Автореферат и диссертация по медицине (14.01.08) на тему:Роль барьерной функции желудочно-кишечного тракта и микробиоты кишечника в развитии пищевой аллергии у детей

На правах рукописи

БЕРЕЗИНА ЕЛЕНА ЮРЬЕВНА

Роль барьерной функции желудочно-кишечного тракта и мнкробиоты кишечника в развитии пищевой аллергии у детей

14.01.08,- педиатрия

2 2 ?[)15

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2015

005570861

005570861

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт питания» Федерального агентства научных организаций

Научный руководитель

Ревякина Вера Афанасьевна - доктор медицинских наук, профессор, заведующая отделением аллергологии ФГБНУ «НИИ питания»

Официальные оппоненты

Лусс Людмила Васильевна - доктор медицинских наук, профессор, заведующая научно-консультативным отделением ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России.

Шумилов Петр Валентинович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой госпитальной педиатрии №1 педиатрического факультета ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится « » \> ->—-2015 года в_часов на

заседании Диссертационного совета Д 208.048.10 при ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 119992, г.Москва, ул. Большая Пироговская, д.2, строение 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова (119034, г. Москва, Зубовский бульвар, 37/1) и на сайте www.mma.ru

Автореферат разослан« О 6» 5г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, Чебышева Светлана

к.м.н., доцент Николаевна

Введение

Актуальность темы.

Пищевая аллергия важная медико-социальная проблема. Согласно данным мировой статистики распространенность пищевой аллерген колеблется от 10% до 40% в общей популяции и отмечается тенденция к дальнейшему увеличению числа больных с этой патологией [Балаболкин И.И., 2006, Ревякина В.А., 2008, Almqvist С., 2008, Ellis С. et al., 2003]. Пищевая аллергия является провоцирующим фактором развития атопического дерматита, гастроинтестинальных симптомов, крапивницы, ангиотека и анафилаксии у детей [Пампура А.Н. с соавт., 2008; Ревякина В.А, 2010, Гмошинская М.В., Конь И.Я.,2013; Sletten G.B.G, 2007, Hideaki Monta et al.,2013].

Среди факторов риска развития пищевой аллергии помимо наследственной предрасположенности к атопии, выделяют высокую проницаемость барьера желудочно-кишечного тракта для макромолекул, запускающих каскад аллергической реакции в шоковом органе [Gerth van Wijk R. et al. , 2002; Dreborg S., 2002; Berin MC, Mayer L., 2013]. Одним из биомаркеров повышенной проницаемости слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта считается а- лактальбумин женского молока в моче новорожденных детей. Анализ данных литературы показал достоверное повышение уровня всасывания á- лактальбумина женского молока в моче больных гнойно-воспалительными заболеваниями [Дмитриев A.B., Мазо В.К., Гмошинский И.В. и соавт., 2003, 2004, 2005]. Единичные работы посвящены исследованию данного показателя у новорожденных детей с неблагоприятным течением перинатального и постнатального периодов [Стаченкова C.B., Гмошинский И.В., Боровик Т.Э. и соавт, 1997]. Исследования подобного рода не проводились у детей с высоким риском развития атопии.

Среди прогностических маркеров развития пищевой аллергии у детей заслуживает внимание определение цитокинов в грудном молоке матерей, играющих важную роль в регуляции иммунного ответа у новорожденных. [Nelis Soto-Ramirez, Wilfried Karmaus, 2012, Ustundag В, Yilmaz Е, Dogan Y,

Акагеи Б, Сапа1ап Н, Halifeoglu I, 2005]. В связи с этим, исследование уровней провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в грудном молоке матерей для прогноза развития пищевой аллергии у детей приобретает важное практическое значение.

В литературе последних лет обсуждается роль микробиоты кишечника в формировании пищевой аллергии у детей в период ранней микробной колонизации кишечника. Существенная роль в этом процессе принадлежит именно нормальной микрофлоре, изменения которой в первые дни жизни ребенка могут быть одним из факторов, приводящих к нарушению иммунного баланса, кишечного гомеостаза и задержке формирования кишечного барьера ИбгЫёп В., 2001, КаШотаЫ & а1. 2001,2003, 2007].

Большое значение имеют исследования по организации диетического питания беременных женщин, страдающих аллергическими заболеваниями [Тутельян В.А., Конь И.Я. 2004; Гмошинская М.В., Фатеева Е.М., Алешина И.В. 2003; 1Бо1аип Е., ТаЬуапатеп А., Реко1а Т., 1999]. Особую актуальность приобретает диетотерапия с использованием пробиотиков, и продуктов их содержащих у беременных женщин для снижения риска развития пищевой аллергии у детей.

Все вышесказанное послужило основанием для определения цели и формулирования задач настоящего исследования.

Цель исследования - изучить влияние барьерной функции желудочно-кишечного тракта и микробиоты кишечника на формирование пищевой аллергии у детей для совершенствования методов профилактического питания.

Задачи исследования

1. Произвести отбор беременных женщин с аллергическими заболеваниями и выделить группу детей с высоким риском развития атопии.

2. Изучить уровень экскреции с мочой а-лактальбумина грудного молока у новорожденных детей.

3. Оценить концентрацию цитокинов 11.-17, 1Ь-2, ТОБ-р, а также в^А в грудном молоке кормящих женщин.

4. Определить уровни аллергенспецифичееких IgE антител к белку коровьего молока и его фракциям (казеин, р-лактоглобулин, а-лактальбумин) в копрофильтратах детей раннего возраста.

5. Исследовать микробиоту кишечника беременных женщин и их детей.

