Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Механизмы генетической нестабильности клеток при бронхиальной астме

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ СИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

РГ6 он

На правах рукописи

КОЛСМИЙЦЕВ Андрей Юрьевич

МЕХАНИЗМЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ КЛЕТОК КРОВИ ПРИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ

14.00.16 - «Патологическая физиология»

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандида та медицинских наук

Томск-1994

Работа выполнена на кафедре биологии и генетики МБФ

и кафедре патологической физиологии Сибирского государственного медицинскою университета.

Научные руководители: член-корресп. МАН Высшей школы,

д.б.н., профессор Н.Н.Ильинских; член-корресп. МАН Высшей школы, д.м.н., профессор В.В.Новицкий

Официальные оппоненты: член-корресп. РАМН, д.м.н.,

профессор А.М.Дыгай; д.м.н., профессор Г.П.Гарганеев

Ведущее учреждение: Институт медицинской генетики

ТНЦ СО РАМН.

Защита диссертации состоится « _ » мая 1994 г.

в « _ » часов на заседании Специализированного Учёного

Совета Д 084.28.02 при Сибирском государстве!том медицинском университете (634050, г. Томск, Московский тракт, 2).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Сибирского государственного медицинского университета (г.Томск, пр. Ленина, 107).

Автореферат разослан * ' ь апреля 1994 г.

Учёный секретарь Специализированного Совета, доктор медицинских наук, ,

профессор Т.С.Фёдорова.

ОГ".:Д iCAPAiiTEPnCTIin^ FAEOIII

fcTryr^jsix-CTb прс5лс:и Согласно икеЕакяя данак.:, з

различны:-: регионах Российской рации в средне;,i от 2 до 5Л населения страдает бронхиальной астмой (Чучалил Л. Г. ,1937; Пыцкпй Ей. и соавт. ,1991). При этом считается, что з ка:сс.ч последующем десятилетии эта цифра будет возрастать на 1-2,™ (Чучалин А. Г. , 198?; Адо В. А. и соавт. ,1992). Еолшкстэо исследователей относят бронхпалыг/о астму к числу заболевашй с полигенкнм механизмом наследования: предрасположение к бронхиальной астм? контролируется нескольким! генами, з зовкик-ловенге заболевания определяется ¡гак наследственными факторами, так я факторами Еигглей среды (Адо А. Д. ,1970; Алиев ЕГ. ,1973; Убайдуллаев A.M. и сс-оэт., 1988; Пыший ЕIL и соавт., 1991; Федосеев Г. Е. к соазт. ,1991). Высказывается предположение, что отмечаемый з последние годы стремительный рост числа больных бронхиальной астгай обусловлен всё возрастала.» загрязнен;:?:.? округазвдей среды разнообразна,от мутагенами, что ведёт к накоплению в организме человека генетически аномальных иммунокомпегентных клеток, дефектное функционирование которых обуолэзлпзает появление у генетически предрасположенных'жщ симптомов бронхиальной астмы (Adairs, Knight, 1980).

Цктогенгтичэсккэ исследования лжЗсцитоз периферической крови у больных бронхиальной астмой, проведённые ¡0. Я. Керкисом и ссазт. (1977), позволили установить, что, действительно, при бронхиальной астмэ увеличена частота клеток с хромосог.глымл аберрациями. В то же время, результаты исследования Alvarez, Marvin (1983) свидетельствуют о том, что уровень хромосомных аберраций в генеративной ткани (сяерматогонга) у больных бронхиальной астмой не отличается от нормы. В связи с этим закономерно возникает предположение, что при бронхиальной астме цитогенетически поражены не все ткани организма, а только лимфоидные клетки, и ке исключено, что именно этот дефект з иммунной системе играет ключевую роль з патогенезе основных клинических проявлений данного заболевания. Кроме того, хорошо известно, что цлтогенетические нарушения, возникающие под влиянием мутагенез окрухаидзй среды, очень быстро устраняется

из организма, а длительное сохранение высокого уровня клеток с хромосомными аномалиями обычно связано или с постоянным поступлением в организм кластогенного фактора, или же с дефектом систем, призванных очишать организм от генетически дефектных клеток, в первую очередь - это ДНК-сепаративная и иммунная системы (Ильинских ЕЕ и соавт. ,1986-1993).

Цель работы: изучить особенности цитогенети-ческого статуса клеток крови и определить возможные механизмы нарушения .генетического гомеостаза у больных бронхиальной астмой.

Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:

1. С использованием микроядерного анализа определить уровень цитогенетичэских нарушений в иммунокомпетентных (Т-димфоциты) и неиммунокомпетентных (эритроциты) клетках периферической крови у больных бронхиальной астмой;

2. Изучить активность эксцизионной ДНК-репарации в лим-фоидных клетках крови у больных бронхиальной астмой;

8. Определить особенности иммунологического статуса больных бронхиальной астмой и возможную связь выявленных нарушений иммунитета с изменениями изученных показателей генетического гомеостаза клеток крови;

4 Осуществить исследования, направленные на выявление возможных генотоксических факторов экзогенной и эндогенной природы, циркулирущкх в периферической крови у больных бронхиальной астмой:

а) определить наличие и активность некоторых ферментативных систем в сыворотке крови;

0) изучить особенности воздействия сыворотки больных бронхиальной астмой на активность процессов ДНК-репарации in vif-o;

в) исследовать in vitro действие инфекционных аллергенов на процессы ДНК-репарации в клетках крови;

г) изучить влияние гормонотерапии на цитогенетические и ДНК-репарационные показатели клеток крови;

д) изучить влияние сопутствующей инвазии Opisthorchis Telineus на показатели генетического гомеостаза и

иммунологического статуса.

