Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Стимуляция иммуногенеза и кроветворения синтетическими металлокомплексами

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ

На правах рукописи

БАТЫРБЕКОВ Акрам Анварович

СТИМУЛЯЦИЯ ИММУНОГЕНЕЗА И КРОВЕТВОРЕНИЯ СИНТЕТИЧЕСКИМИ МЕТАЛЛОКОМПЛ ЕКСАМИ

14.00.36 — Аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва — 1991

Работа выполнена в Ташкентском ордена Трудового Красного Знамени государственном медицинском институте Минздрава УзССР и Филиале Института иммунологии МЗ СССР.

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор ХАИТОВ Р. М.

Официальные оппоненты:

Академик АМН СССР, доктор медицинских наук МОРОЗ Б. Б.

Доктор медицинских наук, профессор КОНСТАНТИНОВА И. В

Доктор медицинских наук, профессор ЗЕМСКОВ В. М.

Ведущее учреждение: Второй Московский ордена Ленина государственный медицинский институт им. Н. И. Пирогова.

Защита диссертации состоится « Д^»_О 1991 г.

в «___ » часов на заседании специализированного Совета

Д. 074.09.01. по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора медицинских наук при Институте иммунологии Минздрава СССР по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « » ЦЫса^А 1991) г.

Ученый секретарь специализированного Совета, доктор биологических наук

КОЛОБОВ А. В.

Ш11ЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность пробломы.В последние года интенсивно отучаются новые синтезированные полиалектралитные макромолекулы о • контролируемой структурой, обладающие иммуностимулирующим действием (Р.В.Петрол и др.,1974; Р.М.Хаитов ндр*>19?4*, Р.В.Пет-роя, Р.М,Хаитов, Установлено, что синтотичеокив палке-

де ктролктн обладает йиухэют спектром воздействий на разные звенья формирования иммунного ото та. Одним из характерных черт этих соединений является их высокая комдоексооброзующая способность о комплементарными молекула'.«. Синтезированы кои'ьпгаты галтеиов, белковых» бактериальных и вирусных антигенов о поли-электралитами .(Р.В.Петров и др.\I977-I9P6; P.M.Хаитов,ГРВ9/ . Иммунный ответ на антигенную Часть ко; тле тай во много раз превышает ответ, рааштпагоЕиЯся при идауютзалии нативнымк (иогодными ) ь.1тигенйми. Сув-ствойннм моментом является то, что дгл яндуктш иммунной реакции не требуется дополнительного введения одъювантов.

Б последние годы возрос интерес исследователей к изучению иммуномодулирующнх свойств микроэлементов, применяемых в качестве стимуляторов кроватроронкя. Дефицит некоторых микроаяо-ментов в организме вызывает глубокие нарушения а работе плеточного, и гуморального 1шмушгтсти( Frnker at al,I9?8j Pernendeej f9V9',;Frnk0r ot al. 1982J Chandra 1983"; Dr at al.,19068 Jiimee, I987;aupte at ei.I9fi9{ Moulder at hi.,1989) ,

Известно, что при многих иммунодефшипшх состояниях наблюдается угнетение гемопонза, и наоборот» заболевания кро- , ветворной системы, как правило, протекает на фоне иммуйоде-фшштов. Наличие сочетаниях форм нарушений р<)бо? систем кровв-тлортич и иммунитета диктует необходимое та создидаг таких бифункциональных комплексов, которые одновременно стимулировали бы иммуногенез и гемолооэ,

В ». ¡стоящей работе дается экспериментальное обоснование i ногого перспективного направления в решения щюблемы и..муно регуляции новым классом мпталлсойервдщих синтетических палимок-тролитов, стимулирующих помимо иммуногенеза, угнетенные ¿таги , гемопочза, ассоциированный о иммунодвфшттсшми состояниями.

В настоящий работе тадае представлены результаты исследований по изучению Функций кроветворных стволовых клеток

£

при различных первичных и вторичных нммунодефицитнь'х состояний в позыошюсп их коррекция о помощью микроэлементов и металлсодержащих синтетических паливлектрсшктов.

Цель й задачи исследования. Целью настоящей работы явилось научение дейотвия нового класса синтетических, иолиадектролитов, содержащих в своём составе атомы металлов, на иммунные реакции организма я систему кроветворения, а также исследование имму-ногенеэа и функщгй гемопо&гяческих стволовых клеток при различных формах первичных и вторичных иммунодефиците» и разработка адекватных способов их коррекции о помощью микроэлементов и полимерных металлокомплекссш.

При проведении работ решались следующие задачи:

Г, Изучение действия попов ряда металлов на иммуногенез и кроветворение;

2. Изучение действия на иммуногенез и функции стволовых клеток сополимеров акриловой кислоты и /Н-вишшшрролндона;

3. Сравнительное исследование на иммуногенез и функции кроветворных стволовых клеток последовательного введения ионов металлов и полимеров;

4. Изучение функций кроветворных стволовых клеток у животных о первичными формами нммунодефицктов;

Б. Исследование влияния спленантомии на дафференцнровку гемоповгоческих отоодовых клеток;

Исследование процесса диМюрекцяровки стволовых клеток костного мозга, обработанных аигясывороткой к головному мозгу ышей;

1. Изучение дейсррия ионов металлов н ыеишлокомплексов на иммуногенез и кроватворение у животных с различными формами иммунодефкцнтов.

Научная нови8на.

В настоящей рай о га впервые показано, что комгиексирозашш шгкройлемеитов, широко применяемых в медицинской практике в качестве рпшуляторов кроветворении, с синтетическими полизлек-гролитами,с выраженными иммуноогпмулирувдши свойствам, позволила получить комплексы, обладаюидао суммарным аффектом его со-ксмпонентов. Применение гагах бифункционально активных соади-нений открывает новое перспективное, имеющее йолъпое пракжчвс-кое значагшз направление в иммунологии, а именно, одновременной стимулирование тесно взаимосвязанных мевду собо.1 систем иммунитета X! крове творении прй различных патологических состояниях

(иммунодо^тотты, atieran и Др./ . Впервые показано, что комшгеп-сировжтеа мнкроелемонта о кдауномодулируюпзтм полимером, о одной стороны, пртаодкт к стимуляция у еивоткнх язбира-зльно крае-ного ростка кроветворения, с другой оторопи, наличие микроэлемента в комплотов способствует усилении иммуноадъцранпшх свойств всей макромолекулы.

Паки установлено, что наталлокоиплексы усиливают миграцию гемопоэтичееккх стголовнх клеток, Т- и Б-лим^юпитсп, уенливпиг пропрсс кооперативного взаимодействия 'Г- и В-клоток; псвшойт пролиферацию стволовых клеток и изменяет направление их диЭДо-ренщтровкк я сторону красного роапо кроветворения - spurporro-ез. Наряду с эти« кони металлов и мотаглокомялоисы снижают функциональную аКГ,ГЕНОСТЬ т-супрссJOpOB, Т-киллеров стволовых клеток к т-дп |гг<зре'щ1фуегд!х лимфоцитов.

Рпсрвно показано, что д:г|>Т<зрегщировка стволовых клеток у бпеткмуеннх кшеЯ nudo, но отлетается от таковой нормальных особей, хота известно, что тамэктомил половозрелых животных сонролоздаотея резкям сдвигом ди^регатровки стволовых клеток r сторону эритрспоэза. ГбнарухзншЯ факт свидетельствует о, той, что механизм» контроля дл^Терешшролки стволовых клеток у тим-окточзтроваш<ых хтвотних к у i-aaroft nudo различны.

,гами ус тополю но, что дн^зротироркл с та ai одах клеток костного ?/о л га, тзл-мо от сплснэктотаропанних хивотных через 2 нодсл;; после опорами, с:<ещзна в сторону в^нтропоэза. Через 2 мосяца найлкдпегся 1;осотанс?леш:а кроветворения, очевидно за очйт перераспределения лпч-?оцятсз метду лет>*атячесхими уэлама н roe таим мозгоч,

С покопаю гистологичэсксго анализа селезеночных колоний ммпеЯ, подупшппх глетю; постного г/езга предварительно обработанных Dü тпса - oro г ;;о Я к голоякоку мозгу маоей,' нома впервые устшюллопо, ЧТО ПСПУЛШЙТЛ i'.OO'ííiO'.'OSrcrríX клеток содержит по мектлоЯ "йр-л 2 mía г-т'лпгск, .Одни из них чообходимы для проявлен;!« квлонаеофм^ПЕэК стголпшх клотоп, дртпв контролирует кх в орятрсиднеа шшравленяи.

Памп покл?пне, что jr-wiw :.1лт-чллот? я святвгачеокиб метсило-кемплоксн о«лвд«от суойгттсм суг.зеглояао стамулнройагь иммуногенез к ¿^ялти гочепозтоемтя стрологых клеток у животных с порийчеьш (wot к С?Я) я вторячиыми ("Ьшэктомля,

старость, опухслозчШ pc-ctj flop-wit яммукоде*иийтнЫх достояний.

Весь комплекс исследований можно трактовать как новое научное направление, выражающееся в одновременном стимулировании иммуногенеза и гемопоэза о помощью нового класса металлсодержащих сополимеров акриловой кислота и //-винил пиррол идона при различных формах кммунодефкшшшх состояний.

Основные положения выносимые на аапиту.

Синтетические металл содержоазле сополимеры акриловой кислоты и /У-виянлпнрролидона обладают свойством одновременно стимулировать иммуногенез к гемопоеэ (эрктроповз) у разных видов лабораторных югвоткых.