6. Оценить влияние пробиотика Lactobacillus reuteri на клиническое течение и показатели микробиоты кишечника беременных женщин.

Научная новизна.

Впервые у новорожденных детей с высоким риском развития атопии проведено исследование уровней экскреции с мочой а-лактальбумина грудного молока. Установлено, что у детей с наследственной отягощенностью аллергическими заболеваниями в раннем постнатальном периоде отмечаются высокие уровни экскреции с мочой а-лактальбумина грудного молока, что свидетельствует о повышенной проницаемости стенки кишки для нерасщепленных белков энтералыюй среды и способствует формированию пищевой аллергии.

Впервые исследованы уровни цитокинов IL-17, IL-2, TGF-р, а также slgA в грудном молоке женщин, страдающих аллергическими заболеваниями. Установлены низкие концентрации slgA, TGF-Р и высокие уровни IL-17 в грудном молоке. Показана прямая корреляционная зависимость между высокой экскрецией с мочой а-лактальбумина грудного молока и низкими уровнями TGF-Р и slgA в грудном молоке.

Впервые проведено исследование микробиоты кишечника у беременных женщин с аллергическими заболеваниями биохимическим методом. Отмечено снижение метаболической активности молочнокислой флоры и дисбаланс аэробных / анаэробных популяций микроорганизмов. Уставлено положительное влияние пробиотика Lactobacillus reuteri на клинические симптомы и микробиоценоз беременных женщин с аллергическими заболеваниями и функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта. Установлено, что частота возникновения атопического дерматита у детей от матерей, получающих Lactobacillus reuteri, достоверно ниже по сравнению с контрольной группой.

Практическая значимость

Доказано, что высокие уровни а-лактальбумина грудного молока в моче новорожденных детей характеризуют повышенную проницаемость слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта и могут служить для оценки прогноза развития пищевой аллергии.

Установлена диагностическая значимость определения аллергенспецифических IgE антител к белку коровьего молока и его фракциям в копрофильтратах детей с пищевой аллергией, что служит основой для назначения персонализированной диетотерапии.

Показано, что использование гипоаллергенной диеты и пробиотика Lactobacillus reuteri у женщин в последнем триместре беременности устраняет имеющиеся у них желудочно-кишечные симптомы (запоры, метеоризм) и уменьшают частоту возникновения атопического дерматита у детей.

Положения, выносимые на защиту

1. Определение экскреции а -лактальбумина грудного молока с мочой у новорожденных детей позволяет судить о проницаемости кишечной стенки для макромолекул и прогнозировать развитие пищевой аллергии у детей.

2. Выявленный цитокиновый дисбаланс в грудном молоке у кормящих матерей (низкие значения TGF-P и slgA и высокие уровни IL-17) является основой для развития пищевой аллергии, как пускового фактора аллергических заболеваний.

3. Использование гипоаллергенной диеты и пробиотика Lactobacillus reuteri у женщин в последнем триместре беременности оказывает положительное влияние на их общее самочувствие, состояние желудочно-кишечного тракта и уменьшает частоту возникновения атопического дерматита у их детей.

Внедрение результатов в практику.

Результаты работы используются в практической деятельности отделения аллергологии и научно-консультативного отделения ФГБНУ «НИИ питания»,

а также в учебном процессе при подготовке врачей-курсантов на кафедре диетологии РМАПО.

Получен патент 2521276 С1 на изобретение «Способ определения риска развития аллергической сенсибилизации у детей» от 27.06.14. Апробация работы.

Основные положения диссертации представлены на аллергологической секции Московского общества детских врачей (Москва, апрель 2012 г), ежегодной VI научно-практической конференции «Совершенствование педиатрической практики. От простого к сложному» (Москва, ноябрь 2012 г), XII Российском Конгрессе «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, октябрь, 2013 г.), XV Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов с международным участием «Здоровое питание: от фундаментальных исследований к инновационным технологиям» (Москва июнь, 2014 г).

Результаты исследований, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, использованы при написании методических рекомендаций для врачей «Лечение и профилактика пищевой аллергии у детей раннего возраста» (Правительство Москвы, Департамент здравоохранения, 2011 г.).

Апробация диссертации состоялась на научной конференции клиники ФГБНУ «НИИ питания» 17 сентября 2014 года.

Работа выполнена в соответствии с планом ФГБНУ «НИИ питания» в рамках темы №110 «Разработка системы диагностики, лечебного и профилактического питания, лекарственной терапии при пищевой аллергии». Личный вклад автора

Автор лично осуществлял отбор и наблюдение за беременными и кормящими женщинами и их новорожденными детьми. Проводил анализ, обобщение и научное обоснование полученных результатов. Автором совместно с старшим научным сотрудником НИИ питания РАМН к.б.н. Зориным С.Н. проведены исследования по определению у новорожденных детей экскреции с мочой а-лактальбумина. Автор провел определение цитокинов в грудном молоке кормящих женщин. Вклад автора заключается

7

в участии во всех этапах исследования: от постановки цели и задач до обсуждения результатов в научных публикациях, конференциях, докладах и их внедрения в практику. Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, в том числе 7 статей в научных журналах рекомендованных ВАК РФ, 1 патент на изобретение.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 125 страницах, состоит из введения, обзора литературы, главы «Объемы и методы исследования», трех глав собственных исследований, главы обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включает 11 рисунков и 14 таблиц. Список литературы включает 235 источников, из них 63 отечественных и 172 зарубежных.

Соответствие диссертации Паспорту научной деятельности.

