Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Особенности иммунного статуса и апоптоз лимфоцитов при опийной наркомании

На правах рукописи

Рисберг Виталий Юрьевич

ОСОБЕННОСТИ ИММУННОГО СТАТУСА И АПОПТОЗ ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ОПИЙНОЙ НАРКОМАНИИ

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Уфа - 2002

Работа выполнена на базе отдела клинической и экспериментальной иммунологии Всероссийского центра глазной и пластической хирургии

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Сибиряк C.B. Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Юлдашев B.JI. Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Медведев Ю. А. доктор медицинских наук, профессор Теплова С. Н.

Ведущая организация: Российский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится « Л^ » ^¿(¿¿/^ ¿? 2002 г. в 7У часов на заседании регионального диссертационного Совета К. 002. 124. 01 при Президиуме АН РБ в Уфимском НИИВС им. И. И. Мечникова, ГУП «Иммунопрепарат» адрес: 450075, г. Уфа, Новороссийская, 105

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уф НИИВС им. И. И. Мечникова

Автореферат разослан « » ¿■^t'^/^cJ^i'_2002 г.

/

Ученый секретарь диссертационного совета:

кандидат медицинских наук

Головин В. П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В настоящее время накоплен обширный материал, свидетельствующий о грубых нарушениях иммунологической реактивности у больных, страдающих опийной наркоманией. Длительное употребление опийных наркотоксикантов приводит к формированию иммунодефицита, который сопровождается чрезвычайно высоким риском развития бактериальных инфекций, вызываемых как патогенной, так и оппортунистической микрофлорой, вирусных инфекций, течение которых приобретает у наркоманов нередко «фатальный характер» (Rouveix В., 1992; Roy S., Loh Н., 1996; Eisenstein Т., Hiburger M-, 1998; Nunez G., Urzua J., 1999). Отмечено (Bewley T. et al., 1968), что чаще всего причиной смерти опийных наркоманов являются гноеродные инфекции (39%), гепатиты (29%) и передозировка наркотика (17%). В настоящее время в связи с массивной экспансией вируса иммунодефицита человека к этому «списку» прибавилась ВИЧ-инфекция, частота которой максимальна в среде наркоманов. В этом случае фактором риска являются не только использование нестерильных шприцев и игл, но и особенности нарушений иммунитета, «облегчающие» инфицирование и способствующие более быстрому размножению вируса в организме, в частности С04+-лимфоцитоз (Rouveix В., 1992). Несмотря на интенсивные исследования, механизм нарушений неспецифических и специфических механизмов иммунитета при опийной наркомании и при длительном введении экзогенных опиатов экспериментальным животным до конца не ясен. Характер воздействия опийных наркотоксикантов на иммунные процессы поливалентен и обусловлен как прямым воздействием на опиатэргические механизмы, так и опосредованным через ЦНС влиянием, в том числе так называемым «химическим стрессом» (Carr D. et al., 1995; Van der Laan J. et al., 1995).

В последние годы резко возрос интерес к роли апоптоза в регуляции иммунных функций. Апоптоз - естественный закономерный процесс рецепторно-опосредованной, генетически запрограммированной, физиологически активной гибели клетки, в настоящее вре-

мя рассматривается как один из ключевых механизмов поддержания иммунного гомеостаза - селекции лимфоцитов в онтогенезе, регуляции силы и продолжительности иммунного ответа, реализации механизмов цитолиза, иммунопривилегированности и т.д. (А. А Ярилин, 1996; С. Г. Аббасова и соавт., 1999). Сформулирована концепция «апоптотического иммунодефицита» (А.Н. Череде-ев, JI.B. Ковальчук, 1997; Kovalchuk L., Cheredeev А., 1999). Недостаточность апоптотической элиминации может лежать в основе ряда аутоиммунных и лимфопролиферативных процессов, преобладание «негативной активации» - апоптоза в основе некоторых первичных иммунодефицитов и индуцированных различными факторами вторичных иммунодефицитных состояний. Избыточный апоптоз лимфоцитов, как субстрат формирования иммунодефицита, описан при туберкулезе легких (А.Г. Хоменко и соавт., 1996; Р.Ш. Юсупова и соавт., 2000; Sibiryak S. et al., 1999), гнойно-септических процессах (Е.Р. Черных и соавт., 1999), ВИЧ-инфекции (Bohler Т. et al., 1997), воздействии ксенотоксических факторов (Sibiryak S. et al., 1998).

Апоптоз лимфоцитов при воздействии морфина впервые был описан в 1993 году (Fuchs В., Pruett S., 1993). За прошедший период времени в доступной литературе появились лишь единичные работы, свидетельствующие об активации апоптоза лимфоцитов и макрофагов при длительном воздействии опиатов, и высказано предположение о возможной связи этого факта с высоким риском бактериальных инфекций и тяжелым течением ВИЧ-инфекции (Nair М. et al., 1997; Singhai Р. et al. 1999, 2000). Можно полагать, что исследования в этом направлении углубят понимание механизмов формирования иммунологической недостаточности у наркоманов и позволят разработать новые подходы к иммунокоррекции и, возможно, фармакотерапии лекарственной зависимости.

Цель исследования.

Оценить особенности нарушений иммунного статуса и изучить апоптоз лимфоцитов у больных опийной наркоманией.

Задачи исследования.

1. Изучить иммунный статус опийных наркоманов, включая суб-популяционную структуру лимфоцитов, их функциональную активность, уровень сывороточных иммуноглобулинов, цитокиновый статус. состояние фагоцитарно-метаболической активности цейтро-филов

2. Изучить экспрессию ассоциированных с апоптозом РазИ. и РаэЬ у больных опийной наркоманией в сравнении со здоровыми донорами.

3. Изучить апоптоз лимфоцитов периферической крови у больных опийной наркоманией

4. Охарактеризовать особенности иммунного статуса и апопто-за лимфоцитов у опийных наркоманов в зависимости от наличия или отсутствия клинически выраженной вторичной иммунологической недостаточности.

Научная новизна.

В работе реализован патогенетический принцип оценки иммунного статуса у больных опийной наркоманией II стадии. Выявлены характерные особенности нарушений субпопуляционной структуры лимфоцитов, их функциональной активности, цитокиновый дисбаланс. нарушение фагоцитарно-метаболической активности ней-трофилов. Этот комплекс нарушений позволяет охарактеризовать иммунный статус данных больных как состояние патологической активации иммунной системы в сочетании с функциональной недостаточностью неспецифических и специфических систем имму-норезистентности.

