Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Роль эффекторных цитотоксических лимфоцитов в иммунопатогенезе различных вариантов течения ревматоидного артрита

На правах рукописи

Умар Владимирович

ХАСАНОВ

4858924

IV

РОЛЬ ЭФФЕКТОРНЫХ Щ1ТОТОКСИЧЕСКИХ ЛИМФОЦИТОВ В ИММУНОПАТОГЕНЕЗЕ РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТОВ ТЕЧЕНИЯ РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА

14.03.09- клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

з т 2011

Ростов-на-Дону 2011

4858924

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор Сизякина Людмила Петровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Пинегин Борис Владимирович

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Зотова Валентина Владимировна

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится « ф> ир 2011 года, в П-0О часов на

—> заседании диссертационного совета Д 208.082.02 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (344022, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РостГМУ Минздравсоцразвития России ^

Автореферат разослан « ¡С/ » ^ 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, д.м.н.

Н.Ю. Пшеничная

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЬ.1

Актуальность проблемы. В настоящее время ведутся активные исследования особенностей механизма развития заболеваний, в возникновении и' про-грессировании которых дисфункция иммунной системы играет основную патогенетическую роль (Ярилин А.А, 2008). Следствием дисфункции иммунной системы является формирование иммуноопосредованных заболеваний, в том числе инфекционных, аллергических, лимфопролиферативных, аутоиммунных заболеваний (Сизякина Л.П., 2011).

Аутоиммунная патология формируется при срыве иммунологической толерантности, когда в результате реакций иммунной системы на аутоанти-гены появляются аутоантитела или сенсибилизированные лимфоциты, приводящие к повреждению клеток организма (Сизякина Л.П., 2006). Несмотря на то, что этиология аутоиммунных заболеваний остается во многом дискуссионной, многие иммунопатогенетические механизмы изучены достаточно подробно (Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., Калинина Н.М.,

2008). Очевидно, что в их реализации задействовано большое количество иммунокомпетентных клеток, которые сами или через свои продукты приводят к развитию болезни и ее осложнений (Чередеев А. Н., 1998; Сизякина JI. П., 2005).

Понятно, что при этом взаимодействие клеток между собой, их продуктами и клетками-мишенями играет основополагающую роль (Караулов A.B.,

2009). Активное изучение механизмов этих взаимодействий лежит в основе более полного понимания сути патологических процессов и явлений, происходящих в организме при формировании заболеваний, связанных с нарушением иммунного ответа на каком-либо его этапе (Симбирцев A.C., 2004)

Распространенность аутоиммунной патологии неуклонно растет и на сегодняшний день достигает 3% от общей численности населения (Chapel Н., Haeney М., 2008). Одним из наиболее часто встречаемых аутоиммунных заболеваний является ревматоидный артрит (РА). Частота РА в популяции, согласно данным ВОЗ, составляет от 0,6% до 1,3%, а у близких родственников она достигает 3-5 %. Женщины болеют чаще по сравнению с мужчинами (Мазуров В.И., 2005). Суть патологического процесса при РА составляет генерализованное иммунологически обусловленное воспаление, приводящее к развитию широкого спектра внесуставных (системных) органных проявлений и катаболических нарушений (Насонов Ё.Л. 2006). При формировании ревматоидного артрита существенная роль отводится усилению процессов пролиферации с выраженной супрессией апоптоза, повышению экспрессии ак-тивационных маркеров, нарушению баланса про- и противовоспалительных цитокинов (Сизякина Л.П., 2006). Преобладание продукции провоспалитель-ных цитокинов: фактор некроза опухоли-альфа (ФНО-а), йнтерлейкин-1бета (ИЛ-lß), ИЛ-6, ИЛ-17 играет ключевую роль в иммунопатогенезе РА (Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., 2008). При этом продукция противовоспалительных цитокинов ИЛ-10, ИЛ-4 у больных РА снижается (Сизякина Л.П., 2008).

Исследование иммунологических нарушений при РА открывает перспективы для усовершенствования методов диагностики и понимания клинической гетерогенности болезни, продолжаются поиски новых методов, адекватно отражающих иммунный статус при различных клинических вариантах ревматоидного артрита (Насонов Е.Л., 2001). Несмотря на большое количество исследований, до сих пор интимные механизмы формирования ревматоидного артрита изучены недостаточно. В частности, дискуссионной является роль цитотоксического звена иммунной системы в генезе различных вариантов течения РА, не менее спорным является представление о связи функциональной активности цитотоксических лимфоцитов с прогнозом течения заболевания. Практически не прослежена значимость цитотоксического звена иммунной системы в эволюции РА, а также возможность его использования в качестве диагностических критериев прогноза заболевания и контроля .эффективности проводимой терапии (Сизякина Л.П., 2008)

В связи с этим целью работы является выявление роли эффекторного цитотоксического звена иммунной системы в формировании различных вариантов течения ревматоидного артрита, а также при разных степенях активности и длительности заболевания.

Задачи исследования:

1. Выявить роль эффекторного цитотоксического звена иммунной системы в формировании различной степени активности суставной формы серопози-тивного и серонегативного вариантов РА.

2. Выявить влияние параметров цитотоксических лимфоцитов на формирование варианта прогрессии системного воспалительного процесса.

3. Изучить динамику показателей лимфоцитов, обладающих цитотоксическим потенциалом в зависимости от длительности РА.

4. Разработать способ дифференциальной диагностики степени активности РА в зависимости от особенностей эффекторных цитотоксических клеток.

5. Разработать алгоритм прогноза варианта прогрессии РА в зависимости от состояния цитотоксического звена иммунной системы.

Научная новизна работы:

1.У пациентов с серонегативным вариантом суставной формы РА отмечена прямая корреляционная зависимость параметров цитотоксических лимфоцитов от степени активности системного воспалительного процесса. При этом механизм усиления цитотоксичности СВЗ+Сй8+ осуществляется за счет повышения пула эффекторных клеток на ранней стадии активации и увеличения функциональной активности, а у СБЗ'СВ(1б+56)+ позитивных лимфоцитов за счет не секреторного лизиса.

2. При серопозитивном варианте РА рост аутоиммунной агрессии напрямую связан с активацией эффекторного звена иммунной системы, которая заключается в повышении содержания С03+СБ8+С025+ позитивных лимфоцитов, а также увеличении функциональной активности СБЗ+СВ8+ лимфоцитов за счет активации СВЗ+СВ8СБ95Ь опосредованного лизиса клетки мишени и

выработки ГранзимВ. Лимфоциты, несущие СВЗ"СБ(16+56)+ реализуют ци-тотоксический потенциал за счет усиления секреторного лизиса.

3. У паЦиентбв с серонегативным вариантом РА выявлено угнетение цито-токсического звена иммунной системы при медленной прогрессии, при быстром развитии заболевания повышение активности цитотоксических лимфоцитов происходит за счет усиления не секреторного лизиса и увеличения пула эффекторных клеток, вырабатывающих ГранзимВ. Цитотоксический эффект НК усиливался за счет секреторного, несекреторного лизиса и анти-телозависимой клеточной цитотоксичности.

4. Скорость прогрессии серопозитивного варианта суставной формы РА прямо пропорциональна активности эффекторного цитотоксического звена иммунной системы, что верифицируется повышением экспрессии ранних акти-вационных маркеров СБЗ+СВ8+СБ25+ и усилением цитотоксичности за счет выработки ГранзимВ активированными СБЗ+С08+ лимфоцитами. Цитотоксический эффект СБЗ"СО(16+56)+ реализуется с помощью секреторного лизиса, а также антителозависимой клеточной цитотоксичности.

4. Анализ параметров эффекторного звена иммунной системы при длительности течении серонегативного и серопозитивного РА больше 5 лет выявил снижение экспрессии маркеров ранней активации СВЗ+СБ8+СВ25+, повышение количества лимфоцитов на поздней стадии активации СБЗ+С08+НЬА БЛ и угнетение цитотоксического потенциала. Обратная корреляционная зависимость была выявлена и в функциональной активности СВЗ"СБ(16+5б) за счет угнетения механизма цитотоксичности опосредованного СОЗ' СО(16+56)+ СБ95Ь.

5. Разработан способ диагностики степени активности РА, отличающийся от существующих аналогов достаточно полной, адекватной оценкой состояния иммунной системы и объективно отражающей клинические проявления заболевания.

6. Впервые определены достоверные признаки, убедительно указывающие на усиление цитотоксичности эффекторных лимфоцитов при быстрой прогрессии РА которые можно использовать при разработке алгоритма, позволяющего с высокой степенью достоверности проводить прогноз течения заболевания.

Практическая значимость работы:

Полученные результаты исследования позволили:

1. Усовершенствован способ диагностики степени активности РА

2. Определены показатели цитотоксического звена иммунной системы, позволяющие проводить прогноз течения заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Активация цитотоксического звена иммунной системы имеет патогенетическое значение в генезе различной степени активности суставной формы

РА и характеризуется прямой корреляционной зависимостью аутоиммунной агрессии от цитотоксического потенциала эффекторных лимфоцитов.

2. Скорость прогрессии системного воспалительного процесса напрямую зависит от параметров цитотоксического звена иммунной системы.

3. Длительное течение суставной формы РА характеризуется снижением экспрессии ранних активационных маркеров, повышением количества цитоток-сических лимфоцитов на поздней стадии активации и снижением функционального потенциала эффекторных клеток.

4. Способ дифференциальной диагностики степени активности суставной формы РА включает анализ количественных параметров CD3+CD8+ позитивных лимфоцитов, исследование экспрессии активационных маркеров и оценку цитотоксической активности эффекторных клеток.

5. Алгоритм, позволяющий с высокой точностью проводить прогноз течения заболевания включает мониторинг параметров эффекторных цитотоксиче-ских лимфоцитов, проявляющих специфическую цитотоксическую активность, а также количественные, функциональные параметры киллерных клеток.

Внедрение результатов исследования:

Материалы диссертации включены в лекции и семинарские занятия на кафедре клинической иммунологии и аллергологии ФПК и ППС, а также в практическую деятельность НУПК «Клиническая иммунология» ГОУ ВПО Ростовского государственного медицинского университета; используются на этапах диагностики и лечения больных кардиоревматологического отделения РостГМУ г. Ростова-на-Дону и ревматологического отделения ГУЗ «Областная больница № 2».

