Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Адъювантное действие рекомбинантного белка теплового шока (rHSP70) Mycobacterium tuberculosis на иммунный ответ к бактериальным и вирусным антигенам.

На правах рукописи

ШЕВЧИК Юлия Сергеевна

АДЪЮВАНТНОЕ ДЕЙСТВИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО

БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА (rHSP70) Mycobacterium tuberculosis НА ИММУННЫЙ ОТВЕТ К БАКТЕРИАЛЬНЫМ И ВИРУСНЫМ АНТИГЕНАМ

14.00.36 - аллергология и иммунология

ш

АВТОРЕФЕРАТ —^гаи55

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА - 2009

003479055

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научн исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Научные руководители:

Доктор медицинских наук Екатерина Алексеевна Курбатова Доктор биологических наук, профессор Петр Георгиевич Свешников

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Вячеслав Федорович Лавров Кандидат медицинских наук Валерий Владимирович Малайцев

Ведущее учреждение: ФГУН Государственный институт стандартизации контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасеви Роспотребнадзора РФ

Защита диссертации состоится «29» октября 2009 г. в 12 часов на заседай диссертационного совета Д 001.035.01 при НИИ вакцин и сывороток им. И. Мечникова РАМН (105064, Москва, Малый Казенный пер., д.5а)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вакцин и сыворот им. И.И. Мечникова РАМН

Автореферат разослан «Ру> «сентября» 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Яковлева И. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Широкое внедрение в практику генно-инженерных технологий, методов очистки и химического синтеза антигенов привело к созданию нетоксичных, но, преимущественно, слабоиммуногенных вакцин [S.H.E Kaufmann., 2004, S.A.Plotkin et al., 2008]. Высокоочищенные бактериальные антигены, полисахариды, рекомбинантные белки, синтетические пептиды и олигосахариды нуждаются в использовании адъювантов, неспецифически усиливающих иммунный ответ [Н.В. Медуницын 1999; N.V. Valiante et al., 2003; S.H.E. Kaufmann, 2004].

В настоящее время в экспериментальных исследованиях и клинических испытаниях применяют адъюванты различного происхождения: минеральные соли (гидроксид или фосфат алюминия и др.); растительные (сапонины - QuilA, QS21); микробные (убитые бактерии, липополисахарид и его производные, CpG-мотивы ДНК), полигликозиды (хитозан) [Т.А. Olafsdottir et al. 2009; J. Kovacs-Nolan et al. 2009].

Вследствие токсичности или недостаточной эффективности большинства адъювантов, для широкого клинического использования разрешены только соли алюминия и водно-масляная эмульсия MF-59, а в некоторых странах вирусоподобные частицы (VLP - virus-like particles) и иммуностимулирующий комплекс (ISCOM - immunostimulating complex) [N.V. Valiante et al., 2003; B.C. Baudner et al. 2009].

В последние годы знания о механизме действия адъювантов были существенно дополнены на основе современных достижений, раскрывших новые функциональные возможности системы врожденного иммунитета. Установлено, что врожденный иммунитет участвует не только в быстрой защите организма от инфекции, но и определяет направленность (по Thl/Th2 типу), эффективность и длительность адаптивного иммунного ответа. Исходя из этого, в состав новых вакцин необходимо включать адъюванты, активирующие систему врожденного иммунного ответа [N.V. Valiante et al., 2003].

В этом аспекте перспективными, но малоизученными соединениями, являются белки теплового шока (HSPs - heat shock proteins). HSPs - большая и разнообразная

группа белков, представленных у всех живых организмов. Общее свойство HSPs защита биологических систем от стрессовых воздействий. Способностью индукции иммунного ответа обладают представители нескольких семейств, включ HSP60, HSP70, HSP90 и др., про- и эукариотического происхождения. Болынинств авторов считают, что белок теплового шока с молекулярной массой 70 кДа (HSP70 иммунологически является наиболее значимым [M-F Tsan et al. 2004; Ю.Ф Пастухов и др., 2005; П.Г. Свешников и др., 2007].

HSP70 действует на различные пути активации врожденного иммунног ответа [A.Casadeval et al., 2003], поэтому возможность его использования в качеств адъюванта при разработке вакцинных конструкций против инфекций, вызываемы как внутриклеточными, так и внеклеточными возбудителями, являете расширяющейся областью научных исследований [C.Barrios et al., 1992; E.Roman e al., 1996; R.Young et al., 1996; J.C. Ferraz et al., 2004; W.M.Bogers et al., 2004; M.Pen et al., 2006 и др.].

Адьювантное действие рекомбинантного белка теплового шока (rHSP70 Mycobacterium tuberculosis на активацию систем врожденного и адаптивног иммунитета при его введении в ассоциациях с бактериальными и вирусным антигенами сложной химической природы, высокомолекулярными белковым соединениями (анатоксины), полисахаридами, а также в составе генно-инженерны конструкций до настоящего времени изучено недостаточно. Противоречивь сведения о вероятности развития аутоиммунных процессов при совместно введении HSPs с бактериальными и вирусными антигенами, что важно вследстви высокой степени гомологии аминокислотных последовательностей этих белков живых организмов. Изучению данных вопросов посвящена настоящая работа.

Цель. Исследование действия рекомбинантного белка теплового шока (rHSP70 Mycobacterium tuberculosis на иммуногенные свойства бактериальных и вирусны антигенов в эксперименте.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние иммунизации смесью бактериальных антигенов с rHSP70 н функциональную активность системы врожденного иммунитета пр

моделировании у животных инфекционных процессов вирусной и бактериальной этиологии.

2. Исследовать влияние смеси бактериальных антигенов с rHSP70 на функциональную активность нейтрофилов периферической крови мышей, созревание дендритных клеток и продукцию цитокинов.

3. Оценить стимулирующее действие rHSP70 на систему адаптивного иммунитета при его введении животным в ассоциациях (смесь, конъюгат, химерный генно-инженерный белок) с бактериальными и вирусными антигенами.

4. Определить способность ассоциаций rHSP70 с бактериальными и вирусными антигенами стимулировать образование у животных анти-Н8Р70-антител.

5. Выявить потенциальную возможность образования антител, перекрестно-реагирующих с тканевыми антигенами человека, в ответ на введение ассоциаций rHSP70 с бактериальными и вирусными антигенами в составе препаратов различных конструкций.

Научная новизна

Продемонстрировано, что rHSP70 в составе смеси и химического конъюгата с антигенами условно патогенных микроорганизмов, а также химерного генно-инженерного белка Е7 вируса папилломы человека 18 типа является активным стимулятором систем врожденного и адаптивного иммунитета. В системе врожденного иммунитета впервые показано, что:

- введение смеси rHSP70 с антигенами условно патогенных бактерий (вакцина Иммуновак®) повышает устойчивость мышей к сальмонеллезной и гриппозной инфекциям в большей степени, чем введение каждого из исследуемых препаратов в отдельности;

- иммунизация мышей смесью rHSP70 с Иммуноваком® оказывает более выраженное стимулирующее влияние (по сравнению с действием монопрепаратов) на бактерицидную активность нейтрофилов; созревание дендритных клеток; увеличение числа дендритных клеток, экспрессирующих на мембране Толл-подобные рецепторы (Toll-like receptors - TLRs) 2,4,9 и молекулы МНС класса II, а

также приводит к более ранней продукции TGF0 и тормозит появление в сыворотке крови мышей IL-lp.

- введение мышам смеси или конъюгата rHSP70 с капсульным полисахаридом Haemophilus influenzae типа b стимулирует экспрессию на мононуклеарны лейкоцитах селезенки мышей TLRs 2, 4, 9; повышает число дифференцировочных i активационных маркеров CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, NK, CD3/NK (NKT) CD4+/CD25+(Treg), CD25+, молекул МНС класса II.

В системе адаптивного иммунитета впервые установлено, что:

- введение мышам смеси или конъюгата rHSP70 с капсульным полисахаридок Haemophilus influenzae типа b переключает Т-независимый иммунный ответ на Т зависимый, о чем свидетельствует повышение числа клеток с фенотипом CD4+ (Т хелперы), CD25+ (маркер ранней активации Т-хелперов) и молекул МНС класса II;

- иммунизация животных смесью Иммуновака® с rHSP70 приводит повышению титров антиклебсиеллезных и антистафилококковых антител;

- иммунизация мышей смесью нативного дифтерийного анатоксина и rHSP7 вызывает достоверное повышение титров противодифтерийных антитоксически антител;

- иммунизация мышей смесью rHSP70 с субъединичными гриппозным антигенами приводит к повышению титров антител к антигенам вирусов гриппа А В.

