррекции способности костного мозга продуцировать и поставлять стволовые кроветворные клетки при использовании естественных биорегуляторов: мелатонина и интерлейкина-1 у животных с повреждениями гипоталамических структур.

Обнаружено, что в отличие от мелатонина, нормализующий эффект ИЛ-1 зависит от локализации гипоталамических повреждений. У животных с повреждениями АНД и однократным введением ИЛ-1 исследуемая функция костного мозга не восстанавливается, а курсовое введение ИЛ-1 этим животным усугубляет ее нарушение. Полученные данные указывает на значимость этой зоны мозга для реализации гемспоэзстимулирующего действия >'Л-1.

Установлено, что в исследуемой модели снижение кслониеоб-разования через 8 суток после повреждения заднего гипоталамл-

ческого поля происходит Сез существенных изменений в направлении дифференцировки КОЕс. При повреждении передней гипоталами-ческой области в тесте экзогенного колониеобразованил выявлена тенденция к сдвигу дифференцировки в эритроидном направлении, за счет снижения абсолютного числа Г-КОЕс.

Показано, что усиливающий миграцию эффект мелатонина полностью блокируется предварительным введением налтрексана.

Выявлено доаоаависимое влияние инкубации клеток костного мозга с нативным препаратом ИЛ-1 кролика на колониеобразуюшую активность и направление дифференцировки КОЕс.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные раскрывают ранее неизвестные механизмы нейроиммуномоду-ляции, важные для обеспечения нормального функционирования иммунной системы.

Показано, что корригирующие эффекты влияния гипоталамуса на способность костного мозга продуцировать и поставлять стволовые кроветворные клетки могут быть изменены в результате применения эндогенных биорегуляторов (ИЛ-1 и Мг).

Полученные данные о механизмах действия эндогенных биорегуляторов лейкоцитарного и нейрогенного происхождения составляют основу для разработки новых методов лечения нарушений механизмов резистентности организма.

Основное положение выносимое на защиту. Билатеральное электролитическое повреждение заднего гипоталамического поля приводит к снижению содержания КОЕс у мышей через 8 суток после операции без существенных изменений в направлении дифференцировки стволовых кроветворных клеток.

Эндогенные биорегуляторы нейрогенного и лейкоцитарного происхождения (ИЛ-1 и Мг) обладают способностью восстанавливать нарушенную функцию костного мозга у мышей с повреждением заднего гипоталамического поля.

Апробация работы. Апробация диссертации состоялась на заседании научной конференции отдела общей патологии и патологической физиологии Научно-исследовательского ордена Трудового Красного знамени института экспериментальной медицины РАМН (г. С. Пертербург) 29 июня 1992 г.

Основные положения диссертации докладывались на научных конференциях отдела в 1989,1990, 1991гг, на медцународной конференции, посвященной 100-летию со дня родцения С. В. Аничкова

"Нейрофармакология на рубеже двух тысячелетий'Ч г. С. -Петербург, 1992).

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на №£> страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (2 главы), материалов и методов, 3-х глав собственных исследований, общего заключения и выводов. В диссертации 12 таблиц и 20 рисунков. Прилагаемый список литературы содержит ¿¿¿С наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Исследование проведено на 2500 мышах - самцах ( СВА х С57В16 ) F1, весом 20-26 г, полученных из питомника "Рапполо-во". Животных содержали в условиях вивария на стандартной диете при искуственном освещении с 12-ти часовым циклом день/ночь (8.00 - 20.00) и внешней температуре 19-23°С.

Локальные повреждения структур гипоталамуса проводили под наркозом (гексенал 200 мг/кг, в/б) с помощью нихромового электрода диаметром 0,15 км во второпластовой изоляции за исключением кончика длинной О,4 мм, проводили электролитические (анодный ток 0,4 мА, 12 с) повреждения структур головного мозга мышей по стереотаксическим координатам (Лесников, Пветкова, 1985): передняя гипоталамическая область (AHA) - A0,6L0,4H5,1; заднее гипоталамическое поле(АНР) - PI,6L0,4М5,6; "ложноопери-рованные" животные - билатеральные электролитические повреждения коры головного мозга - АО,6 или PI, 6L0,4Н0,5.

В работе использовали два варианта эндогенного клонирования: однократного облучения (9,0Гр) с зашитой участка костного мозга (Петров, Хаитов,1972) или двукратного облучения (9,0 Гр с экраном конечности, второе - 9,0 Гр с экраном тела) (Hanks, 1964), что в большей степени отражает процесс миграции КОЕс из костного мозга. В модели экзогенного клонирования (Till, MbCuloche,1961), позволяющей оценить главным образом количество и пролиферативную активность КОЕс, мышей-реципиентов облучали в летальной дозе (9,2Гр) и вводили им внутривенно по 5x10* клеток костного мозга от интактных и оперированных мышей-доноров в объёме 0,5мл.

В качестве источника рентгеновского излучения использова-

ли аппарат РУ1М7: напряжение на трубке - 200кВ, сила тока-15 МА, фильтры: Al-1,0; Cu-0,5 мм, мощность дозы 0,47Гр/мин.

При изучении содержания КОЕс в ксстном мозге получали суспензию клеток костного мозга (ККМ) от мышей-доноров. Для этого бедренные кости выделяли в асептических условиях и промывали костный канал средой 199 или раствором Хенкса бесцветного с пенициллином (2000. ОООЕД/л) в объёме 0,5мл. Число жизнеспособных клеток костного мозга определяли с использованием 0,1% трипанового синего в камере Горяева.