Апробация работы:

Основные положения работы доложены, обсуждены и получили положительную оценку на:

1. 63-я Итоговой научной конференции молодых учёных РостГМУ, (г. Ростов-на-Дону, 23 апреля 2009 г.),

it IV Нау^йё-йрактйчёской кйнферёнЦйй Южного федерального 6kpyfa «Ate т^альнШ йрбблёМЫ клинической иммунологии и йллергйлогйи», (г. Пятй' ropcKi 2i октября 2009 г.),

3; Всероссийская национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология - практическому Здравоохранению» (tv МоСКва, 25 февраля 2010),

4. 29th Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology», (Great Britain, London 6th of June 2010).

5. 30th Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology, (Istanbul 11th of June 2011).

6. Congress of the Federation of Clinical Immunology Societies (June 23 2011 in Washington, D.C., USA)

Публикации.

Основные положения диссертации изложены в 8 научных работах, из них 4 опубликовано в изданиях, входящих в перечень ВАК РФ: Российский аллергологический журнал, Цитокины и воспаление, Иммунология (2), а также в материалах российских и международных конференций и форумов. Оформлена заявка на изобретение «Способ дифференциальной диагностики степени активности ревматоидного артрита». Получена приоритетная справка от 28.02.2011 №2011107615

Объем и структура диссертации:

Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, двух глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя (20 источников на русском и 22 на иностранных языках) и приложений. Работа содержит 54 таблицы и 9 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.

Проводилось клинико-иммунологическое обследование 74 больных страдающих суставной формой РА, находившихся на стационарном лечении в кардиоревматологическом отделении РостГМУ, а также в ревматологическом отделении ГУЗ Областной больницы № 2 за период с 2008 по 2011 годы. Контрольную группу составили 15 здоровых доноров. Диагноз устанавливался на основании диагностических критериев Американской ревматологической ассоциации 1987 года и классификации Ассоциации ревматологов России 2007 года. Пациенты были разделены на две группы, первую группу составили 39серопозитивных по ревматоидному фактору (РФ) пациентов (52,7%), а вторую группу 35 больных (47,3 %), серонегативных по РФ. В зависимости от варианта течения заболевания, внутри каждой группы были выделены Подгруппы; 1 подгруппа - больные со средней и высокой степенью активности PA, II подгруппа - больные с Медленной и быстрой профессией аутоиммунной патологии, III подгруппа - пациенты были разделены в зависимости от длительности заболевания: меньше и больше 5 Лет.

Для решений поставленных задач использован комплекс клинических, лабораторных и статистических методов исследования. Применение клинических методов исследования имело важную роль для определения варианта течения суставной формы ревматоидного артрита. С этой целью проводился опрос пациентов о локализации и интенсивности болей в суставах болевого синдрома по визуальной аналоговой шкале (ВАШ) от 0 до 100 мм. Оценка качества жизни больных была основана на результатах вопросов функ-

ционального теста Ли. С целью определения активности РА был использован индекс DAS28 (Насонов Е.Л., 2005).

Лабораторные методы включали общий анализ и биохимическое исследование крови. Инструментальные методы исследования включали ультразвуковое исследование внутренних органов, а также рентгенологическое исследование кистей рук и стоп в прямой проекции.

Фенотипирование лимфоцитов проводилось методом проточной ци-тофлюориметрии на цитофлюориметре Beckman Coulter FC500 (США) с использованием моноклональных антител (Beckman Coulter, США) в прямом иммунофлюорисцентном тесте.

Помимо определения CD3+, CD3+CD4+, CD20+, был проведен анализ количественных параметров цитотоксических лимфоцитов, несущих рецептор CD3+CD8+, CD3CD(16+56)+.

В работе был изучен функциональный потенциал эффекторных клеток, включающий анализ экспрессии активационных маркеров CD3+CD8+CD25+, CD3+CD8+HLA DR, определение содержания цитотоксических лимфоцитов, имеющих поверхностный маркер CD3+CD8+CD95L, способных индуцировать апоптоз клеток-мишеней. Цитотоксическую активность лимфоцитов оценивали по выработке сериновой протеазы- основной эффекторной молекулы Гран-зимВ. Функциональную активность натуральных киллеров (НК) определяли с помощью лейкемических клеток линии К562, чувствительных к лизису натуральными киллерами (Пинегин Б.В. 2001), а также в тесте с помощью феномена антителозависимой клеточной цитотоксичности (Караулов A.B., 1999). Количественно определяли иммуноглобулины классов А, М, G (Манчини, 1965), количество циркулирующих иммунных комплексов (Гриневич Ю. А., 1981), а также интенсивность кислородзависимого метаболизма в НСТ-тесте (Пинегин Б.В., 1989). '

Статистическая обработка полученных данных проводилась на ПК с помощью программного обеспечения Statistica 8.0.360.

Результаты исследований и их обсуждение.

При изучении параметров цитотоксического звена иммунной системы у больных со средней степенью активности суставной формы серонегативно-го РА, выявлено статистически достоверное снижение относительного и абсолютного числа лимфоцитов, несущих рецептор CD3+CD8+ (табл.1). Несмотря на снижение количества, отмечается усиление процессов ранней активации, что документируется статистически достоверным повышением относительного и абсолютного числа клеток, экспрессирующих поверхностный маркер CD3+CD8+CD25+(Ta6n.l). Анализ функционального потенциала подтвердил наличие активации цитотоксического звена иммунной систем, что верифицируется статистически достоверным повышением содержания активированных цитотоксических лимфоцитов, вырабатывающих ГранзимВ и мононуклеаров способных индуцировать апоптоз клеток-мишеней CD 3+CD 8+CD 8+CD9 5 L.

Таблица 1.

Характеристика параметров эффекторного цитотоксического звена иммунной системы при средней и высокой степени активности суставной формы серонегативного РА____

Параметр Контрольная группа Средняя степень активности Высокая степень активности

СПЗ+С08\% 21,8±1,6 15,00±1,51* ** 22,80±1,85

С03+С08+,1*Ю* 0,4±0,05 0,28±0,03* ** 0,69±0,034*

С03"С08+С025+,% 1,26±0,03 2,18±0,02* ** 2,90±0,03*

С03+СБ8+С025+, 1*10" 0,02±0,001 0,04±0,002* ** 0,09±0,01*

С03+СВ8+С095Ь,% 0,4б±0,05 0,74±0,02* ** 0,58±0,03*

С03+С08+С095Ь, 1*10у 0,008±0,001 0,012±0,001* *» 0,009±0,001

СБЗ+СВ8+НЬА БЫ,% 0,94±0,07 0,69±0,03* ** 0,86±0,02

С03+С08+НЬА ОЯ,1*Ю" 0,016±0,004 0,012±0,002 ** 0,03±0,002*

СОЗ+СП8+ГранзимВ,% 9,38±2,21 17,13± 1,35* ** 24,09± 0,68*

С03+С08ТранзимВ, 1*10" 0,16±0,005 0,34±0,004* ** 0,73±0,002*

СОЗ'СО(16+56)+, % 12,1±1,2 12,62±1,80 ** 7,60±1,54*

СПЗ-СВ(16+56)+, 1*10у 0,2±0,03 0,24±0,02 0,23±0,04

СОЗ'С1Х16+56)+СБ951Д% 22,75±2,10 28Д5±2,51* **33,21±1,51*

СШ"СО(16+56)+СВ95Ь+, 3*10* 0,40±0,002 0,56±0,003* **1,0Ш),001*

ЦГА 48,31±14,22 71,91±5,22* 81,71±7,93*

ЦТА (К562) 36,12±4,28 52,63±3,83* 62,72±5,83*

Примечание.

"■-достоверные различия показателей по сравнению с контрольной группой (р<0,05);

^-достоверные различия показателей в группе с высокой степенью активности по сравнению со средней (р<0,05);

Количество натуральных киллеров при средней степени активности суставной формы серонегативного РА не отличалось от контрольных значений, однако повышена цитотоксическая активности клеток, несущих рецептор СВЗ"СБ(16+56)+ , способных реализовать киллерный потенциал без участия антиген распознающего рецептора (табл.1). Выявлено, что при средней степени активности суставной формы серонегативного РА биологический эффект НК реализуется преимущественно за счет несекреторного лизиса, при котором апоптоз клетки-мишени индуцируется при взаимодействии с Рая-^апс! на поверхности киллерных клеток, что документируется статистически достоверным повышением относительного и абсолютного числа лимфоцитов, экспрессирующих рецептор СОЗ~СВ(16+56)+ СБ95Ь (табл.1). На увеличение цитотоксической активности НК указывали и результаты цито-токсических тестов.

При исследовании количественных параметров цитотоксических лимфоцитов при высокой степени активности, не выявлены изменения в содержании лимфоцитов, несущих рецептор СОЗ+СБ8+ по сравнению с контрольной группой (табл.1). Эффекторные клетки экспрессировали маркеры ранней активации, что документируется статистически достоверным повышением относительного и абсолютного числа лимфоцитов, несущих рецептор

СБЗ+СВ8+С025+. В то же время количество цитотоксических лимфоцитов на поздней стадии активации при высокой степени аутоиммунной агрессии снижается, хотя и незначительно (табл.1).

Анализ цитотоксического потенциала СОЗ+СБ8+ позитивных лимфоцитов выявил активацию эффекторного звена иммунной системы, на что указывает статистически достоверное повышение количества активированных лимфоцитов, несущих рецепторный комплекс СВЗ+С08+СБ95Ь, а также активация гранзим-перфоринового механизма уничтожения клетки-мишени (табл.1).

Анализ количества лимфоцитов, имеющих поверхностный рецептор СБЗ'СВ(16+56)+ и проявляющих неспецифическую цитотоксичность, выявил статистически достоверное снижение относительного числа при высокой степени активности аутоиммунного процесса по сравнению с контролем. Несмотря на снижение количества, функциональная активность была существенно увеличена за счет усиления несекреторного лизиса, что документируется статистически достоверным повышением относительного и абсолютного числа киллерных клеток, способных индуцировать апоптоз клетки-мишени и активации антителозависимой клеточной цитотоксичности.

