Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Роль аденозина в изменении функциональной активности лимфоцитов и нейтрофильных лейкоцитов периферической крови здоровых доноров и больных бронхиальной астмой

РГ 6 од

2 7 МАЙ

На правах рукописи УДК 616.248-085.217.5.547.857.4

ГАВРИЛОВА Елена Васильевна

РОЛЬ АДЕНОЗИНА В ИЗМЕНЕНИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ

АКТИВНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ И НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ И БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ.

(14.00.36 - Аллергология и иммунология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА - 1996

Работа выполнена на кафедре патологической физиологии Российского государственного медицинского университета.

Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор Г.В.Порядин.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор В.Н.Федосеева; доктор медицинских наук, профессор И.В.Петрова.

Ведущее учреждение - НИИ вакцин и сывороток имени И.И.Мечникова.

Защита диссертации состоится "...."....................1996 г. в "...." часов на заседании специализированного совета Д 084. 14. 06 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117869, г. Москва, ул. Островитянова, 1 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГМУ

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук,

доцент Т.Е.Кузнецова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Бронхиальная астма относится к числу широко распространенных болезней, наметилась тенденция к дальнейшему росту заболеваемости, утяжеляется ее клиническое течение. Бронхиальная астма становится прогрессирующей и все более грозной болезнью: увеличивается число больных, получающих корти-костероидную терапию; они чаще госпитализируются по поводу астматических состояний; несмотря на повышение действенности терапии и реанимации, возросла смертность от бронхиальной астмы.

В формировании бронхиальной астмы принимают участие как гуморальные, так и клеточные звенья специфической иммунологической реакции (Платков Е.М., 1989; Федосеев Г.Б., 1995). Основными имму-нокомпетентными клетками, отвечающими на воздействие антигена специфической реакцией, являются лимфоциты и, в частности, Т-лимфоциты. Имеются многочисленные работы, свидетельствующие как об изменении их количества, так и их функциональной активности Показано, что в основе генеза атопической астмы лежит снижение су-прессорной функции лимфоцитов (Порядин Г.В. с соавт., 1980, 1992; Платков Е.М. с соавт., 1981; Гамкрелидзе А.Г., 1989; Gupta et al., 1988; Gasean et al., 1991).

Кроме специфических факторов защиты, в патогенезе бронхиальной астмы большую роль играют неспецифические факторы, представленные нейтрофильными лейкоцитами, одной из самых реактивных клеточных популяций. Показано, что участие нейтрофильных лейкоцитов в аллергических реакциях сопровождается изменением их функциональной активности: снижается их фагоцитарная активность, происходит ослабление хемотаксиса и спонтанной миграции, увеличивается их адгезионная способность (Маянский А.Н., Галиуллин А.Н., 1984; Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989; Кузник Б.И. с соавт., 1989; Платков Е.М., 1989).

з

Эти особенности функционального состояния лимфоцитов и ней-трофильных лейкоцитов связаны, в том числе, и с нарушением рецепции эндогенных биологически активных веществ: катехоламинов, аце-тилхолина, гистамина, лейкотриенов и других (Ляшенко В.А. с соавт., 1988; Федосеев Г.Б., 1995; Parker, 1987; Rafferty, Holgate, 1989; Neijens, 1990). Имеющиеся сведения о наличии на мембране лимфоцитов и лейкоцитов специфических аденозиновых рецепторов, с помощью которых аденозин оказывает свое регулирующее влияние на функцию этих клеток (Дмитриенко Н.П. с соавт., 1982; Londos et al., 1980; Wolff et al., 1981; Cronstein et al., 1983; Schrier et al., 1986; Schwartz et al., 1988), позволяют предположить зависимость функциональной активности клеток от состояния этих рецепторов.

