Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Роль ангиотензина и цитокинов в развитии почечной недостаточности в эксперименте и эффекты антицитокиновой терапии



На правах рукописи

□03054Т36

СОЛОВЬЁВ Андрей Георгиевич

РОЛЬ АНГИОТЕНЗИИА И ЦИТОКИНОВ В РАЗВИТИИ ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ И ЭФФЕКТЫ АНТИЦИТОКИИОВОЙ ТЕРАПИИ

14.00.36 - Аллергология и иммунология 14.00.25 - Фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук.

Санкт-Петербург 2007

003054736

Работа выполнена в Государственном Учреждении Научно-исследовательский институт Экспериментальной медицины Российской Академии Медицинских Наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Назаров Петр Григорьевич; доктор медицинских наук, профессор Лосев Николай Андреевич

Офгщитьные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Симбирцев Андрей Семенович доктор медицинских наук, профессор Цырлин Виталий Александрович

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится 19 марта 2007 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д.001.022.01 при ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. академика Павлова, 12)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН

Автореферат разослан « ^ » февраля 2007 года. Ученый секретарь

Диссертационного совета Доктор медицинских наук

Бурова Л.А.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Острая почечная недостаточность (ОПН) остается одним из грозных осложнений в практике врачей различных специальностей и причиной высокой смертности больных, в значительной степени определяющей общий исход основного патологического процесса, на фоне которого ОПН возникла.

Особую значимость это осложнение приобретает в практике врачей отделений интенсивной терапии. По данным медицинского страхования США (Medicare), на долю острой почечной недостаточности приходится 23,8% случаев на 1000 всех поступлений в клиники США (Xue, Daniels et al., 2006), причем смертность как результат основного заболевания в течение 90 дней после выписки из стационара высока, достигая 34,5 % при изолированной острой почечной недостаточности и 48,6 % при вторичной острой почечной недостаточности (Melnikov, Ecder et al., 2001; Xue, Daniels et al., 2006). Важную роль в судьбе больных играет острая почечная недостаточность при сердечно-сосудистых операциях (Garwood 2004), трансплантациях почек, тяжелых эндотоксикозах. При острой почечной недостаточности, возникшей вследствие сепсиса, смертность значительно выше (74,5 %) (Neveu, Kleinknecht et al., 1996), чем при острой почечной недостаточности, возникшей как осложнение других состояний (45,2 %) (Neveu, Kleinknecht et al., 1996). Тяжесть подобных состояний не может бьггь объяснена исключительно исходными патологическими факторами. Острая почечная недостаточность сама может приводить к дальнейшим непочечным осложнениям, значительно снижающим выживаемость, и поэтому рассматривается не как курабельное осложнение основного заболевания (Levy, Viscoli et al., 1996), a как самостоятельный синдром, являющийся частью синдрома полиорганной недостаточности.

В последнее время представления о причинах и механизмах развития острой почечной недостаточности существенно изменились в связи с обнаружением выраженных иммунотропных свойств у факторов ренин-

ангиотензиновой системы, известной своим участием в патогенезе острой почечной недостаточности. Показано, что ангиотензин II, считавшийся физиологическим регулятором артериального давления, оказывает стимулирующее действием на иммунокомпетентные клетки и является активатором синтеза некоторых питокинов. В связи с этим внимание ученьгх все больше привлекают иммунологические аспекты развития ОШ1 (1998). Показано, что большинство патологических событий в паренхиме почек, обусловленных столь разными причинами, как сепсис, токсическое воздействие химических агентов (ТН^СЬ, цисплатин) и ишемия, развиваются по сходному сценарию и так или иначе связаны как с участием ангиотензина II, так и с активацией воспалительных цитокиновых каскадов. Накапливаются данные, свидетельствующие о целесообразности включения антицитокиновой терапии в систему лечебных мероприятий при 01Ш. Предполагается, что антицитокиновая терапия должна эффективно предупреждать развитие системного воспалительного ответа и острой почечной недостаточности.

Вместе с тем, роль ангиотензина П как фактора воспаления и индуктора системного воспалительного ответа организма освещена в литературе далеко не полностью. Не ясна роль этого регуляторного пептида в активации про- и противовоспалительных цитокинов. Отсутствуют схемы лечения острой почечной недостаточности, основанные на блокировании активности ангиотензина II и снижении активности провоспалительных цитокинов.

Цель исследования. В связи с этим целью нашего исследования была оценка роли регуляторного гормона ангиотензина II как провоспалительного цитокининдуцирующего фактора и разработка схемы лечения острой почечной недостаточности в эксперименте на животных, основанной на блокировании активности ангиотензина II и провоспалительных цитокинов.

Задачи исследования. Были решены следующие задачи:

- оценить способность рекомбинантного ангиотензина II индуцировать продукцию провоспалительных (IL-ip, TNFa, IL-18) и противовоспалительных (IL-IRa) цитокинов и хемокинов (IL-8) лейкоцитами в культуре in vitro;

- выяснить механизм активации синтеза хемокина IL-8 рекомбинантным ангиотензинном И;

- сравнить цитокининдуцирующие свойства рекомбинантного ангиотензина II с бактериальным эндотоксином (LPS);

- определить механизм ингибиции продукции цитокинов в культуре клеток крови in vitro при действии препарата каптоприл, являющегося ингибитором ангиотензинпревращающего фермента;

- исследовать ренопротективные свойства препаратов каптоприл и пироксам как антицитокиновых агентов с разным механизмом действия на модели ишемически-реперфузионного острого повреждения почек у лабораторных животных и разработать схему комплексной антицитокиновой терапии острой почечной недостаточности как одного из компонентов синдрома полиорганной недостаточности.