Сравнительный анализ параметров цитотоксического звена иммунной системы при средней и высокой степени активности серонегативного РА выявил статистически достоверное повышение относительного и абсолютного числа лимфоцитов, экспрессирующих рецептор СБЗ+С08+ при высокой степени аутоиммунной агрессии. Процессы ранней активации в большей степени были усилены при высокой степени активности РА, также как и повышение содержание лимфоцитов с поверхностным фенотипом С03+С08+НЬА Б Я. Анализ функционального потенциала цитотоксических лимфоцитов, выявил большее повышение цитотоксической активности при высокой степени аутоиммунной агрессии, за счет усиления секреторного лизиса, на что указывает статистически достоверное повышение относительного и абсолютного числа С03+С08+ГранзимВ позитивных лимфоцитов (табл.1).

Сравнительный анализ количества натуральных киллеров, выявил статистически достоверное снижение относительного числа при высокой степени активности аутоиммунного процесса по сравнению со средней. Исследование цитотоксического потенциала натуральных киллеров выявило в большей степени существенную активацию при высокой активности процесса, о чем свидетельствует статистически достоверное повышение относительного й абсолютного содержания киллерных клеток, несущих поверхностный рецептор СБЗ"СО(16+56)+СВ95Ь (табл.1).

Учитывая особенности иммунопатогенеза серопозитивного варианта РА, обусловленные чрезмерной агрессией иммунокомпетентных клеток, локализованных в глубоких слоях синовиальной оболочки, представлял большой интерес анализ параметров цитотоксического звена иммунной системы, при различной степени активности аутоиммунной патологии.

В относительном и абсолютном числе лимфоцитов, несущих рецептор СОЗ+СБ8+ статистически значимых различий не было при средней степени

активности серопозитивного РА по сравнению с показателями контрольной группы (табл.2). При изучении экспрессии активационных маркеров на поверхности цитотбксических лимфоцитов, было выявлено повышение количества эффекторных клеток на ранней стадии активации, что документируется статистически достоверным повышением относительного и абсолютного числа мононуклеаров с фенотипом СВЗ+С08+СБ25+. Количество цитотокси-ческих лимфоцитов на поздней стадии активации было существенно снижено, что верифицируется статистически достоверным уменьшением относительного и абсолютного количества клеток, экспрессирующих рецептор СВЗ+СБ8+НЬА БЛ (табл.2).

Таблица 2.

Характеристика параметров эффекторного цитотоксического звена иммунной системы при средней и высокой степени активности суставной формы серопозитивного РА____

Параметр Контрольная группа Средняя степень активности Высокая степень активности

С03+С08\% 21,8±1,б 23,56±1,90 **18,00±2,69

С03+С08+,1*ЮУ 0,4±0,05 0,41±0,05 ** 0,31±0,01*

С03+С08+С025\% 1,26±0,03 2,06±0,02* **4,0б±0,03*

СВЗ+СБ8+С025+, 1*10а 0,02^0,001 0,04±0,002* ** 0,07^0,001"

С03+С08+С095Ь,% 0,46±0,05 0,64±0,02* 0,6б±0,03*

С03+С08+С095Ь, 1*10ч 0,008±0,001 0,01±0,001* 0,01±0,001*

СШ'СШИЬА1Ж,% 0,94±0,07 0,61±0,03* **0,99±0,02

СШ+С08+НЬА БЛ, 1 * 104 0,016±0,004 0,01±0,002* **0,02±0,002

СБЗ+С08+ГрашимВ,% 9,38± 2,21 30,15±2,51* 34,01±1,51*

СОЗЧЛ^ранзимВ, 1 * 104 0,1б±0,005 0,55±0,003* **0,58±0,001*

СОЗ"СО(16+56)\ % 12,1±1,2 7,16±1,51* **11,85±1,12

СОЗ'СО(16+56)+, 1*10" 0,2±0,03 0,13±0,01* 0,20±0,07

СОЗ"СВ(16+56)+ ГранзимВ, % 10,21±1,10 19,92± 1,35* **27,02±0,88*

СОЗ"СВ(16+56)+ГранзимВ, 1*10" 0,14±0,02 0,21±0,004* **0,46±0,002*

ЦТА 48,31±14,22 69,42±5,22* **84,64±4,93*

ЦТА (К562) 36,12±4,28 48,98±3,83* **65,62±6,83*

Примечание.

■"-достоверные различия показателей по сравнению с контрольной группой (р<0,05);

**-достоверные различия показателей в группе с высокой степенью активности по сравйеИию со срёДней (р<0,05);

Прй изучений функционального потенциала, выявЛенй статистически дбст6вё|)й6е повышение относительного И абЬоЛютйого чисЛа позитивных цитотоксических лимфоцитов, способных индуцировать апоптоз клеток-мишеней у пациентов со средней степенью активности РА по сравнению с показателями контрольной группы. На повышение функционального потенциала указывало и существенное, статистически достоверное повышение относительного и абсолютного числа цитотоксических лимфоцитов, вырабатывающих основную эффекторную молекулу

ГранзимВ, посредством которого клетки реализуют свой биологический эффект (табл.2).

Анализ параметров эффеторногб звена иммунной системы выявил ряд данных, убедительно указывающих на наличие активности цитотоксического звена иммунной системы. То, насколько патогномоничны выявленные изменения для средней степени активности серопозитивного РА, играют ли они патогенетическую роль при формировании той или иной стадии аутоиммунного воспалительного процесса можно будет судить после сопоставительного анализа, включающего изучение также и параметров натуральных киллеров.

При анализе количества лимфоцитов, проявляющих цитотоксическую активность, выявлено статистически достоверное снижение относительного и абсолютного числа лимфоцитов с фенотипом СВЗ(Л}(16+56)+ при средней степени активности по сравнению с контролем. Обращает .внимание существенное повышение функциональной активности НК, которая верифицируется статистически достоверным увеличением относительного и абсолютного числа СОЗ"СО(16+56)+ГранзимВ позитивных лимфоцитов, а также результатами цитотоксических тестов (табл.2).

При анализе количественных параметров лимфоцитов, несущих рецептор СБЗ+СВ8+ при высокой степени активности выявлено снижение по сравнению с контролем. При этом интенсифицированы процессы ранней активации, что верифицируется статистически достоверным повышением относительного и абсолютного числа мононуклеаров с фенотипом СБЗ+С08+СБ25+. Количество цитоксических лимфоцитов экспрессирующих маркеры поздней активации СБЗ+С08+НЬА БЛ не отличалось от показателей контрольной группы (табл.2).

Отмечается также существенное повышение цитотоксического потенциала при высокой степени активности, на что указывает статистически достоверное повышение относительного и абсолютного числа цитотоксических СБЗ СБ8 ГранзимВ позитивных лимфоцитов и мононуклеаров, несущих ре-цепторный комплекс СБЗ+С08+СБ95Ь и способных индуцировать апоптоз клетки-мишени(табл.2).

При анализе количества натуральных киллеров у пациентов с высокой степенью активности аутоиммунной агрессии, как в относительном, так и в абсолютном числе статистически значимых изменений по сравнению с контрольными данными не было вьивлено. Отмечается повышение цитотокси-ческой активности, что верифицируется статистически достоверным повышением относительного и абсолютного числа СОЗ"СВ(1б+56)+ГранзимВ позитивных лимфоцитов и результатами цитотоксических тестов.

При увеличении степени аутоиммунной агрессии у пациентов с серопо-зитивным вариантом РА, снижается количество цитотоксических лимфоцитов. Не до конца ясна природа этой обратной зависимости: является ли угнетение цитотоксического звена иммунной системы фактором, предрасполагающим к более агрессивному течения аутоиммунного процесса. Для того чтобы найти ответ на поставленные вопросы, необходим углубленный анализ эффекторного цитотоксического звена иммунной системы.

Сопоставительный анализ параметров цитотоксических лимфоцитов при различной степени активности РА, выявил усиления процессов ранней активаций на фоне снижения количества клеток, небущих рецептор СВЗ+СБ8+ при высокой степени активности по сравнению со сред-ней(табл.2). Выявлено повышение количества эффекторных клеток, на поздней стадии активации при высокой степени активности, что верифицируется статистически достоверными изменениями в количестве клеток с фенотипом СБЗ+СВ8+НЬА БЯ. Что касается функционального потенциала эффекторных лимфоцитов, несмотря на сохраняющуюся высокую функциональную активность, количество СЕ>3+СВ8+СБ95Ь позитивных лимфоцитов практически не отличалось в группах со средней и высокой степенью активности суставной формы серопозитивного РА (табл.2). Однако, высокая степень активности РА, все же сопровождалась усилением секреторного лизиса, что документируется повышением количества лимфоцитов вырабатывающих ГранзимВ, а изменения в абсолютном числе клеток, с поверхностным рецептором С03+С08+ и вырабатывающих сериновые протеазы имели статистически достоверный характер.

В свете полученных данных, весьма интересно вернуться к поставленным вопросам, по поводу зависимости параметров цитотоксического звена иммунной системы и степени активности РА.

Судя по тому, что при возрастании аутоиммунной агрессии снижается количество СОЗ+СЮ8+ лимфоцитов, может сложиться мнение, что угнетение цитотоксического звена иммунной системы является фактором, определяющим высокую степень активности системного воспалительного процесса, однако полученные данные опровергли это предположение. Несмотря на то, что количество эффекторных клеток снижено при высокой степени агрессии РА, активация эффекторного звена достигла наибольшей степени. Таким образом, мы наблюдаем не угнетение цитотоксического звена иммунной системы, а напротив - активацию. А снижение количества СОЗ+СБ8+ позитивных лимфоцитов с ростом активности аутоиммунной агрессии, можно оправдать тем, что исследования проводилось в периферической крови, а эффекторные лимфоциты мигрировали в очаг воспаления- синовиальную оболочку суставов. Возможно, по этой причине, диагностическая ценность исследования параметров цитотоксических лимфоцитов, не оценена по достоинству. Учитывая зависимость степени активности РА от параметров цитотоксического звена, на основании полученных данных, можно выдвинуть предположение, что именно активация эффекторного звена иммунной системы, является фактором, предрасполагающим к более агрессивному течению системного воспалительного процесса и определение параметров этих клеток, можно использовать как диагностические критерии той или иной стадии активности РА.

При высокой степени активности серопозитивного варианта суставной формы РА наблюдается активация цитотоксических лимфоцитов, реализующих киллерный потенциал без помощи антиген-распознающего рецептора по сравнению со средней степенью аутоиммунной агрессии. Повышено было

как количество НК при высокой степени активности РА, что документируется статистически достоверным увеличением относительного числа СБЗ' СО(16+5б)+ лимфоцитов, так и функциональный потенциал этих' клето<с. Убедительными доказательствами усиления цитотоксической активности НК, является существенное, статистически достоверное повышение относительного и абсолютного числа СБЗ ~СО( 16+5 6)+ГранзимВ позитивных лимфоцитов и результаты цитотоксических тестов(табл.2).