Вместе с тем, в доступной нам литературе мы обнаружили лишь единичные данные о влиянии аденозина на функциональную активность лимфоцитов и нейтрофильных лейкоцитов у больных бронхиальной астмой (Белоусов Ю.Б. с соавт. 1992; Mann et al., 1986; Meitzer et al., 1989; Sustiel et al., 1989). Однако результаты этих исследований весьма противоречивы и не позволяют в полной мере оценить роль пу-риновых соединений в иммунопатогенезе бронхиальной астмы. Вместе с тем, изучение этого вопроса, вероятно, дополнило бы представления о ее патогенетических механизмах.

Целью настоящей работы явилось изучение влияния аденозина на функциональную активность лимфоцитов и нейтрофильных лейкоцитов периферической крови здоровых людей и больных различными формами бронхиальной астмы.

Задачи исследования. Для реализации поставленной цели нами решались следующие задачи:

1. Изучить влияние аденозина на иммунорегуляторную активность лимфоцитов периферической крови.

2. Изучить влияние аденозина на спонтанную и митоген-стимулированную реакцию бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ).

3. Изучить влияние аденозина на НАДФ-оксидазную и миелопе-роксидазную активность нейтрофильных лейкоцитов периферической крови.

Научная новизна исследований.

Впервые было исследовано влияние аденозина на иммунорегуля-торную активность лимфоцитов здоровых людей и больных различными формами бронхиальной астмы.

Впервые исследовано влияние различных концентраций аденозина на спонтанную и митоген-индуцированную пролиферативную активность лимфоцитов больных бронхиальной астмой с учетом периода заболевания (обострение или ремиссия) и его продолжительности (меньше 5 лет или 5 лет и больше).

Изучено влияние аденозина на активность НАДФ-оксидазы и мие-лопероксидазы нейтрофильных лейкоцитов здоровых людей, больных атопической (АБА) и инфекционно-аллергической (ИАБА) формами бронхиальной астмы с учетом периода и продолжительности заболе-вавния.

Практическая значимость работы.

Обнаруженное различие в реакции иммунорегуляторных клеток здоровых доноров, больных АБА и ИАБА на аденозин позволило углубить существующие представления как о патогенезе иммунологической дисрегуляции при АБА, так и о механизмах адаптации организма больного к этому состоянию.

Исследование влияния аденозина на функциональную активность нейтрофильных лейкоцитов показало его роль в регуляции одной из ключевых систем неспецифической реактивности у больных АБА и ИАБА.

Создана экспериментальная модель для оценки влияния биологически активных соединений на функциональную активность фагоцитарных клеток.

Апробация работы.

Материалы диссертации были доложены на I Европейском конгрессе по фармакологии (Milan, Italia, 1995), III Российском Национальном конгрессе "Человек и лекарство", на научных конференциях кафедры патофизиологии РГМУ. По материалам диссертации опубликованы 2 печатные работы.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы и четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и библиографического указателя. Текст изложен на 111 страницах машинописного текста. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 6 таблицами. Указатель литературы содержит 279 наименований, из них 112 - отечественных и 167 - зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Объектом исследования служили лимфоциты и нейтрофильные лейкоциты периферической крови 52 практически здоровых людей (27 мужчин и 25 женщин), в возрасте от 19 до 40 лет, 30 больных АБА (19 мужчин и 11 женщин) в возрасте от 19 до 59 лет и 35 больных ИАБА (15 мужчин и 20 женщин) в возрасте от 19 до 59 лет. Структура группы больных АБА была следующей: 11 пациентов находились в периоде обострения заболевания, у 19 человек наблюдалась его ремиссия; продолжительность заболевания у 18 человек составила меньше 5 лет, у 12 человек - 5 лет и больше. При обследовании у 4 больных АБА выявлена сенсибилизация к пыльце растений, у 22 больных - к аллергенам домашней пыли, у 4 больных отмечалась непереносимость как бытовых, так и пыльцевых аллергенов. В группе больных ИАБА 18 человек находились в стадии обострения, 17 человек - в стадии ремиссии заболевания; у 17 человек продолжительность заболевания составила меньше 5 лет, у 18 человек - 5 лет и больше. Тяжесть заболевания в обоих группах расценена у 3 человек как легкая, у 26 - как средняя. В момент обследования больные не получали гормональной терапии. Подбор больных осуществлялся на базе стационара Института иммунологии МЗМП РФ и Института пульмонологии МЗМП РФ. Забор крови у всех пациентов проводили в день поступления в стационар, до назначения внутривенных инъекций эуфиллина или начала курса специфической иммунотерапии, утром, натощак:

Лимфоциты выделяли в одноступенчатом градиенте плотности по методу Воушп (1968). Для исследования иммунорегуляторной активности выделенные лимфоциты здоровых доноров и больных АБА и ИАБА культивировали в концентрации 2,0 ТО6 кл/мл в течении 48 часов при 37°С в культуральной среде с добавлением аденозина в концентрации 1 мкМ или без него. Для предотвращения последующей

пролиферации регуляторные клетки обрабатывали митомицином С в концентрации 40 мкг/мл в течение 40 минут при 37°С. В качестве тест-клеток использовали стимулированные фитогемагглютинином Р (ФГА) лимфоциты здорового донора. Пролиферацию в изучаемых культурах оценивали через 72 часа по включению Н3-тимидина. Индекс регуляции (ИР) рассчитывали по формуле : И

ИР = 1- _ х100%, где

Р

И - число имп/мин в образцах с клетками, преинкубированными с аденозином; Р - число имп/мин в образцах с клетками, преинкубированными без аденозина.

В каждом опыте проводили контроль жизнеспособности клеток с трипановым синим (не менее 95%).

Для постановки спонтанной и стимулированной ФГА РБТЛ использовали взвесь лимфоцитов в культуральной среде с конечной концентрацией клеток 5х105 в мл. Реакцию ставили в стерильных микропланшетах с U- образными лунками. Все тесты проводили в триплете.

Для оценки ФГА - стимулированной пролиферации в соответствующие лунки добавляли ФГА в субоптимальной концентрации - 1 мкг/мл. Влияние аденозина на спонтанную и индуцированную ФГА РБТЛ исследовали, добавляя его в соответствующие лунки в концентрациях 0,1 мкМ, 1,0 мкМ и 10,0 мкМ. Пролиферацию в изучаемых культурах оценивали через 72 часа по включению Н3-тимидина. Влияние ФГА на пролиферативную активность лимфоцитов оценивали по величине индекса стимуляции (Ист) (Фримель Г., 1987; Weir D.M. et al., 1986).

кол- во имп/мин в культурах с ФГА

Ист=-

кол- во имп/мин в культурах без ФГА Изучение степени активации внутриклеточных антибактериальных

систем проводили в спонтанном и индуцированном НСТ-тесте, в нашей

s

модификации "в окне", которая была необходима для избежания снижения концентрации аденозина за счет активности сывороточных и эритроцитарных ферментов катаболизма пуринов. НСТ-тест ставили следующим образом: в предварительно приготовленные на стекле из пленки "РагаШт" лунки вносили кровь в объеме 0,1 мл и выдерживали во влажной камере при 37°С в течение 30 минут. Неприлипшие клетки смывали в стаканчике с забуференным фосфатами физиологическим раствором (ЗФР), добавляли в контрольные "окна" 0,1 мл ЗФР с гепарином, а в опытные - 0,1 мл раствора аденозина (1,0 мкМ), после чего препарат выдерживали при 37°С 5 минут. По окончании инкубации избыток аденозина удаляли, в "окна" вносили 0,1 мл ЗФР с гепарином 100:1 (спонтанный НСТ) или 0,1 мл раствора конканавалина А (Кон А)в концентрации 200 мкг/мл (стимулированый НСТ) и снова выдерживали стекло во влажной камере в термостате 30 минут. После этого в каждое окно добавляли 0,1 мл 0,2% раствора нитросинего тет-разолия и вновь помещали в термостат на 30 минут. Затем каждое стекло промывали ЗФР, высушивали, фиксировали в 96° этиловом спирте и докрашивали метиленовым зеленым. Просматривали не менее 200 нейтрофилов. Диформазан-позитивными считали клетки с крупными темно-синими гранулами; нейтрофилы с пылевидными отложениями или без включений диформазана считали негативными. Результат выражали в проценте стимулированных клеток, содержащих ди-формазан.