Диссертация соответствует шифру научной специальности: 14.01.08 — Педиатрия и формуле специальности. Педиатрия - область клинической медицины, изучающая здоровье ребенка в процессе его развития, физиологию и патологию детского возраста, а также разрабатывающая методы диагностики, профилактики и лечения детских болезней. Так же соответствует области исследований согласно пунктам 2,3,5.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.

Работа выполнена в период с 2010 по 2014 г. в отделении аллергологии (руководитель отделения - д.м.н., профессор Ревякина В.А.), лаборатории физиологии и биохимии пищеварения (руководитель — д.б.н., профессор Мазо В.К.) и в лаборатории клинической биохимии, иммунологии и аллергологии (руководитель - д.м.н., профессор Сенцова Т.Б.) ФГБНУ «НИИ питания» (директор НИИ питания - академик РАН, д.м.н., профессор Тутельян В.А.), на базе женской консультации при городской поликлинике № 214 и детской поликлиники №66 Южного административного округа г. Москвы.

В исследовании приняли участие 108 беременных и кормящих женщин и их 111 новорожденных детей. Женщин включали в исследование на поздних сроках беременности, начиная с 33-35 недели, и продолжали наблюдение в послеродовом периоде до 4-6 недели после родов. 111 детей находились под наблюдением первые 6 месяцев жизни до введения прикорма. У них оценивалась частота возникновения атопического дерматита, связанного с пищевой аллергией.

Дизайн исследования.

Данное исследование является открытым, сравнительным проспективным, контролируемым. Критерии включения

1. Беременные женщины, страдающие аллергическими заболеваниями или имеющие положительный аллергологический анамнез (наличие аллергических заболеваний у отца будущего ребенка и/или ближайших родственников)

2. Беременные женщины не имеющие аллергических заболеваний у себя и ближайших родственников (контрольная группа).

3. Согласие беременной женщины на участие в исследовании

Критерии не включения в исследование

1. Наличие у беременной женщины тяжелых соматических, неврологических и психических заболеваний.

Выделены две группы беременных женщин. В первую группу вошли 58 беременных женщин с аллергическими заболеваниями или имеющих положительный аллергологический анамнез (основная группа). Вторую группу составили 50 беременных женщин без аллергии (контрольная группа).

Всем 108 женщинам на 32-34 неделе беременности проведена оценка анамнестических данных (наследственность, анамнез жизни, индивидуальный и семейный аллергоанамнез), течения беременности, соматического статуса беременных, выраженности симптомов аллергического заболевания.

Дети, рожденные от беременных женщин, наблюдались с периода новорожденности до 6 месячного возраста. Из них 57 (51,3%) мальчиков и 54

9

(48,6%) девочки. Первичный осмотр детей проводился в 2-3 недельном возрасте, далее ежемесячно до 6 месячного возраста и введения прикорма. Все дети находились на грудном вскармливании. При клиническом осмотре оценивалось состояние кожных покровов и симптомы со стороны желудочно-кишечного тракта. Для диагностики атопического дерматита у наблюдаемых детей были использованы критерии UK Working Party's Diagnostic Criteria for Atopic Dermatitis.

Концентрацию d-лактальбумина женского молока в моче детей определяли с помощью твердофазного иммуноферментного метода. На 30±5 день жизни ребенка производили забор разовой порции мочи в мочеприемник в объеме не менее 1 мл и хранили в пластиковых контейнерах при t минус 20°С до процедуры проведения анализа.

Цитокины и slgA в грудном молоке. Сбор грудного молока у наблюдаемых женщин осуществлялся через месяц после рождения ребенка. Определялось содержание IL-17, IL-2, TNF-ß (трансформирующий фактор роста ß), а также slgA в грудном молоке этих матерей.

Образцы грудного молока забирались в стерильные пластмассовые пробирки на 28-30 день от рождения ребенка. Исследование slgA проводили в течение 2 часов после забора молока, которое центрифугировали в течение 15 минут (3000 об/мин), снимали жировую пленку с поверхности молока и определяли содержание секреторного IgA. Для исследования содержания slgA в грудном молоке применялся метод радиальной иммунодиффузии с использованием моноспецифических антисывороток к SC- фрагменту IgA производства Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.И. Габричесвкого. Образцы грудного молока для определения цитокинов (IL-17, IL-2, TNF-ß) после центрифугирования хранили при температуре 40°. Был использован иммуноферментный метод (ИФА) с применением коммерческих наборов BioSource International Inc., Бельгия.

Определение аллергенспецифических IgE- антител в копрофильтратах осуществлялся с помощью неконкурентного иммуноферментного анализа с применением специальных тест-систем

10

фирмы Allergopharma (Германия), на полуавтоматическом анализаторе «Coda» (Bio-Rad Laboratories, США).

Исследование микробиоты кишечника беременных женщин. Состав кишечной микрофлоры беременных изучался до и после родов с помощью биохимического исследования фекалий методом газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ). Метод основан на определении метаболической активности микрофлоры по спектрам и уровням летучих жирных кислот.

Исследование микробиоты кишечника новорожденных детей. Детям в возрасте 30± 5 дней производили забор фекалий в стерильные пластиковые контейнеры и проводили микробиологическое исследование кала по стандартной методике

Обработка полученных результатов исследования проводилась с использованием программы Statistica 8.0 корпорации StatSoft Inc. (США). При оценке различий в изучавшихся группах использовались критерии непараметрической статистики (критерии Вилкоксона, Краскала-Уоллиса, Манна-Уитни). При корреляционном анализе рассчитывали коэффициент корреляции Spearman.

Результаты собственного исследования и их обсуждение.