Краткосрочное инкубирование клеток костного мозга от ин-тактных мышей, выделенных как описано ранее, проводили в пробирках, обработанных силиконом (Sigma,USA) в растворе Хенкса бесцветного в объеме 2мл (10® ККМ/мл) при температуре 37° С в течение 2 часов, затем осаждали центрифугированием (1500 об/ мин, 7 мин), ресуспендировали и вводили в/в по 5x10ц жизнеспособных клеток в объеме 0,5мл на мышь летально облученным реципиентам (9,2Гр).

Во всех случаях число колоний на селезенке подсчитывали через 8 • суток после облучения, селезенки фиксировали в жидкости Еуэна. Морфологическое определение типов селезеночных колоний проводили по методу (Basford,Goodman,1974) при увеличении Х100-200. На группу исследовали не менее 100 колоний. Учитывали следующие типы колоний: эритроидные (Э), гранулоци-тарные (Г), мегакариоцитарные (Мг), недифференцированные (НД) и смешанные (СМ). Для оценки направления диференцировки использовали коэффициент отношения числа эритроидных колоний к гранулоцитарным (Петров и др. 1979).

Во всех случаях изучения корригирующего действия Мг и ИЛ-1 клетки костного мозга от оперированных мышей-доноров клонировали через 8 суток после повреждения гипоталамуса, то есть в период максимального снижения исследуемой функции костного мозга (lesnikov et al. ,1909). Взвесь костномозговых клеток получали от 3-5 оперированных мышей-доноров, как описано выше, и вводили её внутривенно сингенным летально облученным (9,2Гр) реципиентам но 5хЮ4 клеток на мышь.

В работе были использованы эндогенные биорегуляторы ней-рогенного и лейкоцитарного происхождения: мелатонин( Мг) и ин-терлРйкш1-1(ИЛ-1). Их действие на функциональные показатели K0F': пцвншзаи! в тр^х экспериментальных моделях:

1) при непосредственном контакте Мг и ИЛ-1 с клеткам» костного мозга (действие при краткосрочной инкубации);

2) при введении этих веществ неравномерно облученным мышам с интактным гипоталамусом (влияние на миграцию КОЕс из костного мозга);

3) при введении мелатонина и ИЛ-1 мышам с угнетением исследуемой костномозговой функции (способность Ш и ИЛ-1 к коррекции сниженного содержания КОЕс в костном мозге у мышей с повреждением гипоталамлческих структур).

МелатонинСЫ-ацетил-б-метокситриптамин, Швейцария)(5мк/мл х106 клеток костного мозга или 5-50 мкг/мышь в/б), антагонист опиоидных пептидов налтрексон (USA) в дозе 250 мкг/мышь в/б.

НативныЯ препарат ИЛ-1 кролика (нИЛ-1к)(НИИЭМ РАМН) и ре-комбинантный Ш-lß человека (рИЛ-l^ ч), любевно предоставленный проф. D. Borascchi (Италия). Контролем служили инактивированные прогреванием (90°С, 30 мин) препараты ИЛ-1.

В работе использовали стеклянную посуду, обработанную сухим жаром (180°С, 2ч) или апирогенную пластмассовую посуду одноразового использования и одноразовые шприцы.

Результаты обработаны статистически с использованием t-критерия Стыодеята

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Влияние мелатонина на колониеобразугацую и миграционную активности костномозговых КОЕс.

Кз модели эндогенного клонирования выявлено, что предварительная краткосрочная инкубация клеток костного мозга с ме-латонином (5мкг/10вККМЛ<л) не вызывает существенных изменений колониеобрааующей активности КОЕс (41,2+2,8 по сравнению с действием растворителя 46,6+3,2).

Полученные данные хорошо согласуются с данными литературы об отсутствии иммуностимулирующих свойств мелатонина при обработке этим нейрогормоном культуры иммунокомпетентных клеток (Maestroni et al., 1986; 1990).

Лля оиенки влияния м?латонина на тграшип КОЕс костного мозга применяли метод эндогенного клонирования у неравномерно облуч»и»шх мьдай с однократным введением мелатонина после пер-

вого облучения. Показано, что этот нейрогормон в дозе 5 мкг/мышь не изменяет, а в дозах 25 и 50 мкг/мышь значительно усиливает эндогенное колониеоОразование у этих животных, максимальный эффект отмечен при дозе 25 мкг/мышь (примерно 50Х увеличение числа колоний по сравнению с введением растворителя). Стимулирующее действие мелатонина на исследуемую костномозговую функцию блокируется предварительным введением налт-рексона Ш-видимому, мелатонин в определенных дозах способен усиливать миграцию КОЕс из костного мозга, тем самым способствуя поступлению клеток-предшественников в иммунную систему. Отмена стимулирующего действия мелатонина налтрексо-ном свидетельствует о том, что экзогенно введенный мелатонин, влияет на поступление клеток- предшественников в иммунную систему путем активации опиоидной системы. Такой же механизм действия экзогенного мелатонина показан на гуморальный и клеточный иммунный ответ (Maestroni etal. ,1986).

Влияние краткосрочного инкубирования клеток костного мозга интактных мышей с интерлейкином-1 на колониеоб-разующую активность КОЕс.