- использование в качестве антигена генно-инженерной конструкции и химерного белка Е7 вируса папилломы человека 18 типа и HSP70, в значительн большей степени (в 7,8 раза) увеличивает продукцию специфических антител, п сравнению с гуморальными ответом на введение одного рекомбинантного белк Е7(ВПЧ-18);

- антитела к химерному белку E7(Bn4-18)-HSP70 перекрестно реагируют рекомбинантным белком Е7(ВПЧ-16);

- иммунизация химерным белком Е7(ВПЧ-18) - HSP70 приводит к увеличени образования IgGl- и ^02Ь-антител и снижению продукции 1§02а-антител, чт свидетельствует о поляризации иммунного ответа по Th2 пути.

Впервые установлено, что введение животным гН8Р70, ассоциированного с бактериальными и вирусными антигенами, в составе препаратов различных конструкций, не вызывает образования анти-Н8Р70-антител, перекрестно-реагирующих с общими тканевыми антигенными эпитопами человека.

Практическая значимость

гНБР70 можно рассматривать в качестве потенциального кандидата в адъюванты при конструировании бактериальных и вирусных вакцин. Конъюгация гНБР70 с полисахаридными антигенами дает возможность использовать его для индукции Т-зависимого иммунного ответа, повышения эффективности иммунизации и формирования иммунологической памяти. Химерный белок Е7 вируса папилломы человека 18 типа может быть использован для получения моноклональных антител, разработки диагностических тест-систем, а также при создании профилактических и лечебных препаратов против инфекций, вызванных вирусами папилломы человека 16 и 18 типов.

Основные положения, выносимые на защиту

1) гН8Р70 в ассоциации с бактериальными антигенами в составе препаратов различных конструкций стимулирует функции системы врожденного иммунитета, что проявляется в активации нейтрофилов; созревании дендритных клеток, увеличении числа дендритных клеток, экспрессирующих ТЬЯэ 2, 4, 9 и молекулы МНС класса II. Следствием этого является быстрое повышение устойчивости мышей к инфекциям бактериальной и вирусной этиологии.

2) гНБР70 оказывает адъювантное действие при активации системы адаптивного иммунитета, способствуя повышению титров антител к бактериальным и вирусным антигенам.

3) гНБР70 в ассоциации с бактериальными и вирусными антигенами в составе препаратов различных конструкций (при использованных схемах и дозах введения) вызывает у животных образование анти-Н8Р70-антител, не обладающих перекрестной реактивностью с тканевыми антигенами человека.

Апробация работы. Основные материалы диссертации представлены и обсуждены: на 5-ом Всемирном конгрессе по иммунологии и аллергологии (получен

сертификат победителя конкурса молодых ученых), Москва 2007; на конференци молодых ученых НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова РАМН, посвященно 100-летию присуждения Нобелевской премии И.И.Мечникову (Москва, 2009); конференции отдела иммунологии НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечнико РАМН (2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 научных работы журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Материалы работы изложены на 14 страницах машинописного текста и состоят из введения, 3 глав обзора литературы, глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литератур включающего 179 источников (12 отечественных и 167 зарубежных). Диссертац иллюстрирована 42 таблицами и 2 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Препараты. В качестве адъюванта для усиления иммуногенной активност

бактериальных и вирусных антигенов использовали рекомбинантный бело

теплового шока с молекулярной массой 70 кДа (rHSP70). полученный пр

клонировании EcoRI-HinDIII фрагмента ДНК, кодирующего ген HSP7

Mycobacterium tuberculosis с 6 остатками гистидина на N-конце, в плазмиду pQE3

Клетки Escherichia coli штамма BL21(DE3) трансформировали ДНК плазмид pQ

HSP70 и затем выращивали при 37°С в питательной среде LB (Luria-Bertani

Выращенную культуру Е. coli штамма BL21(DE3) центрифугировали, суперната

подвергали аффинной металл-хелатной хроматографии с использованием ион

Zn(II). Элюат диализовали против фосфатно-солевого буферного раствор

определяли концентрацию белка, лиофильно высушивали. Препарат содержал ЛП

в концентрации 0,185-0,226 мкг/мг при определении в ЛАЛ (лизат амебоцит

Limulus polyphemus) тесте (Cambrex Bioscience, США). rHSP70 получен

Всероссийском научном центре молекулярной диагностики и лечения.

rHSP70 использовали в качестве адъюванта в составе препаратов различны

конструкций (смесь, конъюгат, химерный генно-инженерный белок) с антигенам

микроорганизмов. Из бактериальных антигенов использовали поликомпонентн

вакцину Иммуновак® (ФГУП «НПО «Микроген») из антигенов условно патогенных микроорганизмов (Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Escherichia coli и Staphylococcus aureus), предназначенную для иммунотерапии хронических воспалительных и аллергических заболеваний. Вакцина представляет собой сложный липополисахридно-белковый комплекс, содержащий ЛПС, ассоциированный с белком наружной мембраны грамотрицательных микроорганизмов, а также пептидогликан и тейхоевые кислоты S. aureus являющиеся лигандами для TLRs 1/2, 4, 5, 6, 9 (исследование по экспрессии TLRs проведено д.м.н., проф. Б.С.Народицким, НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН). Наряду с этим для изучения адъювантного действия rHSP70 использовали отдельные компоненты Иммуновак®: стафилококковый и клебсиеллезный антигены (НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН), а также другие бактериальные препараты: анатоксин столбнячный очищенный адсорбированный жидкий (АС®'), анатоксин дифтерийный очищенный адсорбированный жидкий с уменьшенным содержанием антигена (АД-м\ очищенный столбнячный и дифтерийный анатоксины (ФГУП «НПО «Микроген»), капсульный полисахарид (полирибозил-рибитолфосфат) Haemophilus influenzae типа b. полученный с помощью осаждения цетавлоном (лаборатория иммунохимической диагностики НИИВС им.И.И.Мечникова РАМН, д.м.н. Н.Е.Ястребова). В качестве вирусных антигенов использовали полуфабрикат гриппозной инактивированной субъединичной трехвалентной вакцины на эпидсезон 2005-2006 годов (ФГУП «НПО «Микроген»),

Конъюгаты rHSP70 с бактериальными антигенами (столбнячный или дифтерийный анатоксины, клебсиеллезный антиген, капсульный полисахарид Н. influenzae типа Ь) получали с помощью сшивки глютаровым альдегидом. rHSP70 добавляли к препаратам в соотношении 1:1 по весу (для полисахарида 2,3:1 по весу). Контроль качества полученных препаратов проводили методом электрофореза в 7,5% полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях (7,5% SDS-PAGE) (рис.1).

В ряде опытов были использованы конъюгаты, сорбированные на геле гидроксида алюминия.

Химерный (слитный) белок Б7 вируса папилломы человека 18 типа - Е7ГВПЧ 18VHSP70 сконструирован генно-инженерным путем и кодирует в одной рамк считывания последовательности генов Е7 и HSP70 [РСТ, USA, 2005].

. "JW| ' *щ

•41 ¡11

tif}

______30

1 2 3 4 5 6

Рис.1. Электрофорез анатоксинов в полиакриламидном геле. Окраска по Кумассии.

Примечание. 1 - дифтерийный анатоксин; 2 - конъюгат дифтерийног анатоксина с rHSP70; 3 - столбнячный анатоксин; 4 - конъюгат столбнячног анатоксина с rHSP70; 5) rHSP70 до конъюгирования; 6 - маркеры (кДа).

Конъюгаты и химерные белки получены во Всероссийском научном центр молекулярной диагностики и лечения.

Лабораторные животные. Мыши белые беспородные, линейные СВА BALB/c массой 14-16 г и 18-20 г, самцы. Морские свинки массой 250-300 полученные из питомника НЦ биомедицинских технологий (филиал «Андреевка» Животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом в соответствии «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Методы исследования активации системы врожденного иммунитета.

Активацию системы врожденного иммунитета определяли по защи животных от заражения через 24 часа после иммунизации, а также использовал методы оценки изменений, происходящих в организме животных на клеточн молекулярном уровне.

При воспроизведении сальмонеллезной инфекции мышей заражал внутрибрюшинно X typhimurium №415 дозой 10б микробных клеток/0,5 мл через 2 часа после иммунизации. Для определения заражающей дозы группе интактны

животных внутрибрюшинно вводили культуру S. typhimurium в дозах микробных клеток в объеме 0,5 мл, определяли LD5o и рассчитывали критерий значимости (Z) [С.Гланц, 1999].

Защиту мышей от вируса гриппа оценивали после заражения штаммом вируса гриппа птиц H5N2 (A/Mallard/Pansil/1024/84 - H5N2), выделенного от уток и адаптированного к мышам (штамм предоставлен Ю.А.Смирновым, НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН). Заражение проводили через 24 часа после иммунизации дозами от 0,7 до 10 LD. Мышам давали легкий эфирный наркоз и интраназально вводили заражающую дозу штамма вируса гриппа в объеме 100 мкл. Учитывали гибель мышей в опыте и контроле, вычисляли процент выживших мышей и критерий значимости (Z).