Впервые изучена экспрессия ассоциированных с апоптозом РазЯ и Ра$Ь на лимфоцитах периферической крови при опийной наркомании. Обнаружено, что при опийной наркомании наблюдается гиперэкспрессия РаэЯ и тенденция к увеличению экспрессии РазЬ. а также нарушение нормального соотношения содержания РаБЯ* и РаэЬ+ лимфоцитов с основными субпопуляциями лимфоцитов, лимфоцитов, экспрессирующих активационные антигены и интегральный белок митохондрий - продукт антиапоптогена Вс1-2. Гиперэкспрессия ассоциированных с апоптозом мембранных гликоп-ротеинов отражает общую тенденцию к активации и повышенную апоптотическую готовность лимфоцитов.

Впервые выявлено, что в периферической крови опийных наркоманов повышено содержание лимфоцитов с морфологическими, тинкториальными признаками апоптоза, а также отмечено повышение активности одного из ключевых ферментов, участвующих в реализации программы апоптоза - каспазы 3. Обнаружено, что Т-лимфоциты опийных наркоманов при активации через Т-клеточ-ный рецептор характеризуются повышенной готовностью к апоп-тозу, но резистентностью к проапоптогенному эффекту глюкокортикостероидов.

Впервые показано, что преобладание процессов апоптоза наиболее характерно для опийной наркомании, осложненной наличием инфекционного иммунопатологического синдрома, т.е. вторичной иммунологической недостаточности.

Научно-практическая значимость работы.

Полученные результаты расширяют представления о механизме и характере иммунотоксического действия опийных наркотоксикантов, что открывает перспективу разработки новых подходов к иммунокорригирующей терапии и, возможно, оптимизации терапии абстинентного синдрома.

Внедрение результатов исследования.

Материалы диссертационной работы включены в учебный процесс при чтении лекций врачам по курсу иммунологии на кафедре глазной и пластической хирургии с курсом иммунологии института последипломного образования Башкирского государственного медицинского университета (БГМУ), в учебный процесс курса иммунологии БГМУ, кафедры психиатрии и наркологии БГМУ. Разработанные автором методические подходы реализованы в клинико-диагностической работе отдела клинической и экспериментальной иммунологии и ВИЧ-диагностики Всероссийского центра глазной и пластической хирургии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Характер нарушений иммунного статуса при опийной наркомании II стадии отражает состояние патологической активации иммунитета на фоне функциональной недостаточности специфических и неспецифических механизмов иммунореактивности.

2. Лимфоциты периферической крови больных опийной наркоманией характеризуются гиперэкспрессией ассоциированных с апоптозом FasR и FasL, а также повышенным апоптозом как непосредственно в организме наркоманов, так и при специфической активации в витральной системе. Механизмы интенсификации апоптоза у опийных наркоманов полимодальны.

3. Избыточный апоптоз лимфоцитов при опийной наркомании может являться субстратом развития вторичной иммунологической недостаточности.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на научных конференциях, в том числе и международных: III и IV научных конференциях с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге - 2000» (Санкт-Петербург, 2000); «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге - 2001» (Санкт-Петербург, 2001), Ш съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Сочи, 2000); VI Xenobiotic Metabolism and Toxicity Workshop (Antalya, Turkey, 2000), VI Конгрессе РААКИ (Москва, 2001); XI Международном Конгрессе иммунологов ICI-2001 (Stokcholm, 2001; 1-й конференции иммунологов Урала). Фрагменты работы неоднократно докладывались на заседаниях Башкирского научного общества иммунологов (2000,2001).

Публикации.

По теме диссертационного исследования опубликовано 10 работ, из них 2 работы в международной печати.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 129 страницах, иллюстрирована 13 таблицами и 15 рисунками. Она состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы, посвященной результатам собственных исследований и их обсуждению, заключения, выводов, библиографического списка, включающего 230 литературных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования явились две группы лиц. Первая группа включала 50 человек здоровых добровольцев - доноров в возрасте от 18 до 25 лет (25 мужчин и 25 женщин). Донорами были студенты ВУЗов г.Уфы, сотрудники Всероссийского центра глазной и пластической хирургии. При подборе доноров проводилось предварительное анкетирование, в результате которого выяснено, что ни один из обследуемых этой группы не употреблял наркотические вещества группы опия. Среди обследуемых не было выявлено лиц с признаками иммунопролиферативного, аутоиммунного или инфекционного иммунопатологических синдромов. 4% обследуемых этой группы указывали на наличие аллергических реакций на пищевые продукты и бытовые аллергены. На момент обследования ни один из доноров, включенных в контрольную группу, не страдал острыми инфекционными заболеваниями. Все обследуемые контрольной группы были поставлены в известность о проводимом исследовании и дали согласие на участие в нем.

Альтернативная группа была представлена лицами, страдающими опийной наркоманией (45 человек), добровольно поступившими на стационарное лечение в Уфимский городской наркологический диспансер (10 человек) или в Республиканскую психиатрическую больницу № 1 (35 пациентов). По результатам наркологического и клинического обследования всем обследованным пациентам был выставлен диагноз опийной наркомании II стадии. Всем наркоманам было проведено клинико-анамнестическое обследование для выявления наличия синдрома вторичной иммунологической недостаточности согласно общепринятым алгоритмам (Т.И. Гришина, А.Л. Пухальский, 1998; И.В. Нестерова, 2000). 54% обследованных наркоманов характеризовались наличием инфекционного иммунопатологического синдрома и страдали от упорно-рецидивирующих гнойно-бактериальных инфекций кожи (пиодермии), которая сочеталась с абсцессами в области введения наркотоксикантов. 15% из этих больных отмечали повышенную частоту респираторных инфекций, 23% - рецидивирующий герпес различной локализации, в 30% случаев рецидивирующие инфекции кожи сочетались с гастроэнтеропатией, в 26% случаев - с хроническими и урогенительными инфекциями. Это свидетельствовало о клинически манифестной вторичной иммунологической недостаточности (ВИН).

Лабораторное обследование проводилось в начальной фазе абстинентного синдрома до начала седативпой и дезинтоксикацпон-нои терапии, спустя 12 - 24 часа после последнего введения наркотоксиканта.

Оценку субпопуляционной структуры лимфоцитов проводили непрямым иммунофлюоресцентным методом с использованием стандартных панелей моноклональпых антител (МКА) производства НПО «Сорбент» (НИИ иммунологии МЗ РФ) и НПО «Медбп-оспектр» (ВОНЦ РАМН). Для выявления Fas-R и Fas-L использованы МКА клонов DX-2 и alf-2.1 соответственно (Caltag Lab.. USA). Все МКА использовались в разведениях, указанных производителями. В качестве «вторых» антител использовались ФИТЦ-меченные (Fab-2) -фрагменты козьих антител против IgG мыши (ICN) в конечном разведении 1:1000. Учет результатов осуществляли с помощью микроскопа-цитофлюориметра Лю.мам - ИЛ-6А (светофильтр возбуждения 450±10 им-, эмиссии - 510 им). Учитывалось количество антиген-реактивных клеток за вычетом числа светящихся клеток в негативном контроле (как правило, не более 2 -4%).