Научная новизна работы. Впервые показано наличие у общеизвестного вазоактивного регуляторного пептида ангитензина II провоспалительного действия, проявляющегося в способности активировать синтез провоспалительных цитокинов клетками крови in vitro.

Показана каскадность провоспалительного эффекта ангиотензина II при активации синтеза цитокинов в клетках крови in vitro.

Открыт факт спонтанного синтеза ангиотензина II культурой клеток крови человека in vitro.

Проведен сравнительный анализ провоспалительного действия ангиотензина II и LPS, показано сходство вызываемых обоими агентами провоспалительных цитокиновых каскадов.

Показано, что ангиотензин Н-блокирующий препарат каптоприл (известный в основном как ингибитор ангиотензинпревращающего

фермента) обладает способностью блокировать синтез провоспалительных цитокинов in vitro, и что этот противовоспалительный, антицитокиновый эффект не связан с общеизвестным механизмом действия каптоприла -ингибированием ангиотензинпревращшошего фермента.

Впервые разработана схема превентивной антицитокиновой терапии острой почечной недостаточности в эксперименте на животных in vivo, подобран эффективный антицитокиновый агент, определена его доза и путь введения.

Доказана эффективность антиангиотензиновой и неспецифической антицитокиновой терапии острой почечной недостаточности у экспериментальных животных с помощью нового препарата пироксам (SAHA).

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты проведенной работы проливают дополнительный свет на роль ренин-ангиотензиновой системы в норме и патологии. Благодаря полученным данным получает экспериментальное освещение механизм воспалительного повреждения паренхимы почек при ишемии и сепсисе, становится более ясной роль иммунологических последствий повышения уровня эндогенного ангиотензина II в патогенезе неспецифических системных васкулитов при гипертензиях.

Как результат более глубокого понимания физиологии ренин-ангиотензиновой системы открываются пути к новым антицитокиновым стратегиям и тактикам лечения почечной недостаточности при острых и хронических заболеваниях.

Работа также дает новую методику защиты структуры и функции почек в сердечно-сосудистой хирургии, трансплантологии, токсикологии и интенсивной терапии. Разработанная нами методика превентивной антицитокиновой терапии ОПН может быть опробована в клинических условиях и оказаться полезной в широком спектре неотложных состояний медицины катастроф, например, при сепсисе, шоке, отравлениях. Fie

исключено, что предложенная нами схема может быть модифицирована и улучшена совместным применением различных антицитокиновых агентов.

Полученные нами новые данные о способности каптоприла блокировать синтез провоспалительных цитокинов могут служить основой для дальнейшего углубленного изучения антицитокиновых свойств этого препарата с целью расширения показаний к его применению в частности в кардиологии (van de Wal, Plokker et al., 2006) и гепатологии (Kanno, Tazuma et al., 2005).

Основные положения выносимые на защиту.

1. Человеческий рекомбинантный ангиотензин И обладает цитокининдуцирующими свойствами и активирует синтез про- и противовоспалительных цитокинов клетками крови in vitro.

2. Ангиотензин II-индуцированный синтез хемокина IL-8 в лейкоцитах происходит опосредованно, через первичную активцию провоспалительных цитокинов IL-lp и TNFa.

3. Препарат пироксам (SAHA) защищает животных от поражения почек и развития ОПН в условиях ишемии почек на ишемически-реперфузионной модели за счет снижения выброса в кровь ангиотензина II и провоспалительных цитокинов IL-ip, TNFa, IL-18.

4. Ингибитор ангиотензинконвертирующего фермента каптоприл подавляет синтез цитокинов in vitro, независимо от его антиферментативной активности, но антицитокиновое действие препарата каптоприл недостаточно для клинического эффекта in vivo.

Личный вклад в проведение исследования. Личным вкладом автора в выполненную работу является самостоятельное проведение большинства экспериментов и интерпретация полученных результатов. Вклад соавторов ограничивался обучением работе с лабораторными животными, применяемым методам исследования, научно-методическими советами и

конструктивной критикой, ценными советами по настройке установок экспериментов и отработкам методик. Личным вкладом также является вся организационная и практическая работа по забору и культивированию клеточных культур и проведению работ с кровью, а также часть работ по выполнению экспериментов на мышах по ишемии-реперфузии почек.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены на следующих конференциях:

доклад на ежегодной конференции международного интерлейкинового общества (International Interleukin Society Annual Conference), Дублин, Ирландия, 20 - 23 сентября 2003 г.;

доклад на Всероссийской конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия», г. Курск, 16-18 мая 2006 г.;

доклады на X Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В. И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», Санкт-Петербург, 29.05 -1.06.2006;

доклад на Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре», Санкт-Петербург, 17-19 октября 2006 г.;

доклад на совместной конференции отдела иммунологии и отдела нейрофармакологии им. C.B. Аничкова Института экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, 27 ноября 2006 г.;

доклад на заседании Санкт-Петербургского отделения Российского научного общества иммунологов, декабрь 2006 г.

По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 2 журнальных статьи в российском и международном научных периодических изданиях («American Journal of Physiology - Renal Physiology» и «Цитокины и воспаление») и 5 тезисов.

Объём и структура диссертации. Объём работы составляет 102 страницы машинописного текста, включая 1 таблицу, 25 рисунков. Список

литературы состоит из 130 наименований (19 отечественных источников и 111 иностранных).