Анализ состояния здоровья и течения беременности у наблюдаемых женщин основной группы показал наличие у 30 из них (51,7%) разнообразной аллергической патологии. Так, у 4 (13,3%) из них отмечалась бронхиальная астма, у 9 (30%) - круглогодичный аллергический ринит, 11 (36,7%) поллиноз, 6 (20,6%) - крапивница. Остальные 28 (48,3%) беременных женщин имели аллергические заболевания у ближайших родственников. Аллергические заболевания у беременных женщин контрольной группы не отмечались.

Патология со стороны ЖКТ отмечалась у 26 (24,1%) из 108 наблюдаемых женщин обеих групп. Причем частота желудочно-кишечных заболеваний у женщин контрольной группы была в 1,5 раза чаще по сравнению с женщинами из основной группы (29,2% и 20% соответственно). С одинаковой частотой в обеих группах встречались гастриты, язвенная болезнь, холециститы. Запоры во время беременности на поздних сроках в 2

11

раза чаще беспокоили женщин основной группы по сравнению с группой контроля (30,1% и 14,6% соответственно).

У 60 (55,5%) беременных женщин отмечался отягощенный акушерский анамнез. Основными факторами, осложнявшими течение беременности, являлись угроза прерывания беременности, ранний и поздний гестозы, анемия.

Роды протекали без осложнений у 70 (64,8%), слабость родовой деятельности у 11 (10,2%), быстрые или стремительные роды у 8 (7,4%), роды были преждевременными у 2 (1,8%), кесарево сечение у 17 (15,8%) женщин (рис.1). Послеродовый период у всех женщин протекал удовлетворительно.

Рисунок 1. Особенности течения родов у наблюдаемых женщин

Осмотр 111 детей, рожденных от наблюдаемых матерей показал, что 109 были доношенными и 2 родились недоношенными. Ранний период адаптации у большинства детей протекал удовлетворительно. В первые дни жизни у 20 (18,0%) детей отмечалась токсическая эритема, а у 62 (55,8%) младенцев физиологическая желтуха. Госпитализация потребовалась 2 детям по поводу недоношенности и внутриутробной гипотрофии.

После рождения к груди приложили в родильном зале 57 (51,4%), в течение первых 12 часов 31 (27,9%), на вторые сутки 5 (4,5%), на 5-10 сутки 18 (16,2%) новорожденных детей (рис.2).

5% на вто[ сутки

28> в nepeb.v, часов

^51% родильном зале

Рисунок 2. Сроки прикладывания к груди

Среди детей с поздним прикладыванием к груди 18 (16,2%) младенцев в течении первых (5-10) дней получали молочные смеси. К концу первого месяца жизни все наблюдаемые дети находились на грудном вскармливании.

Функциональные нарушения желудочно-кишечного тракта отмечались у 83 (74,8%) младенцев. При этом 76 (68,5%) детей беспокоили колики до 3 месячного возраста, а у 26 (23,4%) детей до 5-6 месячного возраста. Срыгивания наблюдались у 33 (29,7%), запоры у 30 (27,0%) детей. Лактазная недостаточность была выявлена у 12 (10,8%) детей в возрасте с 2 до 4 мес.

В течение первых 3 месяцев жизни эпизодические высыпания на коже, связанные с погрешностью в диете матери, отмечались у 39 (35,1%) младенцев, а в период от 3 до 6 мес. у 7 (6,3%) детей. В первые 6 мес. жизни атопический дерматит развился у 11 (10%) детей, из них у 4 (6,8%) от матерей основной группы, получавших пробиотик Lactobacillus reuteri и у 7(14%) детей от матерей контрольной группы.

18%

течение

легкое

55%

27% средне-

тяжелое течение

Рисунок 3. Распределение детей в зависимости от тяжести течения АтД

Таким образом, дебют АтД у 11 детей из 111 обследованных пришелся на возраст от 2 до 6 месяцев. Основным провоцирующим фактором в развитии атопического дерматита у этих детей был алиментарный. При этом наиболее частой причиной были: нарушение диеты матери на фоне грудного вскармливания и докорм молочными смесями.

При разработке неинвазивного метода, характеризующего проницаемость слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта у детей первых дней жизни, находящихся на грудном вскармливании, была выявлена тесная взаимосвязь между всасыванием й-лактальбумина грудного молока в кровь и его экскрецией с мочой. Это позволило рассматривать данный белок в качестве биомаркера целостности кишечного барьера у детей первых дней жизни [Дмитриев A.B., Гмошинский И.В. , Мазо В.К. и соавт.,2003, 2004,2005].

Исследование уровней й-лактальбумина грудного молока в моче 61 ребенка в возрасте 30±5 дней, находящихся на грудном вскармливании, показало изменение данного показателя от следовых количеств до 300,0 нг/мл. В зависимости от содержания а-лактальбумина грудного молока в моче выделены 2 группы детей. В первую группу вошло 52 ребенка с низким уровнем экскреции й-лактальбумина в моче (от следовых значений <0,9 нг/мл до 40,0 нг/мл, т=7,87+1.32 нг/мл); во вторую - 9 детей с высокой экскрецией й-лактальбумина в моче (от 40,0 нг/мл до 300,0 нг/мл, m=l 11,54+9,12 нг/мл) (табл.1).

Таблица 1. Уровни экскреции ä-лактоальбумина грудного молока у новорожденных детей.