При исследовании количественных параметров цитотоксических лимфоцитов у больных с суставной формой серонегативного РА, при медленно прогрессирующем варианте статистически достоверных различий по сравнению с контрольной группой не выявлено (табл.3).

Однако, несмотря на то, что количество эффекторных клеток не отличалось от контрольных показателей, статистически достоверно была снижена экспрессия как ранних СБЗ+СВ8+С025+, так и поздних активационных маркеров СВЗ+СБ8+НЬА БЯ. Анализ функционального потенциала цитотоксических лимфоцитов, выявил снижение числа СВЗ+СБ8+ГранзимВ позитивных клеток при медленной прогрессии по сравнению с контролем. В относительном числе цитотоксических лимфоцитов, способных индуцировать апоп-тоз клеток мишеней статистически значимых различий не было, однако абсолютное число СОЗ+СВ8+СБ95Ь лимфоцитов было существенное снижено при медленной прогрессии аутоиммунного процесса (табл.3).

В свете полученных данных, представлял большой интерес исследование параметров цитотоксических лимфоцитов, проявляющих неспецифическую цитотоксическую активность. Анализ цитотоксического потенциала натуральных киллеров выявил статистически достоверное снижение относительного и абсолютного числа лимфоцитов, способных индуцировать апоп-тоз клетки-мишени и несущих рецептор СОЗ"СБ(16+56)+ СБ95Ь. Однако, несмотря на то, что при медленной прогрессии системного воспалительного процесса подавлен несекреторный лизис, результаты цитотоксических тестов не отличались от контрольных значений (табл.3).

Изучив параметры цитотоксических лимфоцитов при медленном варианте прогрессировать, серонегативного ревматоидного артрита было выявлено существенное угнетение эффекторного цитотоксического звена иммунной системы. Но все же остается ряд вопросов, в частности, носят ли выяв-Яёнййе йзШёШЬШ йаютеМетйЧескШ харак+Ьр, якйяеШ лй ЬШжейиё кВлйче-ШёнйМ, айиваШоййУх; фуккЦиойапкйЫк НйраШтров ЦйтэтоксЙчеекйх Мймфоцйтов сдерживающкМ йеханйзйЬм быстрой Прогрессий ауййммунйо-Го процесса.

Таблица 3.

Характеристика параметров эффекторного цитотоксического звена иммунной системы в зависимости от варианта прогрессирования суставной формы серонегативного РА

Параметр Контрольная Группа Медленная Прогрессия Быстрая Прогрессия

С03+С08\% 21,8±1,б 18,63±2,84 15,63±1,77*

С03+С08\1*10у 0,4±0,05 0,41±0,03 0,33±0,07

С03+С08+С025+,% 1,2б±0,03 0,58±0,02* ** 2,99±0,03*

СПЗ+СБ8+С025+, 1 * 10у 0,02±0,001 0,01±0,001* **0,06±0,001*

СПЗ+С08+С095Ь,% 0,46±0,05 0,05±0,03 ** 1,08±0,04*

СПЗ+С08+С095Ц 1*10" 0,008±0,001 0,001±0,001* ** 0,01±0,001*

СБЗТС08+НЬА ЭЯ,% 0,94±0,07 0,41±0,02 * ** 0,71±0,03*

СБЗ+С1:>8+Н1.А 011,1*10" 0,016±0,004 0,01±0,003 * 0,015±0,002

С03+С08+ГранзимВ,% 9,38± 2,21 6,98± 1,22 **15,20± 1,72*

СШ+СОв'ГрашимВ, 1*10" 0,1б±0,005 0,14±0,002 * ** 0,31±0,001*

СШ'СП(16+56)+, % 12,1±1,2 10,09±0,82 12,36±1,65

С1ЭЗ"СО(16+56)+, 1*10" 0,2±0,03 0,24±0,02 0,26±0,09

СШ'СО(16+56)+ГранзимВ, % 9,38± 2,2] 8,12± 1,22 ** 15,10± 1,72*

СШ"СО(16+56)+ГранзимВ, 1*10" 0,1б±0,005 0,16±0,002 ** 0,28±0,001*

С03"С0(1б+5б)+С095Ь+,% 22,75±2,10 5,б1±1,98* ** 23,21±1,10

С03'С0(16+56)+С095Ь+,1*Ю" 0,40±0,002 0,06±0,002 * ** 0,45±0,001*

ЦГА 48,31±14,22 55,21±6,09 ** 72,09±7,22*

ЦТА (К562) Зб,12±4,28 41,53±3,81 ** 59,13±2,49*

Примечание.

"■-достоверные различия показателей по сравнению с контрольной группой (р<0,05);

♦♦-достоверные различия показателей в группе с быстрой профессией по сравнению с медленной (р<0,05);

Поставленные вопросы определяет необходимость исследование параметров цитотоксических лимфоцитов при быстром варианте прогрессирования РА.

При быстрой прогрессии серонегативного РА выявлено снижение относительного числа лимфоцитов, несущих рецептор СБЗ+С08+ (табл.3). АналЙЗ Цит-о'-гЬксйчёскйх лимфоцитов На ранней стадйй актйваЦиЙ, выявил статистйческй дбётовернбё пойышёниё относительного и абсойктй чйсЛа МойЬнуклёарЗв, экспрессйруюифх рецеПтбр СШ+СВ8+СШ5+. КЬЛЙчёство ЖмфоциТЬв, на йоздней стадий активаций; бклв снижено, что ДЬкумёнтйру-ется статистически достоверными изменениями относйтельногЬ й абсолютного числа эффекторных клеток, имеющих на своей поверхности рецептор СБЗ+СБ8+НЬА ОЯ (табл.3).

Анализ функционального потенциала эффекторных лимфоцитов, выявил, статистически достоверное повышение количества клеток, способных индуцировать апоптоз клеток мишеней СОЗ+С1}8+СБ95Ь при быстрой прогрессии заболевания по сравнению с контролем. На увеличение функцио-

нальной активности указывает и статистически достоверное повышение относительного и абсолютного числа активированных лимфоцитов, вырабатывающих сериновую протеазу- ГранзимВ (табл.3).

Быстрый вариант прогрессии серонегативного РА характеризовался существенной активацией цитотоксического звена иммунной системы, сопровождающейся увеличением функциональной активности, несмотря на то, что количество этих клеток было снижено по сравнению с контрольной группой.

Количественные параметры естественных киллеров, экспрессирующих СВЗ"СВ(16+56)+ не отличались от контрольных показателей при быстрой прогрессии РА. При изучении функциональных параметров Ж, была выявлено повышение содержания лимфоцитов, несущих СВЗ'СВ(16+56) СБ95Ь (табл.3). На увеличение функциональной активности НК указывали результаты цитотоксических тестов, которые были статистически достоверное повышены при быстрой прогрессии РА по сравнению с контролем.

Исследование параметров цитотоксических лимфоцитов при быстром варианте прогрессирования серонегативного РА, выявило активацию цитотоксического звена иммунной системы, в то время как при медленном варианте прогрессирования изменения носили противоположный характер. Полученные данные подтверждают предположение о патогенетической роли эф-фекторных лимфоцитов при формировании различных вариантах течения РА, что можно использовать для прогноза характера течения аутоиммунного процесса.

Сравнительный анализ параметров цитотоксического звена иммунной системы выявил тенденцию к снижению числа лимфоцитов, несущих рецептор СВЗ+С08+ при быстрой прогрессии заболевания по сравнению с медленным развитием РА (табл.3). При исследовании экспрессии активационных маркеров, было выявлено существенное повышение количества мононуклеа-ров на ранней стадии активации, что документируется статистически достоверным повышением относительного и абсолютного числа лимфоцитов, имеющих поверхностный рецептор СВЗ+СВ8+СВ25+. При быстром развитии заболевания в большей степени было повышено содержание цитотоксических лимфоцитов, на поздней стадии активации и несущих рецептор СВЗ+СГ)8+НЬА ой (табл.з). Выявлено увеличение функционального потенциала ¡три быстром варианте прогрессирования РА, Повышено было число цитотоксических лимфоцитов, имеющих лиганд к рецептору апоптоза СВЗ+СВ8+СБ95Ь. Статически достоверно в большей степени было повышено относительное и абсолютное число СВЗ+СВ8+ГранзимВ позитивных лимфоцитов* способных запустить секреторный лизис клетки-мишени при быстрой прогрессии РА

Анализ количественных параметров натуральных киллеров существенных различий между группами не выявил. При сопоставлении цитотоксиче-ской активности НК выявлена активация, которая документируется статистически достоверным повышением относительного и абсолютного числа киллерных клеток, имеющих на своей поверхности лиганд к рецептору апоп-

тоза, посредством которого лимфоциты, реализуют биологический эффект при быстрой прогрессии. Полученные данные, указывающие на повышении функционального потенциала, подтвердили й результаты цитотоксических тестов, статистически достоверно повышенные при быстрой прогрессии аутоиммунного процесса, по сравнению с медленным вариантом развития РА.

При анализе цитотоксического звена иммунной системы у больных медленным вариантом прогрессирования суставной формы серопозитивного РА, по сравнению с контрольной группой в содержании СБЗ+СБ8+ лимфоцитов статистически значимых изменений не выявлено (табл.4).

При исследовании экспрессии активационных маркеров на поверхности цитотоксических лимфоцитов, было выявлено снижение количества эф-фекторных клеток на ранней стадии активации, что документируется статистически достоверным снижением относительного и абсолютного числа клеток, имеющих поверхностный фенотип СБЗ+СВ8+С025+ при медленной прогрессии серопозитивного РА по сравнению с контролем. Снижено было и ко-, личество цитотоксических лимфоцитов, на поздней стадии активации, на что указывает статистически достоверное снижение относительного числа моно-нуклеаров, несущих рецептор

Статистически достоверно было снижено при медленном развитии заболевания относительное и абсолютное число цитотоксических лимфоцитов, способных индуцировать апоптоз клеток-мишеней и несущих рецептор СВЗ+СБ8+СБ95Ь. Однако у лимфоцитов с поверхностным фенотипом СБЗ+С08+ усилен секреторный механизм реализации цитотоксического эффекта, что верифицируется статистически достоверным увеличением относительного и абсолютного числа СБЗ+СВ8+ГранзимВ позитивных лимфоцитов.