Оценку функциональной активности лимфоцитов производили в реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) с использованием культур цельной крови (Hirschorn R., 1974: Long В.. et ai., 1983). Оценку реакции осуществляли морфологическим способом (H.A. Самойлина, 1970). В качестве митогенов использовали ФГА-Р (10 мкг/мл, Difco), митоген лакоиоса (МЛ. PWM) (10 мкг/мл. Sigma), и aiiTJiCD3 МКА (2.5 мкг/мл, клон ICO-90 НПО «Медбиоспектр» ВОНЦ РАМН).

Документацию аиоптоза лимфоцитов осуществляли методами суправитального окрашивания клеток бис-бензимидом - Hoechst 33342 (Р.Ш. Юсупова, 1999; Cupic V. et al.. 2000).. проточной пито флюорометрией и по активности каспазы 3. Для суправитального окрашивания использован раствор Hoechst 33342 (1 мкг/мл). Учет результатов производили на люминесцентном микроскопе МБН-15А при увеличении х900, светофильтр возбуждения флюоресценции 360±5 нм, эмиссии - 490 нм. Учитывалось содержание клеток с четкими признаками фрагментации ядерного материала.

Для проведения проточной цитофлюориметрпи лимфоциты отмывали однократно фосфатным буфером, затем однократно высокомолярным фосфат-цитратным буфером (Gong J. et al.. 1994). пред-

ставляющим смесь 0.2 М двузамещенного фосфатанатрия и 0.1 М цитрата натрия. Затем клетки вновь ресуспендировали в ФБСР и фиксировали 70% ледяным этанолом. В последующем клетки окрашивали пропидиум-иодидом по стандартной методике и анализ осуществляли на проточном цитофлюориметре EPICS Coulter.

Активность каспазы 3 (СРР32) оценивали флюорометрическим способом по скорости ферментативного расщепления специфического субстрата Z-DEVD-AFC (Nicholson D. et al., 1995). Использовали стандартный набор реагентов FluorAce Apopain Assay Kit (BIORAD). Интенсивность флюоресценции оценивали на флюоро-метре VersaFluor 1.3 (BIORAD).

Оценку экспрессии белка Вс1-2 осуществляли иммуногистохи-мическим методом, используя первичные антитела к bcl-2 (клон 124, DAKO) и «визуализирующую» систему EnVision™+ Systems/ HRP Rabbit DAB+ (DAKO). Мазки, фиксированные смесью метанол-ацетона (1:1) обрабатывали антителами против Вс1-2 и окрашивали согласно прилагаемым к антителам и визуализирующей системе инструкциям. Подсчет антиген-позитивных клеток (содержащих гранулы субстрата) осуществляли в световом микроскопе при увеличении хЮОО, подсчитывая не менее, чем 500 клеток. Результат выражали как % содержания антиген-позитивных клеток.

Уровень сывороточных иммуноглобулинов классов G, М, А определяли стандартным методом радиальной иммунодиффузии по Манчини (Mancini G. et al., 1964), используя моноспецифические сыворотки против иммуноглобулинов человека (Н.-Новгородский НИИ эпидемиологии и микробиологии).

Для оценки фагоцитарно-метаболической активности нейтро-филов использован традиционный тест латекс-фагоцитоза (частицы латеса 1.5 мкМ, Sigma) и НСТ-тест (модификация Campbell D., Douglas S., 1997). Для индукции «респираторного взрыва» использовали агрегированный нагреванием зимозан (Sigma) в конечной концентрации 250 мкг/мл.

Уровень цитокинов определяли, используя стандартные твердофазные иммуноферментные тест-системы производства НИИ ОЧП (С.-Пб.) - ProConIL-lß, ProConTNFcc, ProCOnlFNplus, ProConIL-2, ProConIL-4.

Все обследуемые (как здоровые доноры-добровольцы, так и пациенты, страдающие опийной наркоманией) были тестированы на наличие антител к вирусам гепатитов В (диагностическая ИФА

тест-система «BeKToHbcAg-aHTHTena»-crpHn, «ВекторБест», г. Новосибирск) и С («Векто HCV- антитела стрип», «ВекторБест», г. Новосибирск) и ВИЧ1/2 («ИФА-Рекомибест антиВИЧ-1+2-стрип», «ВекторБест», г. Новосибирск).

Интенсивность процессов липопероксидации оценивали по содержанию в сыворотке малонового диальдегида (МДА) по специфической реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой, используя стандартный метод, предложенный И.Д.Стальной и Т.Г. Гаришвили (1977).

Статистическую обработку данных производили, используя стандартный пакет статистических программ Windows 95 ( Stat Windows 4.0). Для каждого признака предварительно оценивался характер распределения, и, в зависимости от характера распределения использовались параметрические или непараметрические критерии различий. В большинстве случаев для сравнения альтернативных групп применялся стандартный метод дисперсионного анализа ANOVA с использованием критерия Newmann-Keuls для отрицания «нулевой гипотезы». При небольшом числе наблюдений в группах использовался LSD-критерий. Различия считались существенны при Р<0.05. Для сравнения различий между сопряженными признаками, в зависимости от характера распределения, использовался критерий Стьюдента для сопряженных признаков или критерий Вилкоксона. При альтернативном распределении достоверность различий между группами оценивалась с использованием критерия х2 с «поправкой» Иетса. При проведении корреляционного анализа применялись стандартные методы оценки корреляции между признаками. При классификации объектов использован иерархический кластерный анализ (Дюран Б., Оделл П., 1977; Жамбю М.,1984) в рамках программы «CLASSMASTER», версия 1.1 (Б.Г. Миркин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При анализе основных показателей иммунного статуса опийных наркоманов были выявлены следующие нарушения. Гемограмма наркоманов характеризовалась статистически значимым лейкоцитозом с отчетливым палочкоядерным «сдвигом влево» нормо-регенераторного характера. Одновременно нарушалась фагоцитарно-метаболическая активность нейтрофилов - содержание активно-фагоцитирующих клеток, равно как и интенсивность фагоцитоза у опийных наркоманов, в сравнении со здоровыми донорами, снижалось на 27 и 34% соответственно. Показатели спонтанного НСТ-теста были практически одинаковы в обеих группах, но при индукции «респираторного взрыва» нейтрофилов зимозаном в группе опийных наркоманов содержание активированных клеток было значимо ниже, нежели в норме. Эти результаты согласуются с данными других исследователей. Нарушение механизмов фагоцитоза и кислород-зависимого киллинга микроорганизмов связывается с прямым воздействием экзогенных опиатов и играет важную роль в развитии иммунодефицита при опийной наркомании (Оукеэ К. й а1., 1985; ТиЬаго Е. е1 а1., 1985 - 1987).