В работе использовали модель с двухчасовой инкубацией клеток костного мозга с нативным препаратом ИЛ-1 кролика (нИЛ-1к) и рекомбинантным препаратом ИЛ-1/ человека(рИЛ-1ч).

Выявлена дозовая зависимость влияния нЮ1-1к на колониеоб-рааукацую активность КОЕс костного мозга мышей. Стимулирующее действие препарата наблюдали начиная с дозы 0.5 мкг/мл. Максимальный стимулирующий эффект был при инкубации клеток костного мозга с нИЛ-Ik в дозе 1,0-1,25 мкг/мл ( 20,0+3,2 и 36,0+4,1 КОЕс х 10г ККМ, в контроле 8,0+1,0 КОЕс х 105 ККМ). Гистологическое исследование типов селезеночных колоний выявило, что нИЛ1к в дозе 5мкг/мл усиливает селезёночное колониеобразование за счет увеличения числа эритроидных колоний (9,6+1,2 , по сравнению с прогретым препаратом 3,4+0,6 КОЕс х 105ККМ).С повышением дозы до 1,0 мкг/мл происходит увеличение числа как эритроидных, так и гранулоцитарных колоний (8,6+1,6 по сравнению с прогретым контролем 3,6+0,6 КОЕс х 10у ККМ ). Причем, наблюдается тенденция к сдвигу дифференцировки в сторону гра-нулоцитопоэза, Э/Т - 1,7, в контроле - Э/Г - 2,6. нИЛ-1к в

дозе 2,5 мкг/мл увеличивает число колоний смешанного типа 5,4+1,8 по сравнению с действием прогретого препарата 1,4+0,6 ЮЕс х 105 ККМ. По мнению некоторых авторов, увеличение числа колоний смешанного типа позволяет предположить преимущественное действие препарата на полипотентные клетки - предшественники (Magll et al. ,1982).

В этих же условиях инкубации был использован препарат рИЛ-1>вч в дозах: 0,01, 0,1 и 1,0 мкг/мл. Стимуляцию колони-еобразушей активности КОЕс костного мозга полный препарат оказывал только в дозе 1,0 мкг/мл (11,0+0,8 в контроле -7,6+0,8 КОЕс х 10 ^ККМ). Таким образом, выявлено, что как нИЛ-1к, так и рИЛ-1J ч при непосредственном контакте с клетками костного мозга в течении 2ч усиливают колониеобразуюшую активность КОЕс костного мозга, по-видимому за счет увеличения пролиферации КОЕс.

Влияние КЛ-1 на колониеобразуюшую и миграционную активности КОЕс костного мозга.

Действие препаратов нИЛ-1к (0,1-10,0мкг/мышь) и рИЛ-1/ ч (0,1-2,5 мкг/мышь) на миграцию КОЕс иа костного мозга мышей исследовали на модели эндогенного клонирования (Hanks,1964).

Введение нИЛ-1к в дове 1,0 мкг/мышь достоверно увеличивает общее число колоний 17,0+1,1 по сравнению с прогретым препаратом - 12,5+1,1 и число эритрсвдньж КОЕс (Р<0,02). Увеличение дозы препарзга до 10,Омкг/мыпь вызывает усиление выхода Г-КОЕс (Р<0,01), не изменяет число Э-КСЕс и смешает коэффициент Э/Г-1,1 в сторону гранулоцитопоэза.'

Следует отметить, что стимуляция миграции КОЕс из костного мозга происходит, в основном, за счет увэличения числа Э-КОЕс (10,0+0,8)(при действии прогретого препарата 7,2+0,8; Р<0,02). У Г-КОЕс наблюдалась тенденция к увеличению числа колоний (3,4 +0,4) по сравнению с контролем (2,9+0,3). Возможно, что стиму-лнрушее действие Л Л-1 на эритропоээ связано с освобождением простагландина, -который, как известно мслрг стимулировать образование БОЕ-Э (Hangcc.Prcxnyer, 1987) или со стимуляцией популяции Т лимфоцитов. способной усиливать эритрсидную диМ*3-ppi'iuipoBicy (Estrov et si. ,1985; Попов и яр. .1??'?).

Так как р работе использовали частично очищенный препарат

нИЛ-1к, возникает вопрос, действительно ли его стимулирующий эффект обусловлен действием ИЛ-l? Для этого исследовали влияние рИЛ-1ßч на миграцию КОЕс в дозах; 0,1, 0,5 и 2,5 мкг/мышь ( по данным литературы рИЛ-lß ч оказывает максимальное стимулирующее действие на увеличение числа Г-КОЕ в дозе 0,5 мкг/мышь)(Stork et[al. ,1988; Williams et al. ,1989). В опыте с рЭДМ ß4 было сокращено время между облучениями для того, чтобы уменьшить влияние пролиферации на эффект усиления колони-еобразования (для быстро обновляющейся популяции клеток костного мозга время удвоения 10-14 ч)(Lev is,Trobaugh,1964).

Выявлено, что рИЛ-1 рч усиливает миграцию КОЕс из костного мозга в дозе 0,1 мкг/мышь (15,3+1,5). Прогревание препарата полностью снимает его стимулирующее действие (9,3+2,4). Большие дозы препарата не оказывали стимулирующего эффекта.

