Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Участие пуриновых соединений в процессах иммунорегуляции при атопической бронхиальной астме

РГ Б ОД 2 2 АПР 1996

На правах рукописи УДК 616.248-085.217.5.547.857.4

МАКАРКОВ Александр Иванович

УЧАСТИЕ ПУРИНОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ В ПРОЦЕССАХ ИММУНОРЕГУЛЯЦИИ ПРИ АТОПИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ

(14.00.36 - Аллергология и иммунология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА - 1996

Работа выполнена на кафедре патологической физиологии Российского государственного медицинского университета.

Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор Г.В. Порядин.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор H.A. Константинова доктор медицинских наук, профессор И.В.Петрова

Ведущее учреждение - Государственный научный центр РФ - Институт иммунологии

Защита диссертации состоится " ... " ................1996 г. в " ... " часов на заседании специализированного совета Д 084. 14. 06 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117869, г. Москва, ул. Островитянова, 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГМУ

Автореферат разослан " ... "................1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук,

доцент Т.Е. Кузнецова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Уникальность пуриновых соединений в биологическом смысле связана с тем, что они представляют собой компоненты, необходимые для реализации столь важных для всех живых систем процессов, как преобразование энергии и самовоспроизведение. Соединения аденозина присутствуют в клетках всех типов -животных, растительных, бактериальных. Филогенетическая древность пуриновых соединений объясняет их чрезвычайно широкое участие в различных биохимических процессах и регуляторных реакциях. Они способны влиять на функциональную активность клеток нервной, эндокринной, сердечно-сосудистой, дыхательной, выделительной и других систем (Елисеев В.В., Полтавченко Г.М., 1991; Сергеев П.В., Шима-новский H.JI., 1987; Федоров H.A. с соавт., 1990).

Пристальное внимание иммунологов во всем мире было привлечено к изучению иммунотропных эффектов аденозина и его метаболитов после публикации сведений о том, что нарушение обмена пуриновых соединений может приводить к тяжелым поражениям иммунной системы (Дмитренко Н.П., 1984, 1987; Bagasra et al., 1992; Parkman, Gelfand, 1991; Stephai et al., 1993; Peeters et al., 1993; Weinberg et al., 1993).

Следует отметить, что при этих ферментопатиях в плазме крови больных создаются чрезвычайно высокие концентрации аденозина и его метаболитов, в том числе обладающих иммунотоксическим действием (Дмитренко Н.П., 1984, 1987, 1990; Дмитренко Н.П. с соавт., 1982; Fischer, 1992; Hirschhorn, 1990). Между тем, большой интерес представляет изучение эффектов, вызываемых более низкими, близкими к физиологической, концентрациями аденозина и адениновых нуклеотидов, и связанных со стимуляцией пуриновых рецепторов лимфоцитов. Важно, что именно "рецепторные" эффекты пуриновых соединений участвуют в текущей адаптации организма к изменению дви-

гательного режима, перегреванию, умеренной гипоксии или незначительным травмам и т.д.

Более четверти века назад были опубликованы первые работы (Йошпа Л.Л., 1967, 1968), в которых сообщалось о нарушениях обмена макроэргических пуриновых соединений при бронхиальной астме, выражавшихся в снижении содержания АТФ и нарастании концентрации АДФ, АМФ и аденозина в крови этих больных. Позднее это наблюдение было подтверждено другими исследователями (Джавахишвили Д.Н., 1978; Квашина Т.Л., 1979; Юрков Ю.А. с соавт., 1971, 1976; Church, Holgate, 1986; Mateos et al., 1989)! Первоначально эти изменения объясняли гипоксией, развивающейся во время приступа бронхиальной астмы. Однако оказалось, что усиленный катаболизм макроэргических пуриновых соединений сохранялся и в периоде клинической ремиссии, хотя и был менее выражен (Квашина Т.Л., 1979; Харитонова A.B., Квашина Т.Л., 1976; Юрков Ю.А. с соавт., 1976). Сходные сдвиги в обмене пуриновых соединений были выявлены также у больных экземой (Юрков Ю.А. с соавт., 1971), ревматизмом и системными заболеваниями соединительной ткани (Гвелесиани К.Т. с соавт., 1972), т.е. при болезнях, не сопровождающихся нарушениями вентиляции легких. Все это позволило предположить, что изменение пури-нового обмена при аллергических и аутоиммунных заболеваниях сопровождает перестройку иммунной системы у этих больных. Экспериментально показано нарушение баланса внеклеточных пуриновых рецепторов на лимфоцитах больных бронхиальной астмой (Белоусов Ю.Б. с соавт., 1992а,б; Сергеев П.В. с соавт., 1991).