Содержание мононуклеаров - лимфоцитов (35.0 ± 11.0%) и моноцитов (2.85 ± 1.63%) у опийных наркоманов, в сравнении со здоровыми донорами (36.4 ± 7.0 и 3.50 ± 2.19%), соответственно, имело тенденцию к снижению, однако статистически значимых отличий не было.

Содержание СОЗ+ Т-лимфоцитов в группе опийнных наркоманов было статистически значимо выше (таблица 1), процентное содержание СЭ4+ Т-хелперов существенно не изменялось, в то время как процентное содержание СБ8+ Т-лимфоцитов увеличивалось в 1.3 раза, что закономерно приводило к депрессии соотношения СБ4+/СБ8+ Т-лимфоцитов. Наряду с выраженным Т-субпопуляци-онным дисбалансом в периферической крови наркоманов выявлялся выраженный СБ 19+В-лимфоцитоз, при этом процентное содержание В-лимфоцитов превышало таковое у здоровых доноров почти в 2 раза. В то же время содержание ЫК-лимфоцитов имело отчетливую тенденцию к снижению. Значимо увеличивалось содержание лимфоцитов, экспрессирующих активационные антигены -низкоаффинный рецептор к 11,-2 (СБ25) и антигенов гистосовмести-мости II класса (НИА-ОК). Таким образом, был выявлен «активированный тип» субпопуляционного профиля лимфоцитов, за исклю-

Таблица 1

Основные параметры иммунного статуса у здоровых доноров и опийных наркоманов

Оцениваемые параметры Доноры (п = 20 - 50) Опийные наркоманы (п = 22-45) Р

Субпотляции лимфоцитов, %

Ш±БО)

СОГ 60.0 ± 9.3 66.8 ± 12.5 = 0.004

СЭ4+ 45.0 ± 8.9 48.2 ±9.7 = 0.10

С08+ 24.4 ± 5.9 31.6 ±7.4 = 0.001

СЭ4+/С08+ 1.93 ±0.63 1.60 ±0.47 = 0.006

13.5 ±6.7 24.6 ±12.1 = 0.001

СЭ16+ 20.1 ±6.9 17.7 ±7.6 = 0.11

С025+ 10.8 ± 6.2 17.7 ± 10.0 = 0.002

22.7 ± 8.3 29.0 ±8.9 = 0.001

Пролифератавная активность

лимфоцитов. % властных форм

(Медиана (25- 75%-ль)

Спонтанная 4.4(2.0-5.0) 4.4(1.5-6.5)

РНА-индуцированная 55(40-65) 44(28-55) = 0.03

Р\УМ-индуцированная 16(6-23) 10(8-13) = 0.08

АнтиСБЗМКА-индуцированная 35(18-45) 22(12-30) = 0.02

Сьшороточные

иммуноглобулины, г/л СМ ± 8Б)

1дм 1.40 ±0.94 2.51 ± 1.40 = 0.003

12.10 ±4.6 9.60 ± 3.3 = 0.012

1.80 ± 1.57 1.40 ±0.70

Уровень ишпокинов. пкг/мл

(Медина (25- 75%-ль)

1Ь-1Р сыворотка 0(0-25) 25(4-30) = 0.001

1Ь-1Р ЛПС-индуцированный 521(444-652) 427(414-450) = 0.04

тара сьгооротка 12(9-15) 18(12-20) = 0.10

Т№а ЛПС-индуцированный 462 (328 -624) 283(205-370) = 0.05

1РКа сыворотка 5(0-14) 6(0-18) = 0.10

ПТ^а ЛПС-ивдуцированный 170(89-247) 10(0-38) = 0.001

1Ь-2 сыворотка 48(16-57) 76(0-163) = 0.040

1Ь-4 сыворотка 100(73- 104) 334(61-372) = 0.045

чением NK-клеток, которые, как известно, высокочувствительны к прямому токсическому действию опиатов. Увеличение экспрессии активационных антигенов не сопровождалось, однако, увеличением функциональной реактивности лимфоцитов.

Статистически значимое снижение митогенного ответа лимфоцитов отмечалось при добавлении всех использованных митоге-нов - ФГА (преимущественно Т-лимфоциты), PWM (Т-зависимая пролиферация B-клеток) и антиСОЗМКА («физиологическая» стимуляция Т-клеток опосредованно через ТКР).

Глубокое нарушение иммунореактивности у наркоманов находило отражение и в выраженной дисиммуноглобулинемии, при этом уровень IgM в этой группе был резко повышен, уровень IgG значимо снижен, а уровень иммуноглобулинов класса А имел отчетливую тенденцию к снижению, что свидетельствует о поликлональ-ной активации B-лимфоцитов в сочетании с нарушением процесса «переключения» изотипов иммуноглобулинов.

Сывороточный уровень основных провоспалительных моноки-нов в группе больных опийной наркоманией был существенно выше, нежели у здоровых доноров. Это касалось, в первую очередь IL-lß, который практически не определялся в сыворотке обследуемых контрольной группы. Сывороточные уровни TNFa и a-IFN статистически значимо не отличались, но имели тенденцию к увеличению в группе опийных наркоманов. Интенсивность спонтанного синтеза цитокинов в 24-часовых культурах мононук-леаров была практически одинакова в обеих группах. Различия между группами проявились при индукции синтеза цитокинов ли-пополисахаридом (ЛПС) Е. coli. ЛПС-индуцированный синтез IL-lß в группе опийных наркоманов незначительно, но статистически значимо снижался; синтез TNFa угнетался почти в 2 раза, а индукция синтеза a-IFN вообще не наблюдалась. Повышенный выброс провоспалительных цитокинов, в первую очередь IL-lß и TNFa, наиболее характерен для местных и системных острых инфекционных процессов и является отражением «иммунологического стресса» (C.B. Сибиряк и соавт., 1996; И.С. Фрейндлин, 1999; Baumann H., Glaudie, 1994). Повышенный уровень TNFa и IL-lß, скорее всего, не связан с непосредственным воздействием наркотоксикантов, поскольку в витральных системах, а также при однократном введении морфин и родственные соединения угнетают продукцию монокинов (Bencsics A. et al., 1997). Свидетельством

массивного антигенного воздействия является и высокий сывороточный уровень Т-клеточных цитокинов - уровень 1Ь-2 в крови наркоманов был повышен вдвое, а уровень ИЛ-4 - в 4.5 раза. В этой связи особенно интересны последние данные, свидетельствующие об изменении характера дихотомии Т-хелперов при совместном воздействии экзогенных опиатов и антигена: обнаружено, что морфин в сочетании с ЛПС способен переключать синтез цитокинов с ТЫ- на ТИ2 - профиль (Яоу Б. е1 а!., 1999). Имеющееся противоречие между высоким уровнем 1Ь-4, контролирующим переключение синтеза иммуноглобулинов с ^М на 1^01 и подавляющим синтез ^М, и выявленным характером дисиммуноглобулинемии можно объяснить тем, что гуморальный ответ на бактериальные антигены, в избытке поступающие в организм наркомана, в большинстве являются тимуснезависимыми и индуцируют образование ^М-ан-тител. Кроме того, процесс переключения изотипов иммуноглобулинов в В-клетке контролируется не только 1Ь-4, но и рядом других цитокинов (у-1Е№, ТОРр и др.) и, что особенно важно, зависит от их баланса, что не оценивалось в настоящей работе.