Показатели I группа(п=52) с низким уровнем экскреции й-лактальбумина II группа(п=9) с высоким уровнем экскреции й-лактальбумина

Колебания 0,3 - 40,0 нг/мл 40,0-300,0 нг/мл

Среднее значение 7,87+1,32 нг/мл 111,54+9,12 нг/мл

Количество детей, у которых развился атопи-ческий дерматит, п(%) 2 (3,8%) 6 (66,7%)

У детей с высокой экскрецией а-лактальбумина в моче в 1,95 раза чаще регистрировалась семейная предрасположенность к аллергическим заболеваниям по сравнению с детьми, имевших низкие значения этого белка (77,8% и 40,4% соответственно, Р <0,05). Установлена прямая корреляционная связь между отягощенным семейным анамнезом по аллергическими заболеваниями и высокой экскрецией с мочой а-лактальбумина (г=+0,67).

При исследовании микробиоты кишечника у наблюдаемых детей в кале выявлялся Staphylococcus aureus (>105 КОЕ/г), причем чаще у детей с высокой экскрецией а-лактальбумина в моче, чем у детей низкими значениями этого белка (88,9% против 21,2%, Р<0,05). Проведенный корреляционный анализ выявил взаимосвязь между высокой экскрецией а-лактальбумина в моче и повышенным количеством Staphylococcus aureus (г=+0,58). В отношении бифидобактерий и других представителей нормальной и условно патогенной микрофлоры статистически значимых различий в обеих группах не установлено. В ходе наблюдения было выявлено, что в группе детей с высокой экскрецией а-лактальбумина в моче частота встречаемости атопического дерматита была выше, чем у детей с низкими значениями этого биомаркера (66,7% против 3,8%, Р<0,01) .

Таким образом, высокий уровень а-лактальбумина грудного молока в моче новорожденных детей характеризует повышенную проницаемость барьера желудочно-кишечного тракта и способствует развитию пищевой аллергии у младенцев в виде атопического дерматита.

Результаты исследования уровней slgA и цитокинов (TGF-P, EL-17,IL-2) в грудном молоке кормящих женщин представлены в табл.2.

Как показали проведенные исследования в грудном молоке кормящих женщин, страдающих аллергическими заболеваниями или имеющие аллергические проявления в семье, выявлялись низкие показатели slgA, TGF-p и высокие IL-17 по сравнению с кормящими женщинами без аллергии. Не выявлено статистически значимых различий концентраций IL-2 в

15

грудном молоке у женщин в двух наблюдаемых группах. Выявленный цитокиновый дисбаланс у корящих матерей с аллергией (низкие значения ТвБ-Р и высокие уровни ГЬ-17) по-видимому, является основой для развития пищевой аллергии, как пускового фактора аллергических заболеваний. С некоторой долей вероятности это подтверждается данными клинического наблюдения за детьми от этих матерей, у которых чаще наблюдались кожные проявления аллергии (Р<0,05).

Таблица 2 Уровни slgA и цитокинов в грудном молоке кормящих женщин

Показатели Первая группа (n=26) Кормящие женщины с положительным аллергологическим анамнезом Вторая группа (п=18) Кормящие женщины с отрицательным аллергологическим анамнезом Р- вероятность различий между первой и второй групп

slgA мг/дл 2,76+0,13 3,88+0,16 Р<0,05

TGF-P, pg/ral 43,2+4,8 56,7+6,4 Р<0,01

IL-17, pg/ml 0,33+0,12 0,24+0,11 Р<0,05

IL-2, pg/ml 5,5+0,7 4,6+1,4 Р<0,1

Для определения влияния пробиотика Lactobacillus reuteri и характера питания на развитие аллергических состояний у детей первых месяцев жизни, были выделены две группы беременных женщин. Основную группу (п=60) составили беременные женщины, получающие гипоаллергенную диету (исключение орехов, морепродуктов, шоколада, цитрусовых) и пробиотик Lactobacillus reuteri. Контрольную группу (п=48) составили беременные женщины, получающие стандартные диетические рекомендации, предлагаемые в женской консультации. Исследование микробиоты кишечника у наблюдаемых беременных женщин на 33-35 недели беременности до соблюдения специальных диетических рекомендаций были однотипными, поэтому результаты были объединены (табл.3).

Таблица 3. Результаты биохимического исследования метаболической активности кишечной микрофлоры у женщин основной и контрольной группы в последнем триметре беременности до приема Lactobacillus reuteri (n=108)_

Показатели Абсолютное содержание, мг/г Относительно содержание, ед.

Результат Норма Результат Норма

С2 (уксусная) 5,653 ± 0,555 5,88 ±1,22 1,892 ± 0,012 0,634 ± 0,015*

СЗ(пропионовая) 0,524 ± 0,201 1,79 ±0,95* 0,127 + 0,015 0,189 ± 0,011*

С4(масляная) 0,489 + 0,237 1,75 ±0,85* 0,030 ±0,008 0,178 + 0,011*

ИзоСп/Сп У. (изоС4 + изоС5 + изоСб) 0,313 + 0,110 0,631 ± 0,011* 0,022 ±0,003 0,059 ± 0,015

Результат Норма

ИзоСп/Сп 2,227 ±1,264* 0,430 + 0,130

6 Общее содержание У С, 2,136± 1,59* 10,51 ±2,50

Анаэробный индекс (С2- С4) -0,261 ±0,0011 -0,576 +0,110

* р - достоверность различий между полученными результатами и нормальными значениями.

У большинства 84(77,8%) беременных женщин отмечалось

6

достоверное снижение суммарного количества изучаемых кислот ^С,

(р<0,01). В профиле С2-С4 монокарбоновых кислот отмечено повышение относительного количества уксусной кислоты при сниженном содержании пропионовой (СЗ) и масляной (С4) кислот (р<0,01). Выявлены низкие показатели X (из° С4 + изоС5 + изоСб) и повышение соотношения изокислот к монокрабоновым кислотам (изоСп/Сп). Полученные данные свидетельствуют о снижении метаболической активности молочнокислой флоры (бифидобактерий и лактобактерий) и появление штаммов с измененными свойствами. Низкие значения пропионовой кислоты указывают на нарушение синтеза биогенных аминов, которые блокируют адгезию патогенов. При этом повышена активность отдельных штаммов аэробных бактерий (стрептококков и стафилококков) при снижении активности анаэробных микроорганизмов (бактероидов, эубактерий и клостридий).