Таким образом, проведенные исследования подтвердили факт стимулирующего действия ИЛ-1 на колониеобразование in vitro, (Fibbe et al. ,1986,1988; Zucali et al. ,1987) и выявили усиление миграции КОЕс под действием нИЛ-1к и рШ-lß ч . Дозовая зависимость действия нШМк на колониеобразующую активность КОЕс показана в опытах in vitro, максимальный стимулирующий эффект отмечен при инкубации клеток костного мозга с нИЛ-1к в дозе 1,0-1,25мкг/мл

Обобщая данные экспериментов in vivo и in vitro по влиянию нИЛ-Ik на колониеобразование можно заключить, что препарат нИЛ-lk усиливает миграцию КОЕс из костного моага и их пролиферацию, причем минимальные дозы нИЛ-1к, стимулирующие колониеобразование, повышают число э-КОЕс, а увеличение дозы препарата приводит к усилению гранулоцитопоэза Стимулирующее действие ИЛ-1 на гранулоцитопоэз согласуются с данными литературы об усилении лейкоцитоза под действием лейкоцитарного пи-рогена и рИЛ1>б (Федоров др. ,1982;Morrissey et al., 1988) и увеличении числа Г-КОЕ под влиянием ИЛ-1ß (Morrissey et al. ,1988; Schwartzet al. ,1988). Зависимость направления диффе-ренцировки КОЕ от концентрации вводимого ИЛ-1 согласуется с данными Кравцова с соавт. (Кравцов и др. 1990) о влиянии концентрации макрофагальных факторов на дифференцировку КОЕ. Стимуляция колониеобразования может быть связана in vitro как с продукцией факторрв ПТЛ, так и макрофагов.

Таким образом, в проведенном исследовании показана воз-

можность усиления выхода КОЕе из костного мозга под действием лейкоцитарного биорегулятора(ИЛ-1) и нейрогормона (мелатони-на), а также дозозависимое усиление колониеобразования после непосредственного контакта Ю1-1 с клетками костного мозга и отсутствие стимулирующего эффекта у мелатонина.

Учитывая выявленные гемопоээстимулирующие свойства КЛ-1 и мелатонина, взаимосвязь их действия с системой опиоидных пептидов, сделана попытка применить эти эндогенные Г-иорегуляторы для коррекции нарушений костномозговой функции, вызванных локальным повреждением гипоталамических структур у мышей.

Влияние локальных электролитических повреждений структур гипоталамуса на количество и тип колоние-образуших единиц в костном мозге мышей.

На моделях эндогенного и экзогенного клонирования изучали процесс колониеобразования в селезенке мышей через 8 суток после локального электролитического повреждения передней гипо-таламической области (AHA) и заднего гилоталамического поля (АНР). Выбор сроков исследования связан с данными литературы о существенных изменениях иммунологических и гормональных реакций в этот период при повреждении гипоталамуса у различных видов животных (Корнева и др. ,1978; Шхинек,1975; Катаева,1991; Cross et al. ,1982), глхкокортикоидные гормоны хотя и участвуют в модулирующем влиянии гипоталамуса на процесс колониеобразования, но их роль не является определяющей (Аджиева,1988; Лесников и др. ,1989).

Для анализа характера изменений колониеобразования при повреждении структур гипоталамуса исследовали не только изменения числа колоний, но и определение типов селезеночных колоний и соотношение числа эритроидных колоний к гранулоцитарным (Э/Г). Этот показатель широко используется для оценки влияния различных факторов на лиЗФеренцировку КОЕс (liteen Л 676 .Петров и др. ,1979 1979; Voir et al. ,1970).

Эндогенное кслониеобраэовани? и тип KOFc у мышей, неравномерно облученных, через 8 суток после повреждения гипоталамических структур.

\

- 13 -

Проведёны три серии опытов. В экспериментах использовали модель эндогенного клонирования с залитой участка костного мозга (Петров,Хаитов,1972). Контролем служили группы животных, облученные тотально (контроль эндогенного фона), облученные с экраном и введением гексенала и облученные с экраном "ложноо-перированные" мыши. Основным контролем служили "ложноопериро-вэнные" мыши (уровень колониеобразования в этой группе принят за 1007.).

Установлено, что повреждение АНР вызывает примерно двукратное снижение общего числа гемопоэтических микроколоний у этих животных (62,4+7.5Х) достоверное по сравнению с "ложноо-перированными" животными (Р<0,02), что согласуется с ранее полученными данными о числе макроколоний (Лесников и др. ,1989). Гистологический анализ типов микроколоний выявил достоверное снижение числа эритроидных колоний при повреждении АНР (24,6+4,ОХ) по сравнению с этим показателем у "ложлоопериро-ванной" группы (45,7+7,9Х). Количество гранулоцитарных колоний у этих животных имеет отчетливую тенденцию к снижению (16,6+4,0 по сравнению с контролем 28,4+8,22), достоверные изменения получены лишь в одной серии опытов (1,8+0,5 ROE по сравнению с 6,7+2,0 в контроле). Вследствии этого коэффициент отношения Э/Г( 1,5) лишь незначительно отличается от контрольных и может указывать лишь на тенденцию к изменению дифферен-цировки . Среди других типов колоний обращает на себя внимание снижение числа мегакариоцитарных колоний у животных с повреждением АНР, достоверное (Р<0,05) по отношению к контрольным группам.