Рав-рецептор (РазII) является одним из основных рецепторов апоптогенного сигнала для лимфоцитов (в основном для Т-лимфо-цитов). Апоптоз, реализуемый через систему РавИ/ТазЬ, является важнейшим механизмом регуляции иммунного ответа, цитотоксич-ности, поддерживания иммунопривилегированности. Экспрессия РаэЯ возрастает при активации клеток, что позволяет рассматривать его в числе типичных «активационных» маркеров. (Барышников А. Ю. соавт., 1997; Салмаси Ж.М. и соавт., 1999; Р.Ш. Юсупова, 2000). В свою очередь мембрано-ассоциированный РаэЬ, эксп-рессируется в периферической крови на С08+ ЦТЛ, в меньшей степени на МК-лимфоцитах, реализуя механизмы цитолиза, а также на активированных СБ4+ Т-хелперах, что необходимо для ауто-элиминации активированных РаэИ-экспрессирующих клеток - феномен «братоубийства» или клеточно-автономного апоптоза (1и БЬ. е1 а1., 1995; Тапака М. е1 а1., 1996). Анализ изучения экспрессии РавЯ и РавЬ на лимфоцитах периферической крови опийных наркоманов иллюстрирует таблица 2.

Таблица 2

Экспрессия Гав-рецептора (ЕавК) и Гав-лиганда (РавЬ) на лимфоцитах периферической крови у здоровых доноров и больных опийной наркоманией

Группа обследуемых Содержание СБ95+ лимфоцитов, М±8Э Содержание СБ95Ъ+ лимфоцитов, М ± ББ

Кл. /мкл Лица с высокой (более 25%) экспрессией Кл./мкп

Здоровые доноры 9.5 ± 6.6 п =20 0.24 ±0.16 п = 20 5 8.0 ± 3.4 п =12 0.18 ±0.09 п =13

Опийные наркоманы 27.4 ± 14.9 п = 34 Р<0.001 1.62 ±0.67 п = 34 Р<0.02 47 Р=0.0036 11.8 ±6.9 п=12 Р = 0.08 0.28 ± 0.20 п =12 Р= 0.1

В периферической крови опийных наркоманов процентное содержание и абсолютное число СБ95+ лимфоцитов было почти в 3 раза выше, а частота встречаемости лиц с высоким уровнем экспрессии была значительно выше. В отличие от здоровых лиц, у которых содержание С095+ лимфоцитов значимо коррелировало лишь с содержанием СОЗ+ (11= + 0.68) и СБ4+ (11= +0.55) лимфоцитов, у опийных наркоманов была выявлена значимая позитивная корреляция с содержанием СОЗ+ лимфоцитов (11= + 0.42), СБ25+ (К. = +0.65)и НЬА-ОЫ (Я= +0.45) лимфоцитов, а также СБ72+ В-лимфоцитов (11= + 0.60). Расчет предложенных И.П. Балмасовой и соавторами (2000) показателя вероятности апоптоза, ПВА (отношение содержание СЕ>95+ по отношению к сумме основных субпопуляций лимфоцитов) и показателя готовности к апоптозу, ПГА (отношение уровня СБ95+ к сумме активированных лимфоцитов), показал статистически значимое увеличение этих показателей у наркоманов.

Содержание лимфоцитов, экспрессирующих БазЬ, в периферической крови наркоманов имело отчетливую тенденцию к повыше-

нию, что может отражать общую тенденцию к активации. При этом, судя по соотношению абсолютного числа FasL+ лимфоцитов и основных субпопуляций лимфоцитов, потенциально способных эксп-рессировать FasL+ это увеличение происходило за счет CD4+ и NK-лимфоцитов, в то время как экспрессия FasL+ на С08+ЦТЛ, по сути, снижалась. Можно предположить, что при опийной наркомании возрастает вероятность клеточно-автономного апоптоза и наблюдается гиперэкспрессия FasL+ на NK-лимфоцитах на фоне угнетения FasL-опосредованных механизмов цитотоксичности ЦТЛ.

Конечным этапом апоптоза является процесс фрагментации ядерного материала клетки под воздействием специфических эн-донуклеаз. Идентификация клеток с морфологическими признаками фрагментации ядра осуществлялась с использованием красителя Hoechst 33342, обладающего способностью интенсивно связываться с интактной ДНК или ее крупными фрагментами как суп-равитально, так и в фиксированных клетках. Содержание лимфоцитов с морфологическими признаками апоптоза составило в контрольной группе (М ± SD) 9.4 ± 4.6%, в группе опийных наркоманов было в 2 раза выше - 18.2 ± 12.6% (рисунок 1). При этом если в группе доноров характер распределения признака не отличался от нормального, то в группе опийных наркоманов существенно увеличивалась частота встречаемости обследуемых с экстремальными значениями признака, и характер его распределения был отличен (Р<0.01) от нормального. Частота встречаемости обследуемых со значениями, превышающими величину 2SD для группы здоровых доноров, составила для контрольной группы 3.2%, для группы опийных наркоманов - 34% (х2=6.94, Р=0.0084). Существенно, что в группе здоровых доноров корреляция между содержанием FasR(CD95)+ лимфоцитов и клеток с фрагментированным ядром отсутствовала, а в группе опийных наркоманов была статистически значимая позитивная корреляция - RCn составил, соответственно, -0.24 и +0.53 (Р=0.008). Этот факт свидетельствует об активации Fas-опосредованных механизмов апоптоза в обследуемой группе. Полученные данные были подтверждены цитофлюориметри-ческим анализом содержания апоптотирующих лимфоцитов в периферической крови1 5 здоровых доноров и 5 опийных наркоманов (окрашивание пропидиум иодидом), показавшим статистически значимое увеличение процентного содержания гипохромных клеток.

' Автор благодарит сотрудника РОНЦ АМН Е.Р. Полосухину за помощь в проведении исследования

Рисунок 1. Содержание лимфоцитов с признаками апоптоза (окраска Hoechst 33342) в периферической крови здоровых доноров (п = 34) и больных опийной наркоманией (п = 31).

По оси ординат: содержание клеток с морфологическими признаками фрагментации ядра, %.

По оси абсцисс: 1 - здоровые доноры; 2 - опийные наркоманы. Различия между группами статистически существенны (Р<0.001). Использован непараметрический «U» - критерий Манна-Уитни.

