Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Анализ участия женского полового гормона эстрадиола в развитии гипоксической формы легочной гипертензии у самок крыс популяции Wistar

На правах рукописи

КОВАЛЕВА Юлия Олеговна

Анализ участия женского полового гормона эстрадиола в развитии гипоксической формы легочной гипертензии у самок крыс популяции \Vistar

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология 03.03.01 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2014

Работа выполнена на факультете фундаментальной медицины ФГБОУ ВПО Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор заведующий лабораторией патологии и фармакологии гемостаза ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России

доктор медицинских наук, профессор заведующая лабораторией клинической и экспериментальной биофизики ФГБУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России Соодаева Светлана Келдибековна

Ведущая организация: ФГБУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» РАМН

Защита состоится 5 июня 2014 года в 13:00 на заседании диссертационного совета Д 001.024.01, созданного на базе ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН по адресу : 125315, Москва, ул. Балтийская, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ученой части ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, 8 и на сайте www.academpharm.ru

Автореферат разослан........................2014 г.

Медведев Олег Стефанович Медведева Наталия Александровна

Макаров Владимир Александрович

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Елена Артуровна Вальдман

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИСЛ Т. К А 20 14

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Легочная артериальная гипертензия (ЛГ) представляет собой заболевание, определяемое патологическим сострянием малого круга кровообращения и характеризующееся хроническим повышением давления в сосудистой системе легких и правом желудочке сердца, а также его гипертрофией (Мартынюк Т.В., Чазова И.Е., Наконечников С.Н., 2011; Forfia P.R., Trow Т.К., 2013). Гипоксическая форма ЛГ (ГФЛГ) возникает либо при хроническом уменьшении парциального давления во вдыхаемом воздухе (высокогорная болезнь), либо как гипоксическое состояние организма, возникающее в результате заболеваний легких и нарушения их функции, таких как обструктивная болезнь, воспалительный процесс разного генеза, апное (Penaloza D., Arias-Stella J., 2007; Sunderram J., Androulakis I.P.,2012; Nathan S.D., Hassoun P.M., 2013). В последних случаях ЛГ является осложнением легочных заболеваний, усугубляющим их течение. Патогенез ГФЛГ является сложным и зависит от вида заболевания дыхательной системы (Чучалин А.Г., 2008: Voelkel N.F., Mizuno S., Bogaard HJ., 2013). Однако, общим является развитие суживающей реакции сосудов малого круга кровообращения, возникающее при острой гипоксии, как адаптивная реакция, и приводящее к увеличению сосудистого тонуса и сосудистого сопротивления при действии хронической гипоксии (^aronson P.I. и др., 2006; Sylvester J.Т. и др., 2012). Вторым общим и важным фактором патогенеза ГФЛГ является изменение секреторного фенотипа эндотелия сосудов, выражающееся в увеличении синтеза сосудосуживающих и уменьшении сосудорасширительных факторов, что, в конечном итоге, также приводит к возрастанию сосудистого тонуса, и сопровождается активацией свертывающей системы крови и процесса воспаления (Hassoun P.M. и др:, 2009; Kling er J. R, Aman, S. H, Gladwin, M. T, 2013). Третьим важным фактором в развитии ГФЛГ в последнее время рассматривается зависимость проявления этого заболевания от пола человека и животного. Известно, что ГФЛГ встречается чаще среди женской популяции, нежели среди мужской (Safdar Z., 2013; Pugh М.Е., Hemnes A.R., 2010). Этот факт противоречит представлению, сложившемуся в последнее десятилетие, о протективной роли женского полового гормона эстрадиола в отношении сердечно-сосудистой системы (Chung М.Т. и др., 2010; Fukumoto Т. и др., 2013; Kypreos К.Е. и др., 2014). Было выявлено, что существуют не только