В связи с этим, представляло большой интерес исследовать возможное участие пуриновых соединений в модуляции иммунных реакций у больных атопической бронхиальной астмой (АБА).

Целью настоящей работы явилось изучение роли пуриновых соединений в регуляции экспрессии поверхностных антигенов и про-

лиферативной активности лимфоцитов периферической крови здоровых людей и больных атопической формой бронхиальной астмы.

Задачи исследования. Реализация поставленной цели предусматривала решение следующих конкретных задач:

1. Провести сравнительное изучение моноклональных антител серий JIT и ИКО для определения особенностей экспрессии поверхностных антигенов лимфоцитами периферической крови больных атопической формой бронхиальной астмы.

2. Изучить влияние аденозина и аденозиндифосфорной кислоты (АДФ) in vitro на экспрессию важнейших мембранных маркеров Т-лимфоцитов (CD3-, CD4- и С08-антигенов) здоровых доноров в условиях кратковременной и продолжительной инкубаций.

3. Исследовать рецепторные механизмы влияния пуринергических агонистов, использованных в концентрациях, близких к физиологическим, на экспрессию поверхностных антигенов Т-лимфоцитов.

4. Изучить влияние аденозина in vitro на экспрессию CD3- CD4- и С08-антигенов лимфоцитами периферической крови больных АБА в условиях кратковременной и продолжительной инкубаций с учетом периода заболевания и его продолжительности.

5. Исследовать влияние пуриновых соединений на спонтанное включение 3Н-тимидина и митоген-индуцированную пролиферативную активность лимфоцитов здоровых доноров и больных АБА.

Научная новизна исследований. В результате проведенных исследований существующие представления о модулирующем эффекте аденозина на экспрессию поверхностных антигенов лимфоцитами здоровых людей были дополнены сведениями о зависимости наблюдаемого феномена от концентрации нуклеозида. Впервые было исследовано влияние различных концентраций АДФ на экспрессию поверхностных антигенов лимфоцитами здоровых людей.

Впервые изучен рецепторный механизм влияния АДФ на экспрессию поверхностных антигенов Т-лимфоцитов здоровых людей.

Впервые показана измененная реакция лимфоцитов периферической крови больных АБА на их обработку аденозином. Установлена зависимость характера модулирующего действия аденозина на антигенный профиль мембраны лимфоцитов больных АБА от продолжительности заболевания.

Впервые исследовано влияние продолжительной инкубации с аденозином на экспрессию поверхностных антигенов лимфоцитами здоровых людей и больных АБА. Проанализирована связь наблюдаемых изменений структуры цитоплазматической мембраны иммунорегулятор-ных клеток с их функциональной активностью.

Практическая значимость работы. Сравнительное изучение количества CD3+-, CD4+- и С08+-лимфоцитов периферической крови, выявляемых с помощью двух серий моноклональных антител, позволило обнаружить характерное снижение экспрессии С08-антигена, выявляемое с помощью антител JIT, но не ИКО, у больных АБА.

Обнаруженное различие в реакции иммунорегуляторных клеток здоровых доноров и больных АБА на адениновые соединения позволило углубить существующие представления как о патогенезе иммунологической дисрегуляции при АБА, так и о механизмах адаптации организма больного к этому состоянию.

Выявленные при изучении пуриновых соединений общие закономерности процесса модуляции экспрессии поверхностных антигенов лимфоцитами in vitro могут быть использованы при разработке протокола исследования иммунотропной активности других биологически активных веществ.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на 1 Международном конгрессе по иммунореабилитации (г. Сочи, 1994), 5 Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (г. Москва,

1995), 1 Европейском конгрессе по фармакологии (Milan, Italia, 1995), на научных конференциях кафедры патофизиологии РГМУ. По материалам диссертации опубликованы 4 печатные работы.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 105 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения и выводов. Работа-иллюстрирована 12 таблицами и 5 рисунками. Указатель литературы включает 202 названия (отечественных - 61, зарубежных - 141).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Объектом исследования служили лимфоциты периферической крови 49 практически здоровых людей (24 мужчины и 25 женщин) и 54 больных АБА (32 мужчины и 22 женщины). Структура группы больных АБА была следующей: 37 пациентов находились в периоде ремиссии, у 17 наблюдалось обострение заболевания. 17 человек страдали астмой 1 год или менее, 12 человек - более 1 года, но меньше 5 лет, и 25 пациентов имели "стаж" заболевания 5 и более лет. При обследовании у 11 больных выявлена сенсибилизация к пыльце растений, у 34 - к аллергенам домашней пыли, у 9 человек отмечалась непереносимость как бытовых, так и пыльцевых аллергенов.

