Автореферат и диссертация по медицине (14.00.06) на тему:Рецепция, внутриклеточная сигнализация и гипоксические белки при высотной легочной артериальной гипертензии

i фезиди} , ' ï

(решение от " " ^ ' ^^ ' ' '

присудил учснутс : с

Начальник управления DA Л ;

=— î

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР КАРДИОЛОГИИ И ТЕРАПИИ КЫРГЫЗСКОЙ РЕСПУБЛИКИ

На правах рукописи

АЛДАШЕВ АЛМАЗ АБДУЛХАЕВИЧ

РЕЦЕПЦИЯ, ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ СИГНАЛИЗАЦИЯ И ГИПОКСИЧЕСКИЕ БЕЛКИ ПРИ ВЫСОТНОЙ ЛЕГОЧНОЙ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ.

14.00.06 - Кардиология 03.00.04 - Биохимия

диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Бишкек - 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

I. ВВЕДЕНИЕ 8

И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13

2.1. Молекулярные механизмы гипоксической вазоконстрикции сосудов легкого 13

2.1.1. Теория "непрямого эффекта" 16

2.1.2. О механизме прямой гипоксической вазоконстрикции сосудов легкого 21

2.1.3. Роль уровня внутриклеточного кальция в гипоксической вазоконстикции сосудов легкого 26

2.1.3. Хроническая гипоксия и ремоделирование

сосудов легких 29

2.1.4. Влияние гипоксии на регуляцию экспрессии

ряда генов 32

2.2. Адренорецепторы и гипоксия 42

2.2.1. Структура адренорецепторов 42

2.2.2. в-белки и аденилатциклаза 46

2.2.3. Аденилатциклаза 51

2.2.4. Механизмы регуляции передачи сигнала 52

2.2.5. Взаимная регуляция стимулирующих и ингибирующих аденилатциклазу путей

передачи сигнала 58

2.2.6. Возможная роль адренорецепторов в генезе

ВЛАГ 61

2.3. Гипоксические стресс-белки 67 2.3.1. Экспрессия стресс-белков при хронической

гипоксии и активация митогенных путей

передачи сигнала в клетке 67

2.3.2. Механизмы рецептор-опосредованной регуляции пролиферации клеток. РТК-зависимый митогенный путь

передачи сигнала 69

2.3.3. Рецептор тирозинкиназа. Механизмы

передачи митогенного сигнала в клетке 71

2.3.4. Регуляция передачи митогенного сигнала

в клетке на уровне РТК 74

2.3.5. G-белок зависимый митогенный путь

передачи сигнала 75

2.3.6. Активация МАПК-каскада 76 2.4. Задачи исследования 82 III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 84

3.1. Экспериментальная модель В ЛАГ 84

3.2. Выделение плазматических мембран из предсердий крупных животных по

методу Feldman et el.(1988) с модификациями 85

3.3. Выделение плазматических мембран из

миокарда желудочков сердца 86

3.4. Выделение плазматических мембран из легких 87

3.5. Определение плотности рецепторов на мембране методом связывания радиоактивного лиганда 87

3.6. Исследование активности аденилатциклазы

на мембранах клеток 89

3.7. АДФ-риболизирование Gi -белков Пертуссис

токсином (ПТк) 90

3.8. Выделение общей РБК из ткани 90

3.9. Выделение РНК из клеток в культуре 91

3.10. Электрофорез РНК в агарозном геле 92

3.11. Капиллярный перенос РНК на мембрану

(Nothern blot) 93

3.12. Гибридизация РНК с кДНК зондами 93

3.13. Определение гомеостаза Са в тромбоцитах человека по описанной методике

(Меньшиков и др., 1985) 94

3.14. Определение интенсивности флуоресценции

квина-2 95

3.15. Выделение и определение количества Р-адренорецепторов на лимфоцитах 95

3.16. Культивирование лимфоцитов 96

3.17. Электрофорез белков в полиакриламидном

геле 97

3.18. Электрофоретический перенос белка

с геля на мембрану (Вестерн блот). 98

3.19. Идентификация специфических белков

методом иммуноблоттинга. 98

3.20. Эффект ионов кальция на экспрессию

гипоксинов 99

3.21. Трансляция белков в бесклеточной системе 99

3.22. Выделение клеток сосудистой стенки

легочной артерии телят 100

3.23. Изучение скорости пролиферации и

синтеза ДНК в клетках 100

3.24. Окрашивание специфических белков клетки методами иммунофлуоресценции

и иммуногистохимии 101

3.25. Изучение активации МАП киназ 102

3.26. Выделение факторов роста из среды

культивации клеток 103

3.27. Препаративное выделение белков

для аминокислотного анализа 103

3.28. Статистическая обработка результатов 104

3.29. Реактивы 104 IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 105

4.1. Гиперреактивность сосудов малого круга в ответ на гипоксию у горцев и пороговая чувствительность к гипоксии тромбоцитов