Таким образом, повреждение АНР вызывает угнетение эндогенного колониеобразсвания, сопровождается снижением числа эритроидных и мегакариоцитарных колоний и тенденцией к снижению числа гранулоцитарных колоний. Учитывая особенности использованной модели клонирования, можно предположить, что снижение эндогенного колониеобразования при повреждении АНР обусловлено угнетением миграции КОЕс из защищенного участка костного мозга. однако нельзя полностью исключить возможность изменения пролиферативной активности колониеобрадукшх клеток. Оценка этого показателя проведена в тесте экзогенного клонирования костномозговых КОЕ от оперированных животных-доноров в организм? легально облученных сингенных реципиентов.

Влияние павреЯ8£Ш( структур гипоталамуса на содержание и тип KOES Й костном мозге у мышей через 8 суток после операции.

Модель экзогенного клонирования (Till, McCul lcjch, 1961) позволяет оценить содержание КОЕс, их колониеобразующую (про-лиферативную) способность и дифференцировочные потенции.

Следует отметить, что в данной модели "ложная" операция сама по себе не приводит к значительному изменению общего числа КОЕс по сравнению с интактной группой. Шэтому для оценки изменений числа КОЕс, вызванных операционными воздействиями, за основной контроль принимали содержание КОЕс в костном мозге интактных животных - 100Х.

Установлено, что повреждение АНР у мышей приводит к достоверному снижению числа КОЕс в костном мозге (на 40-50Х) по сравнению с этим показателем у животных интактной и "ложно-оперированной" групп (Р<0,001). У мышей с повреждением AHA также происходит достоверное (Р<0,001) уменьшение числа КОЕс, но его степень менее выражена, чем у животных с повреждением АНР. Различия в числе КОЕс между этими экспериментальными группами достоверны (Р<0,02).

Гистологический анализ гемопоэтических колоний выявил, что у животных экспериментальных групп происходит значительное снижение числа З-КОЕс, максимально выраженное при повреждении АНР (17,2+1,6 КОЕ) по сравнению с содержанием Э-КОЕс в интактной 35, 9+2,1 КОЕ) и "ложнооперированной"(32,0+2,8 КОЕ) группах.

Повреждение AHA и АНР вызывает достоверное (Р<0,05) ив равной степени (в два раза) снижение числа Г-КОЕс по сравнению с этим показателем в интактной группе животных. Тенденция к уменьшению содержания Г-КОЕс отмечена также у "ложноопериро-ванных" мышей, но лишь в одной из серий опытов выявлено достоверное снижение числа Г-КОЕс в данной контрольной группе. Возможно, отмеченные изменения числа Г-КОЕс у всех оперированных животных частично обусловлены выбросом глккокортикоидных гормонов в ответ на операционный стресс (Ромашко,198б; Швец, 1982) и могут быть связаны с (избирательным) ингибирумдим влиянием глюкокортикоидов на коммутированные КОЕс.

Сопоставление числа Э-КОЕс и Г-КОЕс у мышей с повреждени-

ем гипоталамических структур показало, что величина отношения зритроидных колоний к гранулоцитарным (3.3-4,8) значительно не отличается от контрольных значений (2,9-3,2) и находится в пределах физиологической норны (Петров и др. 1978). Можно отметить лишь слабую тенденцию к относительному усилению эритроид-ного ростка, более выраженнуи при повреждении AHA. Со стороны других типов колоний отмечено снижение числа колоний смешанного типа у животных с повреждением AHA и АКР, достоверное только при повреждении AHA (Р<0, 001).

Таким образом, на модели экзогенного клонирования установлено, что повреждение гипоталамических структур снижает содержание (пролиферацию) КОЕс в костном мозге, но не оказывает существенного влияния на направление дифференцировки колони-еобразующих кроветворных клеток.

Сопоставляя результаты экзогенного и эндогенного клонирования клеток костного мозга следует отметить, что снижение числа КОЕс у животных с повреждением АНР наблюдали в обеих использованных моделях, что по-видимому, обусловлено угнетением как пролиферации, так и миграции стволовых клеток, тогда как при повреждении AHA достоверное снижение колониеобразова-ния отмечено только в экзогенном тесте. Эти данные позволяют предположить, что у животных с повреждением AHA снижена пролиферация СКК, но сохраняется нормальная способность КОЕс костного мозга к миграции, что подтверждается сохранением нормальной реакции на введение антигена у этих животных (Аджиева, 1988).

В то же время, соотношение кроветворных колоний различных типов, развивающихся в селезенке из КОЕ, является, вероятно, достаточно жестким показателем и в меньшей степени зависит от центральных влияний, чем миграционная и пролиферативная способности КОЕс.

В дальнейшем, модель экзогенного клонирования была выбрана для исследования возмсГйюго корригирующего действия эндо-. генных биорегуляторов, активных в отношении СКК, на исследуемую функцию костного мозга при экспериментальной патологии ПНС.

Коррекция нарушений костномозговой функции у мышей с noB;«.*.r.<?>uw4 гипоталамуса с помощью мелатонина и ИЛ-1.

Исследуемые биорегуляторы активны в отношении КОЕ и реализуют своё действие с участием стресс-лимитирующей системы, основным компонентом которой являются опиоидные пептиды (Пшенникова,1987; Viederman,1989; Frasohini et al. ,1990).