Выявлен неоднозначный характер диф|«ренцнровкй стволовых кие ток у тимэкгомироранных мышей я у мышей аш1в , а таккв у других линий мша ей с первичными кымунодефицитами.

При вторичном иммунодефиците вызванном спленэктомией отмечаются преходящие изменения в процессе дифферешшровкн стволовых »леток.

С помощью алтосывороуют к головному мозгу мышей в костном мозга обнаружены два типа клеток Т-ряда; одни из них необходимы для проявления колонмеобразующей функции стволовых кяеток, другие контролируй их дяфферекцировку в врнгроидном направлении.

С помощью ионов металлов и полимерных металлокомллексов иохно существенно корригировать иммуногенез и гемопо-зз у тавотных с первичными и вторичными (формами иммунодефицитаых состояний.

• практическое значение работа.

На основании проведенных экспериментальных исследований поручено положительное решение на выдачу Двух авторских свидетельств: Г) Заявка № 4482636/31-06 (097875) "Еодораотворимые Металл-полимерные комплексы в качество стимуляторов иммуногенеза а гемопоэза и способ их получения", Т589 г.} 2) Заявка й 4495772/30-14 (124254) "Способ трансплантации клеток костного мозга",1Б89 г*

Проспект "ИослеДоваяие биологической активности нового класса метьллсодеркадих синтетических подиалактролитов" был представлен на ВДНХ УаООР (1ЭЛ5). Получен Акт внедрения "Способ Стимуляции иыМуни'гбта у кур о помощью щшксодержащега коы-шгаксиого йоедшвйия" (19Я9) на о.пной из птицефабрик Ташкентской ьбласти.

Полимерные металлокомнлекпы могут яайта широкое прахгачео-коа применение в качестве вммуномодулирущих препаратов при им-мунодафютепшх сое то«гида.

Апробация работы. Основные результата работы доложены и об-суэдены на Первой Республиканской кош^врекшга по медицинской иммунологии (Тапкент.ТЭгч) ; меллукаропном симпозиуме "Стромальная и Т-клеточная ре гул пиля кроне тсорннх отвплотшх кнвток"(Мооква, 19П4); научной кочТеренгли с мехдуипродным участием "Современные метода иммуис теракта" (Тймкент.Г&Я'У ; заседании Узбекского научного обнистна иммунологов (Ташкент,Т9П5) ; на Ч-у Симпозиуме по макроматекулярным соединениям и палинерач (T7IP, ТОЙ?) ; Х1У Менделееве том съезде по оба;ей и прикладной хим ии (Пои ке н т, 1989) ; 33-м Международном симпозиуме по мркромолекуляриым соединениям (Монреаль, Канада,1990) .

Публикация результатов исследовании. По материалам диссер-татациош. /Л работы опубликовано 19 научных работ, получено пололи тельное резеняэ ка выдачу двух авторских свидетельств на изобретение.

Объём к структура диссертация. Диссертация и юхена на 284 страницах машинописного текста я состоит из введения, 9-ти глав, включающие обзор литературы, собственные исследования, обсуждение получеттх результатов и вкводов. Список литературы включает TI9 отечественных и 206 иностранных источников. Работа нллюо-трнрораяа 2 схемами, 12 рнсуикшн я 7Г табл-цами.

Материалы и метода исследования.

В экспериментах испапьэоралн мкшей линии CPA, C57BL , гибридов (СБА х CSTBl)^, полученнуе из питомника чистилинейных лотропшх АШ СССР "Столбовая". Р ряде опытов использовали мншей линии nude, hrs , С53 н.ЯГС.Д2, поддерживаэмне п Институте иммунологии 43 СССР. Р опнтвх использсрали мылей в во'расте 2-3 мес., вессм 2П-22 гр. В части экспериментов испальзогали мшей в возрасте Г-20 мес. Ряд опытов проведены на крисчх породи wietnr весом 2Л0 гр. !ая получения комплемента использовали морских свинок массой ЯСС-*СП гр.

В сер'чт ояытов лкгогаых облучали на установим ЭГО-2. Мощность дозн Гр/'мии. В опытах с экранированием лямфоидных а кроветрорг'мх органов мыл ей облучали на аппарата РУМ-77 о ноеэ-ностьо дозн 2,15 I'p/мпн. На установке проведены исследовании с экрйнированием различных участков костното мозга и области тимуса.

В спита? О иммунизацией в качества антагена тпольаоваяк вратроциш йарена/ЗБ).

Кол ячее гво антителоойрааувддос клеток (АОК) в селезенке определяла пряшш методом локального геышщаа в агароае по Ерна (1963),

И^текоявкость мигранта стволовых гае го к яа косяшго шага определяли методой Р,В.Петрова р р.МДаатова (1972). Шааа во время легального облучения акраннровадц участок костаого мозга правой задней конечноегн до уровня 1/2 голена. На 7-е сутки после ейлученш подсчитывали число дискретных Жшгоней, фор-гару-юшхея на поверхности селезенки, каядая из которше образуется из огвйяовых елеиентов.

Для учёта ынграшщ ^-лимфоцитов из ищу с а использовали модель разработанную Р.М.ЗСантовш (1975), Мша?«? во врэмя легального ойлучзккя вкранировала область тимуса. Спустя 2-е суток т вводили 10 сингенншс клеток костного мозга з 2'10й ЭБ. Через 8 суток опраделялв число АОН в селезенка. В данной моделк высота еу-иуиного ответа далнкоы зависну от количества ТЧиеток, мигрировавших я селезенку, Т.к. число В-лкмфоднтов строго фиксировано. Ервпвраш веодшщ сразу цосде облучения енбоишй.

. Миграции В-лшфоцитОв из кос того мозга изучали на под еды Р.МДавтова (1976) » Ешвотным во врамя летального облучения вкранировала учроток костного ыоэга задних конечностей до уровня 1/2 бедра» Препарату вводила сразу гослз облучения, Чераз 2-а суток ушам вводили 2'Ю7 клеток гамуса в 2«108 ВБ. Чераа 6-и сутой Ьнределял?! калмчеатво АОК в селезенке.

Кооперацию Т- а В-лшрэцнтов изучали согласно метода Миллера а Митчелла (1968) * Летально облученном мша/л вводил® Ю7 ю1отон костного мозга (источник В-лкмфздятов.), 2 >10*клеток тп-иуоа (мемчник Т-лтк>питоз.) й 2 «Кг ВатеМ бводшш препараты и Ьйустн 8 суток ыатодоьЗ Ернй определяли число АГО в селе-

вёнкз. ,

Ак^аайоать спецафяческих !Р-аулрессоров определяли по «входу Вяайар, Отобр (1875)* Мшиаь! вводили гдавраиыуннуа дозу ЭБ -Чв$5эз $-10 ¿ишй ^шх ¿рала зало7 Клеток селевевдш (йо-Мнв* ^еувр^ссор&й) й Ь 2 «108 ВБ вводили шгактшщ сингел-

бпуйЫ 4 Дня ойраделяли »шело АОК и селезенка. С^Ша^'кйШа ^йЫавЫ а. »V» ш ЬшьрфШШЩ Доза ЭБ

ЕУраббйд? ьнздафаческ&х против йанногЬ антигена Т-суц-|рввёйрЬВ| накаШгйййзЦнхсЙ в Ьелеэенкз Ешуишй шаей. Пераиоо

спленоцнтов пнтактннм реципиенте:.? приводит к подавления иммунного ответа к ЗБ. Препарата вводили либо с гнпорюгмунной дозой SB, либо вторичнш рэцгатиентам, получившим спленоциш от гйпер-иммушмх доноров. Другими словами изучали влияние препаратов как на стадии формирования Т-супрвссоров в оргайизыэ гиперпм-мушшх мкпеЯ, так я на стадия ФунпЦконнрованш Т-супрессоров в организме вторичных реципиентов.

Неспецифические Т-супреосори опроделялн по методу Мёл7ера (1972). Для этого 5 >Г07 глотек селезенки родительского генотипа (СБА или C57BL) трансплантарсвали реципиентам гибритной природы-{СБА х C57BI)Fj. Торез 7 суток «шзй иммунизировали 5-10° ЭБ а еяё через 5 дней определяли число АОК в селезенке. Исслодуемаа препарата вводили одновременно л клетками селезенки.

Для проведения гистологического анализа селезенки фиксировали в жидкое и Буона, после чего их пропускали через ряд спиртов и заливали в пярафкл. Затем готовили серия срезов селевен-ш. Препараты окрашивали гематоксилин-эозином. В селезенке njat микроскопии выявляли следующие типы колоний: I. эритроидныо, состоящие из скопления эрятробластов; 2. гранул они тарные- скопление »ных, палочкоядерных и сегмактоядерных лейкошттов; 3. ко-гаиариоцитарниа - скопление чогарёх и более мегакариоцйтов; 4* недифг^ранпнроваши^состояЕиа из клеток, когор&э Морфологически трудно о*неста к какому-либо типу клеточных элементов^ б. смешанные - скопление одновременно йрятхобластов й лейкоцитов, зритробластов и мегакариоцитоа ri т.д.