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Использовали кровь 14 здоровых волонтеров (5 женщин, 9 мужчин) 24 40 лет. Мыши-самцы массой 20-25 г линии С57В1/6 были получены из Jackson Laboratories. Питательные среды RPMI 1640 и DMEM для клеточных культур (Life Technologies) обогащали добавлением следующих компонентов: 10 мМ L-глутамина, 24 мМ NaHC03, 10 мМ HEPES, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина и 10% сыворотки плодов крупного рогатого скота (Life Technologies). Использовали стерильный физиологический раствор (0,9 % NaCl; Baxter Healthcare), раствор гистопака-1077 для выделения мононуклеаров из крови человека, рекомбинантные препараты человеческих ангиотензина П (Sigma), IL-lß (Cistron Biotechnology), рецепторного антагониста IL-1 (IL-lRa), TNF-связывающего протеина (TNF-BP, или TNF-Rp; Peprotech), IL-18-связывающего протеина IL-18BP (Peprotec), TNFa (Vertex Pharmaceuticals), а также липополисахарид (LPS) E. coli (Difco), реагенты для иммуноферментного определения ангиотензина II человека (Promega), реактивы для иммуногистохимического исследования (Santa Cruz Biotechnology), препараты каптоприл (Sigma) и пироксам (suberoyl-3-aminopyridineamide hydroxamic acid, SALLA.; Italfarmaco, Cinisello Balsamo, Italy). Все использованные в культурах клеток препараты, реагенты и рекомбинантные цитокины, согласно паспортам, были стерильными и апирогенными по критериям Food's and Drug's Administration.

Культуры клеток цельной крови человека и культуры выделенных из крови мононуклеаров инкубировали в среде RPMI 1640 в 96- или 24-луночных планшетах (Becton Dickinson; Greiner) в С02-инкубаторе при 37 °С в течение 10-12 ч. Концентрации активаторов и других реагентов в среде составляли: ангиотензина П - 250, 500 и 1000 нМ; LPS Е. coli - 20 нг/мл; IL-lß — 20 нг/мл; IL-lRa) - 100 нг/мл; IL-18BP - 50 нг/мл; каптоприла - 2 мМ, 1 мМ, 0,5 мМ. Содержание цитокинов в культуралыюй среде оценивали

методом жидкостной электрохемишоминесценции на приборе Origen Analyzer (Igen). Определение содержания ангиотензина П в супернатанте производили иммуноферментным методом (Promega).

Ишемию-реиерфузию почек у мышей производили под общей анестезией пережатием обеих почечных сосудистых ножек на 22 мин. Это вызывало обратимую ОПН. Контрольной группе операцию проводили так же, но сосудистые ножки не пережимали (ложнооперированные животные). Экспериментальной группе вводили препарат пироксам (SAHA) внутрибрюшинно и per os в различных дозировках от 10 до 100 мг/кг. Число мышей в группах перед началом каждого эксперимента составляло 15. Степень ОПН оценивали по уровню креатинина и азота мочевины крови (BUN). Проводили гистологическое и иммуногистохимическое исследование почек; в экстрактах почек измеряли концентрацию цитокинов. Гистологические изменения в почках оценивали количественно, в баллах, по критериям ATN (Acute Tubular Necrosis) для оценки степени повреждения почечной паренхимы и острого канальцевого некроза. При статистической обработке данных использовали тест ANOVA. Статистическая значимость различий принималась в 95% доверительном интервале. Значения выражены как средняя арифметическая ± стандартная ошибка средней (M±SE).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Установлено, что стимуляция культур клеток крови человека (как разбавленной цельной крови, так и выделенных из нее мононуклеаров) in vitro рекомбинантным препаратом ангиотензина П человека в концентрациях от 250 до 1000 нМ дозозависимым образом стимулирует продукцию цитокинов провоспалительного ряда: 1L-8, IL-lß, TNFa, а также вызывает дозозависимое увеличение выработки IL-lRa - противовоспалительного цитокина, антагониста рецептора IL-lß. По сравнению с нестимулированными культурами крови ангиотензин II вызывал статистически значимое увеличение уровня указанных цитокинов в супернатанте культур (во всех случаях р<0,05).

На примере активации синтеза 1Ь-8 были проведены эксперименты по выяснению зависимости его синтеза от участия других цитокинов, в частности, 1Ь-1р, ТМРа и 11,-18. С этой целью проводили стимуляцию синтеза 1Р-8 в культурах крови и лимфоцитов человека рекомбинантным ангиотензином II в условиях блокирования активности провоспалительных цитокинов 1Ь-1(3 и ТОБа. Для блокирования 1Ь-1|3 использовали рекомбииаитный препарат рецепторного антагониста 1Ь-1Яа человека, для блокирования ТОТа — растворимый рекомбинантный рецептор ТЫ Ра (ЮТ-Яр) человека. Они добавлялись в культуры крови вслед за ангиотензином П, чтобы активация синтеза 1Ь-8 происходила в условиях нейтрализации 1Ь-1Р и ТОТос ингибиторами. Для сравнения было исследовано влияние указанных ингибиторов на ангиотензин П-индуцированный синтез 1Ь-1р. Полученные данные показали, что ангиотензин П-активированный синтез 1Ь-8 является ЮТа- и 1Ь-1 р-олосредованным. Это подтверждается тем, что при блокировании 1Ь-1(3 и ТОТа соответствующими белками (ГЬ-Ша и ТЬТ-Ир) продукция 1Ь-8 статистически значимо снижалась (р<0,05) по сравнению с культурами, стимулированными ангиотензином II без ингибиторов 11.-1 [5 и ЮТа.

Результаты описанных экспериментов указывают на то, что вызываемая ангиотензинном II продукция хемокина 1Ь-8 не является результатом прямого действия ангиотензина на механизм запуска синтеза 1Ь-8, а является вторичным событием, наступающим под действием таких активированных ангиотензингом провоспалительных цитокинов, как 1Ь-1Р или ЮТа, либо их обоих. В то же время, механизм запуска синтеза 1Ь-1р под действием ангиотензина II иной, - возможно, прямой, во всяком случае, он не зависит от ЮТа. Отсутствует также зависимость ангиотензин П-стимулированного срштеза 1Ь-8 от 1Ь-18. Добавление 1Ь-18-связывающего протеина (II.-) 8ВР) к стимулированной культуре клеток никак не воздействовало на синтез 1Ь-8.