При анализе количества НК, выявлена тенденция к снижению количества лимфоцитов, экспрессирующих рецептор СБЗ Ш(16+56)+. Анализ функционального потенциала, выявил весьма противоречивые данные. С одной стороны, выявлена тенденция к угнетению секреторного лизиса, что документируется снижением СОЗ'СБ(16+56)+ ГранзимВ позитивных лимфоцитов, несекреторного лизиса клеток-мишеней, опосредованного Развале!, а с другой - усилена антителозависимая клеточная цитотоксичность

При быстрой прогрессии суставной формы, серопозитивного РА выявлена тенденция к снижению относительного и абсолютного числа лимфоцитов, несущих рецептор СОЗ+СБ8+ по сравнению с контролем (табл.4).

Анализ активационных маркеров на поверхности цитотоксических лимфоцитов, выявил повышение количества эффекторных клеток на ранней стадии активации при быстрой прогрессии заболевания, что документируется статистически достоверным повышением относительного и абсолютного числа ранних активационных маркеров СОЗ+СВ8+СБ25+. В то же время, количество эффекторных клеток на поздней стадии активации, было существенно снижено, что документируется статистически достоверным снижением относительного и абсолютного числа цитотоксических лимфоцитов, несущих рецептор

по сравнению с контролем (табл.4).

Таблица 4.

Характеристика параметров эффекторного цитотоксического звена иммунной системы в Зависимости от варианта прогрессирования су'ставно'и формы серопозитивного РА

Параметр Контрольная группа Медленная прогрессия Быстрая прогрессия

СТО+С08\% 21,8±1,6 22,78±1,09 ** 18,62±1,46

С03+С08+,1*Ю" 0,4±0,05 0,44±0,05 0,35±0,07

С03+С08+С025+,% 1,26±0,03 0,77±0,02* ** 2,98±0,03*

С03+С08+С025+, 1*10" 0,02±0,001 0,01±0,001* ** 0,06±0,01*

С03+С08+С095Ц% 0,46±0,05 0,10±0,03* 0,08±0,04*

С03+С08+С095Ь, 1*10" 0,008±0,001 0,002±0,001* 0,001±0,001*

С03+С08+НЬА БИ,% 0,94±0,07 0,61±0,02* ** 0,74x0,03*

СЭЗ +С08+НЬ А БЯ, 1 * 109 0,016±0,004 0,012±0,002 ** 0,01±0,001*

С03+С08+ГранзимВ,% 9,38±2,21 19,41±1,98* 20Д4±1Д0*

СОЗ^СОБ^ГранзимБД* 10Ч 0,16±0,005 0,375±0,002* 0,38±0,001*

СОЗта(16+56)+, % 12,1±1,2 8,73±2,44 7,00±1,29*

СОЗ"СО(16+56)+, 1*10у 0,2±0,03 0,17±0,04 0ДЗ±0,02*

СОЗ'СВ(16+56)+ГранзймВ, % 9,38±2,21 8,12± 1,22 ** 15Д0±1,72*

СОЗ'СО(16+56)+ГраюимВ,1*Юу 0,16±0,005 0,14±0,002 **0,28±0,001*

С03'С0(16+56)+С095Ь+,% 22,75±2,10 16,41±1,18 * 15Д0± 1,72*

СОЗ'СО( 16+5 6)+СБ951Д 1 * 10Ч 0,40±0,002 0,34±0,002 * 0,28±0,001*

ЦТА 48,31±14,22 55,51±6,09 ** 85Д7±2,22*

ЦТА (К562) 36,12±4,28 43Д7±3,81 **64,36±2,49*

Примечание.

*-достоверные различия показателей по сравнению с контрольной группой (р<0,05);

"""-достоверные различия показателей в группе с быстрой прогрессией по сравнению с медленной (р<0,05);

При исследовании функционального потенциала цитотоксических лимфоцитов, выявлена существенное повышение активности при быстрой прогрессии РА, которая документируется статистически достоверным повышением относительного и абсолютного числа СОЗ^ВВ^ранзимВ позитивных лимфоцитов по сравнению с контролем (табл.4).

Однако* количество цитотоксических лимфоцитов, способных индуцировать апойтоЗ кйёток-кйщенёй с поМощью йиганДа было сМШёнд,- Что указывает На то; что прйб^ететйым йрй быстрой варйайтё прёгрёСсйрбваййя Ьус?авной ффмЫ сёройозйтийнош РА йвЛяется ¡зё&пкзаций цитдтоксйчё<жб-го эффекта; 6 помощью эффёкторной моЛекулМ ГранзймВ.

При анализе количества НК у пациентов с быстрой прогрессией суставной формы серопозитивного РА, выявлено статистически достоверное снижение относительного и абсолютного числа СВЗ"СБ(16+56)+ позитивных лимфоцитов по сравнению с контролем. Несмотря на снижение количества НК, зафиксировано повышение цитотоксической активности, что документируется статистически достоверным повышением относительного и абсолют-

ного числа лимфоцитов, экспрессирующих СОЗ'СБ(16+56)+ГранзимВ, а также результатами цитотоксических тестов (табл.4).

Таким образов, при быстрой прогрессии серопозитивного варианта суставной формы РА на фоне снижения количества НК, выявлена существенное повышение функциональной активности этих клеток.

При сравнительном анализе параметров цитотоксического звена иммунной системы, выявлено снижение относительного числа лимфоцитов, имеющих поверхностный фенотип СБЗ С08+ при быстрой прогрессии системного воспалительного процесса по сравнению с медленным развитием заболевания.

При анализе динамики активационных маркеров на поверхности цитотоксических лимфоцитов, выявлено существенно повышение количества эф-фекторных клеток на ранней стадии активации при быстрой прогрессии по сравнению с медленным развитием РА, что верифицируется статистически достоверным повышением относительного и абсолютного числа клеток, имеющих поверхностный рецептор СБЗ+СВ8+СВ25+. В то же время, при быстрой прогрессии серопозитивного РА, суставной формы наблюдается рост количества клеток на поздней стадии активации, о чем свидетельствует статистически достоверное повышение относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих СВЗ+СВ8+НЬА ВЯ+.

Помимо активации, быстрая прогрессия аутоиммунного процесса по сравнению с медленной характеризовалась тенденцией к повышению количества лимфоцитов, экспрессирующих СВЗ +СВ 8+ГранзимВ.

При сопоставительном анализе количества НК при различных вариантах прогрессии серопозитивного РА, суставной формы статистически достоверных различий не было выявлено. При быстром развитии, функциональная активность по сравнению с медленной прогрессией существенно выше, что верифицируется статистически достоверным повышением относительного и абсолютного числа НК, вырабатывающих ГранзимВ, а также результатами цитотоксических тестов.

У пациентов с серонегагивным вариантом суставной формы РА было проведено исследование цитотоксического звена иммунной системы в зависимости от длительности течения заболевания. Установлено, что в количественных параметрах специфических эффекторных лимфоцитов статистически значимых изменений не наблюдается (табл.5).

Исследование активационных параметров эффекторных лимфоцитов, выявило статистически достоверное снижение относительного и абсолютного числа клеток находящихся на ранней стадии активации и экспрессирующих рецептор СОЗ+СБ8+СВ25+. При длительности течения аутоиммунного процесса больше 5 лет, статистически достоверно повышено относительное и абсолютное число цитотоксических лимфоцитов, имеющих на своей поверхности маркеры поздней активации СОЗ+СВ8+НЬА В11 (табл.5).

Таблица 5.

Характеристика параметров эффекторного цитотоксического звена иммунной системы в зависимбсти от'длительности течения суставной формы се- ' ронегативного РА

Параметр Меньше 5 лет Больше 5 лет

СОЗ+СБ8+,% 14,25±4,13 19,50+4,23

СБЗ+С08\1*Ю" 0,27±0,13 0,50+0,31

С03+С08+СВ25+,% 1,93±0,02 0,94+0,02*

С03+С08+С025+, 1*10" 0,01±0,01 0,001+0,01 *

С03+С08+С095Ь,% 0,544+0,04 0,39+0,02*

СБЗ+СБ8+СБ95Ь, 1*10* 0,007±0,001 0,009+0,001*

СШ+СБ8+НЬА БЫ,% 0,64±0,03 1,21+0,03*

СВЗ+СБ8+НЬА БИ ,1*10* 0,009+0,003 0,017+0',003*

С03+С08+ГракзимВ,% 14,31± 1,51 9,18+2,04*

СБЗ^ПвТранзимВДПО9 0,32±0,004 0,15+0,004*

СОЗ"СО(16+56)+, % 11,41±5,86 11,00+6,91

СБЗЧИХ16+56)*, 1*10' 0,20±0,09 0,25+0,11

свзта( 16+5 6)+СБ95Ь+,% 26,51±3,12 24,80+1,15

СВЗ"СБ( 16+56)+СБ951Д 1 * 10у 0,50+0,003 0,410+0,001

ЦТА 73,13+11,92 60,34+2,44

ЦТА (К562) 54,91+2,17 45,33+3,90*

Примечание.

■"-достоверные различия показателей между группами (р<0,05);

Анализ цитотоксического потенциала, выявил статистически достоверное снижение относительного числа лимфоцитов, способных индуцировать апоптоз клеток мишеней. При длительности заболевания снижено относительное и абсолютное числа цитотоксических лимфоцитов, экспресси-рующих СВЗ+СБ8+ГранзимВ (табл.5)

Количество НК не отличалось в группах больных с длительностью РА больше и меньше 5 лет. Анализ функционального потенциала НК, выявил тенденцию к снижению результатов цитотоксических тестов, и лишь в исследованиях с клетками лейкемического ряда К562, изменения была статистически достоверны (табл. 5). На угнетение функциональной активности указывало и снижение количества НК, экспрессирующих рецептор СБЗ' С0(16+56)+С095Ь.

В зависимости от длительности суставной формы серопозитивного РА, было исследована экспрессия активационных маркеров. Выявлено статистически достоверное снижение относительного и абсолютного числа клеток на ранней стадии активации и экспрессирующих рецептор С03+С08+е025+(табл.6).

При длительности течения аутоиммунного процесса больше 5 лет, статистически достоверно повышено относительное и абсолютное число цитотоксических лимфоцитов, имеющих на своей поверхности маркеры поздней активации С03+С08+НЬА БЯ.