ядерные, но и мембранные рецепторы к эстрадиолу, которые обуславливают быструю реакцию на этот гормон (Kim К.Н., Young B.D., Bender J.R., 2014). Активация этих рецепторов на эндотелии сосудистой стенки приводит к активации синтеза расширительных факторов, таких как оксид азота или простациклин, что реализуется в уменьшении сосудистого сопротивления и, в конечном итоге, может приводить к уменьшению артериального давления (do Nascimento G.R. и др., 2009). Эти данные вошли в противоречие с высокой степенью заболеваемости ГФЛГ среди женского населения, развитием гипертензии у женщин при беременности или на фоне приема гормональных средств в разных возрастных группах и были объединены в группу явлений, так называемого "эстрадиолового парадокса". Таким образом, сформировался клинический запрос на экспериментальное изучение роли женского полового гормона в развитии гендерзависимых заболеваний и, в частности, ЛГ. Существует несколько экспериментальных моделей ЛГ (Tofovic S.P., 2010). Монокроталиновая и блеомициновая модели воспроизводят структурные изменения, характерные для идиопатической и токсической форм легочной гипертензии, соответственно. При изучении влияния эстрадиола на степень проявления ЛГ в этих моделях было показано протективное действие гормона как в экспериментах на самках, так и у самцов крыс разных линий (Tofovic S.P. и др., 2009; Nadadur R.D. и др., 2012). В отношении гипоксической формы ЛГ были получены противоречивые результаты. Самцы крыс с ГФЛГ, хронически получавшие эстрадиол, демонстрировали меньшую степень развития заболевания (Lahm Т. и др., 2012). Удаление яичников - основного органа, синтезирующего эстрадиол в организме самок, приводило к ухудшению состояния этих животных при моделировании ГФЛГ (Resta Т.С., Kanagy N.L., Walker B.R., 2001). Данные получены более 10 лет назад, а в последнее время подобных исследований проведено не было. Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования стало изучение влияния хронического применения эстрадиола на развитие гипоксической формы легочной гипертензии на самках крыс популяции Wistar. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1.Провести сравнение степени развития гипоксической формы легочной гипертонии у интактных и овариэктомированных самок крыс популяции Wistar.

2.0ценить влияние хронического введения эстрадиола в дозах 5, 15 и 60 мкг/кг на степень развития гипоксической формы легочной гипертонии у овариэктомированных самок крыс популяции Wistar .

3.Провести анализ механизма действия хронически вводимого эстрадиола в дозе 15 и 60 мкг/кг в день на развитие гипоксической формы ЛГ с помощью блокатора эстрадиоловых рецепторов типа а и Р ICI 182,780 у овариэктомированных самок крыс.

4.Изучить изменение реактивности изолированных сосудов малого и большого круга кровообращения у овариэктомированных самок крыс с ГФЛГ и хроническим введением разных доз эстрадиола.

5.Провести анализ изменений гематокрита, количества эритроцитов и гемоглобина в плазме крови нормотензивных и крыс с ГФЛГ при хроническом введением разных доз эстрадиола.

Научная новизна работы. Установлено, что эстрадиол не оказывает протективного действия, а способствует развитию гипоксической формы легочной гипертензии у самок крыс популяции Wistar. Выявленный эффект эстрадиола значительно снижается в условиях применения ICI 182,780 - блокатора аир рецепторов к эстрадиолу, что подтверждает реализацию эффекта эстрадиола через специфические рецепторы. Анализ реакций системного артериального давления (АД) выявил уменьшение его величины у самок с ГФЛГ при хроническом введении эстрадиола по сравнению с ГФЛГ самками без введения эстрадиола. Оценка ответов изолированных перфузируемых сегментов системных и легочных сосудов показала, что в основе различий в изменении артериального давления в малом и большом круге кровообращения лежат разнонаправленные изменения реактивности сосудов большого и малого круга кровообращения на сосудорасширительные и сосудосуживающие факторы. Хроническое введение эстрадиола овариэктомированным самкам крыс с ГФЛГ приводит к снижению кислородтранспортной функции крови - уменьшению гематокрита, содержания эритроцитов и гемоглобина, что свидетельствует о множественности механизмов отрицательного действия эстрадиола на развитие гипоксической формы ЛГ у самок крыс популяции Wistar.

Теоретическая и практическая значимость работы. Впервые показано отрицательное воздействие эстрадиола на развитие гипоксической формы легочной гипертензии, моделируемой посредством хронической прерывистой гипобарической гипоксии. На изолированных сосудах установлено снижение реактивности легочных сосудов к эстрадиолу, уменьшение эндотелий-зависимых реакций на этот гормон. Кроме того, хроническое введение эстрадиола овариэктомированным самкам с ГФЛГ вызывает снижение кислородтранспортной функции крови за счет уменьшения количества гемоглобина. Увеличение степени развития ГФЛГ сопровождается уменьшением величины системного артериального давления, что свидетельствует о проявлении протективного действия гормона на сосуды большого круга кровообращения, опосредуемого увеличением реактивности к сосудорасширительным факторам и уменьшением - к сосудосуживающим агентам. Полученные результаты необходимо учитывать в клинической практике при применении эстрадиола для коррекции гормонального статуса у женщин. Положения, выносимые на защиту:

1. Женский половой гормон эстрадиол способствует развитию гипоксической формы легочной гипертензии, моделируемой хронической прерывистой гипобарической гипоксией, у самок крыс популяции Wistar.