Коррекция нарушенной функции костного мозга с помощью мелатонина. Действие курсового введения мелатонина на колониеоб-разующую активность клеток костного мозга определяли через 8 суток после операции, т. е. в период максимально сниженного содержания КОЕс в костном мозге у животных с билатеральным электролитическим повреждением гипоталамуса. Для этого оперированным мышам-донорам клеток костного мозга, начиная через 24ч после операции, ежедневно вводили мелатонин в дозе 5 мкг/мышь в течение 7 дней, за час до наступления темнового периода. Мышам контрольных групп вводили растворитель. Чэрез 8 суток после операции клетки костного мозга извлекали и трансплантировали в/в летально облученным рецшштам по 6x10 ККМ/мышь. Число и тип КОЕс определяли у интактных, "лож-нооперированных" животных и животных с повреждением AHA и АНР.

Курсовое введение мелатонина восстанавливает содержание КОЕс в костном мозге у мышей с повреждением АНР до уровня контрольных значений, повышая число З-ШЕс до 27,2+1,2 (Р<0,001) и Г-КОЕс 11,4+1,4 по сравнению с действием растворителя (16,6+1,6 и 7,6+0,8 КОЕхЮ5 ККМ соответственно). Отношение количества эритроидных колоний к гранулоцитарным у мышей с повреждением АНР, получавших мелатонин (2,4) близко к этому показателю у интактных животных (2,9). Число мегакариоцитар-ных, недифференцированных и смешанных колоний достоверно не различалось в опыте и контроле. Следует отметить, что сам по себе "операционно-инъекционный" стресс ("ложная"операция в сочетании с многократным введением растворителя), как правило, несколько стимулирует исследуемую костномозговую функцию: особенно заметно увеличивает число колоний смешанного типа (примерно в два раза). Эти наблюдения не противоречат литературным данным о развитии гиперплазии в костном мозге у мышей через 8 суток после нанесения стрессорного воздействия (Шахов и др. , 1986).

Курсовое введение мелатонина мышам с повреждением AHA также увеличивает содержание КОЕс в костном мозге до уровня

контрольных значений. Инъекции мелатонина повышают количество Э-КОЕс до 22,6+1,0 и СМ-КОЕс до 4,6+0,6 К0Есх10гККМ по сравнению с действием растворителя (19,6+0,6 и 2.8+0,4 К0Есх105ККМ соответственно). В этой же группе животных, получавших мелато-цин, можно отметить тенденцию к нормализации Э/Г (2,2 - в контроле 1,7).

Вместе с тем, наиболее отчетливый корригирующий эффект мелатонина проявляется в группе мышей с максимальными отклонениями исследуемой функции костного мозга, а именно - при повреждении АНР.

Коррекция нарушений функции костного мозга с помощью ИЛ-1.

Для коррекции пониженного колониеобразования использовали однократное и курсовое введение нИЛ-1к в дозе, стимулирующей миграцию клеток костного мозга (1мкг/мьш>, в/б).

Проведенные серии опытов включали в себя следующие группы животных: мыши с повреждением AHA и АНР; животные с повреждением исследуемых структур и введением активного и инактивиро-ванного прогреванием нИЛ-1к; "ложнооперированные" мыши, получавшие активный или прогретый нИЛ-1к; интактные животные без введения препарата.

Однократное введение нШЫк оперированным мышам за сутки до клонирования эффективно восстанавливает содержание КОЕс только у животных с повреждением АНР (35,6+3,2 КОЕсхЮ^ККМ у интактных - 35,6+1,2 KOEcxlO5 ККМ). Инактивированный прогреванием препарат такого эффекта не оказывает, число КОЕс у этих животных остается сниженным (25,8+2,0, Р<0. 001). После повреждения AHA содержание КОЕс было сниженным у всех экспериментальных групп, восстановления колониеобразования не наблюдали.

Гистологическое исследование типов КОЕс выявило, что у животных с повреждением AHA и введением препарата, значительно снижено число 3-КОЕс (16,8+0,8; 14,6+1,0; Р<0,02 и Р<0,001 по сравнению с соответствующей лсжнооперированной группой). Число Г-КОЕс также имеет тенденцию к снижению. Сниженное число КОЕс не восстанавливается введением препарата.

Тагам образом, у мышей с повреждением АНР однократное введение лИЛ-1к восстанавливает число как эритроидных, так и гранулоцитарннх КОЕс ло контрольных величин. У животных с пов-релдением ЛНА восстановления колониеобразования не- наблюдали.

Ежедневное введение нИЛ-1к в течение первых 5 дней после

операции восстанавливает содержание КОЕс у животных с повреждением АНР до уровня интактных мышей, как и введение прогретого препарата Вероятно; восстановление колониеобрааования в контрольной группе является результатом повторных инъекций прогретого нИЛ-Ik. Напротив, курсовое введение нИЛ-1к мышам с повреждением AHA значительно усиливает нарушения со стороны костного мозга Число КОЕс в этой группе снижено до 28,0+2,8, наиболее выраженные значимые изменения наблюдали со стороны эрит-роидных колоний (Р<0,02 по сравнению с контролем).

Как известно, повреждение AHA у мышей приводит к выраженной инволюции тимуса и усилению глюкокортикоидной реакции на стресс (Лесников и др. ,1989). Имеются сведения, что курсовое введение рИЛ-1 jS, восстанавливающее КОЕс в костном мозге и количество лейкоцитов в периферической крови усиливает инволюцию тимуса и снижает его клеточность (Morrissey et al. ,1988). Очевидно, что не только состояние организма, но и доза введенного препарата определяют эффект ИЛ-1. Малые дозы могут стимулировать или нормализовать, а большие ингибировать, что характерно для действия регуляторных пептидов (Клуша,1984). В наших опытах наиболее четкое корригирующее действие на костномозговую функцию наблюдали при однократном введении нШЫк в дозе 1 мкг/мышь по белку у животных с повреждением АНР. В то же время введение этой же дозы мышам с повреждением AHA не эффективно. По-видимому, целостность этой зоны мозга важна для реализации корригирующего действия ИЛ-1 на исследуемую функцию костного мозга.