и лимфоцитов периферической крови 105

4.1.1. Особенность реакции гемодинамики малого круга кровообращения в ответ на гипоксию

в различных субпопуляциях горцев 105

4.1.2. Активность кальциевых каналов и

гиперреактивность сосудов легкого у горцев. 109

4.1.3. Реакция адренорецепторов лимфоцитов нормо-, гиперреакторов и больных ВЛАГ горцев на

гипоксию. 116

4.1.4. Состояние Р-АР у горцев с выраженной ВЛАГ

с признаками ГПЖ сердца 121

4.1.5. Устойчивость к высокогорной гипоксии

и десенситизация Р-АР 126

4.2. Адренорецепторы и развитие ВЛАГ 129 4.2.1. Влияние хронической гипоксии на состояние

АР сердечно-сосудистой систем 129

4.2.2. Влияние гипоксии на состояние р-АР-опосредованной системы передачи

сигнала гипоксии 134

4.2.2.1. Плотность р-АР 137

4.2.2.2. Базальная активность аденилатциклазы 140

4.2.2.3. Активация аденилатциклазы изопротеренолом 142

4.2.2.4. Активация аденилатциклазы форсколином 145

4.2.3. АДФ-риболизирование белков 146

4.2.4. Обсуждение результатов 147

4.3. Гиперреактивность сосудов малого круга кровообращения и экспрессия

гипоксических белков. 155

4.3.1. Экспрессия гипоксических белков

в лимфоцитах горцев 155

4.3.2. Изучение механизмов индукции

гипоксических белков в лимфоцитах человека 161

4.3.3. Идентификация гипоксических белков лимфоцитов человека методом двумерного гель-электрофореза 164

4.3.4. Усиление экспрессии гипоксина рЗ 8 (PCNA)

происходит на уровне транскрипции 168

4.3.5. Гипоксии р38 и индукция митогенов гипоксией 169

4.3.6. Обсуждение 174

4.4. Экспрессия гипоксических белков клетками легочных сосудов животных с моделью

высотной легочной артериальной гипертензией 184

4.4.1. Экспрессия гипоксических белков

эндотелиальными клетками и фибробластами

из легочной артерии бычков и яков. 184

4.4.2. Выделение из легочной артерии телят с моделью высотной легочной артериальной гипертензией субпопуляции клеток, гиперчувствительных к гипоксии и обладающих высоким пролиферативным потенциалом 189

4.4.3. L1-клетки более чувствительны к митогенной стимуляции через Gi-белок-сопряженный

рецептор, чем L2-TMK 196

4.4.4. Активация МАП киназ и передача митогенного

сигнала в L1 -клетках и L2-TMK 201

4.4.5. L1-клетки обладают способностью к

автономному росту 203

4.4.6. Обсуждение 205 4.5. Идентификация гипоксических белков,

секретируемых L1 -клетками 212

4.5.1. Идентификация ранее неизвестного белкового фактора роста р36,

секретируемогосубэндотелиальными клетками L1 212

4.5.1. Идентификация фактора роста соединительной ткани, как митогенного фактора,

секретируемого L1-клетками 225

4.5.2. Обсуждение 232

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 240

VI. ВЫВОДЫ 242

VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 244

1.ВВЕДЕНИЕ

Человечество в процессе увеличения своей численности и активной деятельности постоянно усиливает экспансию на ранее недоступные географические регионы и климатические зоны. Цивилизация наступает и вовлекает в хозяйственную и экономическую деятельность заполярную тундру, пустыни, тропические джунгли и прибрежный шельф океанов. Горы не являются исключением и с каждым годом все меньше и меньше высокогорных районов остаются нетронутыми цивилизацией.