Защиту мышей от штаммов S. aureus №1986 и №6 определяли на моделях локальной и генерализованной стафилококковой инфекции при заражении мышей через 24 часа после иммунизации. При воспроизведении локальной инфекции в подушечку левой лапы вводили 2x109 микробных клеток S. aureus в объеме 100 мкл, а в подушечку правой лапы 0,9% раствор натрия хлорида в том же объеме. При генерализованной инфекции в подушечку лапы вводили дозу 4x109 микробных клеток S. aureus в объеме 0,1 мл. Через 7-14 дней мышей выводили из опыта с помощью эфирного наркоза и определяли разницу в массе опытной и контрольной конечностей.

Фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови мышей определяли с помощью набора «ЛАТЕСТ» производства НПЦ «Медицинская иммунология» в соответствии с инструкцией производителя.

Анализ фенотипа дендритных клеток и субпопуляционной структуры мононуклеарных лейкоцитов селезенки мышей осуществляли методом проточной цитометрии с применением моноклональных антител (фирма Caltag Laboratories, США) против соответствующих антигенов.

Уровень цитокинов определяли в сыворотках крови мышей методом ИФА с использованием тест-систем фирмы Biosource (Бельгия).

Методы исследования активации системы адаптивного иммунитета.

Активацию системы адаптивного иммунитета определяли на моделях защит животных от заражения возбудителями бактериальных инфекций через 7-21 ден после последней иммунизации исследуемыми препаратами, а также по уровн антител (AT) в сыворотке крови животных. Для определения титров А использовали реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА), реакцию задержк гемагглютинации (РЗГА), а также метод твердофазного иммуноферментног анализа (ИФА). Для определения титров AT в ИФА сорбцию полистироловы планшет (ВНИИ «Медполимер», Москва) проводили rHSP70, капсульны полисахаридом Н. influenzae типа b или стафилококковым антигеном в рабочи концентрациях (2, 5, 2 мкг/мл, соответственно). Изотипы и субизотип иммуноглобулинов (А, М, G1, 2а, 2Ь и G3) определяли методом непрямого ИФА соответствии с инструкцией производителя [РСТ, США].

Определение уровня перекрестно-реагирующих антител к антигена органов и тканей человека после иммунизации rHSP70 в составе бактериальных вирусных препаратов различных конструкций проводили с помощью твердофазног ИФА [Н.Е.Ястребова и др., 1995]. Положительными считали результаты пр разности оптической плотности ДОП > +0,2 между опытной и контрольно сыворотками (не иммунизированные мыши). Исследование проведено лаборатории иммунодиагностики НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакет прикладных программ Excel (Microsoft Corporation, США) и интегрированны пакетом статистического анализа Statgraphics Plus v5.0 (Manugistics Group, Inc США) с применением параметрических методов сравнения при нормально распределении (/-критерий Стьюдента). Выживаемость мышей после заражения течение заданного срока рассчитывали при использовании критерия значимости -(С.А.Гланц, 1999).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Активация системы врожденного иммунитета

Исследования по защите животных от экспериментальной инфекции, отражающие функциональную активность системы врожденного иммунитета, проведены на моделях сальмонеллезной, стафилококковой и гриппозной инфекций у мышей, зараженных через 24 ч после иммунизации rHSP70 в составе бактериальных препаратов различных конструкций.

Большой раздел работы специально посвящен использованию сложного липополисахаридно-белкового комплекса из 4 видов условно патогенных микроорганизмов (терапевтическая вакцина Иммуновак®). Присутствие в Иммуноваке® ЛПС (144 мкг/мг) и его незначительной примеси в rHSP70 (0,1850,226 мкг/мг), то есть в 637-778 раз меньше, чем в Иммуноваке®, позволило бы разобщить эффект действия ЛПС и rHSP70. Это обусловлено тем, что ряд авторов связывают иммунологическую активность rHSP70 с контаминацией ЛПС [M-F. Tsan, В. Gao, 2004; 2009].

На модели сальмонеллезной инфекции были определены оптимальные дозы и схемы введения Иммуновака®, обеспечивающие защиту от заражения (20 мкг 3-кратно) (табл.1). Лучшие результаты при иммунизации мышей rHSP70 получены при его 3-кратном ежедневном введении в дозе 10 мкг [И.Б.Семенова, Д.С.Воробьев и др., 2007]. В наших исследованиях также было установлено, что смесь Иммуновака® с rHSP70, при 3-кратном ежедневном введении в дозах 20 и 10 мкг, соответственно, стимулировала защиту от инфекции, вызванной S. typhimurium, в большей степени, чем иммунизация монопрепаратами. Так, при введении смеси Иммуновака® с rHSP70 на 5 сутки выжило 9 из 10 мышей, взятых в опыт (критерий значимости Z=3,4), при иммунизации по такой же схеме Иммуноваком® - выжило 6 из 10 мышей (Z=2,76), а при введении rHSP70 - 4 из 10 мышей (Z=2,65). На основании полученных данных можно предположить, что действие rHSP70 связано не только с примесью ЛПС, а обусловлено наличием в его составе других структур, обладающих иммуностимулирующей активностью.

И

Таблица 1

Индукция устойчивости мышей к заражению 5. ¡урЫтипит после введения смеси Иммуновака® с гН5Р70

№№ №№ Препарат для Схема иммунизации Разовая доза, мкг Количество г* Р

опы- груп- иммунизации выживших мышей из

та пы числа взятых в опыт

крат- интервал, Иммуновак гНБР на 5 на 21

ность сут сутки сутки

I 1 Иммуновак 1 - 200 - 7/10 0/10 2,69 <0,01

2 гНБР70 1 - - 100 5/10 1/10 2,25 <0,05

3 Иммуновак®+ гНБР70 -«- - 200 1 4/10 0/10 2,42 <0,02

4 -«- -«- - 200 10 6/10 0/10 2,96 <0,005

5 -«- -«- - 200 100 5/10 0/10 1,26 >0,05

6 Контроль (не иммунизированные) - - - - 0/10 0/10 - -

II 1 Т1 ® Иммуновак 1 - 400 - 5/10 0/10 1,77 >0,05

2 -«- 3 2 20 - 8/10 2/10 3,08 <0,005

3 -«- -«- -«- 200 - 7/9 0/9 2,73 <0,01

4 -«- 3 1 20 - 7/10 1/10 3,07 <0,005

5 -«- -«- -«- 200 - 4/9 0/10 2,88 <0,005

6 -«- 3 ежедневно 20 - 6/9 1/9 2,76 <0,01

7 -«- -«- -«- 200 - 3/10 0/10 1,37 >0,05

8 гНБР70 -«- -«- - 10 4/10 0/10 2,65 <0,01

9 Иммуновак®+ гН8Р70 3 -«- 20 10 9/10 1/10 3,40 <0,005

10 Контроль (не иммунизированные) - - - - 1/10 0/10 - -

Примечание. 1) * - Ъ — критерий значимости (на 21 сутки наблюдения), [С.А.Гланц, 1999]; 2) р — достоверность разности между опытом и контролем; 3) все группы мышей заражены внутрибрюшинно 5. ¡урЫтипит в дозе 106 микробных клеток в объеме 0,5 мл; 4) заражение проведено через 24 ч после иммунизации дозой 200

На модели локальной стафилококковой инфекции был показан более выраженный защитный эффект смеси Иммуновака® с гШР70, чем при иммунизации каждым из этих препаратов в отдельности.

Смесь Иммуновака® с гШР70 повышала защиту от гриппозной инфекции (¿=2,2) по сравнению с Иммуноваком® или гНБР70 в отдельности (2=1,96 и 2,1 соответственно) (табл.2).

№№ групп-

пы_

1_

2_

3_

4

Примечание. 1) * - Z - критерий значимости; 2) р - достоверность разницы ежду опытом и контролем; 3) схема иммунизации: 3-кратно ежедневно нутрибрюшинно; 4) заражение проведено через 24 ч после иммунизации дозой 0,7 D.

С целью выяснения механизма действия смеси Иммуновака® с rHSP70, по равнению с каждым из этих препаратов в отдельности, исследовали некоторые оказатели активации системы врожденного иммунитета: фагоцитарную активность ейтрофилов периферической крови мышей ex vivo, созревание дендритных клеток n vitro и продукцию цитокинов in vivo.

Фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови мышей ценивали по синтезу активных форм кислорода, определяющих бактерицидные войства препаратов. Наибольший индекс активации нейтрофилов (3,5) ериферической крови мышей получен при введении смеси Иммуновака® с rHSP70. [Я Иммуновака®, rHSP70 и интактных животных он был меньше (2,9; 2,3 и 1,8 оответственно).