Физ, р-р Аиг2 Аш 2 Анг2 Днг2

(контроль) +■ IL-IRa + TNFRp + П.-18ВР

Рисунок 1. Синтез 1L-8 клетками крови здоровых доноров под действием ангиотензина II в присутствии рскомбинантных белков, нейтрализующих IL-lf), TNFa и IL-18.

По оси абсцисс отложены варианты опыта: контроль (культуры, инкубированные с физиологическим раствором), культуры с ангиотензином П (500 нМ), культуры с ангиотензийом I! (500 нМ) и IL-IRa (100 нг/мл), культуры с ангиотензином II (500 нМ) и TNF-Rp (] мкг/мл), культуры с ангиотензином II (500 нМ) и 1L-18Вр (50 нг/мл). По оси ординат - кратность повышения синтеза IL-8 но сравнению с контролем (культурами, инкубированными с физиологическим раствором).

Представлены средние величины и ошибки средних (M±SE) по культурам клеток крови 14 допоров. Звездочки - отличие от контроля достоверно, р<0,05.

Аналогичный эксперимент проведен с LPS в качестве стимулятора культуры клеток крови. При стимуляции культур клеток LPS, как и ангйотензиином И, синтез 1L-8 также индуцируется опосредованно, через 1L-

IP и TNFa, задействован в этом случае также IL-18. Добавление соответствующих связывающих агентов статистически значимо снижало выработку IL-8. По характеру снижения синтеза IL-8 ведущим путем следует признать цепочку LPS -> IL-ip IL-8. Иными словами, первичным эффектом LPS, как и ангиотензина П, является активация синтеза провоспалительного цитокина IL-ip, а уже этот цитокин вызывает активацию хемокина IL-8.

Для подтверждения неспецифического противовоспалительного действия препаратов группы ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента мы проанализировали влияние одного из них - препарата каптоприл - на выработку IL-8 в культуре клеток крови здоровых доноров. В качестве стимулятора синтеза 1L-8 в этих опытах был использован LPS в дозе 20 нг/мл. Мы показали, что имеет место снижение LPS-индуцированного синтеза IL-8 каптоприлом, значимое (р<0,05) при его дозах 1 и 2 мМ. Содержание IL-8 при этом снизилось в 4-5 раз. Поскольку известный механизм действия каптоприла - это ингибиция ангиотензинконвертирующего фермента, то с этим механизмом действия, в первую очередь, следует связывать и наблюдаемый эффект каптоприла в LPS-стимулированной культуре клеток. Таким образом, синтез IL-8 в клетках крови не только может быть индуцирован ангиотензинном II, добавленным в культуру клеток извне в качестве активирующего агента, но находится под контролем эндогенного ангиотензина II и существенно зависит от образования этого медиатора внутри клеток, поскольку подавляется в присутствии ингибитора фермента, ответственного за процессинг ангиотензина II.

Для уточнения того, каким образом LPS вызывает синтез IL-8 (напрямую или опосредованно, через другой цитокин), и на каком уровне происходит блокировка провоспалительного цитокинового каскада каптоприлом, мы проверили, блокирует ли каптоприл синтез IL-8, индуцированный рекомбинантным цитокином IL-ip. Установлено, что

ингибирующий эффект каптоприла при EL-1 p-индуцированном синтезе IL-8 становится значимым при дозе 1 мМ, в то время как эффект при LPS-индуцированном синтезе IL-8 наступает уже при концентрации 0,5 мМ, что говорит о том что в цепочке LPS 1L-1 [i 4 IL-8 данный препарат работает

1,2 -

Фиг), р-р Анг2 Анг2 Аш2 Aiir2

(контрой.) + IL-IRa -t-TNFRp I + IL-18UP

Рисунок 2. Ингибирование синтеза IL-8, индуцированного в культурах клеток крови здоровых доноров LPS и IL-ip, в присутствии каптоприла -ингибитора ангиотензинпревращающего фермента.

Заштрихованные столбики - культуры. стимулированные LPS (20 нг/мл), белые столбики - культуры, стимулированные IL-lp (20 нг/мл). По оси ординат — кратность изменения синтеза 1L-8 но сравнению с контролем (культурами с LPS или IL-lp, но без каптоприла). Представлены средние величины и ошибки средних (M+SE) по культурам клеток крови 14 доноров. Звездочки (*) - достоверное снижение по сравнению с контролем (культурами, содержащими соответствующий стимулятор — LPS или TL-1), р<0,05.

на обоих этапах. Возникает вопрос: приведенная кепочка провослалительного каскада, индуцируемого LPS, связана с тем, что LPS

шщуцирует непосредственно синтез ангиотензина II, и тогда каптоприл действует общеизвестным способом посредством блокады процессинга ангиотензина I, или LPS не влияет на ренин-ангиотензиновую систему, и тогда полученные данные указывают на непосредственную антицитокиновую активность каптоприла? Выбор между этими альтернативными объяснениями позволяют сделать результаты экспериментов, приведенные ниже.