Таблица 6.

Характеристика параметров эффекторного цитотоксического звена иммунной системы в зависимости от длительности течения суставной формы се-

Параметр Меньше 5 лет Больше 5 лет

СБЗЧЛ)8\% 20,40±1,50 24,35^2,54

СОЗ+СВ8+,1*10У 0,33±0,01 0,46±0,06*

СОЗ+С08+СШ5+,% 1,64±0,02 0,95±0,02*

С03+С08+С025+, 1*10" 0,03±0,001 0,02±0,001*

С03+С08"С095Ц% 0,72±0,04 0,41±0,02*

СБЗ+СП8+С095Ь, 1*10" 0,01±0,001 0,01±0,001

С03+С08+НЬАВЯ,% 0,56±0,03 1,81±0,03*

СВЗ+С08+НЬА БЯ ,1*10" 0,01±0,003 0,03±0,003*

С03+С08+ГранзимВ,% 15,32± 1,51 11,23± 2,04*

СВЗ+СБ8'ТранзимВ,1*10у 0,25±0,004 0,21±0,004*

СОЗ"СО(1б+56)+, % б,00±1,67 7,45±0,74

СБ16+С056-, 1*10" 0,1±0,04 0,14±0,08

С03'С0(16+56)+С0951Д% 31,43«,12 21,32±1,15*

С03'СВ(1б+56)+С095Ь+,1*Ю" 0,50±0,003 0,40±0,001*

ЦТА 70,21±6,92 58,92±5,44

ЦТА (К562) 61,82±2,17 52,59±3,90*

Примечание.

♦-достоверные различия показателей между группами (р<0,05);

При анализе функционального потенциала СОЗ+СБ8+ позитивных лимфоцитов было выявлено статистически достоверное снижение относительного числа лимфоцитов, способных индуцировать апоптоз клеток мишеней, экспрессируя СВЗ+СБ8+СВ95Ь+. Статистически достоверное снижено при длительности РА больше 5 лет относительное и абсолютное число цито-токсических лимфоцитов, вырабатывающих ГранзимВ (табл.6).

Несмотря на то, что содержание НК не отличалось в группах больных, анализ цитотоксической активности выявил угнетение функциональной активности, что документируется снижением относительного и абсолютного числа лимфоцитов, несущих рецептор С03'С0(1б+56)+С095Ь+ и подтверждается результатом цитотоксического теста (табл. 6).

Таким образом, выявленная прямая корреляционная зависимость количественных и функциональных параметров цитотоксических лимфоцитов и степени активности системного воспалительного процесса, а также особенности цитотоксического звена иммунной системы при различных вариантах прогрессии РА могут быть использованы в качестве дополнительного диагностического и прогностического критерия течения заболевания.

ВЫВОДЫ

1. У пациентов с серонегативным вариантом суставной формы РА активность процесса коррелирует с параметрами "цитотоксического звена иммунной системы. Средняя степень активности РА характеризуется снижением количества СБЗ+С08+ позитивных лимфоцитов, усилением процессов ранней активации и увеличением цитотоксического потенциала за счет секреторного и несекреторного лизиса. Лимфоциты, проявляющие неспецифическую цитотоксичность и несущие рецептор СБЗ"СВ(16+5 6)+ , реализуют биологический эффект за счет инициализации апоптоза клеток-мишеней с помощью Баз-^апс! на поверхности киллерных клеток.

2. Высокая степень активности суставной формы серонегативного РА характеризуется увеличением количества СБЗ+СБ8+ лимфоцитов, повышенной экспрессией С03+С08+С025+, снижением содержания СВЗ+СБ8+НЬА БЯ и усилением цитотоксического потенциала за счет активации гранзим-перфоринового механизма уничтожения клетки-мишени, а также цитоток-сичности, реализуемой с помощью СЭЗ СБ8+СБ95Ь. Усилена цитотоксиче-ская активность СВЗ'СБ(16+56)+ позитивных лимфоцитов за счет несекреторного лизиса и активации антителозависимой клеточной цитотоксично-сти.

3. При серопозитивном варианте суставной формы РА у пациентов со средней степенью активности системного воспалительного процесса выявлено повышение количества цитотоксических лимфоцитов на ранней стадии активации и снижение экспрессии поздних активационных маркеров. Анализ функционального потенциала выявил усиление цитотоксичности, которая верифицируется повышением содержания СБЗ+СВ8+СБ95Ь позитивных лимфоцитов и усиленной выработкой ГранзимВ. При снижении содержания СВЗ'СО(16+56)+ усилена их неспецифическая цитотоксичность.

4. У пациентов с высокой степенью активности суставной формы серопози-тивного РА отмечается дальнейшее усиление цитотоксического потенциала за счет активности системного воспалительного процесса.

5. У пациентов с серонегативным вариантом суставной формы РА, при мед-» ленной прогрессии Заболевание выяплсно угнетение цитотоксического звена иммунной еистеМЫ, которая характеризуется снийссНием экспрессии ранних (С03'С084СШ5ч), пйздних активационных маркеров (С03+С084НЬА ОЯ) и снижения цйтотоксической активности за счет подавлением механизмов секреторного и несекреторного лизиса клеток-мишеней. Количественные И функциональные параметры лимфоцитов, проявляющих неспецифическую цитотоксичность, снижены при медленном развитии заболевания.

6. Быстрый вариант прогрессии серонегативного РА характеризуется активацией цитотоксического звена иммунной системы, сопровождающейся увеличением цитотоксического потенциала, что указывает на патогенетическую

роль параметров цитотоксических лимфоцитов в формировании варианта Прогрессии системного воспалительного процесса.

7. У пациентов с суставной формой серопозитивного РА, при медленном варианте прогрессирования, выявлено уменьшение количества эффекторных клеток на ранней стадии активации и при этом снижена экспрессия поздних активационных маркеров и CD3+CD8+CD95L лимфоцитов, способных индуцировать апоптоз клеток-мишеней, однако секреторный лизис CD3 CD8 клеток был усилен. На фоне снижения количества лимфоцитов, экспресси-рующих рецептор CD3'CD(16+56)+ выявлено угнетение секреторного лизиса, что документируется снижением CD3"CD(16+56)+ ГранзимВ позитивных лимфоцитов, и усилением антителозависимой цитотоксичности.

8. Быстрый вариант прогрессии суставной формы серопозитивного РА характеризуется усилением процессов ранней активации CD3+CD8+ позитивных лимфоцитов, снижением количества клеток на поздней стадии активации, а также усилением цитотоксичности за счет выработки ГранзимВ. Цитотокси-ческий потенциал CD3"CD(16+56)+ реализуется с помощью механизма секреторного лизиса и антителозависимой клеточной цитотоксичности.

9. Скорость прогрессии серопозитивного варианта суставной формы РА прямо пропорциональна активности эффекторного цитотоксического звена иммунной системы.

10. При длительности течения суставной формы серопозитивного и сероне-гативного РА больше 5 лет нарушены процессы ранней активации цитотоксических лимфоцитов с усилением экспрессии поздних активационных маркеров и происходит снижение цитотоксического потенциала CD3+CD8+ позитивных лимфоцитов. Угнетение количественных и функциональных параметров было выявлено у CD3'CD(16+56)+ клеток, проявляющих неспецифическую цитотоксичность.

11. Разработанный способ дифференциальной диагностики степени активности суставной формы ревматоидного артрита включает комплексный анализ количественных параметров CD3+CD8+ позитивных лимфоцитов, оценку экспресии активационных маркеров CD3+CD8+HLA DR, CD3+CD8+CD25+ и изучение цитотоксичности лимфоцитов.

12; Выявленное угнетение активационных, функциональных параметров эффекторных лимфоцитов При медленном прогрессировашш суставной формы РА и активаций цйтотомического звена иммунной системы при бы* cfpoM развитии заболевания являются критериями Прогноза течения Заболевания.

Практические рекомендации:

'1. У Пациентов для дифференциальной диагностики степени активности РА введен параметр индекс активности (ИА) и при выполнении условия 11,8% < ИА< 18,2%, диагностируют среднюю степень активности ревматоидного артрита. При выполнении условия ИА>18,2% диагностируют высокую степень активности ревматоидного артрита. Для определения ПА исследуются количественные параметры цитотоксических лимфоцитов (CD3+CD8+, CD3" CD(16+56)+), активационные (CD3+CD8+CD25+, CD3+CD8+HLA DR) а также оценивается цитотоксический потенциал по экспрессии CD3+CD8+CD95L, выработке ГранзимВ и по результатам цитотоксических тестов.

2. При снижении количества клеток, несущих рецептор CD3+CD8+CD25+ и угнетении цитотоксического потенциала за счет подавления механизмов секреторного, несекреторного лизиса и снижении количественных и функциональных параметров лимфоцитов, проявляющих неспецифическую клеточную цитотоксичность ожидается медленный вариант прогрессирования суставной формы РА. При повышении функциональной активности лимфоцитов, выполняющих цитотоксическую функцию прогнозируют быстрое развитие системного воспалительного процесса.

Работы, опубликованные по теме диссертации.

1. Т. Kalashnikova, U. Hasanov, М. Gashkova, Y. Sokolova, L. Siziakina. The dynamics of immune status and cytokine profile in patients with rheumatoid arthritis as influenced by infliximab administrstion // Submitted Abstracts. The 2nd TRiPR conference Innate Immunity and the Pathogenesis of Rheumatic Diseases. - Italy, Genoa, 2009. P. 29.

2. T. Kalashnikova, U. Hasanov, M. Gashkova, L. Siziakina. Correlation between status of immune system and efficacy of infliximab in patients with rheumatoid arthritis // Submitted Abstracts. The 3rd TRiPR conference Adaptive.Im-munity and the Pathogenesis of Rheumatic Diseases. - Italy, Genoa, 2009. P.32.