Подбор больных осуществляли на базе стационара Института иммунологии МЗМП РФ. Забор крови у всех пациентов проводили в день поступления в стационар, до назначения внутривенных вливаний эу-филлина или начала курса специфической иммунотерапии, утром, натощак.

Лимфоциты выделяли центрифугированием в одноступенчатом градиенте плотности по методу Воуит (1968).

Для оценки исходной экспрессии поверхностных антигенов лимфоцитами периферической крови использовали взвесь клеток в забу-ференном фосфатами физиологическом растворе (ЗФР). При изучении влияния исследуемых веществ на поверхностный фенотип лимфоцитов клетки инкубировали с приготовленными на культуральной среде растворами аденозина (0,01; 0,1; 1,0 и 10,0 мкМ) или АДФ (0,1; 1,0 и 10,0 мкМ) в течение 30 минут или с раствором аденозина 1,0 мкМ в течение 16 часов при температуре 37°С. После инкубации клетки дважды отмывали ЗФР при температуре 4°С. Конечная концентрация клеток во взвеси составляла во всех экспериментах 2,5 млн/мл.

Реакцию проводили в микроварианте на стекле с лунками из пленки "РагаШт". В каждую лунку вносили по 0,01 мл раствора поли-Ьлизина и выдерживали 30 минут при 37°С. Все инкубации проводили во влажной камере. По истечении времени капли поли-Ь-лизина удаляли, а затем в каждую лунку вносили по 0,01 мл исследуемой взвеси лимфоцитов, и препарат также выдерживали в термостате в течение 30 минут. Затем избыток клеток удаляли, а стекло промывали с ЗФР, после чего в лунки вносили по 0,004 мл раствора соответствующих моноклональных антител. Препарат выдерживали в течение 30 мин при 4°С, затем снова промывали ЗФР и вносили в лунки по 0,004 мл рабочего раствора РаЬ-фрагментов антимышиных антител, меченых изотиоцианатом флюоресцеина. Выдерживали 30 мин при 4°С, промывали ЗФР, излишки жидкости удаляли. В лунки вносили по 0,02 мл забуференного фосфатами раствора глицерина. Препарат микроскопи-ровали в водной иммерсионной системе с использованием люминесцентного микроскопа "Люмам ИЗ". Оценивали наличие и специфичность флюоресценции (по критериям Фримель Г., 1987) не менее чем у 200 клеток. Клетки с морфологией моноцитов не учитывали. В каждом опыте проводили контроль жизнеспособности клеток с трипановым синим (не менее 95%) и неспецифического связывания меченой сыворотки (не более 4%). Процент клеток, неспецифически связавших меченые антитела, учитывали при оценке результатов опыта.

Для постановки спонтанной и стимулированной ФГА РБТЛ использовали взвесь лимфоцитов в культуральной среде с конечной концентрацией клеток 5х105 в мл. Реакцию ставили в стерильных микропланшетах с 11-образными лунками. Все тесты проводили в триплете.

Для оценки ФГА-индуцированной пролиферации в соответствующие лунки добавляли ФГА в субоптимальной концентрации (1мкг/мл). Влияние аденозина на спонтанную и индуцированную ми-тогеном пролиферацию исследовали, добавляя его в соответствующие

лунки в концентрациях 10,0; 1,0 или 0,1 мкМ. Далее микропланшет инкубировали в С02-инкубаторе в течение 72 часов при температуре 37°С. За четыре часа до окончания культивирования во все лунки вносили по 0,02 мл 3Н-тимидина (0,01 мкКи). По завершении инкубации содержимое каждой лунки переносили на стекловолоконные микропористые фильтры и промывали дистиллированной водой. Пролиферацию лимфоцитов оценивали по включению меченого 3Н-тимидина, выражаемому в импульсах в мин. Влияние ФГА на пролиферативную активность лимфоцитов оценивали по величине индекса стимуляции (ИС), который подсчитывали следующим образом:

кол-во имп/мин в культурах с ФГА

ИС=-

кол-во имп/мин в культурах без ФГА

Влияние аденозина на спонтанную или ФГА-индуцированную пролиферацию оценивали по величине индекса влияния - ИВ (ИВсп или ИВфрд), который вычисляли по формуле:

кол-во имп/мин в культурах с аденозином

ИВ=-

кол-во имп/мин в культурах без аденозина

Определение достоверности различий полученных результатов проводили при большой выборке с помощью критерия I Стьюдента, при малой выборке с ненормальным распределением, а также при сравнении попарно связанных вариант - с применением непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни (Лакин Г.Ф., 1990). Расчеты проводили на персональном компьютере с применением пакета прикладных программ '^а^Кса". В таблицах указаны среднее арифметическое значение соответствующего параметра и его средняя ошибка (М+т). На рисунках представлено среднее значение изучаемого показателя.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Сравнительное изучение моноклональных антител серий JIT и ИКО к поверхностным антигенам лимфоцитов (CD3,