Научная новизна раСотн Впервые установлено, что одним из неспецифичеких проявлений бронхиальной астмы является синдром генетической нестабильности клеток крови, проявляющийся увеличением числа онтогенетически дефектных иммунокомпетентных (Т-лимфоциты) и неиммунокомпетентных (эритроциты) клеток периферической крови, а также снижением активнбЬти эксцизионной репарации ДНК. Показано тага®, что нестабильность генома клеток крови у больных бронхиальной астмой тесно связана с нарушениями иммунологического статуса организма (снижение общего числа Т-лимфоцитсз, нарушение1 соотношения клеток отдельных их ёубпопуляций, активацией B-звена иммунитета), высоким уровнем лизоссмальных фэрмектоз (катепсин Д) и снижением свободной активности фермента клеточных мембран - 5'-нуклеотидазы в сыворотке крови. Также впервые обоскозано, что в крови больных бронхиальной астмой имеется генотоксический фактор эндогенной природы, о чём свидетельствует способность сыворотки крови больных изменять ДНК-репарационные процессы в культуре клеток здоровых доноров. В специальных исследованиях доказано, что способностью индуцировать (потенцировать) нарушения генетического статуса клеток крови у больных бронхиальной астмой обладают некоторые бактериальные возбудители (Staphyllococcus аигецз и Streptococcus pneumoniae), используемые для лечения больных бронхиальной астмой глхкокортикоидные гормоны (преднизолон, гидрокортизон), а также сопутствующая основному заболеванию описторхозная инвазия.

Теоретическое и практическое значение. Установленный факт генетической нестабильности клеток крови у больных бронхиальной астмой и подученные по итогам настоящего исследования данные о механизмах возникновения цитогенетических И ДНК-репарационных нарушениях вносят новые сведения в существующие представления о патогенезе бронхиальной астмы и могут служить основанием для разработки новых, патогенетически обссксззкнкх подходов к терапии данного заболевания. ИспольауемхЛ в работе метод подсчёта числа Т-молЦоцнтоа с

Уй'.крокдрв5-.ш в периферической крови (-микроядернкй анализ) мозгйт быть рекомендован для использования в клинической лабораторной практике, а результаты его должны учитываться специалистами при определении тактики лечения больных бронхиальной астмой, поскольку многие сопутствующее факторы (инфекция, гормонотерапия и пр.) в процессе лечения больных могут существенно усугубить выявляемый при этом заболевании феномен онтогенетической нестабильности клеток крови и нарушения активности систем поддержания генетического гомеостаза организма. Практический аспект шкет иметь и анализ активности ДНК-репарационных процессов - системы, отвечающую за общую жизнеспособность клеток, устойчивость её генетических структур к различным зкзо- и эндогенно возникавдш повреждавшим воздействиям.

Апробация работы. Ыатериалы диссертационной работы докладывались и обсувдались на 24-ой и 25-ой Всесоюзных научных конференциях "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск, 1986; 1987); на 2-ой межвузовской научной конференции по проблемам генетик:: (Томск, 1587); на Всероссийской научной конференции "Проблемы- аллергических заболеваний" (Казань,1988); на региональной научной конференции "Экспериментальная и клиническая иммунология на Еостоке страны" (Красноярск, 1988); на областной научно-практической конференции "Иммунологическая недостаточность, гсзкякческие и лабораторные методы выявления, иммунокоррекция" (Томск, 1983); на 52-ой итоговой конференции Тбилисского государственного медицинского института- (Тбилиси, 1989); на 27-ой научной конференции высших медицинских учебных заведений Прибалтийских республик и Белорусской ССР (Каунас, 1389); на Всесоюзной конференции молодых у-'ёных "Актуальные проблемы экспериментальной и клинической иммунологии (Шсква, 1389); на VI съезде общества генетиков и селекционеров им. Е И. Вавилова (Шнек, 1992).

Публикация. По материалам диссертации опубликовано 18 работ.

- б -

Объем и структура работы Диссертация состоит из введения обэора литературы (глава 1), описания материала и методов исследования (глава 2), полупенных результатов (глава 3), их обсуждения (глава 4), выводов и списка' литературы.

Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, Содержит 12 таблиц и 6 рисунков. Библиографический указатель включает 213 отечественных ;; 49 иностранных источников.

МАТЕРИАЛ И 53Т0Щ1

2 хсдэ рабстьз сбслэдовэло 4 9 больных бронхиальной астмой (инфекционно-аллергнческая форма) и 29 пациентов с - хроническим бронхитом, обоего пола, в возрасте 27-50 лет, находиваихся на обследовании и лечении в клиниках пропедевтики внутренних болезней Сибирского государственного медицинского университета (зав. кафедрой - профессор Ф. Тетенев).

У каждого из обследованных: больных забирали кровь из пальца для определения количественных показателей периферической крови, изучения гемограммы и подсчёта числа эритроцитов с микроядрами (Бс1пмс1, 1975), а также из локтевой вены - для определения числа ФГА-трансформированных лимфоцитоз с микроядрами (Самойлина ЕЛ-, 1970), определения активности эксцизн-онной ДНК-репарации (Засухина Г. Д. ,1975), иммунологических исследований и биохимического анализа. О состоянии иммунного статуса больных судили по определению общего количества Е-рок (Т-лимфоциты), ЕАС-розеткообразования (В-лимфоциты), абсолютно-, го количества Кон А -индуцированных Т-лимфоцитов хелперов я супрессоров в периферической крови, а также по уровню основных классов иммуноглобулинов в сыворотке крови. Биохимический раздел работы включал определение свободной активности лизосомальных ферментов (катепсин Д и ДНК-аза), фермента клеточных мембран (5'-нуклеотидзэа), а также метод полуколичественной оценки активности пероксидазы в нейтрсфилах периферической .крови. Полученные данные сравнивали с аналогичными показателями у 23-х клинически здоровых добровольцев аналогичного возраста. При анализе полученного

Таблица 1

Распределение групп обследуемых пациентов и лабораторных животных в соответствии с использованным набором методических приёмов

Количество обследуемых пациентов и лабораторных животных

Группы наблюдения Методические приёмы Здоровые доноры Больные бронхиальной астмой Больные хроническим бронхитом Больные атопичес-ким дерматитом Мши "СБА"

1. Изучение цитоге-нетического статуса клеток периферической крови: а. Определение числа эритроцитов с микроядрами 23 49 29 не изучали не изучали

Л Лт1Г(ЛЧЛ»лП11Л чтчir\ w«-> лимфоцитов с микроядрами in vitro 23 49 25 не изучали кэ изучали

в. Определение индекса стимуляции внепланового ■ синтеза ДНК 23 49 29 12 50

2. Изучение показателей иммунореак-тивности 21 41 не изучали не изучали не изучали

3. Изучение показателей периферической крови а. Общий анализ крови 21 45 не изучали не изучали не изучали

б. Активность перок-сидаэы в нейтрофидах 21 37 25 не изучали

4. Биохимический анализ сыворотки крови: а Белковое зеркало 21 : 41 не изучали не изучали не изучали

б. Свободная активность лизосомальных ферментов 12 27

¡в. Свободная активность фермента клеточных мембран 12 21 не изучали не изучали не изучали

фактического материала в отдельные группы обследуемых больных бронхиальной астмой выделяли пациентов с сопутствующим диагнозом описторхоз (26 человек),, а также лиц, получавших гормональную терапию (18 человек).