Определение активности миелопероксидазы проводили по методу Лецкого В.Б. (1973) в нашей модификации. Кровь наносили в лунки на предметное стекло и помещали в термостат при температуре 37°С на 25 минут. На каждом предметном стекле находилось по 2 лунки: контрольная и опытная. Через 25 минут стекло промывали ЗФР. Затем в опытную лунку добавляли 0,1 мл аденозина в концентрации 1,0 мкМ, в контрольную - 0,1 мл ЗФР с гепарином, и помещали в термо-

стат на 5 минут. Мазки фиксировали спирт-формалиновой смесью и выдерживали 5-7 минут в инкубационной среде, содержащей 0,4% раствор бензидина на 40% этиловом спирте и 0,006% пероксида водорода. После этого препарат промывали водой, высушивали и докрашивали метиловым зеленым. Подсчитывали 200 полиморфноядерных лейкоцитов, и в каждой клетке оценивали содержание характерных гранулярных включений. Все клетки по степени активности фермента были разделены на 4 группы: 1 группа - отсутствие гранул; 2 группа -имеются единичные гранулы; 3 группа - почти вся клетка заполнена гранулами, имеется лишь несколько свободных участков; 4 группа -вся клетка заполнена гранулами, свободные участки отсутствуют. Затем выводили средний цитохимический коэффициент активности мие-лопероксидазы:

К = (А+Вх2+СхЗ) : 200 где А - количество клеток 2 группы, В - количество клеток 3 группы, С - количество клеток 4 группы.

Определение достоверности различий полученных результатов проводили при большом размере выборки с помощью критерия I Стью-дента, при малой выборке с ненормальным распределением, а также при сравнении попарно связаных вариант - с применением непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни (Лакин Г.Ф., 1990). Расчеты проводили на персональном компьютере с применением пакета прикладных программ '^а^иса". В таблицах указаны среднее арифметическое значение соответствующего параметра и его средняя ошибка (М+ш). На рисунках представлено среднее значение изучаемого показателя.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние аденозина на иммунорегуляторную активность лимфоцитов периферической крови здоровых доноров, больных АБА и ИАБА. Влияние аденозина в концентрации 1 мкМ на ре-гуляторную активность лимфоцитов изучали по изменению уровня включения тест-клетками меченного 3Н-тимидина. Полученные данные выражали в виде индекса регуляции (ИР). Положительные значения ИР оценивали как индекс супрессии (ИС), отрицательные - как индекс активации (ИА).

Индивидуальные показатели для каждого из обследованных лиц представлены на рисунке 1.

о о

8 ° °

о о

о о о о

о о

8 О в О

о = о °

—а

о

—8 о ° о

о о

- 8

9 - о о

о

9

Рисунок 1. Влияние аденозина на регуляторную активность лимфоцитов здоровых доноров, больных АБА и ИАБА. По оси ординат - величина индекса регуляции (%).

Из рисунка видно, что в группе здоровых доноров инкубация им-мунокомпетентных клеток с аденозином обусловливала у 84,4% людей усиление пролиферативного ответа тест-лимфоцитов на ФГА - ИА со-

ставил 27,12+3,86%, а у 15,6% происходило его подавление (ИС = 18,0+2,76%).

В отличие от здоровых доноров, у больных АБА лишь в 40% случаев наблюдалось усиление пролиферативного ответа клеток тест-системы под действием аденозина (ИА составил -15,5+5,42%), а у 60% - его подавление (ИС составил 20,6+3,15%).