Употребеление гипоаллергенной диеты и пробиотика Lactobacillus reuteri (Рела Лайф) в течение последнего триместра у беременных женщин оказало положительное влияние на их общее самочувствие и состояние ЖКТ. У подавляющего большинства беременных женщин (84,5%) отмечено исчезновение запоров. Причем в 2,5 раза уменьшилась частота жалоб на запоры в основной группе и в 1.4 раза в контрольной группе. Отмечена хорошая переносимость Lactobacillus reuteri у наблюдаемых женщин. Побочных реакций на его прием не отмечено.

Динамика показателей биохимического исследования метаболической

активности кишечной микрофлоры у беременных женщин основной группы

на фоне приема Lactobacillus reuteri представлена в табл. 4.

Таблица 4. Динамика показателей биохимического исследования метаболической активности кишечной микрофлоры у беременных женщин основной группы на фоне приема Lactobacillus reuteri (n=60)

Показателя Абсолютное содержание, мг/г Относительно содержание, ед.

До лечении После Норма До лечения После Норма

С2 (уксусная) 5,653 ± 0,555 4,926 ± U30 5,88 ± 1,22 1.892 ±0.012 0,864 ±0,013« 0,634 ±0,015

СЗ(проонон овая) 0,524 ± 0,201 1,812 ± 0,442» 1,79 ±0,95 0,127 ±0,015 0,199 ± 0,010* 0,189 ±0,011

С4 (масляная) 0,489 ± 0,237 1,721 ± 0,236' 1,75 ± 0,85 0,030 ± 0,008 0,118 ± 0,011" 0,178 =± 0,011

ИзоСп/Сп 2 (а)оС4 + нюС5 + изо Сб) 0,313 ±0,110 0,538 ±0,011 0,631 ±0,011 0,022 ± 0,003 0,053 ± 0,005 0,059 ±0,015

до лечении После лечения Норма

ИзоСп/Сп 2221 ± 1,264 0320 ± 0,130* 0,430 ±0,130

Общее содержание 6 5е' 2,136 ± 1.59 7,42 ± 2,58* 10,51 ±2,50

Анаэробны i Яндекс (С2- С4) -0,261 ±0.0011 +0,576 ±0,110 -0,576 ±0,110

Здесь и в табл. 5: * р — достоверность различий до и после лечения.

Использование данного пробиотика у женщин основной группы способствовало достоверному повышению метаболической активности молочнокислой флоры и восстановление баланса между аэробными/анаэробными микроорганизмами. На этом фоне обмечалось уменьшение запоров у беременных женщин этой группы и частоты обострений аллергических заболеваний. В то же время у беременных

18

женщин контрольной группы не обнаружено статистически значимых изменений в показателях кишечной микробиоты (табл.5).

При оценке состояния микробиоты кишечника у новорожденных установлено статистически значимое (р<0,001) более высокое содержание лактобактерий у детей матерей основной группы по сравнению с контрольной группой. Так, количество лактобактерий в 108"107 КОЕ/г отмечалось у 43 (71,7%) детей матерей основной группы и у 10 (20,8%) детей из группы сравнения. Количество бифидобактерий в 109Т0Ш КОЕ/г отмечалось у 37 (61,7%) и 14 (29,2%) детей матерей основной и контрольной групп. Staphylococcus auerus в высоких титрах (>Ю5КОЕ/г) достоверно чаще выявлялся (р<0,05) у детей матерей основной группы (31,7% против 18,7%).

Таблица 5. Динамика показателей биохимического исследования метаболической активности кишечной микрофлоры у беременных женщин контрольной группы, не принимающих Lactobacillus reuteri (n=48)

Показатели Абсолютное содержание, мг/г Относительно содержание, ел.

долгчпн После Норма до лечения После Норма

С2 (уксусвяя) 5,653 ± 0,555 5,648 ±1,24 5,88+1,22 1,892 ±0,012 1,684 ±0,015 0,634 ±0,015

СЗ(пропюво вав) 0,524 ± 0,201 0,367 ± 0,009 1,79 + 0,95 0,177 ±0,015 0,179 ±0,012 0,189± 0,011

С4 (масляная) 0,489 ±0,110 0,945 ±0,019 1,75 ± 0,85 0,030 ±0,008 0,042 ±0,011 0,178 ±0,011

ИзоСп/Сп I (язоС4 + аз оС5 + язоСб) 0,313 ±0,110 0369 ± 0,011 0,631 ±0,011 0,022 ± 0,003 0,069 ± 0,004 0,059 ±0,015

до лечения после лечения Норма

ИзоСп/Сп 2,626 ± 1,48 2,430 ±0,130 0,430 ± 0,130

Общее содержав** 6 Zc< 2,136 ± 1.59" 2,127 ±2,50 10,51 ±2,50

Анаэробный индекс (С2-С4) -0,261 ±0,0011 -0,489 ±0,111 •0,576 ±0,110

Наблюдение за детьми, рожденными от наблюдаемых матерей с учетом рекомендованных рационов питания во время беременности, показало, что кумулятивная частота АтД к 6 месячному возрасту была достоверно ниже в группе детей, матери которых во время беременности получали гипоаллергенную диету и пробиотик Lactobacillus reuteri (6,8%), по сравнению с детьми матерей контрольной группы (14,8%) (р<0,05).