2. Эффект является специфическим, реализуясь через альфа и бета рецепторы к эстрадиолу.

3. Анализ отрицательного действия эстрадиола на развитие ГФЛГ у самок крыс популяции Wistar подтверждает участие данного полового гормона в развитии патологического процесса, что находит свое выражение в разнонаправленном изменении реактивности сосудов малого и большого круга кровообращения и уменьшении кислородтранспортной функции крови.

Апробация результатов исследования. Основные положения диссертации были представлены на 21-ом и 22-ом Европейских Конгрессах , посвященных изучению гипертензии (Милан 2011, Милан 2013); на XIX международной молодежной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов" (Москва, 2012); на VIII Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 220-летию со дня рождения академика K.M. Бэра, «Механизмы

функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2012); на XXII съезде Физиологического общества имени И.П. Павлова (Волгоград, 2013). Публикации. Диссертационные материалы опубликованы в -11 работах, из которых 3 статьи - в научных изданиях, рекомендуемых ВАК, и 8 тезисов - в сборниках материалов конференций России и за рубежом.

Личный вклад. Автор работы является основным исполнителем проведенного исследования на всех этапах: анализа данных литературы по теме диссертационной работы, проведения экспериментальной части исследования, обработки и анализа полученных данных, формулировании выводов и рекомендаций. При активном участии автора подготовлены публикации по материалам диссертации. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 121 странице и включает введение, обзор литературы, описание методов исследования, результаты, обсуждение, выводы, список цитируемой литературы (содержит 209 источников, в том числе 23 опубликовано в отечественных изданиях). Работа иллюстрирована 32 рисунками и содержит 7 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

At

Эксперименты проводили на самках белых крыс популяции Wistar, которых содержали в стандартных условиях согласно требованиям Council Directive 86/609/ЕЕС (Guiade for use the laboratory animals, 1996). Деление животных на экспериментальные группы и моделирование гипоксической формы легочной гипертензии. Моделирование гипоксической формы легочной гипертензии осуществляли путем посадки экспериментальных животных в барокамеру, внутри которой с помощью вакуумного насоса создавали разряжение воздуха, соответствующее высоте 5 ООО м над уровнем моря, что приводило к уменьшению содержания кислорода во вдыхаемом воздухе до 10 %, по 10 часов в день в светлое время суток в течение 14 дней (прерывистая гипоксия) (Абдулла А. и др., 1991). Ввиду большого количества экспериментальных групп, исследование разделили на несколько серий. Во время первой серии животных делили на две групп. Животные одной из них оставались интактными (n=17), а животным второй группы (п=17) в двухмесячном возрасте проводили билатеральную овариэктомию (удаление яичников с обеих сторон под анестезией тиапенталом натрия, 40 мг/кг, внутрибрюшинно). Через месяц все животные

делились на 4 группы : 1) контрольных крыс группы (К) содержали в обычных условиях вивария; 2) овариэктомированных крыс группы (К/ов) содержали в обычных условиях вивария; 3) контрольных крыс группы (Гип) подвергали воздействию гипобарической гипоксии; 4) овариэктомированных крыс группы (Гип/ов) подвергали воздействию гипобарической гипоксии. Во второй и третьей сериях экспериментов овариэктомия была проведена в 2-х месячном возрасте всем животным. Через 2 недели после операции самкам начинали вводить вещества по группам: 1) крысам группы (Ов/к) ежедневно вводили растворитель пропиленгликоль; 2) животным групп (Ов/Е2-15) ежедневно вводили Е2 в дозе 15 мкг/кг; 3) крысам группы (Ов/Е2-60) ежедневно вводили Е2 в 60 мкг/кг в день; 4) самкам группы (Ов/Е2-15+бл) совместно с Е2 в дозе 15 мкг/кг вводили блокатор эстрогеновых рецепторов ICI 182,780 в дозе 150 мкг/кг; 5) крысам группы (Ов/бл) вводили только блокатор ICI 182,780 в дозе 150 мкг/кг. Спустя две недели после начала введения веществ, животных всех групп подвергали воздействию хронической гипоксии, в ходе которой (2 недели) продолжали вводить соответствующие вещества, а группам с введением пропиленгликоля и эстрадиола в разных дозах соответствовали группы контроля, содержавшиеся в виварии Ов/к не Гип , Ов/Е2-15 не Гип и Ов/Е2-60 не Гип.