Полученные данные свидетельствуют о том, что введение нИЛ-Ik корригирует нарушенную функцию при патологии ЦНС, однако характер эффекта зависит от локализации гипоталамических повреждений.

Ito-видимому, действие ИЛ-1 на исследуемую функцию костного мозга реализуется,- вероятнее всего, на уровне ЦНС, а именно - на уровне структур переднего гипоталамуса Эта зона расположена в передней гипоталамической области, частично захватывает паравентрикулярные ядра и граничит с супрахиазматическими. Необходимо подчеркнуть, что именно в этой зоне и близких к ней структурах гипоталамуса человека (Breder et al., 1988) и крысы (Lechan et al. ,1990) обнаружено высокое содержание ИЛ-1, как в нейронах, так и в проводящих путях. Возможно, что экзогенно

введенный или образующийся на периферии ИЛ-1 выполняют прежде всего роль триггера в активации внутримозговой системы ИЛ-1, вовлеченной с другими медиаторными системами мозга в механизмы развития комплекса защитных реакций организма, включая процесс

клеточного обновления в иммунной системе. »

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Повреждение гипоталамуса, высшего интегративного центра, вызывает сложный комплекс нейрогуморальных изменений, которые приводят к нарушению нормального функционирования различных клеточных систем. Показано, что повреждение передней гипотала-мической области приводит к инволюции тимуса, элиминации части Т лимфоцитов (Cross,1982; Лесников и др. 1989) и снижению функциональной активности фагоцитов костного мозга (Катаева,1991), что вызывает нарушение способности костного мозга продуцировать и поставлять стволовые кроветворные клетки. Известно, что в отсутствии ИГЛ клетки костного мозга не образуют колоний (Мирошниченко и др. ,1988), а для пролиферации и диффиренциров-ки КОЕ необходима кооперация Т лимфоцитов и макрофагов (Голь-дберг и др., 1988). Следует отметить, что на фоне сниженной пролиферативной активности КОЕ костного мозга у животных с повреждением АНД, способность к миграции не нарушается. Вероятно, поэтому, однократное введение нИЛ-1к в наших опытах,не вызывало нормализации экзогенного колониеобразования, а курсовое введение лишь усугубляло имеющиеся нарушения.

Можно предположить два вероятных пути реализации действия введения нИЛ-lre 1) введение нШИк в использованной модели усугубляет нарушение функциональной активности Т лимфоцитов. В литературе имеются сведения о значительной инволюции тимуса после курсового введения ИЛ-1 (Kferrissey et al. ,1988), что не приводит к нормализации колониеобразования. 2) Реализация стимулирующего действия ИЛ-1 происходит с вовлечением передней гипоталамической области. В пользу последнего предположения свидетельствуют данные о нормализации экзогенного колониеобразования у мышей с повреждением заднего ггагаталамического поля после однократного или курсового введения ИЛ-1.

Введение другого биорегулятора - мелатонин? приводило к нормализации экзогенного колониеобразования как у животных с

повреждением AHA, так и АНР. Известно, что мелатонин оказывает антистрессовый эффект (Maestroni et al. ,1988; Lesnikov et al. ,1992) и предотвращает инволюцию тимуса (Lesnikov et al.,1992) сохраняя, по-видимому, нормальную функциональную активность Т лимфоцитов. С другой стороны, введение мелатонина усиливает миграцию КОЕс костного мозга и пролиферацию. Вероятно, механизм реализации данного эффекта сложен, однако можно предположить, что в данном случае происходит либо, вовлечение собственной эндогенной опиоидной системы, либо взаимодействие мелатонина с опиоидными рецепторами , так как предварительное введение налтрексона отменяло стимулирующее действие мелатонина на эндогенное колониеобразование.

ВЫВОДЫ

1. Билатеральное электролитическое повреждение заднего гипоталамического поля приводит к значительному (на 40-50%, от контроля) угнетению эндогенного и экзогенного колониеобрааова-ниа, что свидетельствует о снижении процессов миграции и пролиферации . КОЕс, характер дифференцировки при этом не изменяется.

2. Билатеральное электролитическое- повреждение . передней -гипоталамической области приводит к снижению экзогенного коло-ниеобразования, то есть угнетает пролиферацию КОЕс. При этом имеется тенденция к сдвигу дифференцировки в эритроидном направлении за счет снижения абсолютного числа Г-КОЕс.

3. Инкубация нИЛ-1к с клетками костного мозга оказывает доэоэависимое влияние на колониеобразующую активность и направление дифференцировки КОЕс. Максимальный стимулирующий эффект нЮЫк оказывал в дозе 1,0-1,25 мкг/мл, при этом минимальные дозы,стимулирующие колониеобразование повышают число Э-КОЕс, а увеличение дозы препарата приводит к усилению грану-лоцитопоэза.

Инкубация рИЛ-1/Зч в дозе 1,0 мкг/мл с клетками костного мозга усиливает колониеобразующую активность КОЕс.