Определение функциональной активнестл Т-дафферетдарувщих лимфоцитов (Р.В.Петров; В.М.МанькоД978) проводйли следуйщиУ . образом. K'5'ÎO4 клеткам костного Ысзга мышей СВА Добавляла Î0S ейнгенных клеток лимфатических узлов й смзс& переносили летально облученным реципиентам (СВА х С57Б1)р£= Чероь 0 суток Мышей забивали, извлекали селевенки в подсчитывал^ число колоний на йх поверхности. У реципиентов, получившие омеЬь клеток kîoi-ного мозга и лимфатически* узлов образуется значительно Меньше колоний на селвзеяка по сравнении с айвбтнымй, йолучишимй только костномозговые клетки. Прй Гистологическом анализе было установлено, чтб клетки лим-fâткчестх узлеё под саздейсгвйбм антигенов гистосормеотямостя йамоняв* йаправленйб диффаренш-ровки кроветворных стволовых клеток б йреймущаойекно 8pîTpch ..." идного на йреимущестйэнно ГранулоцйтарнаЙ пуй> разййтий. Скк-

женив числа колоний на поверхности селезенки не является абсолютным, поскольку эти колонии в основном эрятроидного типа, а гранулоыитарные колонии вырастают в толще селезенка и макроскопически не рвгистрируются. Т-дифферешхирушио (Tci)димфоцяга угнетают рост аритроидных колоний, но усиливают рост грануяо-иитарных колоний. Общее число колоний в селезенке не изменяемся , а происходит перераспределение их вша. Исследуемые препараты вводили совместно с метками костного мозга и лимфатических узлов.

Для определения экзогенных колоний мышей облучали в летальной дозе 8 Гр и трансплантировали им лимфоидш/е и кроветворные ткани, содеряашие стволовые элементы: клеток костного мозга, 5'10® клеток селезенки, 0,2 мл периферической кро-ви(?111, jucCuliooh I9PI).Затем на Р-е сутки после облучения шлей забивали, извлекали селезенки и подсчитмвали число колоний на их поверхности.

Эндогенные колонии определяли следующим образом. Мышей облучали в сублетадьной (6,5 Гр) дозе и на 9 сутки подсчитывала число колоний на поверхности селезенки (Till, bcCulloch IS63). В данной модели колонии в селезенке формируются из стволовых клеток, выаиших после суолеталыюго облучения.

В ряде опытов исследовали воздействие препаратов на "феномен аллогенной ингибиции стволовых клеток". Сущность феномена заключается в том, что стволовые клетки костного мозга мшей C57BL при трансплантации летально облученным мшам (СВАХ C57BL)Fj образуют значительно менкве кляоний в селезенка, чем при переносе такого ке количества клеток сингенным реципиентам С57ВЬ (Р.В.Петров и др. ,1975), При добавлении к клеткам коо-тного мозга мышей C57BI скнгенных клеток лимфатических уздОд, кмониеобшзуящая способность стволовых клеток костного мозга . восстанавливается. В опытах летально (fi Гр) облученным мышам (CPA х С57FX) F-j- вводили либо 10® меток костного мозга мыаей CE7BL j либо смесь I05 клеток костного мозга и ГО7 сингешшх клеток лимфатических узлов. На R суски подсчитывали число колоний на селезенке.

Акаиноо1% Т-лим^юнитоа киллеров определяли на двух экспериментальных моделях. В первой модели "феномен инактивации нэсингеякых столовых клеток" (Р.Н Лытгох>, Л.С.Се слышна, ISfi7; летально облученным швам (СБА х С5?ВГ<)Гт вводили I05 клеток костного моага мышей С57В1 (югегки-мишени) ь смеси с 2'106

клетками лимфатических узлов ишей СБА (клетки-киллеры) . На 0-е сутки после облучения и трансплантации клеток на поверхности селезенки подсчитывали число колоний. В данной модели Т-каллерн мшей СБА полностью инактавируют стволовые а. эмектн мышей C57BL »регистрируемое по p. J кому снижению количества колоний в селезенке.

Бо второй модели, киллернуга активность Т-лимфоцитов оценивали на модели "реакция траг.сглачтат цротав хозяина" (Р.В.Пэт-ров и др. ,Т970). Сублетально облученным ммпам [СВА х C5VRt)Fj вводили 51 Tip клеток лим^атичпских углов юллеЯ CPA. На 9-е сутки подсчитывали число к-олоплй на поверхности селе?епт. В данной модели Т-киллеры мшей СБА иноктигируит эндогенные стволовые клетки в селезенке мыавй гибридной природ«,

"Ошэктомию у мыяей делали согласно метода ?.1илперя (1Э60). Вгмус удалял!? е^.пиршшей с помогу хирургического отсоса ОХ-2.

Спленэктомию производили путем перевязки сосущгсго'-i ноигя у корня селезенки и хирургическим удалением органа.

В некоторых опытах в периферической крови эксперименталь-нк": животных подсчитывали количество эритроцитов *• лейкцитов. Затем делали мазки, окрашивали их по Романовскому-Гимзд и подсчитывали число форменных элементов крови.

В серии экспериментов в качестве иммунодефицита моделировали опухоленоситальство у мшеД. Для этого стандартную дозу 1,5*10^ клеток опухоли Эрлиха вводили подкожно в область бедра.

Ряд опытов поставлен на игвотннх с двумя формами экспериментальных анемий: гемолитическая и постгеморрагическая. Гемолитическую анемию тызнпалн путем вседневного в течении 3-х дней введения солянокислого Ленилгидразинэ г дозо Щ мг/кг. Постгв-норрагическу» шемив индушрогяли путРм ежедневного в течении 30 дпей кровопускания 1,5 мл крови из хвостовой ченк крысы.

Синтетические металлокомплексы получали в два этапа. 1-й этап - синтез акриловой кислотч с вини?гшрродпдоном проводили методом свободной радикальной сополимериэ«ции с дмфенилформа-мидом в среде инертного газа при температуре 40°С под действием инициатора - циклогегоилпвроксадплкарбомата. Состав сополимера определяли методе потегашыетрического титрования та элементного анализе. Молекулярную массу определяли методом свето-рассеиввкия. На 2-й этапе полученный сополимор использовали в качестве макромолекул яри ого лнгапда в реакция комплексообрязо-вания о нонами металлов переходного ряда. Комплекоообразовкгав

провопили в рргащгчееком растворителе в среде инертного газа' при комцатнрй температуру, ГГолучеяадге метаялокрмплексы огаьша-хя в радтрррителе р? резакомцлексирсванного металла. Состав ие-теллокомплекса определял! влеиентным анализом; молекулярную массу - методом сварассеявания, Координационное число ионов металлов раднр 4, Коны металлов вваимодействувт м четырыя атомам? кяслорода двух карбоксильных групп акриловой кислоту. Препарата синтезирована в Иястатуге химии и Физики полимеров АН УеСО? старшим научным сотрудником О.Г.Ходжаевым, - 5Ькскчнооть соединений определяли в остром опыте согласно иеютч Лктчвялда и Уилкоксона в модификации З.Рота (М.Л.Бе-аенкйй,1859),

В работе использовали хлорида кобальта, цинка, железа и меди; пять сополимеров акриловой кислоты и л'-вшшлпнрралндо-наг 16 сополимеров с кобальтом, 18 сополимеров с цинком и 5 сополимеров о железом. Молекулярная масса препаратов 5-ИО кИ, содержание акриловой кислоту 19-50 иолсодержание шкроаде-кэнта в комплексе 0,-| -4,5 %.

Цифровой материал обработан статисшчески (И.П.Ашмарин, Я.А.Воробьёв,1962], Вычисляли среднюю арифметическую (прег подсчёта числа в типа кроветворных колоний в селезенке) шш средний геометрическую (при подсчёта АОК) , их сшибки н доверител] миа интервалы с вероятностью 95 Я. .

РЕЗИГМШ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСЩВДШ

I. Изучение эффекта кояов металлов, сополимеров акриловой кислота к /{¿винил пирролкдо на и полимерных металлоком-шексов на иммуногенез к фушадга кроветворных стволовы клеток

Отправным моментом навдх исследований послушал анализ Оно логической активности ряда микроэлементов. При изучении аффект хлоридов металлов на иымушшй ответ аивоишх на уровне целостного оргттэма выявлено, что только поны цинка двухкрааяо усиливая? ответ к ЭБ. Хлорвда кобальта, железа и.меди не влияют на иммунную реактивность организма. На процесс кооперации Т- и В-лимфоцитов в иммунном ответе стимулирующим вффектой обладат - зоны железа и меди. Хлориды кобальта и цинка не влияют на Т- В-кооперашв.

Ноли мэгаллов, кроме хлорида кобальта, усиливают миграционные свойства кроветворных стволовых клеток. Кроме этого они

оказывают стимуляруюиий »Т^>ект на пролиферацию отволовы* клеток. Выявлено, что явффвреттровпа стволовых клеток, под влиянием ионов металлов смещается избирательно в сторону красного роот^ ка кроветворения. Можно предположить, что ионн металлов непосредственно действуют на колониеобраэующие единицы (КОЕ0) «

Изменений дифференцировал стволовых клеток очевидно связано с тем, что клетки-предаественняга аритроидного ряда более чувствительны к симулирующему действие хлоридов металлов» Однако возможно и другое объяснение полученных результатов. Известка определенная роль в джЭДярвниировка КОЕ0 субпопуляций Г-лимфоцитов. Так, например, Т-ди^ференцируищмо лимфоциты изменяет направление дифференцировкя стволовых клеток с преимущественно эрлтролдного на преимущественно гранулоцитарный путь развития (В.М.Манько, 1978).Не исключено, что катионы металлов влияют иа процесс дифференцирован опосредовано путем воздействия на Т-лимфоцигы, рег;глиругше направление диффвреяцировка. стволовых клеток. Для проверки этого предположения были проведете опыт по изучению действия хлоридов металлов на функции ^-дифференцирующих лимфоцитов. Оказалось, что введение хлоридов металлов шлам (СВА х С57Щ,)Рр получившим смеоь костномозговых клеток и сингекных лимфоцитов (Тс1-лимфоциты} лимфатических узлов мышей СВА, отменяет способность последних сДвя-гать длфферешировку К0Ес в сторону гранулопоэза и блокировать эрнтрондяый рссток кроветворения.