Для выяснения вопроса о возможном участии эндогенного ангиотензина П в цитокиновых ответах клеток крови на LPS нами была поставлена серия опытов по прямому определению уровня ангиотензина П при стимуляции культур клеток крови с помощью LPS. При этом мы получили следующий результат: кровь здоровых людей способна вырабатывать ангиотензин II и без стимуляции LPS, т.е. спонтанно. При этом обнаружена четкая временная зависимость: уровень эндогенного ангиотензина II в течение 4 ч повышался более чем в 2,5 раза по сравнению с начальным. Имеется статистически значимое различие (р<0,05) в уровнях ангиотензина II через 4 ч и в начале инкубации (0,5 ч) как в группе культур, стимулированных LPS, так и в группе нестимулированных культур цельной крови. В то же время нет никаких значимых различий между группами (культурами с LPS и культурами без LPS) на каждом сроке инкубации. Это говорит о том, что LPS не шщуцирует синтез эндогенного ангиотензина кровью, следовательно ангиотензин не является медиатором провоспалительного действия LPS, а действует независимо, хотя и похожим образом.

На основании наших данных можно предполагать, что LPS запускает провоспалительные каскады цитокинов в клетках крови человека без индукции синтеза ангиотензина П, т.е. что ангиотензин II не является медиатором действия LPS. Таким образом, антицитокиновый эффект каптоприла может быть связан как с блокадой синтезируемого кровью ангиотензина II, так и с другими, пока не установленными механизмами.

Каптоприл был испытан нами и в качестве антицитокинового агента на модели острой ишемии почек у мышей. Эксперименты показали, что эффективная доза препарата, используемая in vitro в культурах клеток, не могла быть применена у животных из-за вызываемых ею тяжелых гемодинамических эффектов. Меньшая же доза каптоприла, в качестве препарата превентивной однократной монотерапии в острой ситуации эксперимента на ишемически-реперфузионной модели статистически значимого снижения уровня креагинина и мочевины не дала.

По данным литературы, другим препаратом, снижающим синтез ангиотензина, является пироксам - ингибитор гистондеацетилазы. Доказано также, что он имеет и антицитокиновый эффект широкого спектра. Испытание антицитокиновых свойств ингибитора гистондеацетилазы на модели ишемической ОГШ in vivo показало, что, что эффективной дозой, статистически значимо защищающей почки от воздействия ишемии, является уже доза 10 мг/кг при пероральном введении. Внутрибрюшинный путь введения также достигал цели, т.е. обеспечивал ренопротекгивный эффект, но только при дозе 100 мг/кг. Оценку наступающей ишемической ОПН и ее степени проводили биохимически (по уровню креатинина в крови), морфологически (по ATN-score, индексу острого канальцевого некроза), иммуногистохимически (по определению IL-18 в ткани почек) и прямым измерением содержания IL-ip, TNFcc и IL-18 в гомогенате паренхимы почек. Все исследования показали эффективность препарата SAHA статистически значимым снижением степени повреждения почек и содержания указанных выше провоспалительных цитокинов в группе мышей, получивших SAHA, по сравнению с группой нелеченых мышей (р<0,05).

Несмотря на то, что функцию почек удается защитить, анатомические признаки обратимого некроза почечных канальцев все же имеются, хотя и в значительно меньшем объеме, чем у не леченых мышей. Наши иммуногистохимические данные свидетельствуют и о снижении под

влиянием пироксама (SAHA) Продукции IL-18, с чем коррелирует рснопротсктивный эффект препарата.

Р<0.03

PO.OOl

L.

[XÖ.001

Ложная операция

SAH А mg /kg в нутр и 6 рю ш и н но

SA НА mg/ kg Per Об

Рисунок 3. Эффект пирокеама (SAHA) на течение ишемической острой почечной недостаточности у мышей, вызванной экспериментальной ишемией-релерфузией.

По оси абсцисс группы животных: группа I ложнооперироваиные (контроль, группа 2 - ишемия без лечения (п-)5): группа 3 - ишемия +

SAHA: SAHA внутрибрнжгинно за 30 минут до операции в дозах 10 мг/кг, 100 мг/кг (по 15 мышей на каждую лозу); SAHA per os в лозах 10 мг/кг, 30 мг/кг, 100 мг/кг (по 15 мышей на каждую дозу). По оси ординат содержание креатинина плазмы крови, в мг/дл. Статистически значимые различия с группой 2 (оперированные, не леченные) указаны индексами р над соответствующим столбцом.

Данные литературы подтверждают выводы о собственном антицитокиновом действии препаратов группы б; го катеров ангнотензинпревращающего фермента, подобные нашим. Гак, показано, что

каптоприл и лизиноприл ингибиругот синтез IL-12 мононуклеарами крови человека in vitro при стимуляции LPS. Каптоприл нарушает синтез ТТ.-1(5 моноцитами, стимулированными TNFa. Установлено, что в данном случае каптоприл препятствует проникновению субчастицы р65 фактора NF-kappaB в ядро и, таким образом, прерывает синтез РНК для IL-ip. Введение каптоприла и саралазина в культуры клеток zona glomeruloia почек крыс снижало синтез альдостерона и, соответвенно, ангиотензина. Имеются данные о снижении синтеза JL-6, IL-la, IL-10, П.-12 и IL-18 прекурсорами моноцитов человека.

Дальнейшие исследования помогут уточнить, какие ещё механизмы повреждения устраняет SAHA при ишемическом повреждении почек. К интересным наблюдениям может привести исследование свойств SAHA на других моделях ОПН - септической (LPS), токсической (глицерин, цисплатин). Перспективным для разработки терапевтических антицитокиновых фармакологических схем представляется сочетание SAHA с такими препаратами, как каптоприл (ACEi), блокаторами iNOS синтазы (пентоксифиллипом).