В группе больных ИАБА у 54% происходила стимуляция пролиферативного ответа лимфоцитов под влиянием аденозина (ИА составил 32,21+7,72 %) и у 46% - его подавление (ИС составил 21,97+4,93 %).

Таким образом, в результате проведенных исследований было установлено, что добавление аденозина уменьшало супрессорную им-мунорегуляторную активность лимфоцитов крови здоровых людей. Напротив, добавление аденозина к культуре клеток больных АБА и ИАБА не вызывало значимых изменений иммунорегуляторной активности.

2. Влияние аденозина на пролиферативную активность лимфоцитов здоровых доноров и больных бронхиальной астмой. В следующей серии экспериментов мы провели изучение влияния аденозина в концентрациях 0,1 мкМ, 1,0 мкМ и 10,0 мкМ на спонтанную и ФГА-индуцированную пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови здоровых доноров и больных бронхиальной астмой.

При добавлении в культуру клеток здоровых доноров аденозина происходило снижение спонтанной пролиферативной активности лимфоцитов, достигающее статистически значимого уровня при использовании концентрации 0,1 мкМ (рисунок 2).

ЗДОРОВЫЕ БОЛЬНЫЕ АБА БОЛЬНЫЕ И АБА ДОНОРЫ

МКОНТРОЛЬ НАДЕНОЗИН ШАДЕНОЗИН ПАДЕНОЗИН _0.1мкМ_1,0мкМ_Ю.ОмкМ

Рисунок 2. Влияние аденозина на спонтанную пролиферативную активность лимфоцитов здоровых лиц, больных АБА и ИАБА. По оси ординат - количество импульсов за I минуту, по оси абсцисс - группы доноров.

Иные результаты были получены при добавлении аденозина в культуру клеток больных АБА и ИАБА. В этих группах он вызывал достоверное уменьшение включения метки до 314,08+22,82 имп/мин (р<0,05) и 238, 85+27,53 имп/мин (р<0,05) соответственно только в концентрации 10,0 мкМ. Этот эффект был наиболее выражен у больных обеими формами бронхиальной астмы в стадии ремиссии заболевания (345,46+22,05 имп/мин и 156,12+19,85 имп/мин соответственно) и с продолжительностью заболевания 5 лет и больше (258,0+29,17 имп/мин и 206,46+20,14 имп/мин соответственно).

Таким образом, под влиянием аденозина происходило снижение спонтанной пролиферативной активности лимфоцитов как здоровых доноров, так и больных бронхиальной астмой. Но у здоровых людей аденозин проявлял свой эффект в концентрации 0,1 мкМ, а у больных - в концентрации 10,0 мкМ. Такое смещение эффекта в сторону более высоких концентраций аденозина у больных, вероятно, указывает на снижение экспрессии поверхностных А2- рецепторов к нему.

На следующем этапе мы изучили влияние аденозина на пролифе-ративную активность лимфоцитов, стимулированных ФГА. Результаты экспериментов представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Влияние аденозина на ФГА-стимулированную пролиферативную активность лимфоцитов здоровых доноров, больных АБА и ИАБА.

Группы обследованных контроль аденозин 0,1 мкМ аденозин 1,0 мкМ аденозин 10,0 мкМ

Здоровые п= 15 23,76+4,13 17,07+1,88* 17,58+3,01 * 22,70+4,38

Больные АБА п=20 21,20+1,56 21,93+1,64 21,00+1,84 23,95+2,46

Больные ИАБА п=19 22,95+0,71 22,63+1,18 21,38+1,63 21,56+1,59

Примечание: * - р<0,05

Оказалось, что под действием аденозина во всех трех испытанных концентрациях в контрольной группе здоровых людей происходило снижение ИСт, достигающее достоверно значимых величин при действии низких концентраций изучаемого вещества (0,1 мкМ - 1,0 мкМ). 'Из таблицы 1 также видно, что ни одна из концентраций аденозина не оказывала существенного влияния на ФГА-стимулированную пролиферативную активность лимфоцитов больных АБА и ИАБА.