Е специальных наблюдениях in vitro у больных бронхиальной астшй и у здоровых доноров изучали мутагенный эффект инфекционных аллергенов': Staphyllococcus aureus и Streptococcus pneumoniae, а также генотоксический эффект сыворотки крови обследованных астматических больных и (группа сравнения) пациентов с атопическим дерматитом (12 человек). Для моделирования механизмов генотоксического эффекта Staphyllococcus aureus и Streptococcus pneumoniae в серии экспериментальных исследований, выполненных на БО мышах линии "СБА", проводили изучение внепланового синтеза ДНК в культуре лимфоцитов после добавления стандартной дозы соответствующего аллергена.

- При,обработке полученных данных использовали:

1) критерий Стыодента, для выявления достоверности различий полученных данных по сравнению с контролем;

2) метод ранговой корреляции по Спирмену, для обнаружения корреляционных связей между ДНК-репарационными, иммунологическими, гематологическими и биохимическими показателями периферической крови;

3) дискретно-динамический анализ, являющийся одним из вариантов дисперсионного анализа.

Автор выражает глубокую признательность зав. кафедрой пропедевтики внутренних болезней Сибирского государственного медицинского университета профессору Ф. Ф. Тетеневу за предоставленную возможность выполнения работы в руководимой им клинике, а также сотрудникам кафедры биохимии МЕФ за содействие в проводимых исследованиях.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУВДВЗШ

Авторами ряда работ было установлено, что при изменениях иммунореактивности организма наблюдается повышенный уровень цитогенетических нарушений. Так, в частности, Я Я Керкисом и соаьт. (1977) при исследовании частоты хромосомных мутаций у

больных с аллергическими заболеваниями было показано, что количество клеток с аберрациями хромосом составляет у них в среднем 10,7% при 1,2% в контроле. При этом мутагенный эффект, гак отмечают авторы, наблюдался при действии самых разнообразны:-: аллергенов, как при первичном аллергическом стрессе, так и при ремиссиях.

Результаты проведённого наш! исследования позволили установить, что количество эритроцитов и Т-лимфоцитов с ийроядрами в периферической крови у больных бронхиальной астмой (1,05*0,15%.» и 3,9*0,2%) достоверно превышало их содержание у здоровых доноров (0,2510,07%. и 1,5*0,3%), при этом, однако, практически не отличалось от соответствующих показателей у пациентов с хроническим бронхитом (1,15+0,09%. и 3,3 ±0,4%).

Одной из основных систем, обеспечивавших поддержание генетического гомеостаза и стабильность генетических структур клеток в корме и при патологии, является система ДНК-репарации (Еэстянников В. Д. ,1979; Засухина Г. Д. , 1983). В связи с этим логично предположить, что высокий (превышающий спонтанный) уровень цитогенетических нарушений в клетках периферической крови у больных бронхиальной астмой связан с дефектом работы системы ДНК-репарации. Для выяснения механизмов увеличения числа клеток с 1^:тогекетическжш нарушениями у обследуемых пациентов была изучена активность работы эксцизионкой репарации ДНК путем анализа внепланового синтеза рНК в культуре йГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови.

Как свидетельствуют полученные данные, активность процессов зксцизионной ДНК-репарации в лимфоцитах периферической крови у больных бронхиальной астмой (1,47+0,05 усл. ед.), равным образом как и у пациентов с хроническим бронхитом (1,62+0,11 усл. ед.), оказалась достоверно нгже (в обоих случаях р<0,01) аналогичных значений у здоровых доноров (2,29+0,12 усл. ед.). Следует отметить также, что статистически значимой разницы в величине этого показателя у больных бронхиальной астмой и у пациентов с хроническим бронхитом выявлено не было.

Резюмируя сказанное, можно утверждать, что одним из проявлений бронхиальной астмы является синдром генетической нестабильности клеток крови, проявляющийся увеличением числа

циркулирующее эритроцитов и Т-лимфоцитов с микроядрамн с одновременны!,« снижением активности зксциэионной репарации ДНК в лимфоцитах периферической крови. Выявленные изменения генетического статуса клеток крови кэ язляются специфический признакам! нарушения генетического гомэостаза у больных бронхиальной веткой и в той или иной степени выраженности характерны, по всей видимости, и для других заболеваний бронхоле-гочного аппарата. 00 этом свидетельствуют, з частности, полученные нами данные об уровне клеток с цитогекетическими нарушениями у больных с хроническим бронхитом, а также результаты исследования & а Ярои" акой (1992), показавшей, что цитогене-тические нарушения в ?тках крови у больных раком лёгкого 111-1У стадии обнаруживались в том же количестве, как и у пациентов с хроническими неспецифическим! заболеваниями лёгких.

Известно, что микроядра образуется из ацентрических фрагментов хромосом и даже целых хромосом, которые отстает во время ¡.мтеза клетки на стадии поздней ака- , ранней телефазы (БсЬлЦсЗ, 1975; Папин а В. , Торопцев С.Н., 1983 и др.). В этой связи при интерпретации установленного нами факта увеличения количества эритроцитов с ».¡зкроядрами в периферической крови у больных бронхиальной астмой можно утверждать, что такого рода нарушения в митозе должны происходить еще в клетках центрального звена эритрона на стадии способных к делению ядерных предшественников эритроцитез. Логично предположить также, что выявленная закономерность распространяется и на клетки лимфоидного ряда. Иными словами, есть Есе основания полагать, что определённый процент лимфоидных клеток у больных бронхиальной астмой является генетически неполноценными.