Данное исследование может быть полезным при разработке стратегий лечения больных в сердечно-сосудистой хирургии, медицине катастроф (геморрагические, токсические шоки с гипотензией), неотложной токсикологии и инфекционно-токсических шоках, практике лечения синдрома полиорганной недостаточности в отделениях анестезиологии, реанимации и интенсивной терапии. Перспективным кажется использование препарата SAHA в качестве монотерапии или в сочетании с любым из вышеперечисленных препаратов за 30-60 мин до планируемого подключения аппарата АИК при операциях аорто-коронароного шунтирования, протезирования клапанного аппарата сердца. Данные литературы и нашего исследования предполагают возможность хорошего терапевтического эффекта для лечения ОПН, вызванной краш-синдромом, а также при отравлениях гемолитическими ядами и техническими жидкостями. Следует

ожидать хорошего реноиротективиого антицитокинового эффекта при синдроме полиорганной недостаточности, вызванной сепсисом или тяжелыми инфекционными заболеваниями.

ВЫВОДЫ

1. Ангиотензин II индуцирует синтез про- и противовоспалительных цитокинов IL-ip, IL-8 и TNFa, IL-IRa в культурах клеток цельной крови и культурах мононуклеаров здоровых людей, что объясняет известную способность этого пептида вызывать неспецифическую воспалительную реакцию как на местном, так и на системном уровнях.

2. Цитокининдуцирующая активность ангиотензина II in vitro может быть блокирована фармакологически, с помощью препаратов с антицитокиновым эффектом. Препарат группы ингибиторов ангиотензинконвертирующего фермента (ACEi) кантон рил снижает вызываемую ангиогензинном II продукцию цитокинов.

3. Механизм ингибируюшего действия каптоприла на синтез провоспалительных цитокинов in vitro не ограничивается блокадой ангиотензинконвертирующего фермента, каптоприл влияет на синтез цитокинов и другим путем, который требует изучения и который можно назвать «собственным антицитокиновым эффектом».

4. Каптоприл, как антицитокиновый агент, эффективен в культуре клеток крови in vitro, но достичь с его помощью значимого ренопротективного эффекта in vivo у мышей с экспериментальной острой почечной недостаточностью не удалось.

5. Ишемическое поражение почек in vivo у лабораторных мышей связано с участием цитокинов IL-18, IL-ip и TNFa.

6. Разработана и экспериментально обоснована схема терапии острой почечной недостаточности (на ишемически-реперфузионной модели у мышей in vivo) посредством превентивного (за 30 минут до ишемии) применения препарата пироксам (suberoyl-3-aminopyridineamide hydroxamic acid), подавляющего продукцию провоспалительных цитокинов IL-ip, TNFa

и IL-18 и надежно обеспечивающего хороший профилактический ренопротективный эффект. Наиболее эффективен пероральный путь применения пироксама (клинически эффективной является доза 30 мг на кг массы тела) по сравнению с интраперитонеальным путем введения (100 мг/кг).

* * *

Работа поддержана грантом международного общества нефрологов (International Society of Nephrology) за 2002-2004 гг., грантом Российского фонда фундаментальных исследований 06-0449629, а также средствами лабораторий профессоров Роберта Шрайера и Чарлза Динарелло (University of Colorado Health Science Centre).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Соловьёв А.Г., Резников Л.Л., Назаров П.Г., Dinarello С.А. Провоспалительные цитокин-шщуцирующие свойств ангиотензина II и механизм антицитокиновых эффектов ингибитора ангитензин-превращающего фермента каитоирила // Цитокины и воспаление. - 2006. - Т. 5, № 3. - С. 40-45.

2. Wang W., Faubel S., Ljubanovic D., Mitra A., Falk S.A., Kim J., Tao Y., Soloviev A., Reznikov L.L., Dinarello C.A., Schrier R.W., Edelstein C.L. Endotoxemic acute renal failure is attenuated in caspase-1-deficient mice // Am. J. Physiol. Renal. Physiol. - 2005. - Vol. 288, № 5. - F997-1004.

3. Соловьёв А.Г., Резников Л.Л., Назаров П.Г., Dinarello C.A. Влияние блокатора ангиотензинпревращающего фермента каптоприла на синтез IL-8 клетками крови человека in vitro И Russ. J. Immunol. - 2006. - Vol. 9, suppl. 3. -P. 129-130.

4. Соловьёв А.Г., Резников Л.Л., Назаров П.Г., Dinarello C.A. Способность человеческого ангиотензина II вызывать синтез провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в культуре клеток крови человека in vitro // Мед. иммунол. - 2006. - Т. 8, № 2-3. - С. 178-179.

5. Соловьёв А.Г., Резников Л.Л., Назаров П.Г., Dinarello C.A. Механизм стимулирующего влияния ангиотензина 2 на синтез хемокина IL-8 культурой клеток крови человека: роль IL-Iß и IL-18 // Мед. иммунол. - 2006. - Т. 8, № 2-3.-С. 179-180.

6. Соловьёв А.Г., Melnikov V.Y., Резников Л.Л., Назаров П.Г., Dinarello C.A. Влияние блокатора гистон-деацетилазы на развитие экспериментальной острой почечной недостаточности in vivo // Мед. иммунол. - 2006. - Т. 8, № 2-3.-С. 178.

7. Соловьёв А.Г., Резников Л.Л., Назаров П.Г., Динарелло Ч.А Синтез провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в культуре клеток крови человека in vitro при стимуляции рекомбинантным ангиотензином II // Цитология. - 2006. - Т. 48, № 9. - С. 800.

Подл, в печать 20.12.2006 г. Формат бумаги 60x84 1/16, 0,95 печ. л., Зак. 129, Тираж 100 экз. Типография ООО «А'ГЕНА», 191144, г. Санкт-Петербург, Суворовский пр., д. 39, лит.А. оф. 2

Актуальность проблемы

Острая почечная недостаточность (ОПН) остается одним из грозных осложнений в практике врачей различных специальностей и причиной высокой смертности больных, в значительной степени определяющей общий исход основного патологического процесса, на фоне которого ОПН возникла.