Рисунок 2. Активность каспазы 3 (СРР32, апопаина), оцениваемая по расщеплению конъюгированного с флюорохромом специфического субстрата г-БЕУО-АЕС в лизатах свежевыделенных лимфоцитров периферической крови здоровых доноров (п = 8) и больных опийной наркоманией (п = 8).

По оси ординат: Активность каспазы 3, ЕД.

По оси абсцисс: 1- здоровые доноры; 2- опийные наркоманы.Разли-чия между группами статистически существенны (Р=0.0023). Использован непараметрический «и» - критерий Манна-Уитни.

Цистеиновая протеиназа апопаин (Каспаза 3) активируется из проэнзима СРР32 в ранней фазе апоптоза, является точкой конвергенции различных апоптогенных сигналов, играет ключевую роль в реализации программы апоптоза, обеспечивая деградацию необходимых для жизни клетки субстратов - поли(АДФ-рибоза)-полимеразы (PARP), SREBP- 1,2 и др (Goldberg Y., et al., 1996; Nicholson D., 1996). В периферической крови опийных наркоманов активность каспазы 3 возрастала более, чем в 4 раза (рисунок 2). Реакция была высокоспецифична, поскольку активность блокировалась специфическим ингибитором каспазы 3 комплексом пептид-хлорметилкетон (Ac-DEVD-CMK).

Продукт протоонкогена Вс1-2 - интегральный белок митохондрий является одним из основных негативных регуляторов апоптоза, обеспечивающих антиоксидантный эффект и ингибирующих митохондриальную эмиссию проапоптогенных молекул - цитохро-ма С и AIF (Itoh N. et al., 1993). Экспрессия bcl-2 в FasR+ лимфоцитах обеспечивает их выживаемость (A.A. Ярилин, 2000). Содержание bcl-2+ лимфоцитов в периферической крови здоровых доноров и наркоманов было идентичным: 2.9 (2.3 - 3.0) и 2.9 (2.5 - 3.2), соответственно. Однако, на фоне гиперэкспрессии FasR у наркоманов отношение bcl-2+ клеток к FasR+ клеткам (индекс «супрессии апоптоза») было снижено: 0.26 (0.19 - 0.29) и 0.16 (0.12 - 0.22), соответственно (Р < 0.0023). Причиной относительной гипоэкспре-сии bcl-2 может быть оксидативный стресс, связанный как с прямой ксенотиксической «нагрузкой», так и опосредованный через аномальную активацию иммунной системы. Известно также, что нарушение редокс-статуса может приводить также к гиперэкспре-сии FasR и FasL, потенциировать FasR/FasL апоптоз, а реактивные интермедиа™ кислорода могут непосредственно активировать Bid-зависимый апоптоз (Bauer М. et al., 1998; Zhuang Sh. et al., 2000). В этой связи существенно, что в сыворотке наркоманов было выявлено значимое увеличение содержания конечных продуктов липопероксидации (ТБК-реагирующих продуктов), которое составило ( М ± SD) 3.59 ± 0.88 нмоль/мг белка против 2.05 ± 0.96 у здоровых лиц. В свою очередь, свободно-радикальные процессы являются механизмом реализации «ксенотоксического» стресса, о наличии которого свидетельствовала отчетливая гиперкортизоле-мия: уровень кортизола в сыворотке опийных наркоманов составил 564.0 ± 184.9 нмоль/л, против 376.2 ± 120.5 нмоль/л у доноров.

Содержание Опасгны* Илеке сгя/упясцм Астивнсспъ кяслазы 3 Чюю клеток с

Фзпм фгеумеигаыеи ядра

Рисунок 3. Лктивапнопный японтоз в 72- часовых культурах лимфоцитов периферической крови, стимулированных антиСБЗ МКА1СО-

90 (2.5 Л1кг/!ил) _

- здоровые доноры (п = 8); опийные наркоманы (п =8).

Дальнейшее исследования гюкалит, что возрастание интенсивности аноптоза лимфоцитов сопряжено не только с нарушением рецеигорно-опосредованных процессов, но отражает изменение реактивности Т клеток в процессе их активации через аитигенсвя-зывакнций рецептор (рисунок 3). На рисунке отчетливо видно, что активность каспазы 3 в антиСОЗМКА-стимулированных Т-лимфо-цитах наркоманов увеличивалась более, чем в 2.5 раза, содержание клеток находящихся в теминальной фазе апоптоза также нарастало. в то время как пролиферативный ответ клеток снижался. Еще более интересный факт был получен при изучении дексамета-зон-индуцированиого апоптоза (таблица 3). Добавление дексаме-тазона в культуру активированных антиСЭЗМКА Т-лимфоцитов здоровых доноров вызывало статистически значимое увеличение активности каспазы 3 и снижение пролиферативной активности Т-лимфоцитов. Напротив, в культуре мононуклеаров опийных наркоманов интенсивность апоптоза и пролиферативной активности практически не изменялась. Таким образом, Т-лимфоцнты наркоманов. несмотря [¡а возрастание интенсивности активационного

шоптоза, характеризовались более высокой резистентностью к шоптогенному воздействию глюкокортикоидов. Полученный факт этражает глубокое нарушение сигнал-передающих систем в Т-лимфоцитах и хорошо согласуется с работами, свидетельствующими э дисбалансе активностей аденил- и гуанилатциклаз (Н.Б. Гама-тея и соавт.1991; Fecho К. et al., 1995). в частности. В свою очередь известно, что апоптоз, индуцированный дексаметазоном, ре-шизуется через активацию протеинкиназы А, возрастание адени-татциклазной активности и увеличение цАМФ в клетке (Gruol D., ^ltschmied J., 1993).

Таблица 3

Дексаметазон-индуцнрованный апоптоз" и пролиферативная активность в антаСВЗМКА-стимулированных 72-х часовых культурах моноиуклеаров здоровых доноров и опийных наркоманов

Группа обследуемых Активность каспазы 3 Индекс ci пролис имуляции )ерации

AHTHCD3MKA AhthCD3MKA + дексаметазон AHTHCD3MKA AHTHCD3MKA + дексаметазон

Здоровые доноры (п = 8) 9.5 ± 6.5 13.3 ±8.5 Р=0.046* + 40% 9.7 ± З.З 7.8 ± 1.6 Р=0.06 -20%

Опийные наркоманы (п = 8) 24.1 ± 14.5 19.0 ± 12.8 -21.2% 7.7 ± 4.6 8.1 ±4.7 + 5%

# - дексаметазон добавляли в культуру за 24 часа до конца культиви-зования в концентрации 4 мкг/мл. - использован парный критерий Вилкоксона.

Жирным шрифтом указан процент изменения показателя в сравнении с входным.