Далее исследовали влияние препаратов на созревание дендритных клеток ДК). ДК являются ключевыми эффекторами врожденного иммунитета. Они аствуют в захвате, процессинге и презентации антигена Т-лимфоцитам. При этом

Таблица 2

Индукция устойчивости у мышей к заражению вирусом гриппа А/Н5М2_

Препарат для иммунизации

Разовая доза, мкг

Иммуновак

rHSP

Выжило/всего на 19 сутки

абс

% ± m

Z*

Иммуновак

20

8/9

1,98

<0,05

rHSP70

10

4/10

40,0

1,76

>0,05

Иммуновак +rHSP70

20

10

9/10

90,0

2,20

<0,05

Контроль (не иммунизированные)

3/10

30,0

представлять антиген Т-лимфоцитам способны только зрелые ДК. Для оценк способности Иммуновака®, rHSP70 и смеси Иммуновака® с rHSP70 вызыват созревание ДК, костномозговые клетки-предшественники мышей линии СВ культивировали в среде с GM-CSF и IL-4. На 6 сутки инкубации в культуру клето прибавляли Иммуновак® (25 мкг/мл), rHSP70 (25 мкг/мл) и смесь Иммуновака® rHSP70 (25+25) мкг/мл. По данным этого опыта судили о степени созревания } под действием исследуемых препаратов (табл.3). Внесение в сре культивирования Иммуновака®, rHSP70 или смеси Иммуновака® с rHSP7 приводило к увеличению числа ДК, экспрессирующих TLRs 2, 4, 9, причем эффек был выше при использовании комбинации исследуемых антигенов. Эт свидетельствовало об усилении активации TLR-зависимого сигнального пути, чт приводило в свою очередь к активации ядерного фактора транскрипции NF-kB экспрессии генов провоспалительных цитокинов [Р.М.Хаитов и др., 2000] Действительно, под действием Иммуновака®, rHSP70 и смеси Иммуновака® rHSP70 в культуре ДК повышался синтез провоспалительных (IL-6 и TNF a), a такж регуляторных цитокинов (IL-10, IL-12). Различий в уровне продукции цитокино между препаратами не выявлено. Изменялся фенотип ДК: экспрессировалас молекула терминальной дифференцировки ДК - CD83+, увеличивалась экспресс молекул адгезии CD38+ (с 5,43 до 89,2; 84,5 и 88,3%, соответственно), которы необходимы для контакта ДК с Т-лимфоцитами. Экспрессировалас костимуляторная молекула CD40+, а также молекулы антигенного представлени МНС класса II. Более высокие значения по ряду показателей выявлены пр внесении в среду культивирования смеси Иммуновака® с rHSP70. Полученны данные свидетельствуют о том, что все исследованные препараты приводили созреванию ДК, однако смесь Иммуновака® с rHSP70 стимулировала созревание / в большей степени, чем введение монопрепаратов (Иммуновак® или rHSP70).

Продукцию цитокинов определяли в опытах in vivo через 24 ч после 1-кратно внутрибрюшинной иммунизации мышей исследуемыми препаратами в сыворотк крови. При введении rHSP70 (100 мкг) через 1 час появлялся IL-1

Таблица 3

Уровень ТТЛ, иммунофенотип и продукция цитокинов дендритными клетками мыши под влиянием Иммуновака® и

смеси Иммуновака® с гНБР70

№№ группы Показатель Единица измерения Незрелые ДК Иммуновак®, 25 мкг/мл гШР70, 25 мкг/мл Иммуновак® +гНБР (25+25) мкг/мл

1 ТЫ12 % 14,8±0,3 37,7±0,25 35,4±0,28 41,1±0,5*

2 ТЪЕМ 1,5±0,09 11,7±0,3 8,0±0,2 14,8±0,4*

3 ТЬ119 -«- 3,5±0,18 6,4±0,5 3,4±0,09 12,7±0,09*

4 1Ь-6 пкг/мл пг/мл 0 129 130,9 129

5 ТОТа, -«- -«- 29 217 118 182

6 1Ь-10,-«- -«- 0 11,2 6 13,6

7 1Ь-12,-«- -«- 51,6 197,3 262,6 224,5

8 СБ38 % 5,43±0,14 89,2±0,61 84,5±1,44 88,3±1,7

9 СБ83 -«- 7,6±0,62 30,7±0,11 27,3±0,55 30,5±0,69

10 1-А^ (МНСИ) -«- 19,1±0,63 24,2±0,46 34,7±0,28 40,4±0,83*

11 С040 -«- 0,7±0,14 5,3±0,12 1,21±0,09 3,8±0,11

12 С011с/СБ40 -«- 37,4±1,3 18,1±0,6 22,5±1,4 18,3±0,5

Примечание. 1) * - достоверность разности с Иммуновак®, р<0,05; 2) мыши линии СВА.

в количестве 568 пг/мл против 5,8 пг/мл у не иммунизированных животных, а затем снижался до фоновых значений через 2 часа наблюдения. При иммунизации Иммуноваком® (200 мкг) IL-if3 появлялся также через 1 час (203 пг/мл), н сохранялся на высоком уровне (550-765 пг/мл) в течение 8 часов (срок наблюдения). При иммунизации смесью Иммуновака® с rHSP70 (200+100) мкг IL-ip появлялс позднее (через 2 часа) и оставался на высоком уровне (320 - 488 пг/мл) в течение часов. В группе мышей, иммунизированных смесью Иммуновака® с rHSP70, уровен TGFp (1393 пг/мл против 374 пг/мл у интактных мышей) появлялся раньше (через 1 час), чем в других исследуемых группах, что, вероятно, сдерживало быструю высокую продукцию IL-ip, приводя к адекватной регуляции иммунного ответа Содержание IFNy повышалось через 2 часа в группах мышей, получавши Иммуновак® и смесь Иммуновака® с rHSP70. Уровень остальных исследованны цитокинов (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, TNFa) не изменялся.

Важно отметить, что иммунизация мышей во всех исследованных группах, н приводила к повышению уровня IL-6, который в присутствии TGFp способствуй дифференцировке CD4+Th в Thl7, участвующих в аутоиммунных процессах Напротив, продукция TGFp в отсутствии IL-6 включает активацию Тге (CD4+/CD25+) - регуляторных Т-лимфоцитов [R.Rappuoli, 2007].

Наряду с использованием бактериальных антигенов сложной химическо природы, исследовали активацию системы врожденного иммунитета под действие капсульного полисахарида Н. influenzae типа b (KITHib). Мышей иммунизировал смесью или конъюгатом rHSP70 с КПН1Ь. Конъюгацию бактериальны полисахаридов с белком (столбнячный или дифтерийный анатоксины) традиционн используют для получения гликоконъюгированных вакцин, обеспечивающи развитие Т-зависимого иммунного ответа на Т-независимые антигены, к числ которых относится KITHib. Следует учесть, что, анатоксины являются слабым активаторами системы врожденного иммунитета [P. Jeannin Р. 2002].

Двух- и трехкратная иммунизация мышей KITHib в дозе 5 мкг не вызывал изменения иммунофенотипа мононуклеарных лейкоцитов селезенки з

1

Таблица 4

Иммунофенотип мононуклеарных лейкоцитов селезенки мышей, иммунизированных препаратами капсульного полисахарида Нлп/1иепгае типа Ъ в смеси и после химической конъюгации с гН5Р70

Маркер лимфоцита, содержание,% (М+т) Группы мышей, иммунизированных препаратами

1 2 3 4 5

Kimib 5 мкг KITHib+rHSP70 (5+20) мкг KHHib+rHSP70 (5+100) мкг Конъюгат KTIHib+rHSP70 (5+16,75) мкг Контроль (интактные)

TLR2 0,05±0,01 0,6±0,115 *' **) 0,63±0,12 *> **> 0,60+0,06 *> **> 0,047+0,08

TLR4 0,13±0,01 0,53±0,15 **> 0,63±0,08 *> **> 0,22+0,02 0,17+0,07

TLR9 0,40+0,06 1,3±0,2 **) 0,97±0,12 *) 0,73+0,08 *' **' 0,4+0,057

CD3 5,17+0,12 *> 5,3±0,09 *' 7±0,12 *> **> 4,13+0,09 3,73+0,12

CD4 1,60+0,06 4,5±0,09 **' 2,5±0,12 *> **> 2,17+0,12 1,57+0,24

CD8a 3,0±0,09 4,2±0,15 *> **> 3,77±0,03 3,43+0,12 2,77+0,09

NK 17,8±0,26 23±0,80 **' 22±0,7 *' 15,47+0,63 16,2+0,115

CD3/NK (NKT) 0,83±0,15 2,77±0,17 *' **> 2,5+0,115*' **' 0,57+0,09 0,6+0,06

CD25 2,63±0,12 7,57±0,52 *> **> 3,5+0,3 *' 3,2+0,15 **> 2,7+0,15

CD4/CD25 (Treg) 0,37+0,09 0,7±0,057 *' 0,47+0,03 0,5+0,06 0,37+0,07

CD19 21,8±0,95 26,4±0.57 28,57+0,8 **' 26,2+1,57 **' 18,3+0,6

MHCII 34,9±1,0 37,17±0,33*' 37,9+0,8 *' 34,93+1,87 33,53+1,18

Примечание. 1) достоверность разности между группами: *' р1,2,з,4 и 5 < 0,05 **'р| и 2,3,4 < 0,05; 2) исследование проведено на 12 сутки после 3 кратной внутрибрюшинной иммунизации мышей с интервалом 14 суток; 3) мыши линии СВА.