Гематологическое исследование: определение содержания эритроцитов и концентрации гемоглобина. Расчет уровня гематокрита. Исследования производили в крови исследуемых самок крыс, собранной за сутки до окончания воздействия гипоксии, в пробирки Microvette 500 с антикоагулянтом - КЗЭДТА (Starstetd, Germany). Прямое исследование содержания эритроцитов и концентрации гемоглобина производили на автоматическом гематологическом ветеринарном анализаторе "Гемалайт -1280вет" ("Диксион", Россия). Расчет уровня гематокрита (%) производили по формуле : RBC х MCV / 10, где RBC - эритроцит, MCV - это средний объем эритроцита, автоматически полученный при определении количества. Проведение острого физиологического эксперимента для регистрации гемодинамическнх параметров с использованием имплантируемых катетеров in vivo. Метод записи гемодинамическнх параметров с использованием имплантируемых катетеров in vivo включал в себя непрерывную регистрацию параметров сердечно-сосудистой системы, таких как системное артериальное

давление (САД), среднее правожелудочковое давление (СПЖД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС), у наркотизированых экспериментальных животных. Для чего под уретановым наркозом (1,2 г/кг, внутрибрюшинно) в бедренную артерию и правый желудочек через яремную вену вводили катетеры и регистрировали гемодинамические параметры посредством датчиков и АЦП (Statham, USA и L-Card, модель Е 14-140). Для регистрации и обработки данных использовалась модифицированная программа BioShell (Мурашев А. Н., Медведев О. С., Давыдова С. А., 1997) с частотой оцифровки сигнала 512 Гц.

Исследования реактивности изолированных легочных и системных сосудов сосудов в ответ на перфузию различными веществами in vitro. По окончанию острого физиологического эксперимента после декапитации у самок крыс извлекали легочную артерию 3-го порядка и подколенную артерию. Для получения легочной артерии 3-го порядка производили эктомию правого легкого и располагали его в ванночке с физиологическим раствором. Отсепарированный сосуд с введенным для перфузии катетером помещали в термостатируемую ванночку обьемом 10 мл. Перфузию сосудов модифицированным физиологическим раствором Кребса-Хенсляйта проводили с постоянным расходом со скоростью 2 мл/мин (внутренний проток) и 4 мл/мин (внешний проток) на установке, состоящей из систем внешней и внутренней перфузии изолированного сосуда, компьютера, датчика давления (Statham. USA), АЦП (L-Card, модель Е 14-140), усилителя потенциалов, ванночки для выделенного сегмента сосуда. О реакции сосуда судили по изменению перфузионного давления, выражаемому в мм рт.ст. Регистрацию и обработку данных производили при помощи программы PowerGraph (Измайлов Д. Ю., 2007). Перфузию изолированных сосудов проводили растворами серотонина (3*10"8М- 10" 5М), ацетилхолина (10"9М - 10"5М) и эстрадиола (10'7М- 10"5М). Морфометрические исследования. Морфометрическое исследование сердца проводили сразу после декапитации животного. Относительный вес правого желудочка оценивали, как отношения ПЖ/вес животного, где ПЖ - вес правого желудочка (Itoh A., Tomita Н., Sano S., 2009). Матку после декапитации животного извлекали, помещали в физиологический раствор, далее подсушивали и взвешивали. Для оценки данного параметра не использовали индексов, так как сравнивали

собственную массу матки интактных крыс и массу матки овариэктомированных крыс с различными воздействиями.

Биохимические эксперименты. Определение уровня эстрадиола проводили в сыворотке крови, собранной по окончанию экспериментов, набором для иммуноферментного анализа DRG Эстрадиол ультрачувствительный (EIA-4399, USA). Образцы сыворотки хранили при -20 С.

Статистический анализ. Данные, собранные в ходе эксперимента, оформлены и представлены в виде среднее ± ошибка среднего. Статистический анализ данных проводили по критерию Манна-Уитни для независимых переменных из пакета программы Statistics 6.0 (Statistica Inc.,США). Как статистический значимый, рассматривали уровень доверительной вероятности р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Изучение влияния хронической гипоксии на овариэктомированных и интактных самок крыс.