Обследованная группа опийных наркоманов была неоднород-1а. Среди больных были лица с различной продолжительностью употребления наркотиков, различающиеся по характеру употреб-шемых опийных наркотоксикантов (чистый героин (42%) или героин и суррогаты опия), перенесшие вирусный гепатит В (46 %) или С '62%) и не подвергавшиеся инфицированию, а также имеющие (54%) \ не имеющие клинических манифестных проявлений ВИН. Учи-гывая это, на следующем этапе обработки полученных данных была ;делана попытка выяснить характер нарушений иммунного стату-

са в зависимости от этих факторов. Для классификации объектов в данной системе признаков был использован математический аппарат иерархического кластерного анализа. В результате были выявлены 4 кластера (группы) из которых один кластер был представлен 1 объектом и не учитывался в дальнейшем. Для первой группы (кластера) была характерна максимальная продолжительность приема наркотоксикантов (6.5 ± 1.8 лет), преобладающая частота употребления героина и суррогатов опия (73%), высокая частота выявляемое™ антител к гепатитам В (93%) и С (87%). Все больные (100%), отнесенные к данной группе имели клинические признаки ВИН. Больные второй группы (кластера) были альтернативны по структуре нуклоида - продолжительность употребления наркотоксикантов, чаще чистого героина (56%), была почти в 2 раза меньше (3.8 ± 2.4 года), в этой группе реже выявлялись НСУ и НВУ-позитивные пациенты (44% и 33%), больные наркоманией с клинически манифестными признаками ВИН отсутствовали. Наиболее малочисленной была третья группа (кластер). В этой группе, несмотря на непродолжительный период наркомании (2.6 ±0.9 лет), преобладающее употребление чистого героина (80%), низкую частоту встречаемости НСУ и НВУ-позитивных сывороток (20% и 20%) у всех больных (100%) были признаки ВИН.

Дальнейший анализ особенностей иммунного статуса в зависимости от принадлежности к той или иной группе был осуществлен в рамках АТЧОУА (рисунок 4). В первой группе больные характеризовались максимально выраженными признаками патологической активации иммунитета на фоне выраженной функциональной недостаточности иммунной системы - в этой группе выявлялся максимально выраженный В-лимфоцитоз, увеличение экспрессии ранних активационных антигенов (СБ25), ЫК-лимфоцитопения, наиболее резкая гипериммуноглобулинемия по классу М, выраженная депрессия пролиферативной активности на все использованные ми-тогены (в большей степени при стимуляции Т-лимфоцитов антиСОЗМКА), выявлялось значительное угнетение фагоцитарно-метаболической активности нейтрофилов. Именно в этой группе наблюдалось максимальное значение содержания СЭ95+ лимфоцитов в периферической крови и высокое содержание апопто-тирующих лимфоцитов.

Признаки патологической активации иммунитета и функциональной недостаточности клеток во второй группе наркоманов были

выражены в значительно меньшей степени. Тенденции к лимфопе-нии не прослеживалось. Типичным был выраженный СБ8+ Т-лим-фоцитоз. Содержание В-лимфоцитов увеличивалось в меньшей степени, чем в предшествующей группе. Содержание лимфоцитов, эк-спрессирующих антигены гистосовместимости II класса, было статистически значимо выше, нежели у доноров, а содержание клеток, экспрессирующих СЭ25, хотя и было повышено, но статистически значимых различий не определялось. Содержание СБ95+ клеток также снижалось. Содержание апоптотирующих лимфоцитов в периферической крови наркоманов этой группы увеличивалось, в сравнении с контролем, лишь на 25%, а пролиферативный ответ, хотя и был несколько ниже, чем у доноров, но статистически значимых различий не выявлялось. Явления дисиммуноглобулинемии, хотя и в меньшей степени, сохранялись. Фагоцитарная активность нейтрофилов практически не страдала.

Сравнительный анализ показателя вероятности апоптоза (ПВА) - отношения содержания С095+ клеток к сумме содержания основных субпопуляций клеток, показателя готовности апоптоза (ПГА) • отношение содержания СВ95+клеток к содержанию активированных клеток, экспрессии БавЬ и соотношения содержания Рае!/ лимфоцитов к количеству клеток, потенциально способных экспресси-эовать РаэЬ, в первой и второй группах показал, что все указанные показатели в первой группе были значительно выше. Эти данные свидетельствуют о том, что усиление процессов апоптоза в первой, иммунодефицитной группе, скорее всего реализуется по РазЯ-РазЬ-зависимому механизму.

Особняком стоит третья группа наркоманов. Несмотря на не-1родолжительное время употребления опийных наркотоксикантов, тредставленных, в основном, героином, редкую выявляемость антител к НСУ и НВУ, у всех больных данной группы выявлены при-¡наки инфекционного синдрома, т.е. ВИН. Иммунный статус этих Зольных характеризовался выраженной лимфопенией (статисти-1ески значимое отличие от здоровых доноров), отсутствием Т-суб-юпуляционного дисбаланса, КК-лимфоцитопении. Экспрессия штивационных антигенов, хотя и превышала таковую во второй группе, но была значительно меньшей, чем в первой группе. Что сасается содержания СБ95+ лимфоцитов, то оно было минималь-шм и статистически значимо не отличалось от контроля. Актива-щя лимфоцитов, при их стимуляции через ТКР, практически не

й 150 -

./Г

И,

Л*6?!

п

■ё с

а

о

а

о

о о

о о

а

о

го

А

1

в

0

1

Рисунок 4. «Профили» иммунного статуса в основных группах больных опийной наркоманией.

Но оси ординат представлены значения показателей в % от таковых в группе здоровых доноров 100%. Чиездочка обозначает статистически значимые (Р<0.05) различия с группой здоровых доноров (ЬЯП-критерий).

I " "I I -------- /....«„-„„„Ч I I 1 1 /...ппхт-апЛ

арушалась, но ФГА-индуцированная пролиферация угнеталась в гаксимальной мере. Явления дисиммуноглобулинемии были выра-сены меньше, чем в предшествующих группах, фагоцитарная ак-ивность нейтрофилов была угнетена, но кислородзависимыйме-аболизм практически не страдал. Наиболее характерным для этой руппы больных было высокое содержание в периферической крои клеток с морфологическими признаками апоптоза. ПВА соста-ил в этой группе 0.15 ± 0.10, против 0.11 ± 0.08 в группе здоровых оноров; ПГА - 0.50± 0.37 и 0.36 ± 0.11, соответственно (различия гатистически недостоверны). Можно предполагать, что механиз-[Ы апоптотической гибели в этой группе отличны от первых двух и е связаны с гиперэкспрессией FasR. Следует отметить что при равнении уровня кортизола, максимальные значения получены менно для больных, объединяемых в этот кластер. Так, уровень ортизола в контрольной группе составил 376±120 нмоль/л, в груп-е больных 1 кластера - 560±219 нмоль/л, во второй группе - 550 ± 98 нмоль/л, а в третьей - 600 ± 100 нмоль/л. Иными словами, уро-ень «стрессорной реакции» был максимален. Интересно, что срав-ение скорости «формирования толерантности» (отношение раз-ицы между конечной и начальной дозой наркотоксиканта к про-олжительности наркомании) в группах наркоманов выявило, что аркоманы второй группы характеризовались статистически зна-имым более медленным формированием толерантности, чем нар-оманы первой группы (0.38 ± 0.33 и 0.14 ± 0.08, Р<0.01). У нарко-анов третьей группы толерантность формировалась быстро (0.21

0.14), что может быть связано как с особенностями самого нар-отоксиканта (героин), так и психофизиологическими особенности.