CD4 и CD8). На первом этапе работы нами было проведено сравнительное изучение двух наиболее часто используемых отечественными иммунологами разновидностей моноклональных антител, ЛТ (Институт иммунологии МЗМП РФ) и ИКО (ТОО"Диагнотех"), с целью определить возможность их использования для выявления количественных нарушений баланса иммунорегуляторных клеток у больных АБА, а также для исследования модификации антигенного профиля мембраны лимфоцита после различных фармакологических воздействий.

Как видно из рисунка 1, количество СОЗ+-лимфоцитов, определяемых с антителами серии ЛТ составило 60,21+3,29 в группе здоровых доноров и 58,98+2,01 % у больных АБА (р>0,05), а с антителами ИКО - 68,58+1,36% для здоровых лиц и 69,52+1,18% для больных АБА (р>0,05).

Средняя величина экспрессии С04-антигена, выявляемого с помощью антител ЛТ, оказалась существенно ниже, чем для антител ИКО, как среди здоровых лиц, так и при АБА, причем анализ выборок показал, что при использовании антител ЛТ минимальная варианта в ней значительно меньше (18,6%), чем при применении антител ИКО (35,2%), хотя максимальные варианты практически не различаются. Это наблюдение, по нашему мнению, может объясняться связыванием антител ЛТ с труднодоступным эпитопом С04-молекулы.

Количество С08+-клеток, выявляемых с помощью антител ИКО у больных АБА составило 27,34+0,99%, а в контрольной группе практически здоровых людей - 25,91 + 1,18% (р>0,05). Напротив, использование антител ЛТ позволило показать достоверное (р<0,05) снижение количества СЭ8+-лимфоцитов при АБА до 20,80+1,12% (в контрольной группе - 25,82+1,85%).

А

Б

70 60 % 50 40302010 0

70- 1 Г"

60

% 50-

40-

30-

20-

10-

0-

СОЗ+ СБ4+ С08+

IЛТ ЕИКО

СОЗ+ С04+ С08+

1ЛТ ЕШКО

Рисунок 1. Количество СОЗ+-, С04+- и С08+-лимфоцитов периферической крови здоровых людей (А) и больных АБА (Б), выявляемых с помощью моноклональных антител ЛТ и ИКО. По оси ординат -% клеток, экспрессирующих соответствующий антиген, по оси абсцисс - антигенный маркер.

В результате этих экспериментов мы пришли к выводу, что моно-клональные антитела серии ИКО более полно, чем антитела ЛТ, отражают выраженность мембранно-ассоциированного пула соответствующих белковых молекул. Поэтому во всех последующих экспериментах мы использовали антитела ИКО.

2. Влияние аденозина и АДФ на экспрессию поверхностных антигенов лимфоцитами здоровых людей в условиях кратковременной и продолжительной инкубации. Аденозин в концентрациях 0,1 мкМ и выше оказывает выраженное модулирующее влияние на экспрессию мембранных CD4- и С08-антигенов.

Таблица 1

Влияние аденозина на экспрессию поверхностных антигенов лимфоцитами здоровых людей in vitro в условиях кратковременной инку-

бации.

Маркер Контроль Концентрация аденозина, мкМ

0,01 0,1 1,0 10,0

CD3,% 69,71 + 1,15 71,02+2,06 67,43+1,60 68,66+1,48 68,33+1,59

CD4,% 44,24+0,73 43,05+1,63 34,91 + 1,49 р<0,01 35,57+1,55 р<0,01 35,41+1,85 р<0,01

CD8.% 25,95+1,32 25,53+2,67 32,65+1,83 р<0,05 33,53+2,23 р<0,05 30,55+1,51 р<0,05

ИРИ 1,78+0,10 1,79+0,22 1,09+0,08 р<0,01 1,14+0,12 р<0,01 1,20+0,10 р<0,01

Примечание: р - отражает достоверность различия с контролем

Как видно из таблицы 1, обработка клеточной взвеси аденозином в концентрациях 0,1; 1,0 и 10,0 мкМ приводила к заметному снижению количества клеток, несущих С04-антиген. Напротив, количество CD8+ клеток при обработке аденозином в тех же дозах увеличивалось, в среднем, на 6%. Указанные сдвиги в экспрессии дифференцировоч-ных антигенов лимфоцитами вели к статистически значимому изменению величины иммунорегуляторного индекса (ИРИ - соотношение CD4/CD8), являющегося высокочувствительным индикатором характера иммунорегуляторной активности лимфоцитов.