1.1. Изучение влияния хронической гипоксии на систолическое давление в правом желудочке и на относительный вес правого желудочка сердца у самок, имевших интактные яичники, и овариэктомированных крыс.

После воздействия хронической гипоксии у животных группы Гип наблюдали увеличение систолического давления в правом желудочке на 53 % по сравнению с группой К (р<0,001). Сравнение двух гипоксических групп по величине СПЖД выявило достоверное снижение величины увеличения СПЖД у группы Гип/ов по сравнению с группой Гип на 17% (р<0,05) (Таб.1). Относительный вес правого желудочка после воздействия хронической гипоксии у крыс группы Гип достоверно увеличился на 15 % в сравнении с группой К (р<0,05) (Таб.1). Эти данные свидетельствуют о развитии гипоксической формы легочной гипертензии у группы животных Гип по СПЖД и индексу веса ПЖ. У самок из группы Гип/ов произошло уменьшение степени развития по СПЖД.

Таким образом, уменьшение уровня эндогенного эстрадиола вследствие проведенной заранее овариэктомии самкам крыс приводит к уменьшению у них степени развития гипоксической формы легочной гипертонии.

Таблица 1. Величины систолического давления в правом желудочке сердца и его относительного веса у всех экспериментальных групп.

Экспериментальные группы Регистрируемые параметры

Систолическое давление (мм рт.ст.) Относительный вес правого желудочка (ПЖ/вес животного* 10000)

К (п=8) 41,9 ± 1,6 6,2 ±0,1

Гип (п=9) 64,2 ±2,2 *** 7,0±0,2 ***

К/Ов (п=8) 46,8 ± 3,4 6,1±0,3

Гип/Ов (п=9) 53,0 ±3,8 * 6,4± 0,2

*** - К vs Гип, р<0,001 ; * - Гип vs Гип/Ов, р<0,05.

1.2. Влияние хронической гипоксии на уровень содержания эстраднола в плазме кровн самок крыс^ Результаты исследования указывают на то, что развитие гипоксической формы легочной гипертонии у животных группы Гип сопровождается двухкратным увеличением содержания эстрадиола в плазме крови этих животных в сравнении с самками К (36,88 ± 3,97 vs 18,86 ± 2,29 пмоль/л, п= 7 и п=6, р<0,05). Удаление яичников значительно понижало содержание эстрадиола в плазме крови (К/Ов и Гип/Ов , 0,69 ± 0,18 и 1,06 ± 0,27 пмоль/л, п=7 и п=8) и сопровождалось уменьшением степени развития легочной гипертонии, что выражалось в уменьшении величины СПЖД на 17 % (Таб.1). Таким образом, развитие легочной гипертонии сопровождается двухкратным увеличением содержания эстрадиола в плазме крови. При овариэктомии наблюдается уменьшение степени развития легочной гипертонии.

2. Изучение влияния хронического введения эстрадиола в дозах 15 и 60 мкг/кг и блокатора эстрадиоловых рецепторов типа аир ICI 182,780 в дозе 150 мкг/кг в сочетании с действием гипоксии на овариэктомированных самок крыс. 2.1. Влияние хронического введения эстрадиола в дозах 15 и 60 мкг/кг овариэктомированным гипертензивным самкам крыс на массу матки.

Было показано, что эстрадиол увеличивает массу маток крыс в группах, получавших его в дозах 15 мкг/кг в день и 60 мкг/кг в день, по сравнению с группой Ов/к (п=8 и п = 10 уб п=7, р<0,01 и р<0,001). Эффект носил дозо-зависимый характер (Ов/Е2 -15 уб Ов/Е2 -60, р<0,05). Блокатор эстрогеновых рецепторов, вводимый совместно с Е2 (группа Ов/Е2+бл, п = 10), статистически значимо снижает массу матки в сравнении с группами Ов/Е2 - 15 и Ов/Е2 - 60, соответственно, р<0,01 и р<0,001 (Рис.1).