исключением повышения числа общих Т-лимфоцитов (CD3+) (табл.4). Смес КГВДЬ с rHSP70 и конъюгированный препарат активировали систему врожденног иммунитета, что проявлялось в значительном повышении уровня TLRs 2, 4, 9, также увеличении числа клеток с маркерами CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, NK CD3/NK (NKT), CD25+, CD4+/CD25\ МНС класса II. Повышение уровня CD4+ (T хелперы), CD25+ (маркер ранней активации Т-хелперов) и увеличение содержан МНС класса II можно расценивать как переключение Т-независимого иммунног ответа на Т-зависимый под действием rHSP70.

Проведенные исследования показали, что химическая конъюгация оказалась данном случае менее эффективной, чем введение смеси антигенов, возможно, з счет экранирования активных антигенных детерминант.

2. Активация системы адаптивного иммунитета

Активация системы врожденного иммунитета определяет эффективность направленность развития адаптивного иммунитета. Для оценки способности rHSP7 стимулировать адаптивный иммунный ответ были выбраны бактериальны (анатоксины, Иммуновак®, стафилококковый и клебсиеллезный антигень капсульный полисахарид H.influenzae типа Ь) и вирусные (гриппозны субъединичные антигены, химерный белок Е7 вируса папилломы человека 18 тип препараты.

Оценку активации адаптивного иммунитета при введении rHSP70 бактериальными и вирусными антигенами проводили по образованию антител (А и при воспроизведении инфекционного процесса у животных.

Повышение титров AT к антигенам, входящим в состав Иммуновака®, пр испытанных схемах и дозах введения смеси исследуемого препарата с rHSP7 зависело от природы антигена (табл 5). Стимуляция антителообразования по действием rHSP70 к клебсиеллезному и стафилококковому антигенам, проявивши в данном опыте меньшую иммуногенность (группа 1), оказалась выше в 2,6 и 4, раза, соответственно. При использовании смеси антигенов с rHSP70 оптимальным были дозы rHSP70 в диапазоне от 10 до 100 мкг белка.

Таблица 5

Влияние гШР70 на продукцию АТ к антигенам условно патогенных __микроорганизмов в РПГА_

№№ группы Препарат для иммунизации Разовая доза, мкг Средний обратный титр АТ к антигенам (М±ш)

клебси-елла протей стафилококк кишечная палочка

Иммуновак гШР

1 Иммуновак* 200 - 0,9±0,58 3,1±0,25 0,37±0,4 1,2±3,4

2 Иммуновак +ГН8Р70 200 1 0,66±0,32 2,9±0,34 0,7±0,39 1,2±0,2

3 200 10 1,6±0,32 3,1±0,12 1,6±0,19* (4,3) 1,3±0,45

4 -«- 200 100 2,3±0,13* (2,6) 2,7±0,32 0,54±0,38 0,86±0,58

5 Контроль (не иммунизированные) 0 0 0 0

Примечание. 1) * - достоверность разности с группой 1; 2) на дозу брали по 5 мышей; 3) сыворотки получены через 7 суток после 1-кратного внутрибрюшинного введения Иммуновак®; 4) в скобках указано повышение титров АТ по сравнению с группой 1.

При исследовании смеси стафилококкового антигена с гН8Р70 повышения протективной активности (модели локальной и генерализованной стафилококковой инфекций) у мышей не выявлено. Титр противостафилококковых АТ также не повышался. По-видимому, стафилококковый антиген нуждался в присутствии дополнительных адъювантов, так как в составе вакцины Иммуновак®, содержащей ЛПС и другие иммунодоминантные соединения, титр АТ к стафилококку увеличивался.

При введении смеси натавного дифтерийного анатоксина с гН8Р70 после 2-кратной иммунизации выявлено повышение титра антитоксических дифтерийных АТ (1§=4,1) по сравнению с нативным анатоксином (1§=3,4) в 1,2 раза. Конъюгация анатоксина с гН8Р70 не приводила к усилению иммуногенности (табл.6).

Однократная иммунизация сорбированными на гидроксиде алюминия дифтерийным и столбнячным анатоксинами в смеси с гН8Р70 не выявила

преимуществ по сравнению с коммерческими препаратами (АД-м® и АС®). Эт подтвердилось и при введении иммунизированным морским свинкам дифтерийно токсина, защиту от которого обеспечивал только коммерческий препарат (АД-м®).

Таблица

Титр антитоксических дифтерийных AT в РПГА____

№№ группы Препарат для иммунизации Иммунизирующая доза в 0,5 мл (в скобках указан порядковый номер иммунизации) Средний обратный титр AT (lg) к антигенам (М±т)

1 Нативный дифтерийный анатоксин (ДА) 4 Ц-(1-ая) и 2 и7 (2-ая) 3,4±0,13

2 Смесь ДА+ гН8Р70 4 ЬГ+20 мкг (1-ая) и 2ЫЧ20мкг(2-ая) 4,1±0,08* (1,2)

3 Конъюгат ДА- гНБР70 4Ы (1-ая) и 2Ь1Г (2-ая) 2,95±0,65

4 Контроль (не иммунизированные) не вводили <1

Примечание. 1) * - достоверность различий между группами 2 и 1,3,4, р<0,0 2) в каждой группе использовали индивидуальные сыворотки от 5 мышей; интервал между 1-й и 2-й иммунизациями 32 дня; 4) сыворотку крови мыш исследовали на 14 сутки после 2-кратной подкожной иммунизации; 5) в скобк указано повышение титров АТ по сравнению с группой 1.

При использовании смеси субъединичных гриппозных антигенов вирус

гриппа А и В с гН8Р70 выявлено повышение титров АТ к А/Н,!^ в 4 раза, к В - в

раза по сравнению с исходным препаратом (группа 1) (табл.7).

Таблица

Уровень АТ при иммунизации мышей смесью гриппозных субъединичных

антигенов с гШР70

№ № Препарат для иммунизации Доза, мкг Средний обратный титр АТ к антигенам вируса гриппа

A/H3N2 A/H,N, В

1 Гриппозные субъединичные антигены 3 64-128 64 32

2 Гриппозные субъединичные антигены + гШР70 3+5 128 256 (4) 64(2)

3 -«- 3+10 128 128 (2) 32

4 -«- 3+20 128 256 (4) 64(2)

Примечание. 1) каждая проба - пул сывороток от 5 мышей; 2) сыворот получены на 10 сутки после 2-кратной внутримышечной иммунизации с интервал 21 день; 3) в скобках указано повышение титров АТ по сравнению с группой 1.

Наиболее выраженные адъювантные свойства НБР70 выявлены в составе химерного генно-инженерного белка вируса папилломы человека 18 типа - Е7(ВПЧ-18) - НБР70, иммунизация которым приводила к увеличению титров АТ в 7,8 раза к антигену Е7(ВПЧ-18) по сравнению с рекомбинантным белком Е7(ВПЧ-18) (табл.8). Более того, АТ к химерному белку Е7(ВПЧ-18) перекрестно реагировали с рекомбинантным белком Е7(ВПЧ-16).

Таблица 8

Титры АТ в ИФА к белку Е7 (ВПЧ-18) и химерному белку Е7(ВПЧ-18)-ШР70

№№ группы Препарат для иммунизации Кратность иммунизации и интервал Разовая доза, мкг Уровень АТ к Е7(ВПЧ-18) в ИФА, оп430 Кратность увеличения титра АТ по сравнению с контролем

Е7 НБР

1 Е7(ВПЧ-18) 2-кратно через 3 недели 20 0,318 2,6

2 Е7(ВПЧ-18) -НБР70 -«- 20 140 2,478 20,3 (7,8)

3 Контроль (не иммунизированные) не вводили 0,122

Примечание. 1) каждая проба - пул сывороток от 8 мышей; 2) разведение сывороток 1:2000; 3) сыворотки крови получены на 15 сутки после 2-кратной внутрибрюшинной иммунизации с интервалом 21 день; 4) в скобках указано повышение титров АТ по сравнению с группой 1.