3. Хасанов У.В., Сизякина Л.П. Особенности эффекторных цитотоксических лимфоцитов при различной степени активности ревматоидного артрита // Иммунология. - М., 2010, №4, -С. 203-208

4. Калашникова Т.А., Хасанов У В., Сизякина Л.П. Показатели ак-тивационных маркеров и цитокинового профиля у пациентов с ревматоидным артритом на фоне терапии инфликсимабом // Иммунология. -М., 2010,№4, -С. 208-212

5. Хасанов У.В., Сизякина Л.П. Роль цитотоксических лимфоцитов в патогенезе ревматоидного артрита // Российский аллергологический журнал. - М., 2010, №1,-С. 187-188

6. Хасанов У.В., Сизякина Л.П. Роль эффекторных цитотоксических лимфоцитов в формировании различных вариантов течения ревматоидного артрита//Сборник трудов 5-ой научной сессии Рост ГМУ. - 2010. Т1. -С. 318-321

7. U. Khasanov, L. Sizjakina The role of natural killers (NK) in the rheumatoid arthritis pathogenesis // Submitted Abstracts. Programme of EAACI 2010 29th Congress of the European Academy of allergy and clinical immunology. - UK, London, 2009. P. 201.

8. Андреева И.И., Хасанов У.В., Сизякина Л.П. Клеточно-опосредованные реакции врожденного иммунного ответа при аутоиммунной патологии // Цитокины и воспаление. - СПб.. 2010. Том 9, №4, -С. 66-67

Список сокращений.

CD - антигены кластеров дифференцировки клеток

DAS - Disease Activity Score - индекс активности болезни

ИЛ - interleukin - интерлейкин

ИФН-у - intererferon - интерферон гамма

МПК - мононуклары периферической крови

НСТ спонт. - спонтанное восстановление нитросинего тетразолия

НСТ стим. - стимулированное восстановление нитросинего тетразолия

НСТ- тест - тест восстановления нитросинего тетразолия

РА - ревматоидный артрит

РФ - ревматоидный фактор

НК- натуральные киллеры

ФНО-а - tumor necrosis factor- фактор некроза опухоли- альфа

Печать цифровал. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Формат 60*84/16; Объем 1,0 уч.-изд.-л. Заказ № 309. Тираж 100 экз. Отпечатано в КМЦ «НЕО-ПРИНТ» 344002, г. Ростов-на-Дону, пер., Соборный 24, тел. 247-35-43

Актуальность проблемы. В настоящее время ведутся активные исследования особенностей механизма развития заболеваний, в возникновении и прогрессировании которых дисфункция иммунной системы играет основную патогенетическую роль (Ярилин А.А, 2008). Следствием дисфункции иммунной системы является формирование иммуноопосредован-ных заболеваний, в том числе инфекционных, аллергических, лимфопро-лиферативных, аутоиммунных заболеваний (Сизякина Л.П., 2011).

Аутоиммунная патология формируется при срыве иммунологической толерантности, когда в результате реакций иммунной системы на аутоантигены появляются аутоантитела или сенсибилизированные лимфоциты, приводящие к повреждению клеток организма (Сизякина Л.П., 2005).

Несмотря на то, что этиология аутоиммунных заболеваний остается во многом дискуссионной, многие иммунопатогенетические механизмы изучены достаточно подробно (Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., Калинина Н.М., 2008). Очевидно, что в их реализации задействовано большое количество иммунокомпетентных клеток, которые сами или через свои продукты приводят к развитию болезни и ее осложнений (Чередеев А. Н., 1998; Сизякина Л. П., 2005).

Понятно, что при этом взаимодействие клеток между собой, их продуктами и клетками-мишенями играет основополагающую роль (Караулов A.B., 2009). Активное изучение механизмов этих взаимодействий лежит в основе более полного понимания сути патологических процессов и явлений, происходящих в организме при формировании заболеваний, связанных с нарушением иммунного ответа на каком-либо его этапе (Симбирцев A.C., 2004)

Распространенность аутоиммунной патологии неуклонно растет и на сегодняшний день достигает 3% от общей численности населения (Chapel Н., Haeney М., 2008). Одним из наиболее часто встречаемых аутоиммунных заболеваний является ревматоидный артрит (РА). Частота РА в популяции, согласно данным ВОЗ, составляет от 0,6% до 1,3%, а у близких родственников она достигает 3-5 %. Женщины болеют чаще по сравнению с мужчинами (Мазуров В.И., 2000). Суть патологического процесса при РА составляет генерализованное иммуноло-гически обусловленное воспаление, приводящее к развитию широкого спектра внесуставных (системных) органных проявлений и катаболи-ческих нарушений (Насонов E.JL 2006). При формировании ревматоидного артрита существенная роль отводится усилению процессов пролиферации с выраженной супрессией апоптоза, повышению экспрессии активационных маркеров, нарушению баланса про- и противовоспалительных цитокинов (Сизякина Л.П., 2006). Преобладание продукции провоспалительных цитокинов: фактор некроза опухоли- "' J' альфа (ФНО-а), интерлейкин-1бета (ИЛ-lß), ИЛ-6, ИЛ-17 играет ключевую роль в иммунопатогенезе РА (Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., 2008). При этом продукция противовоспалительных цитокинов ИЛ-10, ИЛ-4 у больных РА снижается (Сизякина Л.П., 2008).

Исследование иммунологических нарушений при РА открывает пер спективы для усовершенствования методов диагностики и понимания кли нической гетерогенности болезни, продолжаются поиски новых методов адекватно отражающих иммунный статус при различных клинических вари антах ревматоидного артрита (Насонов Е.Л., 2001). Несмотря на большое ко личество исследований, до сих пор интимные механизмы формирования рев матоидного артрита изучены недостаточно. В частности, дискуссионной явля ется роль цитотоксического звена иммунной системы в генезе различных вариантов течения РА, не менее спорным является представление о связи функциональной активности цитотоксических лимфоцитов с прогнозом течения заболевания. Практически не прослежена значимость цитотоксического звена иммунной системы в эволюции РА, а также возможность его использования в качестве диагностических критериев прогноза заболевания и контроля эффективности проводимой терапии (Сизякина Л.П., 2008)

В связи с этим целью работы является выявление роли эффекторного цитотоксического звена иммунной системы в формировании различных вариантов течения ревматоидного артрита, а также при разных степенях активности и длительности заболевания.

Задачи исследования:

1. Выявить роль эффекторного цитотоксического звена иммунной системы в формировании различной степени активности суставной формы серопозитивного и серонегативного вариантов РА.

2. Выявить влияние параметров цитотоксических лимфоцитов на формирование варианта прогрессии системного воспалительного процесса.

3. Изучить динамику показателей лимфоцитов, обладающих цитоксиче-ским потенциалом в зависимости от длительности РА.

4. Разработать способ дифференциальной диагностики степени активности РА в зависимости от особенностей эффекторных цитотоксических клеток.

Разработать алгоритм прогноза варианта прогрессии РА в зависимости от состояния цитотоксического звена иммунной системы.

Научная новизна работы:

1 .У пациентов с серонегативным вариантом суставной формы РА отмечена прямая корреляционная зависимость параметров цитотоксических лимфоцитов от степени активности системного воспалительного процесса. При этом механизм усиления цитотоксичности СБЗ+СБ8+ осуществляется за счет повышения пула эффекторных клеток на ранней стадии активации и увеличения функциональной активности, а у СВЗ"СБ(16+56)+позитивных лимфоцитов за счет не секреторного лизиса.

2. При серопозитивном варианте РА рост аутоиммунной агрессии напрямую связан с активацией эффекторного звена иммунной системы, которая заключается в повышении содержания СБЗ+СБ8+С025+ позитивных лимфоцитов, а также увеличении функциональной активности СБЗ+СБ8+ лимфоцитов за счет активации С03+С08+СБ95Ь опосредованного лизиса клетки мишени и выработки ГранзимВ. Лимфоциты, несущие СОЗ"СО(16+56)+ реализуют ци-тотоксический потенциал за счет усиления секреторного лизиса.

3. У пациентов с серонегативным вариантом РА выявлено угнетение цито-токсического звена иммунной системы при медленной прогрессии, при быстром развитии заболевания повышение активности цитотоксических лим - "г фоцитов происходит за счет усиления не секреторного лизиса и увеличения пула эффекторных клеток, вырабатывающих ГранзимВ. Цитотоксический эффект НК усиливался за счет секреторного, несекреторного лизиса и анти-телозависимой клеточной цитотоксичности.

4. Скорость прогрессии серопозитивного варианта суставной формы РА прямо пропорциональна активности эффекторного цитотоксического звена иммунной системы, что верифицируется повышением экспрессии ранних активационных маркеров СВЗ+СБ8+СБ25+ и усилением цитотоксичности за счет выработки ГранзимВ активированными СОЗЧЛ)8+ лимфоцитами. Цитотоксический эффект СОЗ"СО(16+56)+ реализуется с помощью секреторного лизиса, а также антителозависимой клеточной цитотоксичности.

4. Анализ параметров эффекторного звена иммунной системы при длительности течении серонегативного и серопозитивного РА больше 5 лет выявил снижение экспрессии маркеров ранней активации СОЗ+СБ8+СВ25+, повышение количества лимфоцитов на поздней стадии активации СБЗ+С08+НЬА БЯ и угнетение цитотоксического потенциала. Обратная корреляционная зависимость была выявлена и в функциональной активности СБЗ" СО(16+56)+ за счет угнетения механизма цитотоксичности опосредованного СОЗСХ>(16+56)+ СБ95Ь.

5. Разработан способ диагностики степени активности РА, отличающийся от существующих аналогов достаточно полной, адекватной оценкой состояния иммунной системы и объективно отражающей клинические проявления заболевания.

6. Впервые определены достоверные признаки, убедительно указывающие на усиление цитотоксичности эффекторных лимфоцитов при быстрой прогрессии РА которые можно использовать при разработке алгоритма, позволяющего с высокой степенью достоверности проводить прогноз течения заболевания.

Практическая значимость работы:

Полученные результаты исследования позволили:

1. Усовершенствован способ диагностики степени активности РА

2. Определены показатели цитотоксического звена иммунной системы, позволяющие проводить прогноз течения заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Активация цитотоксического звена иммунной системы имеет патогенетическое значение в генезе различной степени активности суставной формы

РА и характеризуется прямой корреляционной зависимостью аутоиммунной агрессии от цитотоксического потенциала эффекторных лимфоцитов.

2. Скорость прогрессии системного воспалительного процесса напрямую зависит от параметров цитотоксического звена иммунной системы.

3. Длительное течение суставной формы РА характеризуется снижением экспрессии ранних активационных маркеров, повышением количества цитоток-сических лимфоцитов на поздней стадии активации и снижением функционального потенциала эффекторных клеток.

4. Способ дифференциальной диагностики степени активности суставной формы РА включает анализ количественных параметров СБЗ+СБ8+ позитивных лимфоцитов, исследование экспрессии активационных маркеров и оценку цитотоксической активности эффекторных клеток.