4. Введение нИЛ-1к усиливает миграцию КОЕс из костного мозга мышей с интактным гипоталамусом. В дозе 1,0 мкг/мышь наблюдали увеличение числа Э-КОЕс, а повышение дозы до 10,0мкг/мышь приводит к образованию преимущественно Г-КОЕс.

Введение рИЛ-1/ч усиливает миграцию КОЕс из костного мозга мышей в дозе ОД мкг/мьшь.

5. Однократное и курсовое введение нШЫк восстанавливает сниженное колониеобраэование только у мышей с повреждением АНР. У мышей с повреждением AHA однократное и курсовое введение ИЛ-1 не восстанавливает исследуемую функцию костного мозга.

6. Мэлатонин в дозе 5 мкг/мл при непосредственном контакте с клетками костного мозга не оказывает стимулирующего влияния на колониеобразуюшую акгивность.

7. Введение мелатонина в дозе 25 и 50 мкг/мышь усиливает миграцию. КОЕс из костного мозга мышей с интактным гипоталамусом. Усиливающий эффект мелатонина полностью блокируется предварительным введением налтрексона, что указывает на вовлечение опиоидной системы в реализацию действия мелатонина.

8. Курсовое введение мелатонина животным с повреждением гипоталамических структур увеличивает содержание КОЕс в костном мозге до контрольных значений. Наиболее отчетливый корригирующий эффект мелатонина проявляется в группе мышей с максимальными отклонениями исследуемой функции костного мозга, а именно - при повреждении АНР.

9. Проведенные исследования позволяют предположить участие эндогенных биорегуляторов (интерлейкина-1 и мелатонина) в гипоталамической модуляции Функции костного мозга как источника стволовых кроветворных клеток.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Лесников Е А., Аджиева С. В., Исаева Е. Н. Гипоталами-ческая модуляция гемопоэтической функции костного мозга //Тезисы I Всесоюзного иммунологического съезда, Ы. ,1989,т. 1,стр. 331.

2. Исаева Е. Н. , Аджиева С. Б., Лесников RA. Изменение ко-лониеобразуюянй активности и направления дифференцировки клеток костного мозга при 1<0вреждении гипоталамических структур. // В сб. "Стресс и иммунитет /психонейроиммунология/ "тез. докл. Всесоюзной конф., Ленинград-Ростов-на-Дону,1999, стр.122.

3. Lesnikov V. А., Lofcchanidse A.A., Isaeva Е. N. , Fomicheva Е,Е. , Adzhieva S.B. and Rybakina E.G. Hematopoietic bone marrow disfunction in experimental CNS pathology and its correct ion. //In afcst. 1st. Intern. Congress LSNF.M, Florence,

Italy, 1990.455(26),p. 602.

4. Исаева E. H., Лесников В. А., Рыбакина Е. Г., Козинец И. А. Влияние интерлейкин-1 терапии на содержание КОЕс костного мозга при экспериментальной патологии ДНС. //В сб. "Природные пептиды" Физиологическое и клиническое значение регуляторных пептидов. Горький, Пущино,1990, стр. 71.

5. Лесников Е А., Исаева Е. Н., Аджиева С. Б., Рыбакина Е. Г. Ефремов О. М., Гридкевич P. JL Эндогенные биорегуляторы в обеспечении реаистентности организма при патологии.// В сб. "Проблемы медицины и биологии сегодня и завтра",посвященной 100-лети» со дня основания НИИЭМ, 1990, стр. 70-72.

6. Лесников И. А., Исаева Е. Н., Лобжанидэе А. А., Фомичева Е. Е., Аджиева С. В. , Рыбакина Е. Г. Нарушение функций костного мозга при экспериментальной патологии ЦНС и их коррекция. //В сб. "Взаимодействие нервной и иммунной систем". Y Всесоюзный симпозиум, Ленинград, Ростов-на-Дону, 1990, с. 103.

7. Lesnikov V. А., Isaeva Е. N. . Korneva Е. А., Pierpaoli V. Melatonin reconstitutes the decreased CFUs content in the bone -¡»arrow hypotalamus-lesioned mice. In book: Role Melatonin and Pineal peptides in neuroimmunomodulation, Plenum Press, N. Y., 1991, pp. 226-231.

8. Isaeva E.N. The influence of interleukin-1 (IL-1) on shleen hematopoietic colonies in mice with experimentally induced CNS pathology.// Abstr., Proceed. Intern. Society for Pathophsihology l.Moscou, Kuopio,Finland,1991, p. 190.

9. Лесников В. A., Исаева E. H. Действие интерлейкина-1 на функцию костного мозга у мышей с интактным и поврежденным гипоталамусом. Tea. медцунар. конф. "Нейрофармакология на рубеже двух тысячелетий", посвящ. 100-летию со дня рождения С. В. Аничкова, С. Петербург, 1992, стр. 125. *

10. Lesnikov V. А., Isaeva Е. N. Effect of interleukin-1 on bone marrow function tn hypothalamus-lesioned mice//Abs. Baltic Sea Conference on Pshychosomaties and Psychotherapy New Societies New Models in Medcine, Kiel(Semany),1992,pp. 109-110.

11. Лесников EA., Исаева E. H., Пьерлаоли В. Действие мела-тонина на гемопоэтическую функцию костного мозга мышей с интактным и поврежденным гипоталамусом. В .сб. Мелатонин: общебиологические и онкологические аспекты. Москва-Обнинск, 1992, стр. 23.

Biiaujfciin> Щ КС- 9fu9)>