По оценкам, проведенным в начале 70-х годов нашего столетия в высокогорных регионах мира (высота 3000 м над ур. моря и выше) проживало около 25 млн. человек (Миррахимов,1971). По данным Высокогорного Института Колорадо в начале 90-х на высокогорье проживало уже свыше 60 млн. человек (Houston, 1992). Причем в случае Тибетского нагорья основной прирост населения происходил за счет принудительной миграции ханьцев из равнинных районов Китая для колонизации Тибета, а в Перу, Боливии, Колумбии и Чили за счет миграции трудовых ресурсов для нужд горнодобывающей промышленности. В Пакистане, Афганистане и Восточной Африке миграция людей в высокогорных районах была связана с затяжными гражданскими войнами в этих регионах. Значительный прирост населения в горных районах государств Центральной Азии и на Кавказе связан с миграцией значительных масс населения в связи с промышленным освоением высокогорных регионов и высоким естественным приростом. Кроме того, следует учесть, что горные долины и альпийские луга являются основной кормовой базой высокогорного отгонного животноводства. Кроме постоянных жителей высокогорья необходимо иметь в виду сезонную и временную миграцию

животноводов, рабочих - вахтовиков, водителей автомашин, контингентов пограничников и других видов военнослужащих, а также альпинистов, туристов, горнолыжников, спортсменов. По данным Высокогорного Института Колорадо от патологий, связанных с высокогорьем, компании, занимающиеся обслуживанием туристов и горнолыжников, терпят убытки только в США почти в 50 млн. долларов, во Франции - в 60 млн. долларов. К сожалению, мы не располагем данными об убытках горнодобывающих компаний, функционирующих на высокогорье. О них мы можем судить только косвенно. Однако, по-видимому, проблема довольно острая, поскольку в Боливии и Чили горнорудные компании финансируют исследования в области высокогорной медицины и профессиональную подготовку специалистов данного профиля в США и Европе.

Все вышеперечисленное объясняет постоянный интерес к исследованиям в области высокогорной биологии и медицины. Поскольку знания биологических механизмов, лежащих в основе адаптации к высокогорной гипоксии, не только у постоянных жителей высокогорья, но и у нерезидентов высокогорья - это залог для разработки стратегии и тактики адаптации, создание научно-обоснованных норм труда и отдыха, проведения мероприятий, облегчающих акклиматизацию к высокогорью. Рассматривая эти вопросы нельзя не обратить внимание на чисто медицинские аспекты, касающиеся, например, механизмов этиопатогенеза болезней высокогорья, их клиники, течения и профилактики. Ведь ряд патологических состояний, таких как острая горная болезнь, высотная легочная артериальная гипертензия (ВЛАГ) развиваются вследствие действия самого горного климата. Острой проблемой является изучение течения обычных заболеваний в условиях высокогорья, поскольку некоторые

сердечно-сосудистые и бронхолегочные заболевания в условиях высокогорья приобретают злокачественное течение. Интересным является также вопрос использования горного климата для лечения некоторых заболеваний. Более подробно с данными вопросами можно ознакомиться в прекрасных нижеприведенных обзорах (Миррахимов,1971; Миррахимов, МейманалиевД984; Парин,1946; Меерсон,1981; Fishman,1990; Grover,1990; Heath, Williams, 1981).

Крайне интересным, с моей точки зрения, является такой малоизученный вопрос, как тератогенное воздействие высотной гипоксии. Опубликовано всего лишь несколько работ, посвященных данному вопросу, в которых указывается на увеличение встречаемости врожденных аномалий и осложнений пренатального и неонатального развития у детей, родившихся на высокогорье (Aldasheva, Moldotashev,1986). Скорее всего, неонатальная гипоксия лежит также в основе развития такого заболевания, как хроническая горная болезнь (Monge, 1942). В тоже время хроническая гипоксия у взрослых вследствие обструктивных заболеваний легких приводит к развитию особой формы легочной артериальной гипертензии - вторичной легочной артериальной гипертензии (ВЛГ) (Миррахимов,1971). Проблема этого заболевания стоит крайне остро в развитых странах Запада. Так, например, в Великобритании количество больных с ВЛГ увеличивается на 100 тысяч человек ежегодно.

В настоящее время показано, что высотная легочная артериальная гипертензия (ВЛАГ), особенно в ее тяжелых формах, развивается чаще у уроженцев высокогорья, чем у жителей равнин, поднявшихся на большие высоты (свыше 3000 м над ур. моря), будучи уже взрослыми (Миррахимов, Мейманалиев, 1984). В общих чертах развитие высотной легочной артериальной гипертензии характеризуется сначала стойким повышением