В связи с этим значительней интерес представляют, на наш взгляд, результаты исследования, характеризующие состояние иммунореактивности больных бронхиальной астмой. Полученные нами данные изучения иммунного•статуса больных бронхиальной астмой вносят определённые коррективу в существующие представления по обсуждаемой проблеме. Так, зри анализе содержания клеток отдельных популяций лимфоцитов у больных бронхиальной астмой отмечалось глубокое подавление общего числа Т-лимфоцитов при достоверном увеличении числа л— ли}»^Фсцлтсз (табл. 2).

Таблица 2

Показатели клеточного и гуморального иммунитета у больных бронхиальной астмой и у здоровых доноров, X ± т

Регистрируемый показатель Больные бронхиальной астмой Здоровые доноры

Лимфоциты , .X х10 /л . Т-дамфоциты, 2 Т-хелперы , 2 Т-супрессоры X Б-ши^ющты, X ДИК, оп. ед. пл А , г/л М , г/л 6 , г/л 27,7 + 0,5 *** 1,20 ± 0,04 ** 23»9 ^ 2,9 ^А* 13,9 +2,5 *** 24,9 + 3,5 ** 28,9 ± 4,2 * 78,1 + 0,8 1,50 ± 0,02 * 1,20 ±0,02 * 9,80 +0,04 ** 35.8 1 0,6 2,19 1 0,04 со с л. о л ии, и x ** 39.9 + 1,3 12.1 ± 0,9 17.2 + 1,2 87., 9 + 9,3 1,80 + 0,13 1,40 ± о,ое 13,2 ± 0,7

Примечание : достоверность различий показателей

у больных и здоровых доноров отмечены: * - при р<0,05; ** - При р<0,01; •*** - при р<0,Ю1.

Не исключено, что генетически дефектные Т-лимфоциты не содержат на своей поверхности характерных для зтих клеток антигенов и, соответственно, не могут определяться в стандартных иммунологических реакциях как Т-лимфоциты.

• Обнаруженное нами достоверное увеличение числа Б-лимфоцитов у больных бронхиальной астмой указывает, .по всей видимости, на наличие аутоиммунного компонента в развитии заболевания. В то же время считается, что при аутоиммунных нарушениях увеличивается количество Т-хелперов и уменьшается -число Т-суп-рессороз, что стимулирует аутореактивныг В-Клетки к образованию аутоантител (Лямперт И. М., 1976; Петров Р. В., 1982).

При анализе содержания клеток различных субпопуляций Т-лимфоцитов у больных бронхиальной астмой наш отмечено достоверное снижение Г числа Т-хелперов с одновременной активацией Т-супрессорного звена иммунитета Установленный по итогам настоящего исследования факт достоверного увеличения содержания Т-сулрессоров противоречит данным Д. К. Новикова (1987). Тем не менее, очевидно, "что развитие аллергического статуса сопровождается изменением содериания Т-супрессоров, что

на нал взгляд, можно связать с протекающий в организм? больного процессами аутоиммуниэаши.

Таким образом, выявленный по итогам настоящего исследования • факт резкого увеличения содержания Т-супрессороа на фоне низкого уровня Т-хелперов у больных бронхиальной астмой может быть связан, на наш взгляд, с компенсаторными усилиями организма больных бронхиальной астмой, направленными на блокирование В-звена иммунитета. Ш нашему мнении, в этом процессе немаловажную роль играют мутационные поражения клеток, поскольку, согласно мнению некоторых учёных (Бахтин Б. В. ,1984), мутактно изменённые клетки дифференцируется и пути их специализации зависят от того, какая часть генома клетки псражг яз. Однако, ш кэ исключаем такж возможность того, что используемые методические подходы по определению уровня Т-суярессорсв и Т-хелперов не совершенна Б частности, показатель чувствительности популяций клеток к теуфиллину может существенно меняться у мутантно нзх:енёнкых иммунокомпетентных меток организма.

Существуют косвенные свидетельства участия субпопуляций Т-супрессороз и Т-хелперов в регуляции - выработки подклассоз иммуноглобулинов (¡зГнгака, Adachi,1976; Федосеев Г. Б. и соавт. ,1987). Таким образом, отмеченное нами достоверное снижение содержания иммуноглобулинов А, М, б у больных бронхиальной астмой может быть обусловлено как недостаточным уровнем Т-хелперов,так и угнетающим воздействием повышенного содержания Т-супрессоров. На наш взгляд, эти данные также могут свидетельствовать о наличии генетических дефектов у части популяций клеток 3-системы иммунитета, хотя не исключены и другие объяснения наблюдаемого феномена.

Анализ полученных нами данных позволяет допустить, что в основе предрасположенности возникновению аллергического статуса у больных бронхиальной астмой лежит молекулярный дефект в гексмэ, наследуемый полифакториалыго, к проявлявшийся нарушением количества и способностью к дофференцировке иммукокомпетенткых клеток, а также диссоциацией адаптивных иммунных реакций в постнатальной жизни. Не исключено, что такого рода дефект может быть индуцирован инфекционным агентом,

окагцващш генотсксический эффект кз и.\с.!укокоыпетентнкэ клетки периферической крови больных бронхиальной астмой и, возможно, передающимся с генеративными клетками последующим поколениям. Частота соматического мутирования лнкфэидных клеток создает патологическую ситуацию, предшествующую клинической манифестации бронхиальной астмы. Однако тот факт, что лица - носители иммунологических аберраций остаются клинически здоровыми на протяжении многих лет, подтверждает существование гомео-статических контрольных механизмов, тормозящих образование и деструктивное влияние аутоантител по отношению как к экзогенным аллергенам, циркулирующим в крови больных бронхиальной астмой, так и к ухе ставшим "собственными" антигенам. Часть этих механизмов регулируются нейро-эндокринным путем (Здродоеский П. О. 1981), другие находятся под непосредственным контролем генов (Alen et al. ,1974; Gell, Kelus, 1982;), третьи функционируют по принципу обратной связи (Uhr, Bail-ran, 1931; Rowley, Fitch, 19S4).

Сказанное, на иаа взгляд, едо pas подтверждает важное значение генетических механизмов в возникновении и развитии бронхиальной астмы. Система ДНК-репарации и иммунного надзора тесно связана друг с другом и каругзкиг одной иг цих Еедёт к нарушению деятельности другой, а "поломка" обеих систем' приводит к развитию синдрома нестабильности гекоьа клеток крови (Ильинских К. Н и соавт. ,1984-1993).