При исследовании изотипов и субизотипов иммуноглобулинов у мышей, иммунизированных химерным белком Е7(ВПЧ-18) - Н8Р70, происходило повышение уровня 1§01, ^02Ь и снижение по сравнению с интактными

животными, что свидетельствовало о поляризации иммунного ответа по ТЬ2 пути [8.А.Р1о1кт,« а1., 2008] (табл.9).

3. Исследование уровня анти-Н8Р70-антител

При введении мышам гШР70 в ассоциации с бактериальными и вирусными антигенами различной природы в составе препаратов различных конструкций (смесь, конъюгат) увеличивались титры анти-Н8Р70-АТ в 10,1-17,5 раза по

21

сравнению с не иммунизированными животными. Наиболее высокое повышени титров анти-Н8Р70-АТ выявлено к химерному генно-инженерному белку (в 178,1 раз по сравнению с не иммунизированными животными).

Таблица

Изотипы и субизотипы иммуноглобулинов к белку Е7 после иммунизации мышей

рекомбинантным белком Е7(ВПЧ-18) и химерным генно-инженерном белком __Е7(ВПЧ-18)-Н8Р70_

Препарат для иммунизации Кратность иммунизации и интервал Разовая доза, мкг Изотипы и субизотипы иммуноглобулинов %

А М й! в2а аь вз

Е7 ШР

Е7 (ВПЧ-18) 2-кратно через 3 недели 20 2,5 8,9 68 2,5 14,8 3

Е7 (ВПЧ-18)-НБР70 -«- 20 140 1 3,3 53,9 2,4 29,4 9,8

Контроль (не иммунизированные) не вводили 15 13,9 24,7 11,1 18,7 16,4

Примечание. 1) каждая проба - пул сывороток от 8 мышей; 2) сыворот: получены на 15 сутки после 2-кратной внутрибрюшинной иммунизации интервалом 21 день.

При оценке безопасности препаратов на основе Н8Р70, имеющих высок) степень межвидовой гомологии, установлено, что присутствие анти-Н8Р70-АТ сыворотке крови иммунизированных животных, не приводило к образовани перекрестно-реагирующих ^в-АТ к органам и тканям (ДНК, коллаген, эластин сердце, легкое, почки, печень) человека при испытанных дозах и схем иммунизации.

выводы

1. Установлено адъювантное действие рекомбинантного белка теплового шока Mycobacterium tuberculosis с молекулярной массой 70 кДа (rHSP70) на активацию систем врожденного и адаптивного иммунитета при его введении в ассоциации с бактериальными и вирусными антигенами.

2. Показано, что смесь rHSP70 с бактериальным липополисахаридно-белковым комплексом (Иммуновак®) увеличивает индекс активации нейтрофилов, число дендритных клеток, экспрессирующих TLRs 2, 4, 9 и молекул антигенного представления МНС класса II и стимулирует созревание дендритных клеток в большей степени, чем каждый из препаратов в отдельности.

3. Выявлено повышение резистентности мышей к сальмонеллезной и гриппозной инфекциям при иммунизации смесью rHSP70 с бактериальным липополисахаридно-белковым комплексом (Иммуновак®) по сравнению с действием монопрепаратов.

4. При иммунизации rHSP70 в смеси или в составе конъюгата с капсульным полисахаридом Haemophilus influenzae типа b установлено повышение числа мононуклеарных лейкоцитов селезенки мышей экспрессирующих TLRs 2, 4, 9; дифференцировочные и активационные маркеры: CD3+, CD8+, CD19+, NK, CD3/NK (NKT), CD4+/CD25+ (Treg), CD25+, МНС класса II.

5. Показано, что rHSP70 стимулирует повышение титров специфических антител к дифтерийному анатоксину; клебсиеллезному и стафилококковому антигенам; субъединичным антигенам вирусов гриппа A/HiNi и В; белку Е7 вируса папилломы человека 18 типа.

6. Выявленное повышение титра антител к белку Е7 вируса папилломы человека 18 типа, входящего в состав химерной генно-инженерной конструкции E7(BIT4-18)-HSP70, сопровождается увеличением титров специфических IgGl-, 1§02Ь-антител и снижением IgG2a-aHTHTen, что свидетельствует о поляризации иммунного ответ по Th2 типу.

7. Установлено повышение уровня анти-Н8Р70-антител в 10,1-178,1 раз мышей, иммунизированных гШР70 в ассоциации с антигенам микроорганизмов (смесь, конъюгат, химерный генно-инженерный белок по сравнению с не иммунизированными животными.

8. Показано, что оптимальный диапазон доз гНБР70 при его введени животным в ассоциации с бактериальными и вирусными антигенам составляет от 10 до 100 мкг белка.

9. Не выявлено образования анти-Н8Р70-антител, перекрестно-реагирующих общими эпитопами тканевых антигенов человека, после иммунизаци мышей различными ассоциациями гНБР70 с бактериальными и вирусным антигенами при испытанных дозах и схемах введения.

10. Установлены различия в эффективности действия гН8Р70, зависящие о природы ассоциированного с ним антигена и конструкции препарата (смес с антигеном, химическая конъюгация, химерный генно-инженерный белок).

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Шевчик Ю.С. Изучение адъювантного действия рекомбинантного белк теплового шока Н8Р70 при введении с вирусными и бактериальным вакцинами. Аллергология и иммунология. - 2007. - т.8. - №1. - с.71.

2. Шевчик Ю.С., Курбатова Е.А., Свешников П.Г., Ахматова Н.К. Активац врожденного и адаптивного иммунитета к бактериальным антигенам по действием рекомбинантного белка теплового шока (гН8Р70). Тезисы докладо Объединенного иммунологического форума (Санкт-Петербург, 2008) Российский иммунологический журнал. 2008. - т.2 - №2-3. - с. 340.

3. Шевчик Ю.С., Курбатова Е.А., Свешников П.Г., Ахматова Н.К., Егорова Н.Б Рекомбинантный белок теплового шока (гШР70) усиливает активаци врожденного и адаптивного иммунитета при совместном введении бактериальными антигенами в эксперименте. Журн. микробиол. 2009. - №1.

4. Шевчик Ю.С., Новикова О.В., Ахматова Н.К., Свешников П.Г., Ястребова Н.Е., Курбатова Е.А. Действие белка теплового шока на иммуногенную активность капсульного полисахарида Haemopilus influenzae типа b. Медицинская иммунология. «Дни иммунологии в СПб». - 2009 - т.11 - №4-5 -

с.42-46.

с.340-341.

J.

Подписано в печать 24.09. оэ Формат 60x84/16. Бумага офсетная.

_Заказ № 704 Тираж 100 экз._

Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

ОГЛАВЛЕНИЕ 8

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. АДЪЮВАНТЫ И СОВРЕМЕННЫЕ

ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О МЕХАНИЗМЕ ИХ ДЕЙСТВИЯ.14

1.1. Общие сведения об адъювантах.14

1.2. Сложные смеси адъювантов.18

1.3. Системы доставки антигена (носители).18

ГЛАВА 2. БЕЛКИ ТЕПЛОВОГО ШОКА - АКТИВАТОРЫ

ВРОЖДЕННОГО И АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА.22

2.1. Белки теплового шока: общая характеристика.22

2.2. Роль белков теплового шока в активации врояеденного и адаптивного иммунитета.23

ГЛАВА 3. АДЪЮВАНТНЫЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА ПРИ РАЗРАБОТКЕ ВАКЦИН ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И

ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ.31

3.1. Противоинфекционные и противоопухолевые вакцины на основе белков теплового шока.31

3.2. Анализ возможной роли белков теплового шока в развитии аутоиммунных процессов.40

ЧАСТЬ И. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.47

выводы

1. Установлено адъювантное действие рекомбинантного белка теплового шока Mycobacterium tuberculosis с молекулярной массой 70 кДа (rHSP70) на активацию систем врожденного и адаптивного иммунитета при его введении в ассоциации с бактериальными и вирусными антигенами.

2. Показано, что смесь rHSP70 с бактериальным липополисахаридно-белковым комплексом (Иммуновак®) увеличивает индекс активации нейтрофилов, число дендритных клеток, экспрессирующих TLRs 2, 4, 9 и молекул антигенного представления МНС класса II и стимулирует созревание дендритных клеток в большей степени, чем каждый из препаратов в отдельности.

3. Выявлено повышение резистентности мышей к сальмонеллезной и гриппозной инфекциям при иммунизации смесью rHSP70 с бактериальным липополисахаридно-белковым комплексом (Иммуновак®) по сравнению с действием монопрепаратов.