'Таким образом, эта данные показывают возможность опосредованного влияния хлоридов металлов ка процесс дифференцирован стволовых клеток путём инактивации регуляторах субпопуляцнЙ Т-лимфоцитов, контролирующих дифференцировку К0Ес» На яоключо-на возможность влияния ионов металлов на диф^зрешдаровку НОВ0 через активацию ( или инактивацию) медиаторов хле. .точного даму-нитета, контролирующих дкфференцировку стволовых клеток.

Известно, что клеточные фор«н иммунного ответа реализуются на уровне функционирования Т-эффекгоров. Открытий Р.В«Пег-рошм и Л.С.Сеславиной (Г967) субкласс Т-лнмфсцятов обладает свойством инактнвировать аоогеяяне стволовые клетки йа оч^в ингибиции размножения клеток-мишеней. В основе этого эффекта лежит, очевидно, киллерноа действие (Р.В.Петрой и др.,19814 19В?) .

Нами проведены исследования по изучении эффзктй конов Ш-таллов на функциональную активность Т-ккллеров йа двух Эксйвра-

ментальных моделях:"феномен инактивации несингенных стволовых клеток" и модель инактивации эндогенных КОЕ0 реципиентов гибридной природы лимфоцитами доноров родительского генотипа. Установлено, что добавление хлоридов металлов реципиентам получениям смесь клеток костного мозга (клетки-шшени) мшей С5?Вь и клеток лимфатических узлов (клеток-киллеров) мшей СБА, угнетает способность последних инактявировать стволовые элементы костномозговых клеток мышей С57ВЬ * Активность Т-кил-леров в наибольшей степени подавляется ионами кобальта, цинка и в меньшей степени при инъокшта хлоридов хелеза и меди.

Аналогичные результаты получены и на 2-й-модели. Добавление ионов металлов реципиентам (СБА хС57ВЬ)Г^, получившим клетки лимфатических узлов мышей СБА отменяет способность последних инактивировать эндогенные К0Ес в селезенке гибридов. Гистологический анализ показал, что ионы металлов способствуют росту как зритроодних, так и гранулоцитарных колоний. На данной модели показано, что активность Т~киллеров в наибольшей степени блокируется ионами цинка, кобальта и меди.

Таким образом, ионы металлов оказывают супрессивное действие на функциональную активность Т-лимфоцитов киллеров.

.... Нами исследовано влияние ионов металлов на способность клеток костного мозга мышей С57В1) формировать колония в селезенке легально облученных мышей (СВА х С57Б1)^. Как известно, К0Ес костного мозга мышей С57ВЬ образуют значительно меньше экзогенных колоний в селезенке гибридов по сравнению с сингенной комбинацией С57РБ ~Н357ВЬ . Данное явление получило название "феномен аллогенной ингибиции стволовых клеток (Р.В.Петров и др.,1975). Добавление к клеткам костного мозга мышей С57Б1 сингенных лимфоцитов лимфатических узлов восстанавливает способность К0Ес костного мозга формировать колонии в селезенке гибридов. Установлено, что ионы кобальта оказывают такой же стимулирующий эффект на стволовые клетки мышей С07В1, , как и М7 кле-лж лимфатических узлов. Это говорит о тем, что иона кобальта в определенной мере способны завещать ф/нкции Т-хелперов. Менее выраженный. стимулирующий зффокт на стволовые кнетри оказываю? ионы меда; и минимальный - хлорид цинка и железа. Полученные данша спидетельствую? о том, что ионы металлов в различной степени способны отменять адлоген-нуп китг.оюлю строловых клеток мшей С57РЪ . Мохно предположить, что ионы металлов действуют непосредственно на стволовые

13

л

ив тки, вслвдствия чего они приобретают способность преодояз-1вть аллогениый барьер и пролиферировать в организме реципиента. Re исключено таете, что ионы металлов инактгаируют радио-«эистентные клетки реципиента, осуществляющие икгибилию опзо-ювых элементов трансплантата. Эти клетки, названные М^-клетка-ш (клетки гибридной резистентности) яроявляит активность в osv югаении лимфоцитов, экспрссскр:/ющие Hh -aiinireHU ( Bamiat. 1972),

Нами изучен эффект хлориде в металлов в отношении ствало-шх клеток на модели угнетения кроветворения, индуцированного 1утём гипериммунизвдии животных ЭВ. Перенос спленоцагов гипер-{ммунизированных мыл ей сопровождайтсн образованием в 2 раза меньшего количества колоний в селезенка легально ойлучвняых ¡ингенных реципиентов по сравнению с иятактными клоткамк Соло-)енки. Добавление ионов металлов к оплечоцигам гилериммуннкзг юноров полностью восстанавливает кслониеобразутацую способноота ■¡оследних.

Таким образом, молено предполагать, что ионы металлов лвбо усиливают проли^раткиные свойства стволовых клеток, либо уг-leTaOT супрессорные механизмы, осуществляющие блокировку про-тиферации стволовых клеток.

Поскольку целью настоящей работы явилось исследование ба-элогической актирноети нового класса соединений, состоящих на ядкроэлемента и полимеров, нами предварительно была исследовала активность полиалектролитой в отношении -ммуногенеза и кро-эетворения. В качесязе синтетического иммуноадъяванта использовали сополимер акриловой кислоты и /V-винилпиррояндона.

Нами установлено, чю в зависимости от содержания акриловой кислота-в комплексе, сополимеры либо не влияют, либо в 2 раза усиливают иммунный ответ к ЗН на уровне целостного организме:, Сополимеры в 2-2,5 раза стимулируют процесс кооператив- • кого взаимодействия Т- z В-лимФо1Щтов. Полученные на?я! результаты согласуются с ранее опубликозенными д'шыми о иммуностп-мулкруюи^м зфТекте сополимера акриловой кислота а //-викилпир-ролидона ("Л.М.Наямитдякол.ГЭяЯ) .

На модели эндогенного клонирования стволовых клоток выявлено, что с повышением пропета акриловой кислоты в комплексе наблвдаечея усиление стимулирующего агента на колениеобраэова-тв. Число колоний на поверхности селезенки увеличивается в 5 pan. Гистологический анализ серийных срезов селезенки показал, что наряду с увеличением числа эритрокдкых колоний повышается количество ' голой::!! гранулоцитяпного типа, Йтиошеняо

вритроидных колоний. к гранулоцитарным не изменяется, т.е. со-' полимеры усиливая пролиферативные свойства стволовых клеток, не омывают влияния на характер их дкффередаровки.

Нами установлено, что сополимеры усиливают процесс расселения стволовых клеток иа экранированного во время летального облучения участка костного мозга. Гистологическое исследование показало, .что сополимеры, как и на предыдущей модели, не влияю* на диррвреникроБку стволовых клеток.

И&ким образом, сополимеры акриловой кислоты и /У-винилшр-ролндона усаливают иммунный ответ на уровне целостного организма, кооперацию Т~ и В-лямфонкгов, миграцию стволовых клеток, йХ пролиферативные свойства, но не оказывав'? влияния на процесс ДЕфференцировкн гемопоэтических стеоловых клеток.

В последующих экспериментах решался вопрос о том, какой эффект окажут на организм последовательные раздельные введения хлоридов металлов и сополимера. Оказалось, что раздельное введение ионов металлов и сополимера ке оказывает влияния на высоту иммунного ответа к ЭБ. Последовательное введение суб-летаяьно облученным животным хлорида кобальта и полимера стимулирует пролиферацию эндогенных К0Ес и смещает их двфферен-цировку в сторону эригроиоээа, Б данном случае эффект опосредуется, очевидно, через действие ионов кобальта на ствопошв клетки, Отсутствие эффекта на иммунный ответ установлен такие при инъекции мышам раздельно хлорида цинка и сополимера. Введение еублетально облученным мшам смеси хлорида цинка а сополимера усиливает пролиферацию стволовых клеток и смещает их дафферелцировку в сторону аритропозза.

Принципиально аналогичные результата получены при исследовании воздействия на иммунный ответ и кроветворение смеси сополимера и хлорида.железа.

Таким образом, при последовательном введении хлоридов металлов и сополимера акриловой кислоты и „у-вкналпирралидощх ,.. ,коиы металлов отменяют иммуностимулирующую активность сополимера. Однако на пролиферацию и характер дифференцировки кроветворных стволовых клеток смесь ионов металлов и полимера оказывает такой же эффект, как н при инъекции только хлорида металла.

Дальнейшие эксперименты явились логическим продолжением вышеописанных опытов. Нами были изучены биологические свойства комплексов микроэлементов с сополимерами акриловой кислоты ы

/У-вянилпирролидока. Предполагалось, что коннотация мякроэле- 1 ментов, применяемых в медицинской практике в качестве оТямуля-торов кроветворения, с синтетическими полиэлактролитечи о выраженными иммунос тимулйруюиктмч свойствами, позволит получить комплексы, обладавшие суммарным »К^ктом его сокомпонентов. Изучены кобальт-, пкнк- п железосодержащие оополимеры акриловой кислоты и Л'-ггмтпмрролил о н я. Препараты различались по мол. массе, содержания микроэлемента а акриловой кислоту в комплексе. ЛД50 магаллокомплвксои л пределах 350-400 мг/.чг.