3. Влияние аденозина на активность НАДФ-оксидазы и миелопероксидазы нейтрофильных лейкоцитов периферической крови здоровых доноров и больных бронхиальной астмой. О функциональном состоянии нейтрофильных лейкоцитов судили по их способности восстанавливать нитросиний тетразолий (НСТ-тест -показатель продукции фагоцитами кислородных свободнорадикальных соединений), а также по их миелопероксидазной активности.

В качестве дополнительного стимулятора фагоцитирующих клеток мы избрали Кон А (200 мкг/мл), механизм действия которого, также как и бактериальных клеток, состоит во взаимодействии с внеклеточными участками трансмембранных гликопротеидов (Hand et al., 1989). Поскольку обработка адгезированных клеток Кон А служила для них. по-существу, вторым активирующим фактором, мы предприняли серию экспериментов с целью определить оптимальную продолжительность инкубации, с тем чтобы дополнительная стимуляция не привела к истощению НАДФ-оксидазной системы фагоцитов.

Оказалось, что количество диформазан-позитивных клеток снижалось во всех трех группах после 15 минутной инкубации с Кон А, однако, уже через 30 минут возвращалась к исходному уровню или даже превышало его. Дальнейшее увеличение времени инкубации с Кон А практически не влияло на количество диформазан-позитивных клеток у здоровых доноров и больных атопической формой бронхиальной астмы, однако, в группе больных инфекционно-аллергической бронхиальной астмой активность НАДФ-оксидазы значительно снижалась через 45 и 60 минут от начала эксперимента. Результаты опытов представлены на рисунке 3.

Рисунок 3. Кинетика изменения НАДФ-оксидазной активности ней-трофнльных лейкоцитои здоровых доноров и больных бронхиальной астмой под влиянием их стимуляции Кон А.

По оси абсцисс - время инкубации с Кон А; по оси ординат • % диформазан-гюзитнвных клеток.

Таким образом, проведенные эксперименты показали, что оптимальное время обработки фагоцитирующих клеток Кон А для их стимуляции - 30 минут.

В результате дальнейших экспериментов было установлено, что средние показатели спонтанного НСТ-теста у больных бронхиальной астмой были достоверно выше, чем в контрольной группе (см. таблицу 2). В литературе имеются данные, что повышение процента диформа-зан-положительных клеток свидетельствует о наличии бактериальной инфекции (Маянский А.Н., Пикуза О.И., 1993). В случае АБА в качестве стимулятора вероятно выступает аллерген, вызывающий развитие аллергического воспаления.

Таблица 2.

Влияние аденозина на спонтанную и стимулированную Кон А активность НАДФ-оксидазы у здоровых доноров и больных бронхиальной астмой.

Группы доноров Спонтанный НСТ-тест (%) Кон А-индуцированный НСТ-тест (%)

без аденозина с аденозином без аденозина с аденозином

Здоровые лица п=12 43,83+2,44 61,20+5,81* 54,50+3,50 47,54+3,03

Больные АБА п=30 55,03+3,20 54,20+4,42 53,65+3,22 51,40+3,22

Больные ИАБА п=30 53,70+3,05 45,85+3,21** 50,40+3,75 56,00+3,44

Примечание: * - р < 0,05; ** - р <0,01

Из таблицы 2 видно, что под действием аденозина содержание диформазан-позитивных клеток в препарате крови здоровых людей увеличивалось. Напротив, в группе больных АБА аденозин не оказывал существенного влияния на изучаемый показатель, а у больных ИАБА - продукция активных форм кислорода существенно тормозилась. Разделение пациентов на группы с учетом периода (обострение или ремиссия) и продолжительности заболевания (меньше 5 лет или 5 лет и больше) показало, что у больных АБА и ИАБА в стадии обострения заболевания под действием аденозина происходило достоверное (р<0,01) снижение количества диформазан-положительных клеток с 60,67+7,45% до 41,83+9,48% и с 54,94+3,42% до 45,94+3,27% соответственно, приближая этот показатель к уровню здоровых людей (рисунок 4).