Известно, что бронхоспазму предшествует 1.:о™}юе выделение медиаторов и вазоактивных веирств при дегрануляции тучных клеток. Кроме этого в процессах тканевого повреждения активное участие принимают токсические метаболиты кислорода, выделяющиеся при активации эозшофилов in vitro. Так, в частности, пероксидаэа способна ' вызывать дегрануляцию тучных меток (Nathan, Klebanoff, 198°). В связи с этим возникло предположение, что выделяемая нейтрофклами перекись водорода токсически действует на генетический аппарат клеток, индуцируя в последних цитогенетические нарушения. В специальных исследованиях нами, было обнаружено достоверное повышение активности пероксидазы в нейтрофилах периферической крови у больных бронхиальной астмой и хроническим бронхитом tl,70±0,10

и 1,46+0,15, соответственно, при 0,22+0,16 у здоровых лиц (р<0,001 и <0,01)3. Таким образом, не исключено, что повышенное содержание к;елопероксидззы в нейтрофильнкх гранулах клеток периферической крови у больных бронхиальной астмой является

Г^ИРГЛ (ЛТЧП' » ГЧ Г", т 7 * гЛ «-1 •1»ЧЛП"И1 »* ТЧТ^Ч ГЧ"» <-ч ГЧ <ЧЧЖ\4

и ии , оАЛИ} ил \Jliani {¿¿ШСЛ^ах Л-МС X е\±1 И

к возрастанию уровня цитогенетических нарушений и изменениям активности внутриклеточной системы ДНК-репарации.

Под влиянием аллергенов значительно активизируются системы гидролитических фэрментоз лизосом (Срнмель X., Брок И. , 1986). Лизосомальные ферменты, в частности ДНК-аза (Сримель X , Ерок II , 1986), высвобождаемые при распаде лейкоцитов, способны оказывать влияние как ка ахроматиноБые структуры веретена деления, ■ так и на структуру хромосом, приводя к появлении клеток с изменениям; в числе и структуре хромосом. Обладая значительной нуклеазной активностью, они могут скаплжаться вокруг ядер и при некоторых обстоятельствах даке проходить через ядерную ьзмбрану. Результаты исследований О. Е Саблиной, Е КЗ. Рамуль (1974-1978) указывают на весомый вклад лизосомальных гидролаз з индуцирование цитогенетических повреждений.

Проведённое нами биохимическое исследование сыворотки периферической крови у больных бронхиальной астмой выявило наличие свободной активности катепсина Д в сыворотке крови у Сольных бронхиальной астмой при отсутствии её у здоровых доноров. В отличие от катепсина Д, свободная активность ДНК-аз з скзоротке крови не выявлялась '.как у больных бронхиальной астмой, так и у здоровых доноров. Обнаруженная прямо-пропорциональная корреляционная зависимость индекса стимуляции ДКК-репарации со свободной активностью фермента указывает, что

*ТТ>ЕЧ Ш.Т^'ТИГЧ И.1П,»Т,Т1ПЛП1Г т.^ш^ппитп ТТ П^ПТЧП^Л'^^ Г1

V с/'.: .1К1 ЬЬ^^и/^пии аш. ^лпии I« лолспиляа и

повышением активности процессов репарации ДНК Теоретически (хотя и маловероятно) это может быть связано с прямым стимулирующш эффектом катепсина Д на процессы ДНКрепарации. Но, вероятнее всего, наличие свободной активности фермента в сыворотке крови у больных бронхиальной астмой вызывает повышение уровня нарушений структуры ДНК на молекулярном уровне и запускает систему ДНК-репарации, чем, по всей видимости, и

объясняется повышенное включение радиоактивной метки в культуры клеток лимфоцитов Сольных бронхиальной астмой. При этом возрастание свободной активности катепсина Д приводит к еще большему увеличению дефектов в ДНК и, как следствие, к ешэ более выраженной активации ДНК-репарационных процессов.

Значение катепсина Д в развитии патологических процессов связывают, во-первых, с его участием в деструктивных процессах, во-вторых, - с действием катепсина Д как фактора образования медиаторов воспаления (Локшина ДА., Соловьёва Ell, 1987; Маянский Д. Е и соавт. ,1987). Закисление среды при воспалительных процессах способствует активации катепсина д, усилении распада белка, нарушения структуры клеточной мембраны, гидролизу ткани. Катепсин Д является патогенетическим фактором развития ревматоидного артритам миодистрофий,*способствует формированию атероматсзных бляквк, принимает участие в развитии цирроза печени, сахарного диабета, поражения сердечно-сосудистой системы (Панин Я Е., ЬЬянская Е iL ,1987).

Таким образом, обнаруженное по итогам настоящего исследования наличие и многократное превышение свободной активности

TT т^ "i^^i^mi^rt т^чгч«*» t» Л« wi. rv ! НАЛ

naicuuuAci Ä в npußii J C/iMijjnoUL ulÄjnAiicuiStnwn ouiMUii| na

наш взгляд, несомненно связано с важной патогенетической ролью зтого фермента в развитии синдрома генетической нестабильности клеток крови. Высказывается предположение (Убайдуллаев А. Ы. и соавт., 1979), что проницаемость лизосомальных мембран генетически детерминирована. В связи с этим, повреждение лизосомальных мембран и высвобождение лизосомальных энзимов в момент инфекционно-аллергического воздействия является, по нашему мнению, одним из пусковых механизмов аутоиммунных нарушений у больных бронхиальной астмой.

Б последнее время появились работы (Iohansen,1982; Fretschi,1984; Еахтеев Р. Д. и соавт. ,1991), указывавшие на характерные особенности изменения пуринового обмена у больных бронхиальной астмой. Так., ряд исследователей (Ольшанский Г.С., 1984; Волков ET. ,1989 и др.) отмечают повышенное содержание мочевой кислоты в сыворотке крови у больных бронхиальной астмой. Учитывая, что у приматов мочевая кислота является конечным продуктом распада пуриновых нуклеотидов, возможно

предположить, что регистрируемая авторами повышенная концентрация мочевой кислоты в сыворотке крови у больных бронхиальной астмой может быть обусловлена дефектами одной или нескольких ферментативных систем, участвующих в пуриновом обмене. Распад пуриновых нуклеотидов начинается с отщепления фосфатной группы под действием 5*-нуклеотидазы с образованием аденозина (Ленинджер А. Л. ,1985). Проведённое нами биохимическое исследование сыворотки крови у больных бронхиальной астмой позволило' обнаружить снижение содержания фермента 5'-нуклеотидазы по сравнена с уровнем его у здоровых доноров (1,01*0,04 и 2,73±0,37 мкмоль Сн/мин на 1 мг белка, соответственно). Таким образом, южно предположить, что выявленный по итогам настоящего исследования дефицит фермента клеточных мембран 5'-нуклеотидазы у больных бронхиальной астмой приводит к замедлению процессов распада пуриновых нуклеотидов, что в конечном итоге обусловлизае^т" накопление мочевой кислоты в тканях и биологических жидкостях.