Установлено, что кобндътсодсржащив полиэлактрслиты в 2-6 раз повшают продукции АОК в селозаике и в 2-3 раза интенсифицируют процесс кооперации Т- и В-лимфоцитозь Выраженным И.М-муноадъюваятшм действием обладают сополимеры с цинком: ответ усиливается в 4-6 раз. Кооперацию. Т- и В-лимфоцитов сополимера о цинком усиливают в 2,5-3,5 раза. Менее выраженным стимулирующим офЬи¡'.том на антит^логенез обладают железосодержащие оополимеры (в 1,7-2,Я раза) ,

Полученные данные свидетельствуют о том, что металлокомп-лексы являются достаточно сильными стимуляторами иммунитета, Адгюяаятный эффект комплексов проявляется как на уровне целостного организма, так и инициативную стадии антитвлогекеза -процесс кооперации Т- и В-лим'Ьоцитов. Поскольку сам сополимер усиливает иммунный ответ в 2 раза, а смесь ионов металлов к сополимера не оказывает влияния на антителегенез, наблюдаемый значительный уммукостямулируьпшй эффект иеталдокомплексов говорит, с одной сторюны, о достаточно прочной связи атомов металлов с полимерным лкгшксм. С другой стороны, обращает на себя внимание факт, что включение макроэлементов в полиЗДект-ролит, существенно усиливает слмукост/мулкрум'Дко свойства последнего. например, лосы кобальта не влияят ьа икмушшй отлет и Т-В-коопергоуго. В результате ксдатгация атомов коб&пьта с полпэлектролитом образуется т'.счллокс с си ышм иммуносгпму-лиругаг. свойством. Точно та?.'.о, хлоргд пинка, ке влияя на процесс Г-Р-коопер'гпка, в 2 разп усгг.чдря'.зг ичму.чгаЯ ответ к ЭЙ. сополи?/ерГ. с шшком суу^стм'ч'о г.отьтг'.'о? иуиу^иь'й ответ и кооперации Т- и в-лг!.^огкточ,

Так{..л образом, кон'^ттютп га с полизлемрогогом

пгигодит к т за—.»уюте.-: и*:» свойств его со-

ТСМПОПОИТОТ-1»

"гллос зглчекг.« ~лг; ;««::згахпс реакций имеет миг-

т^:"'"г: ■ . •■ • . Р ; —."'"■л""1'.'-'"- било

показано, высота иммунного ответа в определенной степени зависит от скорости миграции Т-лимфоцитов из тимуса и В-лим-фоцитов its костного мозга в селезенку иммунизированных живо них, где происходит их кооперативное взаимодействие (P.M.Хаитов, ¿,А,Батырбеков?1975.).

В наших исследованиях установлено, что кобальтсодержа-щне полиалектроли'ш в 2-Я раза усиливают миграцию в-лныфоцнтов вз экранированного участка костного мозга и Т-лимфоцитов из тимуса, Иммуностимулирующий а[фект металлокомплексов наблюдаемый на уровне целостного организма, очевидн'о, реализуется на ртдельных етапах становления иммунного ответа.

Нами изучено влияние ;собальт- и цинкеодержащих полиалек-тролитов на функциональную активное ть специфических и неспецж-$этаских 'Р-супрессоров. Показано, что металлокомплексы сукес-твенно снижают активность специфических Т-супрессоров как на стадии их формирования в организме гипериммунных доноров, так в HQ стадии их функционирования в организма реципиентов, получивших клетки селезенки (Т-суирессори) от уипариммунных мышей. Аналогичным конорсупрессивным действием обладают металлокомплексы и в огяошешги неспецкфических Т-супрессоров, Модно предположить, что иммуноадызвантное действие металлокомплексов в определенной степени зависит от их способности подавлять функции Т-супреосоров, Степень инактивации зависит от процентного содержания микроэлемента в комплексе и его природы.

Извеозио, что Т-лшфэднта киллеры осуществляют целую гамму различных вфТектов в иммунной системе организма. Они пнакти-внруют аллогешше стволовые клетки, принимают участие в отторжении чужеродного трансплантата, реализуют противоопухолевый иммунитет, реакцию трансплантат против хозяина и др. В работе Л.ИДаустовой (IS79j сообщалось о возможности усиления активности Т-киллеров синтетическими полиэлектролита'ди. Активность Т-киллеров позшелесь как при обработке препаратами доноров клеток лимфатических узлов (источник Т-киллеров) , так и при введении полиэлектролитов в культуру взаимодействующих клеток (Т-ккллеры-стволовая клетка) .

В наших опытах сублетально облученным мышам гибридной природа вводили клетки, лимфатических узлов (Т-ккллеры) родительского генотипа и ыеталдокопплекоы, Установлено, что кобальт- и щшксодераащие полимеры в определенной степени отменяют способнее ть Т-киллеров мышей СВА угнетать колоннеобразу»-

щуп способность эндогенных стволовых клеток - гибридов.

Выше говорилось, что ионы металлов угнетают киллерный аф-факт клеток лимфатических узлов. Моино полагать, что это свойство микроэлемента сохраняется при его конъюгации о полиадакт-ролитом, хотя в комплексе инактивирующий аффект атомов металлов выражен не столь значительно.

Таким образом, с помощью полимеров нмегаллокомпяексов ыоаяо регулировать функции Т-киллеров - усиливать их активное» или подавлять.

Нами проведены исследования по изучению аффекта мэуаляоком-плексов на функции стволовых клеток. Установлено, что кебальт-соде ржащие сополимеры усиливают пролиферации эндогенных становых клеток. Гистологический анализ тала кроветворных колоний показад, что металлокомги.^ксы стимулирую? рост чритроидных колоний и как следствие этого отношение эритроэдных колоний к гранулоцитаркым резко возрастает. На модели миграции стволовых клеток из костного мозга показано, что сополимер о кобальтом усаливает данный процесс. Анализ типа задоияй показал, что я в этом случае дп^-ерекштровка НОЕ0 сменена-в сторону зритропо-зэа. Что касается пинксодертаотх полизлектролитов, то они также как и комплексы с кобальтом усиливают эндогвнноз колониасб-разование» Сополимеры с цинком стимулируют миграцию стволовых клеток из экранированного участка костного мозга в селезенку а изменяют направление их дифференцяровкн в сторону аритропозза. Аналогичным действием на пролиферация и дифференцироэку стволовых клеток обладают аалеэосодёряааие полиэлакгроляты.

Итак, можно заключить, что металлокомплексы обладают сга-, аудирующим дейстаием на миграцию н пролиферацию гемопоэтнчес-кях стволовых клеток я избирательно сдвигают направление их : днфференшгрояка в сторону красного роотка кроветворения- эрнт-ропоэз. Очевидно, металлокомплексы воздействуют либо на сами стволовые клетки, либо на клеткп-праЯиественяики зритропдного ряда усиливая процесс их деления и дифферанцяровюг, Елетни-предаеотвекники гранулоцитарного ряда,вероятно, менее чувствительны к действию комплексов.

Представляв? интерес наши данные о влиянии предварительно!: обработки доноров костного мозга и периферической крови кобальт содержащими полиэлектролитами. Мшам вводили металлокомгогвкси и через одни, двое и восемь суток клет^ки их лестного моага и . периферической, крови перекосили летально облученным сиигешши реципиентам. Нами установлено, что КОЕ костного мозга перзне-

io

оенные черев 1-Я суток поело обработки доноров образуют зна- ' чительно больгпе колоний в селеволке, чем интакткые костномозговые клетки. Следует отметить,- что диф$ереяшровка стволовых меток костного мозга даже спустя Я-м суток после обработки доноров металлохомплексами смещена п сторону эритропоэза.

Полученные данные можно интерпретировать как результат непосредственного действия комплексов на стволовые клетки.

Менее выралсшый &Т'*окг сказ из а ют ызтэллокомилексы на стволовые элементы порк^еркчеокой крови,

Таким образом, металлсодерхавдас сополимеры амиловой кислота н л'-ВЕнилппррояидоиа обладают свойством стимулировать отдельные ятапу становления имг^нното ответа, мигршиыо и пролиферацию гемспоэгичьскях стволовых клеток и изменять направленна их дютференпнровки в сторону эритроядяого пути развития.' Другими словами, синтетические металлокомплексы действительно являются бифункциональными соединениями,, т.е. веществами одновременно стимулирующими иммуногенез к гомопоаз (эритропоэз^ .

, Установлено, что кобальт- и циинссдерхашие полиэлектролита обладают свойством стимулировать иа-мунный ответ к ЭБ у морских свинок и крас. Эти хв металл о ко; же ксы стимулируют кроветворение оцениваемое по подсчёту форменных элементов периферической крови у указанных видов животных.

Таким образом, синтетические моталлокомплексы обладают сеойсгвом усиливать тш^.ютсне:* и гемолоиз у разных видов лабораториях «плотных.

II, Изучение функций к^чцстворных стволовых клаток при первичных к вторичных jc.iv у и о де (') п \> 1 т:! и'х с с с- гскш "лх

Нами бшш проведет: исслайоаачид функций кроветворных стволовых клеток у war;! nude в генетически обусловленным от~ сутсивизм ткмуса, а та;с:а у M-ciieii линий ,С'68 и Ы0.Д2, у которых к одному году рази;;?.--о п; с-цент лейкешш.