Другое пуриновое соединение, АДФ, поступает во внеклеточное пространство из тех же источников, что и аденозин, кроме того оно является метаболическим предшественником аденозина в реакции, катализируемой лимфоцитарной 5'-нуклеотидазой (Дмитренко Н.П. с со-авт., 1985; Lüthje, 1989). В связи с этим, мы провели изучение влияния различных концентраций АДФ на экспрессию дифференцировоч-ных антигенов лимфоцитами.

Таблица 2

Влияние АДФ на экспрессию поверхностных антигенов лимфоцитами здоровых людей in vitro в условиях кратковременной инкубации.

Маркер Контроль Концентрация АДФ, мкМ

0,1 1,0 10,0

CD3,% 69,71 + 1,15 68,03+1,11 68,99+1,10 68,20+1,09

CD4,% 44,24+0,73 44,13+1,01 40,13+1,54 р<0,05 36,93+1,38 р<0,01

CD8,% 25,95+1,32 29,47+2,36 31,72+2,00 р<0,05 30,79+1,65 р<0,05

ИРИ 1,78+0,10 1,60+0,13 1,43+1,10 р<0,05 1,37+0,12 р<0,05

Примечание: р - отражает достоверность различия с контролем

Как видно из таблицы 2, АДФ оказывает сходное с аденозином модулирующее влияние на поверхностный фенотип лимфоцитов периферической крови здоровых людей. Однако для реализации этого эффекта требовалась на порядок более высокая концентрация вещества.

Блокатор внеклеточных пуриновых рецепторов теофиллин сам по себе не влиял на экспрессию основных поверхностных антигенов лимфоцитов и полностью предотвращал изменение экспрессии СО4- и С08-антигенов под действием аденозина или АДФ (рисунок 2): количество С04+-клеток в контроле составило 45,05+1,19%, а после их последовательной обработки теофиллином и аденозином (1,0 мкМ) или

АДФ (10,0 мкМ) - 45,17+1,01% и 44,72±0,98% соответственно (р>0,05). Количество клеток, экспрессирующих С08-антиген в контроле было равным 26,72+1,54%, а после инкубации с теофиллином и аденозином или АДФ - 26,11±1,42% и 26,77+1,25% соответственно (р>0.05).

В Контроль Ш Теофиллин ■ Пуриновый агонист

О Теофиллин +

пуриновый агонист

СБЗ СЭ4 СБ 8

СЭЗ СБ4 С08

Рисунок 2. Влияние теофиллина на процесс модуляции поверхностного фенотипа лимфоцитов здоровых людей под действием адено-зина (А) или АДФ (Б). По оси ординат - % клеток, экспрессирующих соответствующий антиген, по оси абсцисс - антигенный маркер.

Эти результаты показали, что процесс изменения экспрессии поверхностных антигенов лимфоидных клеток под влиянием пуриновых соединений опосредован их взаимодействием с соответствующими рецепторами. Кроме того, поскольку АДФ не обладает способностью напрямую стимулировать Ргпуриновые рецепторы , однако его эффекты отменялись блокатором Рррецепторов теофиллином, мы заключили, что модулирующее влияние этого аденинового нуклеотида на поверхностный фенотип лимфоцитов связано с его предварительным расщеплением до аденозина.

Продолжительная инкубация лимфоцитов с аденозином практически не оказывала влияния на экспрессию поверхностных антигенов лимфоцитами здоровых доноров. Эти результаты свидетельствуют о том, что модификация антигенного профиля мембраны лимфоцитов здоровых людей под влиянием пуриновых соединений связана, вероятно, с изменением баланса процессов эндоцитоза и рециркуляции соответствующих гликопротеидных молекул.

3. Особенности влияния аденозина на экспрессию поверхностных антигенов лимфоцитами больных атопической формой бронхиальной астмы в условиях кратковременной и продолжительной инкубации. Как видно из таблицы 3, аденозин в концентрациях 0,1 мкМ и выше оказывает выраженное модулирующее влияние на экспрессию мембранных С04- и С08-антигенов лимфоцитами больных АБА, причем наблюдаемый эффект принципиально отличается от реакции на аденозин клеток здоровых доноров (см. таблицу 2).