Особую значимость это осложнение приобретает в практике врачей отделений интенсивной терапии. По данным медицинского страхования США (Medicare), на долю острой почечной недостаточности приходится 23,8% случаев на 1000 всех поступлений в клиники США [127], причем смертность как результат основного заболевания в течение 90 дней после выписки из стационара высока, достигая 34,5 % при изолированной острой почечной недостаточности и 48,6 % при вторичной острой почечной недостаточности [76, 127]. Важную роль в судьбе больных играет острая почечная недостаточность при сердечно-сосудистых операциях [43], трансплантациях почек, тяжелых эндотоксикозах. При острой почечной недостаточности, возникшей вследствие сепсиса, смертность значительно выше (74,5 %) [87], чем при острой почечной недостаточности, возникшей как осложнение других состояний (45,2 %) [87]. Тяжесть подобных состояний не может быть объяснена исключительно исходными патологическими факторами. Острая почечная недостаточность сама может приводить к дальнейшим непочечным осложнениям, значительно снижающим выживаемость, и поэтому рассматривается не как курабельное осложнение основного заболевания [68], а как самостоятельный синдром, являющийся частью синдрома полиорганной недостаточности.

В последнее время представления о причинах и механизмах развития острой почечной недостаточности существенно изменились в связи с обнаружением выраженных иммунотропных свойств у факторов ренин-ангиотензиновой системы, известной своим участием в патогенезе острой почечной недостаточности. Показано, что ангиотензин II, считавшийся физиологическим регулятором артериального давления, оказывает стимулирующее действием на иммунокомпетентные клетки и является активатором синтеза некоторых цитокинов. В связи с этим внимание ученых все больше привлекают иммунологические аспекты развития ОПН [14]. Показано, что большинство патологических событий в паренхиме почек, обусловленных столь разными причинами, как сепсис, токсическое воздействие химических агентов (HgCb, цисплатин) и ишемия, развиваются по сходному сценарию и так или иначе связаны как с участием ангиотензина II, так и с активацией воспалительных цитокиновых каскадов. Накапливаются данные, свидетельствующие о целесообразности включения антицитокиновой терапии в систему лечебных мероприятий при ОПН. Предполагается, что антицитокиновая терапия должна эффективно предупреждать развитие системного воспалительного ответа и острой почечной недостаточности.

Вместе с тем, роль ангиотензина II как фактора воспаления и индуктора системного воспалительного ответа организма освещена в литературе далеко не полностью. Не ясна роль этого регуляторного пептида в активации про- и противовоспалительных цитокинов. Отсутствуют схемы лечения острой почечной недостаточности, основанные на блокировании активности ангиотензина II и снижении активности провоспалительных цитокинов.

Цель исследования

В связи с этим целью нашего исследования была оценка роли регуляторного гормона ангиотензина II как провоспалительного цитокининдуцирующего фактора и разработка схемы лечения острой почечной недостаточности в эксперименте на животных, основанной на блокировании активности ангиотензина II и провоспалительных цитокинов.

Задачи исследования

Были решены следующие задачи:

- оценить способность рекомбинантного ангиотензина II индуцировать продукцию провоспалительных (IL-1(3, TNFa, IL-18) и противовоспалительных (IL-IRa) цитокинов и хемокинов (IL-8) лейкоцитами в культуре in vitro;

- выяснить механизм активации синтеза хемокина IL-8 рекомбинантным ангиотензинном II;

- сравнить цитокининдуцирующие свойства рекомбинантного ангиотензина II с бактериальным эндотоксином (LPS);

- определить механизм ингибиции продукции цитокинов в культуре клеток крови in vitro при действии препарата каптоприл, являющегося ингибитором ангиотензинпревращающего фермента;

- исследовать ренопротективные свойства препаратов каптоприл и пироксам как антицитокиновых агентов с разным механизмом действия на модели ишемически-реперфузионного острого повреждения почек у лабораторных животных и разработать схему комплексной антицитокиновой терапии острой почечной недостаточности как одного из компонентов синдрома полиорганной недостаточности.

Научная новизна работы

Впервые показано наличие у общеизвестного вазоактивного регуляторного пептида ангитензина II провоспалительного действия, проявляющегося в способности активировать синтез провоспалительных цитокинов клетками крови in vitro.

Показана каскадность провоспалительного эффекта ангиотензина II при активации синтеза цитокинов в клетках крови in vitro.

Открыт факт спонтанного синтеза ангиотензина II культурой клеток крови человека in vitro.

Проведен сравнительный анализ провоспалительного действия ангиотензина II и LPS, показано сходство вызываемых обоими агентами провоспалительных цитокиновых каскадов.

Показано, что ангиотензин П-блокирующий препарат каптоприл (известный в основном как ингибитор ангиотензинпревращающего фермента) обладает способностью блокировать синтез провоспалительных цитокинов in vitro, и что этот противовоспалительный, антицитокиновый эффект не связан с общеизвестным механизмом действия каптоприла — ингибированием ангиотензинпревращающего фермента.

Впервые разработана схема превентивной антицитокиновой терапии острой почечной недостаточности в эксперименте на животных in vivo, подобран эффективный антицитокиновый агент, определена его доза и путь введения.

Доказана эффективность антиангиотензиновой и неспецифической антицитокиновой терапии острой почечной недостаточности у экспериментальных животных с помощью нового препарата пироксам (SAHA).

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты проведенной работы проливают дополнительный свет на роль ренин-ангиотензиновой системы в норме и патологии. Благодаря полученным данным получает экспериментальное освещение механизм воспалительного повреждения паренхимы почек при ишемии и сепсисе, становится более ясной роль иммунологических последствий повышения уровня эндогенного ангиотензина II в патогенезе неспецифических системных васкулитов при гипертензиях.