Пищевая аллергия у детей с АтД подтверждалась результатами исследования уровней slgE антител в копрофилыратах к белку коровьего молока, р-лактоглобулину, а-лактоальбумину и казеину. У всех детей с атопическим дерматитом выявлялись slgE антитела в копрофильтратах к изучаемым белкам коровьего молока и его фракциям. Наиболее высокие концентрации slgE определялись к цельному белку коровьего молока, лактоглобулину и казеину (от 1,1 ±0,17 МЕ/мл до 2,95±0,71 МЕ/мл). slgE к а-лактоальбумину выявлялись у 54,5%, р-лактоглобулину у 81,9%, казеину у 72,7% детей.

Таким образом, проведенное обследование позволило установить, что высокая проницаемость желудочно-кишечного барьера для макромолекул, ряд цитокинов грудного молока женщин, изменение в микробиоте кишечника у беременных женщин являются биомаркерами прогноза развития пищевой аллергии у детей. Выводы

1. У новорожденных детей в раннем постнатальном периоде установлена прямая корреляционная связь между высокой экскрецией а-лактальбумина грудного молока в моче и отягощенным семейным анамнезом по аллергическими заболеваниями (г=+0,67), и повышенным количеством Staphylococcus aureus ( >10s КОЕ/г) в кале (г=+0,58). Определение экскреции с мочой а-лактальбумина у новорожденных позволяет прогнозировать риск развития пищевой аллергии.

2. Низкие значения slgA, TGF-P и высокие IL-17 в грудном молоке кормящих матерей являются прогностическими тестами формирования пищевой аллергии у детей. В группе детей от матерей с дисбалансом цитокинов грудного молока атопический дерматит развивается в первые 6 месяцев в 75,0% случаев, а в группе контроля в 22,2% случаев (JX0.01).

3. У большинства детей первых месяцев жизни, страдающих атопическим дерматитом, выявляются высокие уровни аллергенспецифических IgE антител к белку коровьего молока (81,8%) и его

фракциям: а-лактоальбумину (54,5%), р-лактоглобулину (81,9%), казеину (72,7%) в копрофильтратах.

4. У 77,8% беременных женщин отмечалось достоверное снижение метаболической активности молочнокислой флоры: бифидобактерий и лактобактерий и появление штаммов с измененными свойствами. Выявленные нарушения в микробиоте кишечника у беременных женщин создают предпосылки для изменения иммунного гомеостаза и воздействия рецепторов врожденного иммунитета ребенка на дифференцировку Т-лимфоцитов в направлении как регуляторных, так и эффекторных клеток.

5. Применение пробиотика Lactobacillus reuteri у женщин основной группы способствовало достоверному повышению метаболической активности молочнокислой флоры и восстановление баланса между аэробными/анаэробными микроорганизмами.

6. Наблюдение за детьми, рожденными от матерей с учетом рекомендованных рационов питания во время беременности в первые 6 месяцев жизни, показало, что кумулятивная частота АтД к 6 месячному возрасту была достоверно ниже в группе детей, матери которых во время беременности получали гипоаллергенную диету и пробиотик Lactobacillus reuteri (6,8%), чем в группе детей матерей контрольной группы (14%) (Р<0,05).

Практические рекомендации

1. Для прогнозирования риска развития пищевой сенсибилизации рекомендуется определять а-лактальбумин грудного молока в моче новорожденных детей.

2. Выявленные высокие уровни аллергенспецифических IgE к белку коровьего молока и его фракциям (а-лактоальбумину, Р-лактоглобулину, казеину) в копрофильтратах у детей с атопическим дерматитом обосновывают необходимость ранней диагностики пищевой аллергии и назначения персонифицированной диетотерапии

3. Гипоаллергенная диета и пробиотик Lactobacillus reuteri у женщин в последнем триместре беременности оказывают положительное

влияние на их общее самочувствие и состояние желудочно-кишечного тракта.

4. Включение в комплекс диетических мероприятий пробиотика Lactobacillus reuteri у женщин в последнем триместре беременности может уменьшить частоту возникновения атопического дерматита у рожденных детей.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Березина Е.Ю. Подходы к диетотерапии пищевой аллергии у детей раннего возраста. /Таран Н.Н., Филатова Т.А., Зейгарник М.В., Моносова О.Ю., Ворожко И.В., Березина Е.Ю.// Вопросы практической педиатрии. 2011, том 8, №3, с.79-83

2. Березина Е.Ю. Использование альфа-лактоальбумина женского молока для оценки проницаемости кишечного барьера для макромолекул у детей. / Березина Е.Ю., Зорин С.Н// Материалы XIII Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов «Персонифицированная диетология: настоящее и будущее», Вопросы диетологии , 2011, том 1, №2, с.19

3. Березина Е.Ю. Спектр причинно-значимых аллергенов у детей с атопическим дерматитом. /Ревякина В.А., Сенцова Т.Б., Сурков А.Г., Зотова А.М., Березина Е.Ю.// Материалы XIII Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов «Персонифицированная диетология настоящее и будущее», Вопросы диетологии , 2011, том 1, №2, с.75

4. Березина Е.Ю. Лечение и профилактика пищевой аллергии у детей раннего возраста./ Балаболкин И.И., Белицкая М.Ю., Березина Е.Ю., Вахрамеева С.Н., Ворожко И.В. и др.// Методические рекомендации для врачей - педиатров, диетологов, аллергологов, ординаторов и студентов. М., Департамент Здравоохранения Правительства Москвы, 2011,31 с.