Ов/ Е2- 15 + бл; 219

♦♦♦♦♦♦♦♦ ♦♦♦♦♦♦♦♦ ♦♦♦♦♦♦♦♦ ♦♦♦♦♦♦♦♦

Гипоксия

Рисунок № 1. Масса матки интактных самок, подвергавшихся хронической гипоксии, и овариэктомированных самок крыс популяции \Vistar, подвергавшихся воздействию хронической гипоксии и введению различных веществ. ** и *** - Ов/ Е2-15 ув Ов/к (р<0,01) и Ов/ Е2-60 уб Ов/к (р<0,001); **** - Ов/Е2-60 ув Ов/Е2-15 (р<0,05); # - Ов/Е-15+бл уб Ов/Е2-15 и Ов/Е2-60 (р<0,001); @ - Ов/бл уб Ов/к (р<0,001); & - Гип Ув с Ов/к (р<0,01 ); $ - Гип уэ Ов/бл и Ов/Е2-15+бл (р<0,001).

Эстрадиол, вводимый овариэктомированным самкам крыс в дозах 15 и 60 мкг/кг в день в течение 28 дней, при действии гипоксии в последние 2 недели инъекций достоверно увеличивает массу матки, как основного органа-мишени воздействия женского полового гормона, в сравнении с Ов/к (р<0,01 и р<0,001). Также на основании отсутствия различий между группами Ов/Е2-15, Ов/Е2-60 и Гип можно говорить о том, что уровень женского полового гормона в крови крыс с удаленными яичниками после инъекций эстрадиола в течение 28 дней, согласно косвенному показателю - массе матки, соответствует весу матки интактных самок, и подобная схема введения эстрадиола подходит для воспроизведения физиологического уровня

эстрадиола в крови самок крыс с удаленными яичниками. Блокатор эстрадиоловых рецепторов ICI 182,780, вводимый совместно с эстрадиолом, достоверно снижает массу матки (р<0,001), что говорит о том, что действие блокатора на рецепторы к эстрадиолу эффективно.

2.2. Влияние введения экзогенного эстрадиола и блокатора эстрадиоловых рецепторов при совместном действии гипоксии на систолическое давление в правом желудочке. При сравнении СПЖД крыс групп Ов/Е2-15 и Ов/Е2-60 наблюдали увеличение параметра на 15% и 12,5 % по сравнению с группой Ов/к (п=8 и.п=10 vs п=7, р<0,01 и р<0,05). Введение только блокатора эстрадиоловых рецеторов типа аир ICI 182,780 (п=10, Ов/бл) или блокатора эстрадиоловых рецепторов совместно с эстрадиолом в дозе 15 мкг/кг (п=10, Ов/Е2-15+бл) не приводили к достоверным изменениям по СПЖД в сравнении с Ов/к (51,6±1,9 и 51,3±1,6 vs 48,0±1,5 мм.рт.ст.) (Рис.2).

s о ш

га

а с ш ф

s .

X 03 Ш X

с; z

m о

60,0

55,0

со 5 О. 50,0

4 с S

§ g х S

45,0

о s О

Ов/ Е2- 15 + бл; 5Ï

♦♦♦♦♦♦♦♦ ♦♦♦♦♦♦♦♦ ♦♦♦♦♦♦♦♦ ♦♦♦♦♦♦♦♦ ♦♦♦♦♦♦♦♦

Рисунок №2. Величина систолического артериального давления в правом желудочке сердца овариэктомированных самок крыс, подвергавшихся воздействию хронической гипоксии без и с введением разных доз эстрадиола и блокатора эстрадиоловых рецепторов 1С1182,780 отдельно и в сочетании с эстрадиолом. **-Ов/Е2-15 ув Ов/к (р<0,01);* - Ов/Е2-60 ув Ов/к (р<0,05).

Полученные данные свидетельствуют о том, что у овариэктомированных крыс введение эстрадиола в дозах 15 и 60 мкг/кг совместно с действием гипоксии способствует развитию гипоксической формы легочной гипертензии в сравнении с Ов/к. Этот эффект, по-видимому, опосредуется в основном через активацию специфических рецепторов к эстрадиолу, так как совместное введение блокатора рецепторов к эстрадиолу и самого гормона значимо уменьшает степень развития ГФЛГ у этих животных.