-

ЗДОРОВЫЕ АБА АБА ИАБА ИАБА

ДОНОРЫ ОБОСТРЕНИЕ РЕМИССИЯ ОБОСТРЕНИЕ РЕМИССИЯ

■ КОНТРОЛЬ_ИАДЕНОЗИН 1,0 мкМ

Рисунок 4. Влияние аденозина на активность НАДФ-оксидазы кейтрофилов больных бронхиальной астмой в различные периоды заболевания.

По оси абсцисс - форма и период заболевания; по оси ординат - % диформа-зан-позитивных клеток.

Реакция клеток больных АБА на аденозин практически не зависела от длительности заболевания. У больных ИАБА эффект аденозина был наиболее выражен в группе с продолжительностью заболевания 5 лет и больше (рисунок 5).

% 30

20

10

50

40

60

О

ЗДОРОВЫЕ АБА АБА 5 ЛЕТ И ДОНОРЫ МЕНЬШЕ 5 БОЛЕЕ ЛЕТ

И АБА И АБА 5 ЛЕТ И МЕНЬШЕ 5 БОЛЕЕ ЛЕТ

■ КОНТРОЛЬ

ВАДЕНОЗИН 1,0мкМ

Рисунок 5. Влияние аденозина на активность НАДФ-оксидазы у больных бронхиальной астмой с разной продолжительностью заболевания.

По оси абсцисс - форма и продолжительность заболевания; по оси ординат -% диформазан-позитивных клеток.

Стимуляция клеток Кон А вызывала увеличение образования пе-рекисных соединений лишь в группе здоровых доноров. Аденозин не оказывал влияния на активность НАДФ-оксидазы в клетках, стимулированных Кон А (табл.2).

На следующем этапе мы изучили влияние аденозина на миелопе-роксидазную активность нейтрофильных лейкоцитов периферической крови здоровых доноров и больных бронхиальной астмой. При анализе полученных результатов было установлено, что в контрольной группе здоровых людей миелопероксидазная активность была достоверно выше, чем в группах больных АБА и ИАБА (р<0,05). Под действием аденозина у здоровых доноров происходило снижение активности фер-

мента, у больных АБА и ИАБА отсутствовали ее достоверные изменения.

Таблица 3.

Влияние аденозина на активность миелопероксидазы нейтрофилов здоровых доноров и больных различными формами бронхиальной астмы.

Группы обследованных Коэффициент активности миелопероксидазы

без аденозина с аденозином

Здоровые доноры п=18 2,11+0,03 1,95+0,08*

Больные АБА п=24 1,35+0,14 1,49+0,12

Больные ИАБА п=24 1,85+0,08 1,49+0,18

Примечание: * - р < 0,05 (по сравнению с исходным уровнем

Разделив больных на группы с учетом стадии и продолжительности заболевания, мы установили, что повышение активности миелопероксидазы наиболее выражено у пациентов с АБА при обострении заболевания (0,94±0,34 - исходно и 1,28+0,27 - под действием аденозина) и с давностью заболевания менее 5 лет (1,49+0,21 - исходно и 1,89+0,08 - под действием аденозина). Снижение активности фермента у больных ИАБА наиболее выражено в период ремиссии заболевания (1,86+0,32 - исходно и 1,28+0,47 - под действием аденозина) и у страдающих астмой менее 5 лет (2,03+0,13 - исходно и 1,21+0,32 - при действии аденозина).