Если обработка лимфоцитарной взвеси, полученной от здоровых доноров, растворами аденозина в концентрациях 0,1; 1,0 и 10,0 мкМ приводила к заметному и не зависящему от дозы снижению количества клеток, несущих С04-антиген, в среднем на 9% и приросту количества С08+-клеток, в среднем на 6%, то у больных АБА, напротив, происходило увеличение количества С04+-лимфоцитов. Этот эффект носил отчетливый дозозависимый характер: при действии аденозина в концентрации 0,1 мкМ была отмечена лишь тенденция к возрастанию количества клеток соответствующей субпопуляции, аденозин в концентрации 1,0 и 10,0 мкМ вызывал заметное увеличение числа С04+-клеток. Содержание СЭ8+ клеток при этом практически не изменялось. Указанные сдвиги в экспрессии дифференцировочных антигенов лимфоцитами вели к возрастанию величины ИРИ.

Таблица 3

Влияние аденозина на экспрессию поверхностных антигенов лимфоцитами больных АБА in vitro в условиях кратковременной инкуба-

ции.

Маркер Контроль Концентрация АДФ, мкМ

0,1 1,0 10,0

CD3,% 70,83+1,39 72,08+1,23 71,31 + 1,35 71,51 + 1,41

CD4,% 45,78+1,02 47,85+1,44 50,55+1,13 р<0,01 51,43+1,48 р<0,01

CD8,% 25,71 + 1,40 23,47+1,27 24,38+1,10 24,46+0,89

ИРИ 1,91+0,11 2,17+0,13 2,17+0,12 2,17+0,11

Примечание: р - отражает достоверность различия с контролем

У больных АБА нами также не было выявлено влияния аденозина на экспрессию СОЗ-антигена.

Учитывая то, что в группу больных АБА вошли люди разного возраста, пола, с разной продолжительностью заболевания и т.д., мы предприняли попытку выявить критерий, имеющих значение для особенности ответа лимфоцитов на их обработку аденозином.

Не удалось выявить существенного различия о влиянии аденозина на антигенный профиль мембраны лимфоцитов больных АБА, находящихся в фазе ремиссии или обострения заболевания.

А

С03+ СЭ4+ С08+

СРЗ+ СР4+ С08+

В Контроль Ш Лденозии 0,1 мкМ ■ Аденозин 1,0 мкМ □ Аденозин 10,0 мкМ

Рисунок 3. Влияние аденозина на экспрессию поверхностных антигенов лимфоцитами больных АБА с продолжительностью заболевания менее 5 (А) или 5 и более (Б) лет. По оси ординат - % клеток, экспрессирующих соответствующий антиген, по оси абсцисс - антигенный маркер.

Напротив, как видно из рисунка 3, на характер индуцированного аденозином изменения поверхностного фенотипа лимфоцитов при АБА существенным образом влияла продолжительность заболевания. Для лимфоцитов больных АБА, страдающих этим заболеванием в течение 5 и более лет, оказались эффективными концентрации аденозина, по крайней мере на порядок более низкие, чем в случаях с меньшей длительностью заболевания. При этом увеличение концентрации аденозина не приводило к усилению эффекта в группе пациентов с продолжительностью заболевания 5 лет и более. Так, нуклеозид в концентрациях 0,1; 1,0 и 10,0 мкМ вызывал прирост количества С04+-клеток с 45,56+1,35% в контроле до 51,19+1,40% (р<0,01); 50,99±1,66% (р<0,05) и 52,38+2,38% (р<0,01) соответственно. Примерно такой же прирост доли лимфоцитов, экспрессирующих С04-антиген наблюдался и в группе пациентов, страдающих АБА менее 5 лет, при действии

максимальной из испытанных концентраций аденозина - 10,0 мкМ - с 45,97+1,58% исходно до 50,55+1,87% после 30-минутной инкубации с аденозином (р<0,05). Более низкие концентрации нуклеозида вызывали лишь тенденцию к возрастанию количества С04+-клеток.

На следующем этапе работы мы предприняли исследование влияние аденозина (1,0 мкМ) на экспрессию CD3-, CD4- и С08-антигенов лимфоцитами больных АБА в условиях 16-часовой инкубации, то есть в модели, которая позволяет адекватно оценить истинное изменение баланса иммунорегуляторных клеток под действием испытываемого вещества. Результаты экспериментов представлены в таблице 4.

Таблица 4

Влияние аденозина на экспрессию поверхностных антигенов лимфоцитами больных АБА in vitro в условиях продолжительной инкуба-

ции.