легочного артериального давления с последующим ремоделированием сосудов легкого, развитием гипертрофии медии и сужением просвета легочных артерий и артериол, появлением интимальных поражений сосудов и развитием гипертрофии правого желудочка сердца (Monge et al.,1942; Миррахимов,1971; Stenmark et al.,1989). Когда при ВJIAT легочные сосуды подвергаются ремоделированию, то вдыхание кислорода уже не приводит к снижению (нормализации) повышенного легочного артериального давления. В формировании высокой чувствительности сосудов легкого к гипоксии и развитии ВЛАГ важное значение отводится онтогенезу особи в условиях высокогорья (Миррахимов,1971; Grover et al., 1990; Herget et al.,1989). Кроме того, важным фактором предрасположенности к развитию ВЛАГ является наследственная гиперреактивность сосудистого ложа легких к гипоксии, которая наследуется по рецессивному признаку (Will et al.,1975). У новорожденных бычков в условиях гипоксии развивается легочная гипертензия с такими же функциональными и морфологическими нарушениями, которые характерны для ВЛАГ (Stenmark et al.,1989), тогда как у телят близкородственного вида яков, живущих на высокогорье, ВЛАГ никогда не развивается (Anand et al.,1986). Этим, видимо, объясняется то, что только у части горцев развивается тяжелая форма ВЛАГ (Миррахимов, Мейманалиев,1984). Однако было показано, что у новорожденных животных, развивающихся в условиях гипоксии, сохраняются фетальные характеристики эндотелиальных и гладкомышечных клеток легочных сосудов, обладающих явно большим спастическим и пролиферативным потенциалами (Allen, Harworth,1986). Основным патологическим проявлением ВЛАГ является ремоделирование сосудов легкого и развитие гипертрофии правых отделов сердца. Механизмы, лежащие в основе ремоделирования сосудов при ВЛАГ, еще недостаточно изучены.

Мне также хотелось бы акцентировать еще один немаловажный аспект данной проблемы - общебиологический, поскольку эффект воздействия гипоксии на живую клетку и ее ответ имеют непосредственное отношение к молекулярным механизмам канцерогенеза и регуляции клеточного цикла, регенерации ткани на раневой поверхности и при ишемическом повреждении сердца и мозга, реваскуляризации тканей и реакции живой клетки на неблагоприятные воздействия окружающей среды.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Молекулярные механизмы гипоксической вазоконстрикции

сосудов легкого.

Легочное кровообращение имеет свои особенности, отличающиеся в первую очередь относительно низким уровнем сосудистого сопротивления, возможностью депонировать значительные объемы крови, своеобразием регуляции и перераспределением кровотока. Изучение малого круга кровообращения имеет важное значение не только для физиологии, но и в особенности для клинической медицины, поскольку при многих патологических состояниях и нередко самостоятельно развивается легочная артериальная гипертензия (ЛАГ), влекущая за собой перегрузку правой половины сердца, формирование легочного сердца и его декомпенсацию. Согласно имеющимся данным среди умерших от сердечной недостаточности удельный вес легочного сердца достигает 30%, что подтверждает бесспорную клиническую важность данной проблемы (Замотаев, 1978).

Настоящий обзор посвящен главным образом рассмотрению новых данных о роли молекулярных и клеточных нейрогуморальных факторов в генезе высотной легочной артериальной гипертензии и развитию ремоделирования легочных сосудов.

Прошло уже более 40 лет с тех пор, когда было экспериментально установлено, что под влиянием вдыхания гипоксической газовой смеси увеличивается уровень легочного артериального давления (Van Euler, Lilljestrand, 1946). Было высказано предположение о высокой физиологической значимости легочной артериальной гипертензии для более адекватного взаимоотношения между вентиляцией, кровотоком и лучшей оксигенацией,

протекающей через легочное сосудистое русло артериальной крови. Значение гипоксического фактора в генезе легочных артериальных гипертензий особенно детально изучено на модели гипоксической (вдыхание обедненных кислородом газовых смесей) и высокогорной легочной артериальной гипертензии. Высотную (гипоксическую) легочную артериальную гипертензию, как самостоятельную нозологическую форму, одним из первых выделил и обосновал в своих трудах академик М.М.Миррахимов (М.М.Миррахимов, 1971).

Развитие гипоксической (высокогорной) легочной артериальной гипертензии можно разделить на ряд стадий: 1) стойкая вазоконстрикция артериол малого круга в ответ на гипоксию, которая не снимается при вдыхании кислорода; 2) морфологическое изменение или ремоделирование сосудов легкого; 3) вовлечение правых отделов сердца, развитие гипертрофии, а в последующем декомпенсации правого желудочка сердца.

До сих пор загадочной остается первая стадия, - каким образом уменьшение напряжения кислорода в альвеолах вызывает вазоконстрикцию в легких. Имеется, по крайней мере, 3 вопроса в этой загадке: 1) какая внутриклеточная система играет роль сенсора гипоксии;

2) каким образом информация о снижении концентрации кислорода преобразуется в сокращение гладкомышечных клеток сосудов легкого;

3) какое преимущество дает целостному организму повышение легочного артериального давления при гипоксии? Две гипотезы (Рис.1) пытаются ответить на эти вопросы: 1) теория непрямого эффекта - альвеолярн