Как результат более глубокого понимания физиологии ренин-ангиотензиновой системы открываются пути к новым антицитокиновым стратегиям и тактикам лечения почечной недостаточности при острых и хронических заболеваниях.

Работа также дает новую методику защиты структуры и функции почек в сердечно-сосудистой хирургии, трансплантологии, токсикологии и интенсивной терапии. Разработанная нами методика превентивной антицитокиновой терапии ОПН может быть опробована в клинических условиях и оказаться полезной в широком спектре неотложных состояний медицины катастроф, например, при сепсисе, шоке, отравлениях. Не исключено, что предложенная нами схема может быть модифицирована и улучшена совместным применением различных антицитокиновых агентов.

Полученные нами новые данные о способности каптоприла блокировать синтез провоспалительных цитокинов могут служить основой для дальнейшего углубленного изучения антицитокиновых свойств этого препарата с целью расширения показаний к его применению в частности в кардиологии [116] и гепатологии [55].

Основные положения выносимые на защиту

1. Человеческий рекомбинантный ангиотензин II обладает цитокининдуцирующими свойствами и активирует синтез про- и противовоспалительных цитокинов клетками крови in vitro.

2. Ангиотензин II-индуцированный синтез хемокина IL-8 в лейкоцитах происходит опосредованно, через первичную активцию провоспалительных цитокинов IL-ip и TNFa.

3. Препарат пироксам (SAHA) защищает животных от поражения почек и развития ОПН в условиях ишемии почек на ишемически-реперфузионной модели за счет снижения выброса в кровь ангиотензина II и провоспалительных цитокинов IL-ip, TNFa, IL-18.

4. Ингибитор ангиотензинконвертирующего фермента каптоприл подавляет синтез цитокинов in vitro, независимо от его антиферментативной активности, но антицитокиновое действие препарата каптоприл недостаточно для клинического эффекта in vivo.

Личный вклад в проведение исследования

Личным вкладом автора в выполненную работу является самостоятельное проведение большинства экспериментов и интерпретация полученных результатов. Вклад соавторов ограничивался обучением работе с лабораторными животными, применяемым методам исследования, научно-методическими советами и конструктивной критикой, ценными советами по настройке установок экспериментов и отработкам методик. Личным вкладом также является вся организационная и практическая работа по забору и культивированию клеточных культур и проведению работ с кровью, а также часть работ по выполнению экспериментов на мышах по ишемии-реперфузии почек.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы представлены на следующих конференциях: доклад на ежегодной конференции международного интерлейкинового общества (International Interleukin Society Annual Conference), Дублин, Ирландия, 20-23 сентября 2003 г.; доклад на Всероссийской конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия», г. Курск, 16—18 мая 2006 г.; доклады на X Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», Санкт-Петербург, 29.05 - 1.06.2006; доклад на Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре», Санкт-Петербург, 17-19 октября 2006 г. доклад на совместной конференции отдела иммунологии и отдела нейрофармакологии им. С.В. Аничкова Института экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, 27 ноября 2006 г.; доклад на заседании Санкт-Петербургского отделения Российского научного общества иммунологов, декабрь 2006 г.

По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 2 журнальных статьи в российском и международном научных периодических изданиях («American. Journal of Physiology - Renal Physiology» и «Цитокины и воспаление»)и 5 тезисов.

Объём и структура диссертации

Объём работы составляет 102 страницы машинописного текста, включая 1 таблицу, 25 рисунков. Список литературы состоит из 130 наименований (19 отечественных источников и 111 иностранных).

ВЫВОДЫ

1. Ангиотензин II индуцирует синтез про- и противовоспалительных цитокинов IL-ip, IL-8 и TNFa, IL-IRa в культурах клеток цельной крови и культурах мононуклеаров здоровых людей, что объясняет известную способность этого пептида вызывать неспецифическую воспалительную реакцию как на местном, так и на системном уровнях.

2. Цитокининдуцирующая активность ангиотензина II in vitro может быть блокирована фармакологически, с помощью препаратов с антицитокиновым эффектом. Препарат группы ингибиторов ангиотензинконвертирующего фермента (ACEi) каптоприл снижает вызываемую ангиотензинном II продукцию цитокинов.

3. Механизм ингибирующего действия каптоприла на синтез провоспалительных цитокинов in vitro не ограничивается блокадой ангиотензинконвертирующего фермента, каптоприл влияет на синтез цитокинов и другим путем, который требует изучения и который можно назвать «собственным антицитокиновым эффектом».

4. Каптоприл, как антицитокиновый агент, эффективен в культуре клеток крови in vitro, но достичь с его помощью значимого ренопротективного эффекта in vivo у мышей с экспериментальной острой почечной недостаточностью не удалось.

5. Ишемическое поражение почек in vivo у лабораторных мышей связано с участием цитокинов IL-18, IL-ip и TNFa.

6. Разработана и экспериментально обоснована схема терапии острой почечной недостаточности (на ишемически-реперфузионной модели у мышей in vivo) посредством превентивного (за 30 минут до ишемии) применения препарата пироксам (suberoyl-3-aminopyridineamide hydroxamic acid), подавляющего продукцию провоспалительных цитокинов IL-ip, TNFa и IL-18 и надежно обеспечивающего хороший профилактический ренопротективный эффект. Наиболее эффективен пероральный путь применения пироксама (клинически эффективной является доза 30 мг на кг массы тела) по сравнению с интраперитонеальным путем введения (100 мг/кг). * *

Работа поддержана грантом международного общества нефрологов (International Society of Nephrology) за 2002-2004 гг., грантом Российского фонда фундаментальных исследований 06-0449629, а также средствами лабораторий профессоров Роберта Шрайера и Чарлза Динарелло (University of Colorado Health Science Centre).