Маркер Контроль 0 ч Контроль 16 ч Аденозин 16 ч

CD3,% 69,07+1,43 70,17+0,67 69,97+0,43

CD4,% 45,35+2,43 46,54+1,69 45,95+1,96

CD8,% 26,30+2,38 26,01+ 1,76 31,57+1,77*

ИРИ 1,89+0,30 1,86+0,21 1,65+0,19

Примечание: * - р<0,05

Видно, что так же как и в группе практически здоровых доноров, сама по себе процедура 16-часовой инкубации лимфоцитов в условиях термостата не повлекла за собой существенного изменения экспрессии СОЗ-, СВ4- и С08-антигенов. Однако под действием аденозина достоверно увеличилось количество клеток, экспрессирующих С08-антиген. С учетом временных параметров изучаемого процесса, последнее свидетельствует, вероятно, о способности аденозина увеличить супрессор-ный потенциал иммунорегуляторных клеток у больных АБА.

Полученные результаты удачно дополняют, на наш взгляд, данные Салмаси Ж.М. (1985), показавшего, что у больных АБА с продолжительностью заболевания более 7 лет индекс индуцированной Кон-А иммуноактивации практически в 2 раза ниже, чем у лиц, страдающих этим заболеванием менее 3 лет. Эти данные свидетельствуют о сглаживании отдельных элементов иммунологического дефекта при АБА с увеличением "стажа" заболевания. Не исключено, что в реализации этого процесса определенную роль играет изменение пуринергической регуляции лимфоцитов.

4. Влияние аденозина на пролиферативную активность лимфоцитов здоровых людей и больных атопической формой бронхиальной астмы. Сегодня нет единого взгляда на проблему влияния низких концентраций аденозина на пролиферацию лимфоид-ных клеток как в норме, так и при бронхиальной астме. Учитывая это обстоятельство, а также выявленный в нашем исследовании эффект аденозина в отношении экспрессии Сй8-антигена лимфоцитами больных АБА в условиях продолжительной инкубации, было проведено изучение влияния аденозина (0,1 - 10,0 мкМ) на спонтанную и индуцированную ФГА (1 мкг/мл) РБТЛ здоровых доноров и больных АБА.

Было обнаружено, что спонтанное включение 3Н-тимидина лимфоцитами практически не различалось в этих двух группах, составив, в среднем, 334±52 импульса в минуту для здоровых людей и 324+103 импульса в минуту для больных АБА (р>0,05). Индексы стимуляции пролиферации лимфоцитов в ответ на ФГА также были практически одинаковыми (19,75+4,88 и 18,16+2,02 соответственно, р>0,05), что вполне согласуется с ранее полученными в нашей лаборатории результатами (Салмаси Ж.М., 1985; Бусарова Е.А., 1994).

Как видно из таблицы 5, аденозин во всех испытанных концентрациях практически не влиял на индуцированное митогеном включение 3Н-тимидина лимфоцитами здоровых доноров и пациентов с АБА.

Таблица 5

Влияние аденозина на спонтанную и ФГА-индуцированную пролиферацию лимфоцитов здоровых доноров и больных АБА.

Группы Показатель Концентрация аденозина, мкМ

лиц 0 0,1 1,0 10,0

здоровые ИВСП 1 0,76+0,12 1,02+0,22 0,91 ±0,07

доноры ИС на ФГА 19,75+4,88 17,12+4,32 16,71+4,11 19,23+4,62

ИВфгд 1 0,97+0,10 0,91+0,07 1,09+0,13

больные ИВсп 1 0,94+0,10 1,12+0,12 0,79+0,03*

АБА ИС на ФГА 18,16+2,02 22,89+4,94 19,48+2,84 21,71+3,06

ИВфгд 1 0,99+0,10 1,07+0,12 1,28+0,19

Примечание: * - р<0,01

С другой стороны, наблюдалась тенденция к подавлению включения радиоактивной метки лимфоцитами здоровых людей в спонтанной РБТЛ под влиянием аденозина (0,1 мкМ), не достигающая, впрочем, статистически значимой величины. Другие концентрации аденозина оказались неэффективными. Возможно, это связано с тем, что в более высоких концентрациях аденозин, проникая в клетку, взаимодействует с ингибиторным Р-участком аденилатциклазы, тормозя процесс индуцированного Рррецепторами накопления цАМФ в лимфоцитах (Marone et al., 1986). Напротив, у больных АБА аденозин в концентрации 10,0 мкМ достоверно подавлял спонтанную пролиферативную активность лимфоцитов. Как видно из таблицы 5, индекс влияния нуклеози-да на спонтанную РБТЛ составил 0,79. Различие в концентрациях

нуклеозида, влияющих на спонтанное включение 3Н-тимидина у здоровых людей и больных АБА может объясняться, на наш взгляд, особенностями пуринергической регуляции лимфоцитов при этом заболевании (Белоусов Ю.Б. с соавт., 1992).