Особый хнтерес преде '».чгля:« на-.:t о характера дкф-

ферещирсъкд стволовых iv:e-'jr. у г."ст.;* . Гс^ье С-ило уста-иовльло, что ягмоктомгя re;:'-; о; осе?-?, глакчаат утке такие г?а'р:спнгаг;гой .ys- i-v:-:^.'г:;х глет л г. (-'.В.Петров к др., 19?«) . :": у .ч - с mo^f-muv. от~ сутсп'ри-ям wye я o:\~ ~ :. : ;• ¡yr;:1::-Л^'-'гг^ч^гм': "VM 1 . ■■. - -rfl к-

цвгом гранулощтрного ростка. Однако, анализ типа селезеночных колоний показал, что днТферекцкровка стволовых клеток у ыышей nude происходит .также, как и у нормальных животных (2-3-х кратное преобладание эрктрокдных колоний над гранулоцн-тар!шми- показатель Э/Г) . Другими словами в отсутствии тимуса у ышей nude не нарулен механизм контроля и регуляции дифференцировки стволовых гае так. Известно, что гранулоцитар-ная дифференцировка стволовых клеток контролируотоя Т<1-лимфоцитами ( Р.В,Петров, Е.М.Манько, IS7S) , а аритроидиая дифференцировка. - тетачувстЕИТельнцми регуляторными клетками {Т,£ЯС) химического происхождения ( sharkin 1978). Можно предположить, что у мкпей nude дифф-еренцпровка стволовых клеток контролируется лимфоиднши клетками в функциональном отношении подобные регуляторным клеткам Т- ряда нормальных мдаей. Наше предположение подкрепляется следующими данными. С помощьо ноноклональних антител против Ttiy - Г, Lyt-I и lyt - 2 у мышей hude обнаружены клетки, несуше на своей поверхности ая-тигены, характерные для зрелых Т-лимфоцитов (4th internat.Workahop on ia. def. "»¿"¿а 1,1902),. Обнаружены также хлетка-предаестаэн-никн цитотоксяческих Т-лкмФоцитов и 'Р-клетки, продуцирующие растворимый медиатор - фактор роста Т-клеток. Не исключено, что среди обнаруженных клеток Т-ряда существует пул лимфоцитов, контролирующие диффаренцкровку стволовых клеток. Зфоме того можно предположить, что у мызей nude контролирование днффз-ренцировкя осуществляется другими, отличными от Т-лдафоцатов, субпопуляциями лимфоцитов.

Нарушение процесса дифференцировка стволовых гаеток выявлено я у мышей HR£ н CSfi, В одномесячном возраста диффарая-цировка стволовых клеток у указанных линий ыышей смешена в , сторону эригропоэза. Показатель Э/Т равен 6,3 к 5,2, соотвезч ственно. В возрасте 9-10 мес, у ьшшей Ж;> на фоне снижения колониеобразования.в селезенке, возрастает число колоний гра-нулоцлтарного ряда. Аналогичные разультаты подучены и у мисей С58. Число эритровдшых колоний снижается в болылей степени, чем гранулоцитарных. В возрасте 8-10-мес. у'мышей ПВ;> и С58 отношение эритроидпх колоний к гранулоцитарным составляет 2,В и 1,5, соответственно, т.е. дифференцировка как у нормальных мы<зй. У «шей линим ВМ.Д2 формируется значительно мошие колоний, чем у шпей и G58, но характер дифференцировки с возрастом но изменяется.

Итак, двфференпнровка стволовых клеток у мыйей KR$ б С58 в возрастном аспекте противоположен Процессу дяФФерекцировкЕ у вктактных мшей. С. возрастом дифференцировка К0Ес у нормальных швей смещена в сторону зритропоэза, а у внсоколейкозяых линий мышей в возрасте I мес. угнетается гранулоцитарнай Дифференцировка. Очевидно, у мьйеЙ и С58 по мере развития патологических процессов в кроветворной и иммунной системах, Л}Юнсходнт нарушение регуляторных механизмов, контролирующие дю|фзре кадров ку стволовых клеток.

Тйхкы образом, у мшей HR> , С5В к В10.Д2 генетически предрасположенных к лейкемии дифференцировка гемопозтических отволовых клвток е гранулоцитарном направлена с 4-х недель- . ного возраста сумзтсвенно обличается от дифференцировки стволовых клеток иктактних животных.

D дальнейших экспериментах был исследован характер дифференцировки стволовых клеток в условиях выключения функций селезенки (спленэктомия) , Кроме того изучена зависимость активности Tel-лимфоцитов от функционирования селезенки. Установлено, что в оикгеяной комбинация CBA-XIBA спленэктомкя донора клеток костного мозга не влияет на направление дифференцировки клеток-предшественников костного мозга, взятие как через 2 недели, гак и через 2 мес. после операции, . Направление дифферентуэвхи стволовых клзток не изменяется и при переносе костномозговых клеток мшей СЛА в емзен с _ сингенянми клетками лимфатических уалов, полученных от ин-таггных 1ЛШ10Й или через 2 нед. или 2 мес. после спленэкто-мии доноров.

Исая результаты согласуются с ранее установленными данными, что в сиягенной системе (донор-реципиент) Tel -лимфоцк-■ш не оказывают влияния на характер дк|ференцкровкн Ш30 (Р.В.Петров и Др.,1979) .

При трансплантация клоток костного мозга как ей СВА, спленектомироЕанных Sa 2 нед. до переноса реципиентам F^-паблвдается сдвиг дифферешцтровкк ствелових клеток костного мозга в направлении эрктропоэза. Показатель 3/Т поднимается до 6,0 при 2,4 в контроле. Спустя 2мео. после операндах наблюдается нормализация кроветворения. Сдвиг дифйтеронцировкя на ранних сроках после спленэктомии донора не связан с посг-оясрацконннм стрессом, поскольку дк№еренпировка стволовых клеток у ложяоопегхрелшггых жиротинх не нарушается.

Очевидно, эти нвруэения возникают в результате удаления селезенки на ранних сроках, затем в действие вс1упапт компенсаторные механизмы, приводящие к нормализации кроветворения на поздних сроках после сплеиэктомки. Через 2 мео. после спленэктомии отношение Э/Г равно 2,3. При сравнении активности TcL-лимФоцитов интактных и спленэктомированных доноров получены следующие результат«.

Оказалось, что интактяые клетки лимфатических узлов в одинаковой степени способны изменять направление днфференцн-ровки стволовых клеток как интактннх, так я спленэктомировая-ных доноров. тА-лкмГшита лодяооперированных дсноров обладают способностью изменять направление дифТеренпировкм К0Ес костного мозга спленэктомированных доноров. ССшако ТА -лимфоцит спленэктомированных доноров в одних случаях изменяла направление дифференцировкя стволовых клеток костного мозга интактных доноров, в других случаях не влияли на этот процесс. Можно предположить, что сплекэктомил изменяет клеточный состав костного мозга и лимфатических узлов за счёт перераспределения клеток меяду этими органами, и в частности за счёт миграции некоторой части лимфоцитов из лимфатических узлов в костный мозг. Из литературы известно, что в результата ошген-эктомии увеличивается клеточность костного мозга(1о0вЮ ,1272), ТЪгда взятая нами доза клеток лимфатических уз.-, зв, вффекют-ная в случае интактного донора лимфатических узлов может оказаться пороговой s случае сплензктсмированного донора лимфатических и не влиять на дилере цировку клеток костного мозга интактного донора. Действительно, увеличение дозы клеток лимфатических узлов спленэктомированного донора в 1,5 раза вызывает изменение направления диффзреицировки стволовых клеток интактного костного мозга. Однако np:i использовании клеток костного мозга спленэктомированного донора, выбранная нами минимальная доза снова становится эффективной возможно за счёт мигрировавших в костный мозг Tel -лимфоцитов дай ктеток, присутствие которых увеличивает активность Tj.-лимфоцитов» Следует отметить, что клетки л^атичаских уэлсв интактного донора, HMe:juwe нормальный клеточный состав, в той же дозе изменяют направление диффервнцнровки täte ток-предаес твенникои из косною мозга как спленоктсмирошшшх, тлк к интактного донора.

Б опепнплыюй еврии якопирипентон неми провн&лизиревшт

воэмоглость формирования Tel -лимфоцитов в организме спленак-тонированннх мышей из популяции костномозговых клеток. Установлено, что формирование Т ¿-лимфоцитов происходит меаду 2 в З мее, после зашиты костным мозгом летально облученных ш-явВ, По-видимому, селезёнка не влияет непосредственно йа прочесе дш|ференцировкя TcL-лямфоцитов, но может изменять их активность за счёт перераспределения в организме.

. 3 последующих опытах нш.га проанализирована кояонаеобра-эующая способность и характер дифференцировки стволовых клеток костного мозга, предварительно обработанных внтисыиорог-кой к головному, мозгу мышей (ЯМ}.