Подводя итог. вышесказанному, следует отметить, что ■наруиения генетических структур клеток крови при бронхиальной астме сочетаются с зиеогам уровнем лизосомадьных ферментов (катепсин Л) я снижением свободной активности фермента клеточных мембран 5'-нуклеотидазы в сыворотке крови.

Выявленные изменения биохизгических показателей сыворотки крови у больных бронхиальной астмой сделали возможным предположение о наличии в ней каких-то, пока не известных, фактороз, активно' вмешивавшихся а процессы внутриклеточного гокесстаза. В специально проведённых экспериментах было показано, что экзогенное введение сыворотки больных бронхиальной, астмой в культуру лимфоцитов, полученных от здорозых доноров, от пациентов с бронхиальной астмой, а тага® от больных атоническим дерматитом (группа сравнения), приводило к значительной активации процессов ДНК-репарации (табл.3), что, согласно последним данным экспертов ВОЗ, может служить доказательством наличия в сыворотке больных бронхиальной астмой факторов, повышающих уровень повреждений ДНК и, как следстзие, усиливающих активность процессов ДНК-репарации.

Таблица 3

Активность процессов ДНК-репараций в культуре лимфоцитов периферической крови у здоровых доноров, больных бронхиальной

астмой и атоническим дерматитом при добавлении сыворотки больных бронхиальной астмой, X ± т

Группы больных Индекс стимуляции ДНК-репарационных процессов в культуре лимфоцитов, усл. ед.

До воздействия После добавления сыворотки

больных бронхиальной астмой здоровых доноров больных дерматитом

здороеыэ доноры 2,24*0,13 •а 2,93+0,2 2,03+0,21 2,14+0,16

Больные бронхиальной астмой 1,32+0,08 1,53+0,18 * 2,21+0,35 1,18+0,12

Больные дерматитом 1,08+0,18 ** 2,32+0,15 0,68+0,29 1,21+0,2

Примечание: достоверность различий показателей по сравнении с активностью ДНК-репарации в культуре лимфоцитов до воздействия: *- при р<0,05; **- при р<0,01.

В этиологии и патогенезе бронхиальной астмы важное место занимают особенности природы инфекционного агента, и характера его взаимодействия с организмом "хозяина". Взаимодействие клетки с мутагенным фактором представляет собой весьма сложный процесс, при этом не всегда возможно выделить прямое действие инфекционного фактора на носитель генетической информации - ДНК от их косвенного влияния через реакции клетки. Частое обнаружение высокого уровня антител к стафилококку у пациентов с бронхиальной астмой свидетельствует о возможном его участии в генеге этих заболеваний (Михеева В. А. и соавт. , 1981; Прозоровская К. Н., Басова КН. ,1983).

В свете сказанного определенный интерес представляют, на наз взгляд, полученные нами данные об изменениях, происходящих в культуре клеток больных бронхиальной астмой после добавления

инфекционных аллергенов (Staphillococcus aureus и Streptococcus pneumoniae) в культуру лимфоцитов с повышенной чувствительность» к данному аллергену (табл. 4).

Таблица 4

Активность процессов ДНК-репарации (усл.ед.) в культуре лимфоцитов периферической крови у больных бронхиальной астмой и при добавлении инфекционных аллергенов, X ± ш

Регистрируемый показатель ТТ^ ^ f* i *V ^ jjyj аисдъи стзия После добавления

Staph, sur." Strept. pneura.

>1ндекс стимуляции ДНК-репарации 0,98 ± 0,19 * 2,05 í 0,28 1,49 + 0,27

Примечание: показана достоверность различий показателей по сравнению с культурой лимфоцитов до воздействия инфекционных аллергенов (* - р<0,01).

Этим методическим подходом мы попытались смоделировать приступ бронхиальной астмы или возникновение аллергического статуса in vitro. В результате проведённых экспериментов был выявлен факт стимуляции процессов ДНК-репарации при введении инфекционных аллергенов in vitro, что свидетельствует -> моментальном (время культивирования всего 2 часа) вмепательстве инфекционного агента в генетические механизмы клетки организма "хозяина". Не исключено, что это является провокационным тестом in vitro на выявление уже имеющейся сенсибилизации к аллергену, не обнаруживающейся in vivo. Об этом свидетельствуют, з частности, отрицательные скгркфикационные пробы на соответ-ствуший аллерген. Нельзя отрицать также и опосредованнее действие инфекционных аллергенов на геном клетки "хозяина": реагируя вначале с биохимически важны},ш компонентами клетки, они образуют определённые продукты, которые, взаимодействуя с генетическим' материалом, вызывают мутагенный эффект. Согласно данным Е. В. Гембицкого и Е Г. Алексеева (1985), ведусим звеном в патогенезе бронхиальной астмы является именно .сенсибилизация

организма к различным аллергенам с преимуаэствениой локализацией аллергической реакции в тканях бронхиального дерева. Это положение основано на том, что именно сенсибилизация в определённой мере может приводить к формированию остальных ("вторичных") звеньев патогенеза заболевания.

Анализ результатов описанных выше экспериментов с аллергенами Staphillococous aureus и Streptococcus pneumoniae свидетельствуют о неоднозначности результатов воздействия инфекционных агентов на геном клеток больных бронхиальной астмой. Об этом же свидетельствуют и полученные наш данные на зараженных этими инфекционными агентами мышах. Совершенно очевидно, что сложные процессы, приводящие к возникновению бронхиальной астмы, вряд ли возможно свести только к деятельности инфекционных ' аллергенов, их влиянию на ДНК-репаративныэ процессы и возникновению шпогенетичэски аберрантных клеток; по-видимому, при бронхиальной астме имеет место многофакториалькый комплекс причинно-следственных отклонений, существенное место в котором должно отводиться, на наш взгляд, тем генетическим изменениям, которые, были установлены у больных бронхиальной астмой в настоящей работе.