5. Berezina Е. Optimisation of nutritional therapy of atopic dermatitis in infants. /Revyakina V., Sentsova T., Denisova S., Monosova O., Vorozhko I., Berezina E.// XXX Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology. Istanbul, 2011 P.589

6. Березина Е.Ю. Оценка эффективности диетотерапии у детей с атопическим дерматитом и пищевой аллергией. /Березина Е.Ю., Шарапова К.Г., Ревякина

B.А., Сенцова Т.Б., Моносова О.Ю., Зотова A.M.// Российский аллергологический журнал, 2012, №4, с.72-79

7. Березина Е.Ю. Клинико-иммунологические особенности пищевой аллергии у детей с атопическим дерматитом. /Ревякина В.А., Березина Е.Ю., Сенцова Т.Б., Моносова О.Ю., Ворожко И.В., Денисова С.Н.// Вопросы детской диетологии, 2012, том 10, №3, с.27-30

8. Березина Е.Ю. Оценка проницаемости кишечного барьера для макромолекул у детей с высоким риском развития атопии. / Березина Е.Ю., Мазо В.К., Зорин

C.Н., Ревякина В.А.// Материалы Конгресса педиатров стран СНГ «Ребенок и общество: проблемы здоровья и питания», 25-26 апреля 2012 (Львов, Украина),с.46.

9. Березина Е.Ю. Результаты катамнестического наблюдения за детьми с атопическим дерматитом. /Ревякина В.А., Шарапова К.Г., Березина Е.Ю., Моносова О.Ю., Зотова A.M.// Материалы Конгресса педиатров стран СНГ «Ребенок и общество: проблемы здоровья и питания» 25-26 апреля 2012 (Львов, Украина),с.282

10. Березина Е.Ю. Пищевая аллергия и атопический дерматит у детей. Есть ли взаимосвязь?/ Ревякина В.А., Березина Е.Ю., Сенцова Т.Б., Моносова О.Ю., Кувшинова Е.Д., Тимофеева A.M.// Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2013, № 4, с.22-27

11. Березина Е.Ю. Риск развития пищевой аллергии у новорожденных детей с повышенной экскрецией с мочой альфа-лактальбумина материнского молока. / Березина Е.Ю., Ревякина В.А., Мазо В.К., Зорин С.Н., Гмошинская М.В., Конь И .Я.// (Материалы XII Российского конгресса «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии», 2013). Российский вестник перинатологии и педиатрии, 22-24 октября 2013, том 58, №5, с.28-29

12. Березина Е.Ю. Экскреция с мочой альфа-лактальбумина у детей с отягощенным аллергологическим анамнезом, как фактор риска развития пищевой сенсибилизации. /Березина Е.Ю., Ревякина В.А., Зорин С.Н., Мазо В.К., Гмошинская М.В., Конь И .ЯЛ Российский аллергологический журнал, 2014, №4, с.39-42

13. Березина Е.Ю. Влияние питания беременных женщин на показатели секреторных иммуноглобулинов в грудном молоке./Богданова C.B., Гмошинская М.В., Сенцова Т.Б., Денисова С.Н., Ревякина В.А., Березина

Е.Ю., Ильенко JI.И.// Российский аллергологический журнал, 2014,№4,с. 64-68

14. Березина Е.Ю. Новые тенденции в профилактике атопического дерматита у детей. /Березина Е.Ю., Ревякина В.А, Сенцова Т.Б., Гмошинская М.В., Денисова С.Н., Конь И .ЯЛ Педиатрия. Журнал им. Сперанского Г.Н., 2014, том 93, №3, с. 6-9

15. Березина Е.Ю. Принципы диетотерапии кормящих матерей и детей с атопическим дерматитом. /Березина Е.Ю., Шавкина М.И., Кувшинова Е.Д., Мягкова М.Н., Сазонова О.Ю.// (Материалы XV Всероссийского конгресса диетологов и нутрициологов с международным участием «Здоровое питание: от фундаментальных исследований к инновационным технологиям», Москва, 2-4 июня 2014). Вопросы питания. Том 83, № 3, 2014, с.242-243

16. Березина Е.Ю. Особенности цитокинового статуса у детей с пищевой аллергией. /Ревякина В.А., Березина Е.Ю., Сенцова Т.Б., Шавкина М.Н., Мягкова М.Н., Тимофеева A.M.// (Материалы XV Всероссийского конгресса диетологов и нутрициологов с международным участием «Здоровое питание: от фундаментальных исследований к инновационным технологиям», Москва, 2-4 июня 2014).Вопросы питания. Том 83, № 3,2014, с.245

17. Березина Е.Ю. Патент на изобретение « Способ определения риска развития аллергической сенсибилизации у детей» / Тутельян В.А., Мазо В.К., Зорин С.Н., Березина Е.Ю., Ревякина В.А., Гмошинская М.В. - Патентообладатель: ФГБНУ «НИИ питания» РАМН. М., 2014.// Бюллетень № 18 от 27.06.2014

Список сокращений:

АтД - атопический дерматит

БКМ — белок коровьего молока

ПА - пищевая аллергия

slgE - аллергенспецифический иммуноглобулин Е

Ig - иммуноглобулин

IL - интерлейкин

SCORAD (scoring of atopic dermatitis) - шкала атопического дерматита

TGFp — трансформирующий фактор роста р

Til - Т-хелпер

slgA — секреторный иммуноглобулин А

Подписано в печать 02.07.2015 Тираж 100 экз. Заказ №7227 Отпечатано в типографии "Х-РЯЕЗЗРКШТ" г.Москва, М.Пироговская д.25 +7(499)246-15-18 www.x-pp.ru