При сопоставлении результатов, полученных при изучении влияния аденозина на активность НАДФ-оксидазы и миелопероксидазы фагоцитирующих клеток обращает на себя внимание реципрокный характер выявленных изменений. Так, исходная активность НАДФ-оксидазы нейтрофильных лейкоцитов у больных бронхиальной астмой выше, чем у здоровых лиц, а активность миелопероксидазы у них ниже, чем в

контрольной группе. Под действием аденозина активность НАДФ-оксидазы здоровых доноров возрастает, а активность миелоперокси-дазы снижается. У больных атопической астмой в стадии обострения аденозин вызывает угнетение активности НАДФ-оксидазы, активность миелопероксидазы возрастает. У больных ИАБА, страдающих этим заболеванием 5 лет и более, пуриновый нуклеозид значительно угнетает образование активных форм кислорода, однако, не вызывает торможения активности миелопероксидазы. Складывается впечатление, что изменяя продукцию кислородных свободнорадикальных соединений, которые обладают большой повреждающей способностью, в том числе в отношении собственных тканей, фагоцит тем не менее сохраняет необходимый бактерицидный потенциал за счет модуляции активности другого фермента - миелопероксидазы. В целом эффект аденозина у больных бронхиальной астмой направлен на нормализацию изученных нами показателей функционального состояния нейтрофильных лейкоцитов, приближая их к уровню здоровых людей.

Таким образом, представленные нами данные обосновывают участие пуринергических механизмов в патогенезе бронхиальной астмы и дополняют наши сведения о состоянии активности систем, ответственных за поддержание гомеостаза организма.

выводы

1-Аденозин в концентрации 1,0 мкМ достоверно снижает супрессор-ную активность лимфоцитов здоровых людей, не оказывая влияния на нее у больных АБА и ИАБА.

2.Аденозин в концентрации 0,1 мкМ подавляет спонтанную пролиферацию лимфоцитов здоровых людей, тогда как у больных АБА и ИАБА этот эффект проявляется только в концентрации 10,0 мкМ. Эффект аденозина наиболее выражен у больных АБА в периоде ремиссии заболевания.

3. Аденозин в концентрациях 0,1 мкМ - 1,0 мкМ достоверно подавляет ФГА-индуцированную пролиферацию лимфоцитов здоровых лиц, не оказывая существенного влияния на пролиферацию клеток у больных АБА и ИАБА.

4. Исходная активность НАДФ-оксидазы нейтрофильных лейкоцитов больных АБА и ИАБА достоверно выше, чем у здоровых лиц. При обработке лейкоцитов аденозином активность НАДФ-оксидазы ней-трофилов здоровых доноров достоверно увеличивается, а больных АБА и ИАБА - снижается. Эффект аденозина максимален в группах больных в стадии обострения и с давностью заболевания свыше 5 лет.

5. Активность миелопероксидазы нейтрофилов здоровых доноров выше, чем больных бронхиальной астмой. Активность этого фермента у больных ИАБА выше, чем у больных АБА. Под влиянием аденозина снижается активность миелопероксидазы нейтрофилов здоровых доноров и больных ИАБА (в стадии обострения заболевания) и повышается у больных АБА (в стадии обострения заболевания).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для изучения влияния биологически активных веществ, ката-болизирующихся ферментными системами крови, на функциональную активность нейтрофильных лейкоцитов рекомендуется использовать методику теста в "окне".

2. Оценку влияния биологически активных веществ на функциональную активность нейтрофильных лейкоцитов крови рекомендуется проводить, используя спонтанный и индуцированный НСТ-тест

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Порядин Г.В., Салмаси Ж.М., Гаврилова Н.В., Бусарова Е.А. Влияние ИЛ-2 и интерферонов на функциональную активность иммуноре-гуляторных клеток при бронхиальной астме. / / Тезисы докладов III Российского национального конгресса "Человек и лекарство". -Москва, 1996.-С. 45.

2. Salmasi J.M., Porjadin G.V., Makarkov A.I., Gavrilova E.V. Influence of adenosine and ADP on expression of surface antigens of human T-lymphocytes is connected with stimulation of single type of purine receptors. // Pharmacological Research.-1995.-Vol. 31.-Suppl.-P. 200.