Е литературе имеется сведения о злиянии зкзогенно вводимых гормонов в индуцирование цитогенетических повреждений. В частности, глюкокортпкоиды могут вызывать мутагенный эффект даже при применении их в терапевтических дозах (Ильинских Н. а , Ыережкнна С. В. , 1991).

При обследовании больных бронхиальной астмой, проходивших курс лечения глюкокортикоидными гормонами (гидрокортизон, преднизолон), нами было обнаружено достоверное повышение, уровня эритроцитов с микроядрами (до 3,44+0,277». при 1,05+0,15%. у пациентов, не принимавших гормоны, и 0,26+0,07%. у здоровых доноров). Как оказалось, эффективность работы системы ДНК-репарации в этой группе пациентов оказалась на 2SZ ниже, чем у больных бронхиальной астмой, ке принимавших гормоны, что указывает на более слабые возможности в восстановлении генетических повреждений и, как следствие, - повышение уровня цитогенетических нарушений. Таким образом, лечение больных бронхиальной астмой глйкокортикокдкыми гормонами (гидрокор-

тизон, преднизолон) приводило к болве выраженным проявлениям синдрома генетической нестабильности клеток, крови, чем у пациентов, ке проходивших курс гормонотерапии.

Как выяснилось в процессе обследования, 26 больных , бронхиальной астмой имели сопутствующий диагноз описторхоз с разным сроком инвазии 0р1зИтогсМз ГеНпеиз, обладающих, как известно, генотоксическим эффектом (Гиновкер А. Г. , Ильинских

H.Н, 1981-1991; Кудрявцев Д. II, 1992).

В связи с вышеизложенным закономерно возник вопрос: имеются ли различия в уровне цитогенетических, ДНК-репарационных и прочих изменений у больных бронхиальной астмой, сочетанной с описторхозом, по сравнению с "чистыми астматиками". Проведенный анализ количества эритроцитов с микроядрами выявил достоверное увеличение уровня цитогенетических нарушений в группе больных с сопутствующим описторхозом (до 1,80 ± 0,41%» при 1,05 ± 0,15%. у пациентов без описторхоза), что подтверждает имеющиеся данные литературы.

При изучении эффективности работы системы ДНК-репарации в лимфоцитах периферической крови у больных бронхиальной астмой отмечено достоверное повышение активности репарационных процессов з группе пациентов с сопутствующим описторхозом при достоверном снижении величины этого показателя по сравнению с аналогичными значениями у здоровых докеров (1,8^0,1 усл. ед. при

I,2+0,1 усл. ед. у больных без описторхоза и 2,3+0,1 усл. ед. в группе здоровых доноров). Отсюда, можно заключить, что описторхозная инвазия оказывает стимулирующий эффект на

• активность процессов репарации ДНК у больных бронхиальной астмой.

Таким образом, несмотря на высокую активность внутриклеточной системы ДНК-репарации, количество клеток с циТогенетическими нарушениями у больных бронхиальной астмой с сопутствующей описторхозной инвазией превышало их содержание( у пациентов, не страдающих описторхозом. Тагам образом, стимуляция процессов ДНК-репарации при описторхозной инвазии, отмеченная впервые в исследованиях Д. П. Кудрявцева и соавт. , (1992), также имеет место и у больных бронхиальной астмой с сопутствующим описторхозом. По видимому, эндотоксины,

высвобождаемые при описторхоэной инвазии у больных бронхиальной астмой, способны вызывать нарупенил структуры ДНК. что опосредованно активирует внутриклеточную систему ДНК-репарации.

Известно, что некоторые инфекционные факторы способны усиливать выработку клетками организма интерферона - активного стимулятора процессов ДНК-репарации (Засухина Г. Д. и соавт. , 1373). Кэ исключено, что именно этот механизм способствует активации процессов ДНК-репарации у страдающих описторхоэом больных бронхиальной астмой.

Одновременно с цитогенетическими и ДНК-репарационными изменениями - в группе больных бронхиальной астмой с сопутствующим описторхозом оказалась достоверно снижена концентрация "Г'табуликов и повье;йко содержание альбуминов в сыворотке крови, чтоможно объяснить возможным участием белковых фракций в переносе пока не известных генотоксических факторов, присутствующих в крови у обследованных больных.

ВЫВОДЫ:

1. Одним • из неспецифичееких проявлений бронхиальной астмы является синдром генетической нестабильности клеток крови, проявляющийся увеличением числа циркулирующих эритроцитов и Т-лимфоцитов с микроядрами, а также угнетением процессов эксци-зионной ДНК-репарации.

2. Нестабильность генома в клетках крови у больных бронхиальной астмой сочетается с существенными изменениями иммунологического статуса организма, преявлягощшлися снижением обш,его числа Т-лимфоцитов, нарушением соотношения клеток отдельных их

Гк'тЛгтгл^т^г ит»»'* п т^«лгч«ят»угг»л.Л Т5— «-Vпли?! Л л т т_1 т тт /"V ™

и^ииОи) сл х оЛлуз /иэаЦпУи П одспа лМт/ гшх с ж о.

3. Повышенное число цитогенетически изменённых клеток у больных бронхиальной астмой сочетается с высоким уровнем лизосомальных ферментов (катепсин Д) . и снижением свободной активности фермента клеточных мембран - 5*-нуклеотидазы в сыворотке крови.

4 Сыворотка крови больных бронхиальной астмой обладает генотоксическим эффектом и вызывает активацию процессов эксцизионной репарации ДНК в культуре ФГА-стимулированных лимфоцитов.

5. Лечение больных бронхиальной астмой глюкокортикоидными гормонами (гидрокортизон, преднизолон) приводит к более выраженным проявлениям синдрома генетической нестабильности клеток крови, чем у пациентов, не проходивших курс гормонотерапии.

6. Езедекие инфекционных аллергенов Staphillococcus aureus и Streptococcus pneumoniae активирует процессы эксцизионной ДНК-репарация в культуре Т-лимфоцитов полученных от больных

' бронхиальной астмой.