4. При иммунизации rHSP70 в смеси или в составе конъюгата с капсульным полисахаридом Haemophilus influenzae типа b установлено повышение числа мононуклеарных лейкоцитов селезенки мышей экспрессирующих TLRs 2, 4, 9; дифференцировочные и активационные маркеры: CD3+, CD8+, CD19+, NK, CD3/NK (NKT), CD4+/CD25+ (Treg), CD25+, МНС класса II.

5. Показано, что rHSP70 стимулирует повышение титров специфических антител к дифтерийному анатоксину; клебсиеллезному и стафилококковому антигенам; субъединичным антигенам вирусов гриппа A/HjNi и В; белку Е7 вируса папилломы человека 18 типа.

6. Выявленное повышение титра антител к белку Е7 вируса папилломы человека 18 типа, входящего в состав химерной генно-инженерной конструкции E7(BIT4-18)-HSP70, сопровождается увеличением титров специфических IgGl-, IgG2b-aHTHTen и снижением IgG2a-антител, что свидетельствует о поляризации иммунного ответ по Th2 типу.

7. Установлено повышение уровня анти-Н8Р70-антител в 10,1-178,1 раз у мышей, иммунизированных rHSP70 в ассоциации с антигенами микроорганизмов (смесь, конъюгат, химерный генно-инженерный белок), по сравнению с неиммунизированными животными.

8. Показано, что оптимальный диапазон доз rHSP70 при его введении животным в ассоциации с бактериальными и вирусными антигенами, составляет от 10 до 100 мкг белка.

9. Не выявлено образования анти-Н8Р70-антител, перекрестно-реагирующих с общими эпитопами тканевых антигенов человека после иммунизации мышей различными ассоциациями rHSP70 с бактериальными и вирусными антигенами при испытанных дозах и схемах введения.

Ю.Установлены различия в эффективности действия rHSP70, зависящие от природы ассоциированного с ним антигена и конструкции препарата (смесь с антигеном, химическая конъюгация, химерный генно-инженерный белок).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Поиск новых адъювантов для усиления иммуногености бактериальных и вирусных антигенов с целью получения эффективных вакцинных препаратов, является приоритетным направлением вакцинологии. В адъювантах нуждаются практически все вакцины бактериальной и вирусной природы, особенно высокоочищенные, синтетические, рекомбинантные.

В последние годы знания о механизме действия адъювантов были существенно дополнены на основе современных достижений, раскрывших новые функциональные возможности системы врожденного иммунитета. Установлено, что врожденный иммунитет участвует не только в быстрой защите организма от инфекции, но и определяет направленность (по Thl/Th2 типу), эффективность и длительность адаптивного иммунного ответа. В связи с этим поиск новых адъювантов, стимулирующих систему врожденного иммунитета, является актуальным [164].

Несмотря на длительную историю поиска адъювантов, в настоящее время в клинической практике разрешены к использованию соли алюминия и водно-масляная эмульсия MF-59. Кроме того, в ряде стран используют вирусоподобные частицы (virus-like particles - VLPs) и иммуностимулирующий комплекс ISCOMs®. Первые два адъюванта поляризуют иммунный ответ по Th2, вторые - преимущественно по Thl типу. Многочисленные экспериментальные исследования проводятся по исследованию свойств адъювантов микробного происхождения.

Перспективными кандидатами в адъюванты, с нашей точки зрения, являются белки теплового шока, в частности, рекомбинантный белок теплового шока Mycobacterium tuberculosis с молекулярной массой 70 кДа (rHSP70). rHSP70 является наиболее активным стимулятором врожденного иммунитета по сравнению с другими HSP [5-7]. Всвязи с этим, целью проведенного исследования явилось изучение активации систем врожденного и адаптивного иммунитета при введении бактериальных и вирусных антигенов с rHSP70 (смесь с антигенами, химическая конъюгация и химерный генно-инженерный белок).

Исследования были начаты с изучения способности rHSP70 усиливать активацию врожденного иммунитета на экспериментальных бактериальных и вирусных инфекционных моделях у животных, а также при исследовании молекулярно-клеточных механизмов действия rHSP70 при введении с микробными антигенами различной природы.

Основаная часть работы проведена с использванием сложного липополисахаридно-белкового комплекса из 4 видов условно-патогенных микроорганизмов (терапевтическая бактериальная вакцина Иммуновак®). Выбор этого препрата был обусловлен тем, что он содержит лиганды (ЛПС, тейхоевые кислоты, пептидогликан и др.) для целого ряда TLRs (TLR 1/2, 4, 5, 6, 9). Наличие в Иммуноваке® значительного количества ЛПС (144 мкг/мг) и его примеси в rHSP70 (0,185-0,226 мкг/мг, то есть в 637-778 раз меньше, чем в Иммуноваке®), позволило бы разобщить эффект действия ЛПС и rHSP70. Это обусловлено тем, что ряд авторов связывают иммунологическую активность rHSP70 с контаминацией ЛПС [160].

Для исследования адъювантного действия rHSP70 на стимуляцию врожденного иммунитета были выбраны модели сальмонеллезной, стафилококковой и гриппозной инфекций при заражении животных через 24 часа после иммунизации. Иммунизацию проводили при использовании различных схем и доз введения препаратов. На модели сальмонеллезной инфекции были определены оптимальные дозы и схемы введения Иммуновака®, обеспечивающие защиту от заражения (20 мкг 3-кратно). Лучшие результаты при иммунизации мышей rHSP70 получены при 3-кратном ежедневном введении в дозе 10 мкг [8]. В данном исследовании установлено, что смесь Иммуновака® с rHSP70 при 3-кратном ежедневном введении в дозах 20 и 10 мкг соответственно, действительно стимулировала защиту от инфекции, вызванной S.typhimiirium (при критерии значимости Z=3,4). В группах мышей, иммунизированных по этой же схеме

Иммуноваком® или rHSP70 в отдельности, критерий значимости (Z) был меньше - 2,76 и 2,65 соответственно. Это предполагает, что действие rHSP70 не связано с примесью ЛПС, а обусловлено наличием в его составе структур, отличных от ЛПС и обладающих иммуностимулирующей активностью.

На модели локальной стафилококковой инфекции был показан более выраженный защитынй эффект смеси Иммуновака® с rHSP70, чем при иммунизации каждым из этих препаратов в отдельности.

Смесь Иммуновака® с rHSP70 стимулировала также защиту от гриппозной инфекции.

Для оценки механизма действия смеси Иммуновака® с rHSP70 было проведено изучение фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови мышей, действие этих препаратов на созревание дендритных клеток, продукцию цитокинов in vitro и in vivo .

Оценка фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови мышей была проведена в НСТ (нитросиний тетразоль) тесте по активации синтеза активных форм кислорода, определяющих бактерицидные свойства препаратов. В результате проведенных исследований было выявлено, что наибольший индекс активации нейтрофилов периферической крови мышей был получен при введении смеси Иммуновака® с rHSP70 (3,5) для Иммуновака®, rHSP70 и интактных животных он составил 2,9, 2,3 и 1,8 соответственно.

Ключевыми эффекторами врожденного иммунитета являются дендритные клетки (ДК), которые участвуют в захвате, процессинге и представлении антигена Т-лимфоцитам. При этом только зрелые ДК способны к антигенному представлению. Для оценки способности Иммуновака®, rHSP70 и смеси Иммуновака® с rHSP70 вызывать созревание ДК, было проведено исследование in vitro. Внесение в среду культивирования Иммуновака®, rHSP70 или смеси Иммуновака® с rHSP70 приводило к увеличению числа ДК, экспрессирующих TLRs 2, 4, 9, причем эффект был выше при использовании комбинации исследуемых антигенов.

Это свидетельствует об усилении активации TLR-зависимого сигнального пути, что приводит в свою очередь к активации ядерного фактора транскрипции NF-кВ и экспрессии генов провоспалительных цитокинов [10]. Под действием Иммуновака®, rHSP70 и смеси Иммуновака® с rHSP70 в культуре ДК в равной степени повышался синтез провоспалительных (IL-6 и TNFa), а также регуляторных цитокинов (IL-10, IL-12). При этом изменялся фенотип ДК: экспрессировалась молекула терминальной дифференцировки ДК - CD83; увеличивалась экспрессия молекул адгезии CD38 (с 5,43 до 89,2 84,5 и 88,3% соответственно), появление которых необходимо для контакта ДК с Т-лимфоцитами; экспрессировалась костимуляторная молекула CD40; молекулы антигенного представления МНС класса II. Причем более высокие показатели были выявлены при внесении в среду культивирования смеси Иммуновака® с rHSP70. Полученные данные свидетельствуют о том, что смесь Иммуновака® с rHSP70 стимулирует созревание ДК в большей степени, чем только введение Иммуновака® или rHSP70.