Основанием для проведения исследований послужили данныа (Ooluv 1971), в которых было показано/что обработка клето кос тного мозга кроличьей ATM резко угнетает колониеобразу|>-руп способность костномозговых клеток. Автором был сделан вывод об инактивации стволовых клеток ATM. Однако, А^М. Поверенный с соавт. (1Э78) показали, что добавление сингеи-тх тиыоцитов к обработанным клеткам костного мозга существенно, восстанавливает их колоннеобразующую способность. Другими словами» актисыворотка повреждает не сами стволовыэ клетки, а клетки присутствие которых необходимо для проявления колониеобраэования. Интересные результаты были получены, нами при исследован и данного явления методом гистологического анализа селезеночных колоний,

. Установлено, что обработка костномозговых клеток АШ приводит к выраженному снижению числа колоний, формирующихся в селезенке реципиентов. Добавление сингешшх тимоцитов восстанавливает хашшеобразовакие. Гистологический анализ серийных сре.зов салезёнки показал, что обработка костного мозга АЛЛ приводит к резкому сдвигу диффередашровки стволовых клеток в направлении белого ростка кроветворения (Э/Г падает-о Г,0 до 0.2R) и двухкратному снижению числа формирующихся колоний. При атом снижение происходит главным образом за счёт эритроидных колоний. Число колоний гранулоои-тарного типа изменяется мало. Можно было бы думать о том, что кле.тгси-предиественники, дифференцирующиеся в колонии вритроидного типа, несут общие антигены с антигенами головного мозга. Обработка ATM блокирует функции таких клеток, число колоний в селезенке реципиентов снижается. Клетки- • презлее гнеиники, дг'фрешшружите сн в колонии гранулоцнтар-

вого типа такие антигены не содераи? шш их плотность на jiau-бране невелика. Иначе говоря, рассматриваемые ялатки-предуас-гвенникя различаются в антигенном отпадении, Яше предполода-нй8 поддерживается данными литературы(Kuzneteky et el.1976; ■Monettв ot al, 1976}at al,,I974) ,

При добавлении тимоцитов к обработанном клеткам костного мозга.рост колоний нормализуется, но показатель Э/г восстанавливается линь частично и составляет 0,43. Можно предположить, что популяция костномозговых клеток содержит по мвюьтей ызрэ 2 типа клеток Т-ряда, Одни из них необходим для проявления колонивобразующей Функции H0BQ, другие контролирую? их дхф-фзренцировку в аритроцяном направлении. Сради тнмических дни-фоцитов.содержатся обе субпопуляции клеток, но содервдшв парных ¡элементов превышает содержание лимфоцитов, контродйруз^ щах процесс диффарекцировки К0Вс в эригроидном направленна. Нельзя исключить и той возможности, что хелперныв клетка я платка, ответственные за процесс двфференщфовкц в эрятро-шшол направлении принадлежат к одной и той же субаопуляцян лимфоцитов. Швод о том, что костномозговда клетка содарда? клетки Т-ряда, направлявшие дифференцпровку КС®с-в аритроид-ном направлении согласуется с данными литературы.

Так, shaxkia ~et ~aL (1978) обрабатывали клетка костного ыозга мшей аллоантисыгороткой к 9-антигену. Дкфференцирой-ita К0Ес смекалась в сторону грапулспоаза. Добавление тпмоця-тов нормализовало д&фферекцировку стволовых клеток.

Нами таквд изучена радиочувствительность лкмфоцптоа тимуса, 'восстанавливающие колониеобразоваяие, а таюса необхо- . димость синтеза ДНК, РНК а белка для функционирования клеток.

Установлено, что облучение тимоцитов а дозе 6 Гр на 5($ снижает их способность восстанавливать колоннеобразование, а в Дозе 8 Гр её полностью отменяла. Ингибиторы синтеза ДНК, РНК я белка (мптомитш С, актиномицин Д ii циклогексЕмзд) оказывали минимальное действие на 1иетки тамуса, восотанавля-вавдяа колоннеобразованио.

Ш. Коррекция иммуногенеза и кроветворения у животных с различными (Нормами кммунсдефицитов с помощью ионов металлов и металлокомплексов

Следующим этапом наших исследований была попытка коррекции функций стволовых клеток у иммунодефицитных линий мшей о помощью мккроалементов и синтетических металлокомплексов.

Остановлено, что однократное введение мышам пис/е хлоридов кобальта, цинка и меди, а также кобальт- и цинксодержаишх полиэяег.трслитов в несколько раз усиливает пролиферация стволовых кче-гок. Препараты оказывают стимулирующий эффект на рост врлтровдных колоний и в меньшей степени влияют на клетки-пред-иественкики гранулогшгарного ряда.

Нами установлено, что ввздение хлорида кобальта 4-х недольным мшам НРч£ существенно повышает число гранулоцитарных колоний, не оказывая влияния на рост эритроидных колоний. Показатель Э/Г падает с 6,0 (контроль) до 2,Я, т.е. происходит нормализация кроветворения. Инъекция хлоргда кобальта 8-10 мес. мышам данной линии полностью восстанавливает сниженную колонн-еобразующую способность К0Ес. Гистологический анализ показал, что ионы кобальта двухкратно стимулируют рост эритрошшых колоний и не оказывают влияния на число гранулоцитарных колоний.

Таким образом, хлорид кобальта у стареющих мышей стимулирует зритропоэз, а у моделях - граяулопоэз.

7 милей С5Я в возраста 9-ги месяцев восьмикратно снижается имониеобразуюкая способность стволовых клеток. Введение йобальтсодрржашго полиадектролита Р-ти месячным мышам С5Я полиостью восставав; гвает колониеобразующие потенции стволовых клеток. Цянксодсржаишй полиэлектродит также существенно стимулирует процесс колочиеобразования.

Итак, ионы металлов и полимерные металлокомшексы облаг деюг свойством корригировать лролифоративные свойства стволовых кяеток. При атом следует подчеркнута, что препарата наряду со стимуляцией проялфераипи стаоловых клеток, нормализуют их дифферекпировку. Очевидно, ионы металлов и метал-локомгагексы в какой-то мере замешают нарушенный механизм контроля дифф-ерекцировки стволовых клеток, либо непосред- • ственно воздействуя на стволовые клетки, либо опосредованно! путём влияния на клетки, контролирующие процооо диф)ференци-.

ровкл кроветворных стволовых юте ток. .

В дальнейших исследованиях било установлено, что у старых и старых тимэктомированных мышей резко снижается колонн-еобразующая способность эндогенных стволовых клеток. Гистологический анализ кроветворных колоний показал, что наиболее угнетена гранулоцитарная дилере ни ировка стволовых клеток, ^следствии чего отношение эритроидных колоний к гранулоиитар-ным резко увеличкваетоя. Однократная инъекция хлорида «алеза старым мышам полнестьJ восстанавливает кслониеобразухицую способность стволовых клеток. При этом увеличивается как число эритроидных колоний, так и число колоний гранулоцитарного типа. Менее выраженным стимулирующим действием на пролиферацию стволовых клеток облачает хлорид железа у старых тимэктомированных мышей.

Подученные данные указывают на то, что эффект хлорида аелеза на стволовые клетки проявляется неоднозначно в зависимости от функционального состояния тимуса. Возможно, ионы аелеза непосредственно воздейсгвуют на стволовые клетки, стимулируя их пролиферации и изменяя направление ах дифференци-ровки. Можно допустить также их опосредованное действие путём влияния на определенные субкласси тимусзависимых лимфоцитов, изменяющих направление диф^рещдкрозки стволовых клеток. Можно также предположить, что ионы аелеза влияют -а мембранные и/или внутриклеточные процессы, определяйте пролиферацию и дифференцировку клеток. О такой возможности говорит то, что некоторые ионы металлов, в частности лития, оказывают модулирующее влияние на лимфоидные клетки, усиливая их митогеи-ный ответ на ЛГС путём воздействия на метаболизм циклических нуклеотидов и проницаемость клеточной мембраны (Hart 1982).

Нами также сделана попытка коррекции сниженной колони-еобразующей способности еттоловнх гаеток у старых (19-20 мес.) мышей с помотаю двух микроэлементов- хлоридов кобальта л меди. Слагалось, что указанные микроэлементы полностью вооотанак'тиваит прслтферативныв свойства K05är.

Таким ооразом, ионы металлов обладают свойством восстанавливать nronwfepanKO с пологих каеток и частично нормализовать их лиФференпировку.

В дальнейших экспериментах исследовали aj^wt кобальт-содеркаийго полтора на иммунный отпет л функции cit-олоаых

клеток у тимэктоынроваяных мышей. Однократное введение мзтал-локомплекса существенно восстанавливает иммунный ответ. Следовательно, получеяшй результат говорит о Т-неэависимости т~ таллокомплекса. Введение сублетально облученным тимэктомнро-ванцым мышам сополимера с кобальтом полностаю восстанавливает колониеобразующуп способность стволовых клеток. Гисталогкчзсга анализ показал, что препарат з наибольшей степени стимулирует йелнй росток кроветворения, который значительно угнетён.

Тйким образом, моено сделать вывод, что металлокомплек-сн обладают свойством усиливать иммуногенез и восстанавливать функции стволовых клеток при Т-иммунодефиците.

В серии опытов нрмн установлено, что с помощью металло-комплексов можно корригировать иммунодефицит, развиваящкйоя в процессе опухолевого роста.

В последней оерик экспериментов на моделях гемолитической в постгеморрагической йнемии у крыс было установлено, что кобальт- в цинке оде ржащие сополимеры акриловой кислоты и /f-m-нилпирролидона нормализуют иммунные потенции и кроветворение, т.е. проявляют бифункциональные свойства.