7. У больных бронхиальной астмой с сопутствующей описторхоэной инвазией повышается уровень эксцизионной ДНК-репарации с одновременным возрастанием числа цитогенетически изменённых клеток периферической крови.

8. Нарушения ■ активности системы ДНК-репарации в лимфоцитах периферической крови у больных бронхиальной астмой характеризуются наличием причинно-следственных связей с изменениями количественных показателей периферической крови и содержанием отдельных субпопуляций лимфоцитов.

Список статей опуОлнкаванньк по те;« диссертация] п ю Л работы:

1. Анализ генетических структур клеток и иммунореактивности у больных бронхиальной астмой /Коломийцев А. Ю., Ильинских Н. Е , Осипова Л. R //Проблемы аллергических заболеваний: Тез. док. Всерос. науч. конф, -Казань.-1988.-С. 26.

2. Цитогенетический, ДНК-репарационный и иммунологический анализ клеток больных бронхиальной астмой /Коломийцев

A. ¡й , Белков Б. Т., Осипова JL R //Экспериментальная и клиническая иммунология на Востоке страны: Тез. докл. Есесовз. науч. кокф. -Красноярск. -1988. -С. 57.

3. Дитогенетический гомеостаз и иммунитет у больных бронхиальной астмой /Коломийцев А. Ю., Ильинских Е Е , Волков

B. Т. //Иммунологическая недостаточность, клинические и лабораторные методы выявления, иммунокоррекция: Тез. докл. обл. науч.-практ. конф. -Томск. -1988. -С. 25.

•4. Анализ генетических структур лимфоцитов периферической крови у больных бронхиальной астмой и ХНЗЛ /Коломийцев А. Ю., Волков Е Т., Ильинских Е Е //52-я итоговая студенческая конференция Тбилисского гос. мед. института: Тез. докл. -Тбилиси. -1989. -С. 37

5. Некоторые результаты мониторинга иммунного статуса у больных бронхиальной астмой /Коломийцев А. Ю, , Ильинских Е Е //41-я итоговая студенческая конференция Каунасского мед. института: Тез. докл. -Каунас-Д. -1989. -С. 42.

6. Изучение генетических нарушений у больных с изменениями

Вг\чжг\т л\ try 1илirmtfWAma /Т?г\ А 1П t /СО» г» «гЛ»» гт

wfxuxCM«? iirtimjпиicid f в n< лл / / uu n ллиплсапслл

научная конференция ÔHO ТМИ: Тез. докл. -Томск. -1991. -С. 24.

7. The cytogenetical, DNA-repai rational and immunological analysis of the cells of patients with bronchial âsthrra /Kolcmiytsev A. Yu. , Ilyinskihk N.N. //8-th International Congress of Human Genetics. -Washington Convention Center. -1991. -P. 741.

8. Study of genome nonstability and imunoreactivity of patients with bronchial asthma //1-st International conference on environmental mutagenesis in Human populations at risk. -Cairo. -Egypt. -1992. -P. 1261.

9. Цитогенетические, ДНК-репарационные и иммунологические

изменения в клетках больных бронхиальной астмой /Коло-мийцев А. а , Ильинских Н. Н. , Волков В. Т. // Зкоген: Сб. кр. науч. сообщ. при ТМЛ -Томск. -1992. -N1. -р. 1.4.3.

10. Цитогенетические и иммунологические нарушения в клетках периферической крови у больных полными заболеваниями /Коломийцев А. Л , Ильинских Н. Е , Аксёнов В. С., Коровин ЕЕ. //Зкоген: Сб. кр. науч. сообц. при СГМУ. -Томск. -1992. -N2. -р. 2.4.1.

11. Особенности цитогенетических, иммунологических и биохимических изменения в периферической крови у больных бронхиальной астмой /Коломийцев А. Ю, , Ильинских Н. Е, Волков Б. Т. //3-й Национальный конгресс по болезням органов дыхания: Тез. докл. -Санкт-Петербург. -1992.-С. 340.

12. Состояние систем гомеостаза при наблюдаемой цитогенети-ческой нестабильности у больных с бронхо-лёгочной патологией /Коломийцев A. KL, Ильинских Е Н., Новицкий В. В. //Зкоген: Сб. кр. науч. сооби^ при СГМУ. -Томск. -1993.-Na -С. 9.

13. Биохимическое исследование сыворотки крови в связи с наблюдаемой цитогенетической нестабильностью у больных бронхиальной астмой /Коломийцев А. Ю., Новицкий В. R , Рабинович Д. Л , Суханова Г. А- //Зкоген: Сб. кр. науч. сооби, при СГМУ. -Томск. -1993. -N3. -С. .12

14. Состояние системы гомеостаза при наблюдаемой цитогенетической нестабильности у больных бронхиальной астмой (БА), сочетанной с описгорхозом /Коломийцев А. Ю., Илыш-ских К. Е , Возицкий К В. //Актуальные вопросы гастроэнтерологии: Материалы конференции /Под. ред. Э. И. Еелобо-родовой. Томск: Изд—во Tci»í. ул*~Тс1 "IS S3» ~ С» S5»

15. Генетический полиморфизм групп крови система ABO и бронхиальная астма /Еолков Е Т. .Титова Е Е .Коломийцев А. И.

//Зкогек: Сб. кр. науч. сообп, при СГ35У. -Томск. -1394. -N4. -С. 46.

15. Генотоксический эффект сыворотки крови у больны;': бронхиальной астмой (ЕА) з эксперименте in - vitro /Коломийцев А. Ю. , /jJibHKCKi'X Н. К. , Ъо2И1|кнй В. В. //Зкогек: Сб. кр. кауч. сообц. при СИУ. -Томск. -1994. -!!4. -С. 51.

17. Клннико-гекеалогический анализ аминокислотного пула у больных бронхиальной астмой и у блпжайсих родственников /Еолков В. Т. , Коломийцев А. ¡0. //Зкоген: Сб. кр. науч.

. СООбп. при СГШ'. -ТОМСК. -1994. -N4. -С. 43.

18. Особенности воздействия гормональны:-: препаратов на цито-гекетический аппарат клеток у больных бронхиальной астмой /Коломийцев А. Ю. , ЕВ. Новицкий, Н. Н. Ильинских //Зкоген: Сб. кр. науч. сообщ. при СГМУ. -Томск. -1994. -N4. -С. 17.