5. Алгоритм, позволяющий с высокой точностью проводить прогноз течения заболевания включает мониторинг параметров эффекторных цитотоксиче-ских лимфоцитов, проявляющих специфическую цитотоксическую активность, а также количественные, функциональные параметры киллерных клеток. \ 1

Внедрение результатов исследования:

Материалы диссертации включены в лекции и семинарские занятия на кафедре клинической иммунологии и аллергологии ФПК и 1111С, а также в практическую деятельность НУПК «Клиническая иммунология» ГОУ ВПО Ростовского государственного медицинского университета; используются на этапах диагностики и лечения больных кардиоревматологического отделения РостГМУ г. Ростова-на-Дону и ревматологического отделения ГУЗ «Областная больница № 2».

Апробация работы:

Основные положения работы доложены, обсуждены и получили положительную оценку на:

1. 63-я Итоговой научной конференции молодых учёных РостГМУ, (г. Ростов-на-Дону, 23 апреля 2009 г.),

2. IV Научно-практической конференции Южного федерального округа «Актуальные проблемы клинической иммунологии и аллергологии», (г. Пятигорск, 23 октября 2009 г.),

3. Всероссийская национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология - практическому здравоохранению» (г. Москва, 25 февраля 2010), th

4. 29 Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology», (Great Britain, London 6th of June 2010).

5. 30th Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology, (Istanbul 11th of June 2011).

6. Congress of the Federation of Clinical Immunology Societies (June 23 2011 in Washington, D.C., USA)

Публикации.

Основные положения диссертации изложены в 8 научных работах, из них 4 опубликовано в изданиях, входящих в перечень ВАК РФ: Российский аллергологический журнал, Цитокины и воспаление, Иммунология (2), а также в материалах российских и международных конференций и форумов. Оформлена заявка на изобретение «Способ дифференциальной диагностики степени активности ревматоидного артрита». Получена приоритетная справка от 28.02.2011 №2011107615

Объем и структура диссертации:

Диссертация изложена на 165 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, двух глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя (22 источника на русском и 98 на иностранных языках) и приложений. Работа содержит 94 таблицы и 7 рисунков.

выводы

1. У пациентов с серонегативным вариантом суставной формы РА активность процесса коррелирует с параметрами цитотоксического звена иммунной системы. Средняя степень активности РА характеризуется снижением количества СБЗ+СБ8+ позитивных лимфоцитов, усилением процессов ранней активации и увеличением цитотоксического потенциала за счет секреторного и несекреторного лизиса. Лимфоциты, проявляющие неспецифическую цитотоксичность и несущие рецептор СБЗ"СБ(16+56)+, реализуют биологический эффект за счет инициализации апоптоза клеток-мишеней с помощью Рав-^апё на поверхности киллерных клеток.

2. Высокая степень активности суставной формы серонегативного РА характеризуется увеличением количества СБЗ+СБ8+ лимфоцитов, повышенной экспрессией СБЗ+СБ8+СБ25+, снижением содержания СБЗ+СБ8+НЬА БИ и усилением цитотоксического потенциала за счет активации гранзим-перфоринового механизма уничтожения клетки-мишени, а также цитоток-сичности, реализуемой с помощью СБЗ+СБ8+СБ95Ь. Усилена цитотоксиче-ская активность СБЗ"СБ(16+56)+ позитивных лимфоцитов за счет несекреторного лизиса и активации антителозависимой клеточной цитотоксично-сти.

3. При серопозитивном варианте суставной формы РА у пациентов с со средней степенью активности системного воспалительного процесса выявлено повышение количества цитотоксических лимфоцитов на ранней стадии активации, и снижение экспрессии поздних активационных маркеров. Анализ функционального потенциала выявил усиление цитотоксичности, которая верифицируется повышением содержания СБЗ+СБ8+СБ95Ь позитивных лимфоцитов и усиленной выработкой ГранзимВ. При снижении содержания СБЗ"СБ(16+56)+ усилена их неспецифическая цитотоксичность.

4. У пациентов с высокой степенью активности суставной формы серопози-тивного РА отмечается дальнейшее усиление цитотоксического потенциала за счет активности системного воспалительного процесса.

5. У пациентов с серонегативным вариантом суставной формы РА, при медленной прогрессии заболевание выявлено угнетение цитотоксического звена иммунной системы, которая характеризуется снижением экспрессии ранних (С03+С08+С025+), поздних активационных маркеров (СОЗ+СБ8+НЬА БИ) и снижения цитотоксической активности за счет подавлением механизмов секреторного и несекреторного лизиса клеток-мишеней. Количественные и функциональные параметры лимфоцитов, проявляющих неспецифическую цитотоксичность, снижены при медленном развитии заболевания.

6. Быстрый вариант прогрессии серонегативного РА характеризуется активацией цитотоксического звена иммунной системы, сопровождающейся увеличением цитотоксического потенциала, что указывает на патогенетическую роль параметров цитотоксических лимфоцитов в формировании варианта прогрессии системного воспалительного процесса.

7. У пациентов с суставной формой серопозитивного РА, при медленном варианте прогрессирования, выявлено уменьшение количества эффекторных клеток на ранней стадии активации и при этом снижена экспрессия поздних активационных маркеров и СБЗ+СБ8+СБ95Ь лимфоцитов, способных индуцировать апоптоз клеток-мишеней, однако секреторный лизис СБЗ+СБ8+ клеток был усилен. На фоне снижения количества лимфоцитов, экспресси-рующих рецептор СБЗ"СО(16+56)+ выявлено угнетение секреторного лизиса, что документируется снижением С016+ С056"ГранзимВ позитивных лимфоцитов, и усилением антителозависимой цитотоксичности. же усилением цитотоксичности за счет повышения экспрессии СБЗ+С08+С095Ь и выработки сериновой протеазы. Цитотоксический потенциал СБЗ"СО(16+56)+ реализуется с помощью механизма несекреторного лизиса и антителозависимой клеточной цитотоксичности.

9. Скорость прогрессии серопозитивного варианта суставной формы РА прямо пропорциональна активности эффекторного цитотоксического звена иммунной системы.

10. При длительности течения суставной формы серопозитивного и сероне-гативного РА больше 5 лет нарушены процессы ранней активации цитоток-сических лимфоцитов с усилением экспрессии поздних активационных маркеров и снижением цитотоксического потенциала СОЗ+СБ8+ позитивных лимфоцитов. Угнетение количественных и функциональных параметров было выявлено у СОЗ"СО(16+56)+ клеток, проявляющих неспецифическую ци-тотоксичность.

11. Разработанный способ дифференциальной диагностики степени активности суставной формы ревматоидного артрита включает комплексный анализ количественных параметров С03+С08+ позитивных лимфоцитов, оценку экспресии активационных маркеров СБЗ+С08+НЬА БЫ, СБЗ+СБ8+С025+ и изучение цитотоксичности лимфоцитов.

12. Выявленное угнетение активационных, функциональных параметров эффекторных лимфоцитов при медленном прогрессировании суставной формы РА и активация цитотоксического звена иммунной системы при быстром развитии заболевания являются критериями прогноза течения заболевания.

Практические рекомендации:

1. У пациентов для дифференциальной диагностики степени активности РА введен параметр индекс активности (ИА) и при выполнении условия 11,8% < ИА< 18,2%, диагностируют среднюю степень активности ревматоидного артрита. При выполнении условия ИА>18,2% диагностируют высокую степень активности ревматоидного артрита. Для определения ИА исследуются количественные параметры цитотоксических лимфоцитов (CD3+CD8+, CD3" CD(16+56)+), активационные (CD3+CD8+CD25+, CD3+CD8+HLA DR) а также оценивается цитотоксический потенциал по экспресии CD3+CD8+CD95L, выработке ГранзимВ и по результатам цитотоксичких тестов.

2. При снижении количества клеток, несущих рецептор CD3+CD8+CD25+ и угнетении цитотоксического потенциала за счет подавления механизмов секреторного, несекреторного лизиса и снижении количественных и функциональных параметров лимфоцитов, проявляющих неспецифическую клеточную цитотоксичность ожидается медленный вариант прогрессирования суставной формы РА. При повышении функциональной активности лимфо-цитов,1 - выполняющих цитотоксическую функцию прогнозируют быстрое развитие системного воспалительного процесса.

Работы, опубликованные по теме диссертации.

1. Т. Kalashnikova, U. Hasanov, М. Gashkova, Y. Sokolova, L. Siziakina. The dynamics of immune status and cytokine profile in patients with rheumatoid arthritis as influenced by infliximab administrstion // Submitted Abstracts. The 2nd TRiPR conference Innate Immunity and the Pathogenesis of Rheumatic Diseases. - Italy, Genoa, 2009. P. 29.

Immunity and the Pathogenesis of Rheumatic Diseases. - Italy, Genoa, 2009. P.32.

3. Хасанов У.В., Сизякина Л.П. Особенности эффекторных цитотоксиче-ских лимфоцитов при различной степени активности ревматоидного артрита // Иммунология. - М., 2010, №4, -С 203-208

4. Калашникова Т.А., Хасанов У.В., Сизякина Л,П. Показатели актива-ционных маркеров и цитокинового профиля у пациентов с ревматоидным артритом на фоне терапии инфликсимабом // Иммунология. - М., 2010, №4, -С. 208-212

5. Хасанов У.В., Сизякина Л.П. Роль цитотоксических лимфоцитов в патогенезе ревматоидного артрита // Российский аллергологический журнал. -М., 2010, №1, выпуск 1.-С. 187-188

6. Хасанов У.В., Сизякина Л.П. Роль эффекторных цитотоксических лимфоцитов в формировании различных вариантов течения ревматоидного артрита // Сборник трудов 5-ой научной сессии Рост ГМУ.- 2010г. Т1. - С. 318-321

7. U. Khasanov, L. Sizjakina The role of natural killers (NK) in the rheumatoid arthritis pathogenesis// Programme of EAACI 2010 29™ Congress of the EufiiiT гуч Г ropean Academy of allergy and clinical immunology London 5-9 june 2010, adstract, P. 201

8. Андреева И.И., Хасанов У.В., Сизякина Л.П. Клеточно-опосредованные реакции врожденного иммунного ответа при аутоиммунной патологии // Цитокины и воспаление. - СПб., 2010. Том 9, №4, -С. 66-67