Итак, можно заключить» что с помощью микроэлементов а полимерных меТаллокомплвксов моано.существенно корригировать иммуногенез пгекопоэз tipa первичных и вторичных формах ш-мунодефицктов,

С помощью синтетических мвталлсодерааишх полнэлектроли- • тов открывается возможность целенаправленной коррекции нарушенных ввеньев иммунной системы и кроветворения при различных йммунодефйцятннх состояниях,

ВЫВОДУ

I. Направленным синтезом гемопотенцирующих биометаллов о шмуноадиовайтнымя полиэлектролвтнымй макромолекулами получек новый класс синтетических вммуномодуЛяторов, обладающие полнфункцконалышм действием,

. 2. Комплексированив микроэлементов с сополимерами акриловой кислот а Л'-винклпирролидона позволило получить соединения е мощным иммунотрогшда действием» превосходящее активность цсходаих сополимеров. Метаялокомше ксы в 2-5 раз повышают юадунный ответ к эритроцита« барака на уровне целостного орга-. кизма. Препараты усиливают кооперщшэ Т- еВ- лимфоцитов,

шркааюг миграционные свойства Т- и В-лимфоцитов, но в то га зремя снижают активность специфических и неспецифнческих Т-¡упрессоров и Т-кпллеров.

3. Металлокомплексы усиливают миграцию и пролиферацию *роветворных стволовых клеток и смещают направление ¡ос диф-[)еренщгровкл в сторону эритропоэза. Препараты стимулируют шмуногеназ я кроветворение у разных видов лабораторных аи-зотных. Металлсодернащиа полиэлектролита являются действительно бифункциональными соединениями, регулирующие одновре-iestHO иммуногенез и гемопоаз,

4. Микроэлементы, входящие в состав металлокомплекса, аилжают активность Т-гатеров, Т-дифферецпкрующос лимфоцитов > в различной степени оше^тт аллогенную шпгпбицию стволовых плеток,

5. Установлено, что характер ди^ерэшнровзш кроветворны■ стволовых клеток у бестямусннх ьшш'ай hw.c!e не огличаэтся oif таковой хштактшх особей. Механизмы контроля и регуляции процесса дкфферетшровкл кроветворных стволовых кд&ток у тиыак-тонированных »дыгаей и у мышей различны.

Б. Диф} >з ре ни яров ка костномозговых стволовых клеток оплец-эктомнропашшх мышей СБА в организме реципиентов Fj на. рашшх стадиях посл8 операции смещается в сторону эритропоээа. У спленэктомированных мышей популяция Т-Днфферанщфушщх лш-фоцитов формируемая мезду 2 и 3 мес, после защизы их костным мозгом. , .

?» В костном мозга мыпей обнаружены 2 типа клеток Т-ряда» одни из них контролируют аритроидную диффереиццровку стволовых клеток, другие необходимы для проявлен!«! колоннеобразующей функции кроветворных стволовых клеток.

8. Синтетические Подпмеряыэ металлекомплексы и нояи металлов оказывают модулирующий эффект на иммуногенез и функции кроветворных стволовых клеток у аивотных с парвичнымй ( мина huclttj HR^ И С58) и вторичными [ ншэктомия* старость, опухолевый рост ) формами яммунбдефщйгаых состояний* .

9. Полимерные могаллоконплвксы сущасТЕонно шрригнруыт иммушшЧ статус и картину периферической крова у шмунодофл-

цнтных животных с гемолитической и постгеморрагической формами » кс па риме нталь них анемий.

Ю.Металлсодершзде сополимары акриловой кислоты н /¿вв-нилпирроладона могут найти практическое применение в качестве пммуно- и гймосгимулиругадос средств при сочетаниях формах иммуноде^инитних состояний различной этиологии.

СЯГСПТг РАБОТ, ОГОНШВШгаХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Еатчрбекоь A.A. ТУгияние металлов ка взаимодействие лку Монитор, со стеэлолыми клетками и аилогенную ингибицкю // Узбек ский бнол. журнал,- I9R3.- Я 5.- С. 53-57.

2. Ратырбеков A.A. Влияние металлов на функциональную активность Т-лклуЧ>цктов киллеров // Доклады АН УзССТ.- 1963.-

е f.- С. 50-52.

Л. Мам. ко В.!.'., Поверенный A.M., Бап'рСсков A.A., Саядян Х.С., Семина O.Ji«, Семенец Т.К., Хаитов P.M. Изменение направления ди'ЬТеренцировки стволовых клеток костного мозга при уда лении Т-лкыФоцитов антаыозгоаой сывороткой // Иммунсшогия.-19Ю,- » 0.32-34.

4. Башрбекоь A.A. Влияние кобальта и меди на иммуногенез в кроветворное стволовые клетки // Сб. тр.конф. поев. БО-лет. сшг. "Узб-к" С. 167-173.

5.Еатнрбокоэ A.A., "ачько В.М., Поверенный A.M. ДйЪферан цировка стволовых таеток костного мозга при удалении Т-лимФоия Тов антямпзго.АОЙ «шороткой // Мед. журнал Узбекистана.-1984.-» 9,- С, Г)ГЧ5:>.

6. Еатыро'екоп A.A. металлов ка взаимодействие ствс ловых клеток с С№гге».ны«я г аллогеннкмя лимфоцитами // Сб. тр. "Актуят. pnirp. грачег. орг. я гкпн с й". Тш ген т. -19Я4. - С. 59-ЯЛ.

7. Ватырбэков A.A., Чанько КМ., Руднева Т.Б., Халатян H.A. Йяяяиие спленактсмип на дифферекцировку гемопоэтических стволовых клеток я фупншональнум активность Т-днффврвицирую-вдх дт|кн1й5св // Иммунология,- Т9Й5.- Я 5.- П. 41-44.

ft, Качмрбокоп A.A. Влияние метаялов на пролифорени» и дифферетшроьку ствйдоьых, клеток у старых мышей // Доклады Ali ftßCP»- 19Й5.- * Г.- 0. 54-55.

9. Xhodjaev S.a., Datyrbaoov /.A., Polyner metal сокр1а* «шЦ their biological aotivity // 31 IUPAC Ifacromoleoular еушрсвИш. leoh. Unever., Uaraebuxg. GDR.- 1987,- p. 271.

10. Муратходдаев <T>.H., Каратигин О.Г., Ходогаев С.Г., Ба-гырбеков A.A. Влияние низкомолекулярных комплексов полимеров

) цинком и кобальтом на иммунный ответ и функции кроветворных 5тволовых клеток // Мед. журнал Узбекистана.-1988.-Л 4.- С. 58 - 51.

11. Батырбеков A.A., Ходжаев С.Г., Муратходхаев Ф.Н., {аратыгин О.Г., 7см а/га в а A.C. Кл пялка узкодисперсных сополимеров и их полимерных металлокомплексов на иммунный ответ к эритроцитам барана // Сб. ■ туч. тр. "Оценка имук. стат. и его корр. при разл. патл. сост."Тешкеят.- IS88.- С. 16-1Я.

12. Муратходжаев Ф.Н., Ходжаев С.Г., Батирбеков A.A. Коррекция иммунного ответа у мышей^-опухолаиосителей с по--мощью синтетических металлокомплексов // Доклады АН УзССР.-1988.- !t В.- С. 56-57.

13. Батырбеков A.A., Сирота А.?., Кадырова М.Г. Коррекция вторичных иммунолефицитоп при желеэодефицитиой и гемолитической анемии // Тез. докл. 1-й 03л. конф. "Втор, иымуно-деф. иифек. и некнфек. этиол.".Харьков.- 19ВД.- С. 9.

14. Батырбеков A.A., Сирота А,Р., Кадырова М.Г. Коррекция иммунодефицнтных состояний npir различных формах анемий с помощь» синтогпческих металлокомплексов // Сб. тр. Реопубл. конф. "Иммунодефицита и НЬ А-сиотема".Ташкент,- 1989.- О» 105-106.

15.Батырбеков A.A. .Сирота А.Р. .Кадырова И.Г. Блишша цинк-содержащего полизлектролита на иммунный ответ при хронической постгеморрагической анемии у беренеиных крыс // Доклады АН УаССР,- 1989,- >& Я,- С, 57-5Я.

16. Батырбеков A.A..Сирота А.Р. .Муратходжаев Ф*Н.,Усмано-ва A.C., Ибрагимова Э.Р. Коррекция синтетическими маталлокомп-лексами вторичных кммуиодефгаштных состояний // Тез.докл. Первого Всесоюз. омзда иммунол,- Сочи.-1989,-Т. 2,- С.ГА9.

17. Батырбоков A.A. Доджаев С.Т. ,'Гашев М.М. .Рафиков Р.З. Полимерные металлоксмплекси - новый тли физиологически активных полимеров.бифункционального действия //Тр. Х1У Менделеев, съезда по общ. и прнкл. химии. "Ташкент.- ГЭС9.- С.407. •

Iß. Батирбвков A.A. Иоследоввнло дм^фврекцнровгд ствол о-' вих кроветворных.клеток.у Мышей ишунодвфицитных ланий // Иммунология,- 1990,- Ä 2.- С. 2Р-27,

19. Betyrbeoor А,Л,, Kbodjaer S.U., Hefioov H., Toeher Ы.М. Bif'xnotlonal biologioel acilvity of poljrraer-ma tel coaiplesi oorreJ tion betweea phyeloo-ehisiieal end bioraedlool propartles // 33 IUI taternet. Зувр. of ÜKoromoleo. MonJroel, Canada.- 1990.- P. 104,

20. Ходжаев C.T., Ватырбеков A.A., Муратходвввв Ф.П, Заявка на а.с. й 44R263C/3I-05 097ff75 'Водорастворимые »гетолл-лолимерные комплексы в качестве стимуляторов иммупо-геиепа и гемоповэа п способ их получения", I9B9.

21. Катарбеков A.A., Муритходашев Ф.Н., Ходдаэв С.Г. Заявка на а.о. й 4495772/ЗП-Г4 124254 "Способ трансплантации клеток костного мозга ",1989.