Таким образом, при оценке особенностей иммунного статуса аркоманов в зависимости от наличия или отсутствия ВИН, четко рослеживается ассоциация между наличием ВИН и преобладаем процессов негативной активации, т.е. развитием апоптоти-гского иммунодефицита. Полученные данные свидетельствуют о еобходимости разработки нестандартных методов иммунокорри-1рующей терапии, направленной не столько на активацию иммун-ой системы, сколько на устранение апоптотического иммуноде-ицита.

ВЫВОДЫ

1. Иммунологические нарушения у опийных наркоманов в период раннего абстинентного синдрома можно рассматривать как патологическую активацию иммунной системы, сопряженную с функциональной неполноценностью неспецифических и специфических механизмов иммунореактивности.

2. Наиболее типичными нарушениями иммунного статуса опийных наркоманов являются:

Т-лимфоцитоз с явлением субпопуляционного дисбаланса с преобладанием СЭ8+ Т-лимфоцитов, В-лимфоцитоз, ИК-лимфоци-топения, гиперэкспрессия антигенов ранней и поздней активации;

угнетение пролиферативного ответа лимфоцитов при их стимуляции пектинами и, в большей степени, опосредованной через Т-клеточный рецептор;

явления дисиммуноглобулинемии с гипериммуноглобулине-мией класса М, гипоиммуноглобулинемией по классу в;

нарушения цитокинового баланса с увеличением содержания провоспалительных и Т-клеточных цитокинов в сыворотке, но депрессией индуцированного синтеза цитокинов.

3. В периферической крови опийных наркоманов выявлено значительное увеличение содержания лимфоцитов, экспрессирующих ассоциированный с апоптозом БазЫ, а также изменение соотношения РаБЛ* и РавЬ+ лимфоцитов с другими субпопуляциями лимфоцитов и с содержанием Ьс1-2+ лимфоцитов, свидетельствующее о состоянии «повышенной апоптотической готовности».

4. В периферической крови опийных наркоманов выявлено увеличение содержания лимфоцитов с морфологическими и тинкто-риальными признаками апоптоза, а также повышенная активность ключевого фермента, реализующего программу апоптоза - цисте-иновой протеиназы апопаина (каспазы 3).

5. Т-лимфоциты опийных наркоманов при их активации через антигенсвязывающий рецептор, в сравнении с лимфоцитами здоровых лиц, наряду с угнетением пролиферативного ответа характеризуются гиперактивацией каспазы 3, но отсутствием адекватного усиления апоптоза при воздействии глюкокортикоидов, что свидетельствует о глубоком нарушении баланса механизмов регуляции пролиферации и апоптоза в лимфоцитах.

6. Вторичная иммунологическая недостаточность (ВИН) у опийных наркоманов, выражающаяся в наличии инфекционного иммунопатологического синдрома, ассоциируется с максимальной интенсивностью апоптоза лимфоцитов, что свидетельствует о важной роли апоптотического иммунодефцита в ее развитии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Особенности экспрессии Fas-антигена и апоптоз лимфоци-ов периферической крови у опийных наркоманов // Медицинская ммунология - 2000. - Т.2, №2. - С. 138. (соавт.: Сибиряк C.B., Юл-ашев В.Л., Юсупова Р.Ш., Сибиряк Д.С., Набиуллина Е.В.).

2. The peripheral blood lymphocytes apoptosis as a biomarker of le narcotoxicant-induced immunosuppression // Abstr. of the 4th enobiotic metabolism and toxicity workshop of Balkan countries. -intalya, Turkey, 2000. - P.99, (соавт.: Sibiryak S., Yusopova R., Lurchatova N.).

3. Экспрессия Fas-рецептора на лимфоцитах периферической рови в норме и при различных патологических состояниях // Ал-ергология и иммунология. - 2000. - Т. 1, № 2. - С. 117-118, (соавт.: Сибиряк C.B., Юсупова Р.Ш., Курчатова H.H.).

4. Экспрессия Fas-рецептора и апоптоз лимфоцитов при опий-ой наркомании II Аллергология и иммунология. - 2000. - Т. 1, № 2. С. 119 - 120, (соавт.: C.B. Сибиряк, Р.Ш. Юсупова).

5. Опыт применения бемитила в качестве иммунокорректора ри опийной наркомании // Рациональное использование лекарств Пермь, 2000 - Ч. 1 - С. 38 - 39, (соавт.: Сибиряк C.B., Юлдашев 1.Л., Набиуллина Е.В.).

6. Апоптоз лимфоцитов как механизм развития иммунопато-огии при опийной наркомании // Современные проблемы аллер-ологии, иммунологии и иммунофармакологии - Тез. докл. 4-ого конгресса РААКИ, - Т. 2 - С. 203. ( соавт.: Сибиряк C.B., Юлда-лев В.Л., Набиуллина Е.В.).

7. Апоптоз лимфоцитов при опийной наркомании - возмож-[ая роль в механизме развития вторичной иммунологической не-остаточности // Медицинская иммунология - 2001 - Т.З, № 2 -:.199 - 200, (соавт.: Сибиряк C.B., Юсупова Р.Ш., Юлдашев В.Л.).

8. The lymphocytes apoptosis in the immmunocompromised heroin ddicts // Scand. J. Immunol. - 2001 - Yol. 54, Suppl. 1 - P.17, (соавт.: iibiryak S., Yusopova R., Sibiryak D.).

9. Иммунный статус и апоптоз лимфоцитов больных, страдающих опийной наркоманией // Иммунология Урала. - 2001, Т.1, tel, С. 83 - 84, (соавт.: Сибиряк С. В., Юсупова Р. Ш., Полосухина Е. Р.)

10. The Immune Status and Lymphocyte Apoptosis in the Opioid Addicts // Russian J. Immunol. - 2001.- Vol. 6, №3. P. 282 - 290, (co-iBT.: S. Sibiryak, Yusupova R., Kurchatova N.)

Отпечатано в типографии издательства ЛИРА 450005, Уфа, ул. Гафури 10/1 Лиц. № А 818250 МпиМИ РБ от 25.06.2000 Подписано в печать 15.05.2000. Тираж 2000 экз. Заказ 658