В опытах in vivo мышей иммунизировали 1-кратно и определяли уровень цитокинов в сыворотке крови в течение 8 часов после введения препаратов. При введении rHSP70 (100 мкг) уже через 1 час появлялся IL-1 (3 и быстро снижался до фоновых значений уже через 2 часа наблюдения. При иммунизации Иммуноваком® (200 мкг) IL-1(3 появляся также через 1 час, но сохранялся на высоком уровне в течение 8 часов (550-765 пг/мл). При иммунизации смесью Иммуновака® с rHSP70 (200+100) пг/мл IL-ip появляся позднее (через 2 часа), но оставался на высоком уровне в течение всего срока наблюдения (320 - 488 пг/мл). В группе мышей, иммунизированных смесью Иммуновака® с rHSP70, уровень TGF0 (1393 пг/мл против 374 пг/мл у интактных мышей) появлялся в самый ранний срок (через 1 час) что, вероятно, сдерживало быструю высокую продукцию IL-1|3, приводя к адекватной регуляции иммунного ответа. TGF(3 у мышей, иммунизированных rHSP70, появлялся позднее, через 2 часа (1350 пг/мл), а при введении Иммуновака® - через 4 часа (1341,5 пг/мл). Синтез IFNy выявили через 2 часа в группах, получавших Иммуновак® и смесь Иммуновака® с гН8Р70. В уровне остальных исследованных цитокинов (1Ь-2, 1Ь-4, ТЬ-6, 1Ь-10, \L-12, Т№а) различий с интактными животными выявлено не было.

Проведенные исследования показали способность гНБР70 стимулировать реакции врожденного иммунитета при введении в смеси с Иммуноваком®. Важно отметить, что иммунизация мышей во всех исследованных группах, не приводила к повышению уровня 1Ь-6, который в присутствии ТОБр способствует дифференцировке С04+Т11 в ТЫ 7, участвующих в аутоиммунных процессах. Напротив, продукция ТОБР в отсутствии 1Ь-6 включает активацию Тге§ (С04+/С025+) регуляторных Т-лимфоцитов [133].

Таким образом, гШР70 в составе смеси с бактериальными антигенами сложной химической природы стимулирует врожденный иммунитет. Следствием этого является усиление защиты животных от бактериальной и вирусной инфекции при заражении через 24 часа после иммунизации.

Активация врожденного иммунитета являются связующим звеном с реакциями адаптивного иммунитета. Для оценки способности гН8Р70 стимулировать адаптивный иммунный ответ были выбраны бактериальные (анатоксины, Иммуновак®, стафилококковый и клебсиеллезный антигены, капсульный полисахарид Н. ифиетае типа Ь) и вирусные (субъединичные гриппозные антигены, химерный генно-инженерный белок Е7 вируса папилломы человека 18 типа) препараты.

Изучение влияние гН8Р70 на усиление адаптивного иммунитета к бактериальным и вирусным антигенам выявило ряд особенностей. Установлено, что высокомолекулярные белковые антигены бактериальной природы (дифтерийный анатоксин) в ассоциации гН8Р70 вызывают повышение антитоксических противодифтерийных АТ только после 2-кратной иммунизации. При введении гН8Р70 с нативным дифтерийным анатоксином после 2-кратной иммунизации титр антитоксических дифтерийных АТ повышался до ^=4,1 при иммунизации нативным анатоксином lg=3,4, то есть в 1,2 раза. Конъюгация анатоксина с rHSP70 не приводила к усилению иммуногенности.

При исследовании действия смеси rHSP70 на образование титров AT к антигенам, входящим в состав вакцины Иммуновак®, установлено, что повышение титров AT при испытанных схемах и дозах введения препарата происходило к антигенам, обусловившим в данном опыте меньшее повышение уровня AT (клебсиеллезный, стафилококковый). При иммунизации смесью Иммуновака® с rHSP70 образование AT происходило в большей степени (в 2,6 и 4,3 раза соответственно).

Однако при использовании стафилококкового антигена на модели генерализованной стафилококковой инфекции при разных схемах и дозах иммунизации не было выявлено преимущества в использовании rHSP70. Более того, на модели локальной стафилококковой инфекции, при использовании различных схем и доз введения препаратов, мы также не получили разницы в степени воспалительной реакции в лапке мышей, зараженной штаммом стафилококка, при использовании смеси стафилококкового антигена с rHSP70, по сравнению с контролем. Тем не менее, по сравнению с монопрепаратами (стафилококковый антиген или rHSP70) реакция была менее выраженной. Существенного повышения титров AT к стафилококковому антигену выявлено не было. Это предполагает, что для стафилококкового антигена необходимо использование помимо rHSP70 дополнительного адъюванта, так как в составе вакцины Иммуновак®, содержащей ЛПС и другие иммунодоминантные соединения, титр AT к стафилококку повышался.

Хорошей моделью для исследования иммунологической активности rHSP70 являлся капсульный полисахарид Н. influenzae типа b (KTEHib). Были использованы разные схемы и дозы введения препаратов. Установлено, что KTIHib не стимулировал исследованные нами реакции врожденного иммунитета, тогда как под влиянием KDHib в ассоциации с rHSP70 происходила активация врожденного иммунитета, что проявлялось в значительном повышении уровня ТЪЯб 2, 4, 9, а также увеличении числа лимфоцитов с маркерами СЭЗ+, СБ4+, С08+, СЭ19+, Ж, СБЗ/ЫК (ЫКТ), С025+, МНС класса II. Повышение уровня СЭ4+ (Т-хелперы), СБ25+ (маркер ранней активации Т-хелперов) и увеличение содержания МНС класса II можно расценивать как переключение Т-независимого иммунного ответа на Т-зависимый. Химическая конъюгация КПШЬ с гН8Р70 оказалась в данном случае менее эффективной, чем введение смеси антигенов, возможно за счет экранирования активных антигенных детерминант. При исследованных схемах и сроках взятия крови разницы в титрах АТ к КПНШ между препратами выявить не удалось. Возможно, была необходима бустерная инъекция препаратов.

При использовании гН8Р70 с субединичными гриппозными антигенами, входящими в состав полуфабриката гриппозной инактивированной трехвалентной вакцины, было выявлено повышение титров антител к вирусам гриппа А/Н^] и В в 2 и 4 раза соответственно.

Наиболее сильное адъювантное действие Н8Р70 было выявлено при использовании химерного генно-инженерного белка вируса папилломы человека (ВПЧ) Е7(ВПЧ-18)-гШР70. Использование ШР70 в составе химерного белка Е7(ВПЧ-18)-Н8Р70 приводило к повышению титров АТ к белку Е7 в 7,8 раза по сравнению с монопрепаратом (рекомбинантный белок Е7). При этом выявлена перекрестная антигенная активность с рекомбинантным белком Е7(ВПЧ) 16 типа. Повышение уровня ^01, и снижение свидетельствовало о поляризации иммунного ответа по ТЬ2 пути.

Исследование уровня анти-Н8Р70-АТ при совместном введении гН8Р70 с бактериальными и вирусными антигенами различной природы в смеси, при конъюгации или в составе химерного белка было проведено с целью оценки его безопасности при введении в организм животных. При использовании различных препаратов (анатоксины, гриппозные антигены, стафилококковый антиген, капсульный полисахарид) было установлено, что введение гН8Р70 с различными антигенными препаратами приводит к повышению титров анти-Н8Р70-АТ, за исключением анатоксинов. Отстуствие анти-Н8Р70-АТ при совместном введении с анатоксинами может быть связано с их постепенным разрушением или нейтрализацией эндогенными Н8Р70, присутствующими в организме мышей, так как исследование проводили более чем через 5 недель после последней иммунизации. При введении препаратов без гН8Р70 титры анти-Н8Р70-АТ практически не отличались от контрольных значений. Высокие значения титров АТ, превышающие контрольные в 10,1-17,5 раза были получены при введении стафилококкового антигена и смеси капсульного полисахарида с гН8Р70, а также при использовании химически конъюгированных препаратов. При этом доза антигена, вводимого с гН8Р70, не имела существенного значения. Наибольшее повышение титров анти-Н8Р70-АТ (в 178,1 раза по сравнению с не иммунизированными животными) было получено при исследовании химерного генно-инжерерного белка Е7 вируса папилломы человека 18 типа.

Определение титров 1§0-АТ к антигенам органов и тканей человека показало, что присутстие АТ к гН8Р70 в сыворотке крови иммунизированных животных не приводило к образованию перекрестно-реагирующих АТ, имеющих общие эпитопы с антигенами органов и тканей человека при испытанных дозах и схемах иммунизации, а иммунизация гШР70 не вызывала поликлональной активации В-клеток.

Полученные данные свидетельствуют о целесообразности проведения исследований в направлении изучения адъювантных свойств гН8Р70 в отношении других антигенов, причем при их введении не только с гН8Р70, но и в сочетании с другими адъювантами.