Последнее наблюдение хорошо согласуется с выявленной нами ранее способностью аденозина увеличивать количество С08+-клеток у больных АБА. Сопоставление результатов, полученных в функциональном тесте, и при исследовании экспрессии поверхностных антигенов лимфоцитами, позволило нам заключить, что у больных АБА аде-нозин повышает супрессорную иммунорегуляторную активность лимфоцитов. Различие в концентрации нуклеозида, эффективно влияющей на экспрессию СЭ8-антигена на лимфоцитах периферической крови больных АБА (1,0 мкМ), и на пролиферативную активность лимфоцитов (10,0 мкМ), вероятно, связано с тем, что для изучения поверхностных маркеров клетки инкубировали с аденозином в течение 16 часов, а при постановке РБТЛ - 72 часа. В условиях трехсуточного культивирования нуклеозид неизбежно подвергался разрушению, поэтому в РБТЛ эффективной оказалась его более высокая концентрация.

Таким образом, особенности обмена и рецепции адениновых нуклеотидов и аденозина у больных АБА являются, вероятно, не только звеном патогенеза заболевания, но и факторами, обеспечивающими адаптацию организма больного к длительному существованию в условиях избыточной выраженности реагин-зависимых иммунологических процессов.

выводы

1. Моноклональные антитела серии ИКО позволяют более полно, чем антитела ЛТ, количественно охарактеризовать общий пул мем-бранно-ассоциированных молекул CD3, CD4 и CD8

2. Кратковременная инкубация лимфоцитов здоровых людей с аденозином в концентрациях 0,1 - 10,0 мкМ вызывает снижение количества клеток, экспрессирующих С04-антиген и увеличение доли С08+-лимфоцитов. Этот эффект связан с действием аденозина на Pi-подтип пуриновых рецепторов.

3. Кратковременная инкубация лимфоцитов здоровых людей с АДФ оказывает сходное с аденозином влияние на поверхностный фенотип лимфоцитов, однако для его реализации необходимы более высокие концентрации адениннуклеотида.

4. Инкубация лимфоцитов больных АБА с аденозином в концентрациях 0,1 - 10,0 мкМ в течение 30 минут вызывает увеличение количества клеток, экспрессирующих С04-антиген, доля С08+-лимфоцитов практически не меняется. Наблюдаемый эффект не зависит от периода заболевания (обострение или ремиссия), однако изменяется с увеличением продолжительности заболевания: чем больше длительность заболевания, тем более низкие концентрации аденозина оказываются эффективными.

5. Продолжительная, в течение 16 часов, инкубация с аденозином практически не влияет на экспрессию CD3-, CD4- и С08-антигенов лимфоцитами здоровых людей. У больных АБА аденозин также прак-

тически не влияет на экспрессию СОЗ- и С04-антигенов, однако вызывает увеличение количества С08+-лимфоцитов.

6. Аденозин (10,0 мкМ) угнетает спонтанное включение 3Н-тимидина лимфоцитами периферической крови больных АБА, но нездоровых людей, и не влияет на ФГА-индуцированную пролиферацию лимфоцитов периферической крови здоровых доноров и больных АБА.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для подсчета количества лимфоцитов, экспрессирующих CD3-, CD4- и С08-антигены, с помощью люминесцентного микроскопа целесообразно использовать моноклональные антитела серии ИКО.

2. Для изучения иммунотропной активности биологически актив-

ных веществ целесообразно исследовать их влияния на поверхностный фенотип лимфоцитов в условиях кратковременной и продолжительной инкубации in vitro.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Порядки Г.В., Салмаси Ж.М., Казимирский А.Н., Макарков А.И., Бозиева Н.И. Изучение влияния медиаторов тканевого повреждения на экспрессию поверхностных антигенов лимфоцитами человека in vitro. / / Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-1995.-№ 2.-е. 196-199.

2. Порядин Г.В., Салмаси Ж.М., Макарков А.И., Измененная реакция регуляторных лимфоцитов больных атопической бронхиальной астмой на аденозин. / / Тезисы докладов 5 национального конгресса по болезням органов дыхания, Москва, 1995, № 103.

3. Makarkov A.I., Salmasi J.M., Poq'adin G.V. Adenosine and ADP influence on surface antigens lymphocytes expression in healthy volunteers and atopic asthma patients. / / International Journal of Immunore-habiiitation.-1994.-N. l.-Suppl.-P. 217.

4. Salmasi J.M., Porjadin G.V., Makarkov A.I., Gavrilova E.V. Influence of adenosine and ADP on expression of surface antigens of human T-lymphocytes is connected with stimulation of single type of purine receptors. // Pharmacological Research.-1995.-Vol. 31.-Suppl.-P. 200.