2.3. Реакция САД на хроническое введение эстрадиола и блокатор эстрадиоловых рецепторов при совместном действии гипоксии. При измерении САД прямым способом выявлено его снижение у крыс группы Ов/Е2-15 в сравнении с Ов/к на 10 % (п= 8 vs п=7, р<0,05) (Рис.3). Таким образом, при введении эстрадиола в течение 28 дней в большом круге крообращения наблюдается эффект, противоположный тому, что наблюдается в малом круге крообращения: в малом круге Е2 потенциирует развитие ГФЛГ у овариэктомированных крыс, в то время, как в большом круге кровообращения наблюдается проявление протективного действия женского полового гормона эстрадиола (Lahm Т. и др., 2012). У животных группы Ов/бл САД снизилось относительно самок крыс Ов/к на 13 % (п= 10 vs п=7, р<0,05) (Рис.3). Данный факт можно объяснить тем, что одним из проявлений действия блокатора специфических эстрадиоловых рецепторов а и ß является стимуляция третьего рецептора к эстрадиолу GPR30, расположенному на клеточной мембране. Он стимулирует выработку оксида азота и простациклина, которые вызывают расслабление гладкой мышцы и могут инициировать расслабление сосуда и уменьшение сосудистого сопротивления и артериального давления (Lahm Т. и др., 2012). Однако, при введении блокатора эстрадиоловых рецепторов в дозе 150 мкг/кг совместно с эстрадиолом в дозе 15 мкг/кг и воздействии гипоксии (Ов/Е2-15+бл) эффект уменьшения САД, наблюдаемый в группе Ов/бл, не наблюдался (п=10 , р<0,05) (Рис.3).

120,0

Гипоксия

Рисунок №3. Величина системного артериального давления овариэктомированных самок крыс, подвергавшихся воздействию хронической гипоксии без и с введением эстрадиола в разных дозах и блокатора эстрадиоловых рецепторов 1С1182,780 отдельно и в сочетании с эстрадиолом.

* и @ - 0в/Е2-15 и Ов/бл Ув Ов/к (р<0,05); # - Ов/Е2-15+бл уэ Ов/бл (р<0,05).

3. Изучение реактивности изолированных сосудов малого и большого круга кровообращения овариэктомированных самок крыс при хроническом введение эстрадиола в дозе 15 мкг/кг и действии гипоксии. При сравнении реакции изолированных легочных артерий 3-его порядка на перфузию серотонином между группами Ов/Е2-15 и Ов/к не выявили различий в реакциях. При исследовании сегмента подколенной артерии у групп крыс Ов/Е2-15 уб Ов/к было выявлено уменьшение вазоконстрикторной реакции на серотонин в концентрациях серотонина 10"7 на 84 % (1,6 ± 0,8 уэ 10,2 ± 3 мм рт.ст., п=11 и п=13, р<0,01); ЗхЮ"7 на 53 % (17,6 ± 6,5 уб 37,1 ± 6,8 мм рт.ст., п=11 и п=13,р<0,05) и 10'6 М на 48 % (30 ± 6,6 уб 57,8 ± 5,1 мм рт.ст., п=11 и п=13, р<0,01) (Рис.4).

Рисунок №4. Дозо-зависимая реакция изолированного перфузируемого сегмента подколенной артерии на возрастающие концентрации серотонина у самок крыс с гипоксической формой легочной гипертонии без и на фоне хронического введения эстрадиола в дозе 15 мкг/кг (Ов/к, черная линия, и Ов/Е2-15,пунктирная линия). ** -Ов/Е2-15 уэ Ов/к, [С] = 10"7 М (р<0,01). # - Ов/Е2-15 уз Ов/к при перфузии серотонином в концентрации 3x10"7 (р<0,05); @ - Ов/Е2-15 ув Ов/к при перфузии серотонином в концентрации 10"6 (р<0,01).

Сравнивая реакцию изолированных легочных артерий 3-его порядка на перфузию их ацетилхолином в возрастающих концентрациях (10"9; 1СГ8; 1СГ7; 10~6 ; 10"5М) у групп крыс Ов/Е2-15 и Ов/к, не выявили достоверных отличий между группами.

Проводя эксперименты по перфузии ацетилхолином в возрастающих концентрациях от 10"9 до 10"5 М изолированного сегмента подколенной артерии групп Ов/Е2-15 и Ов/к, отметили достоверное увеличение сосудорасширительной реакции на перфузию концентрацией ацетилхолина (10"5 М) в группе Ов/Е2-15 на 51 % Ув Ов/к°(-58,5 ± 5,1 уб - 88,2 ± 9 %, дельта , п=10 и п= 12, р<0,05) (Рис.5).

£

-120,0

LOG ([ацетилхолин.М])

Рисунок № 5. Дозо-зависимая реакция изолированного сегмента подколенной артерии овариэктомированных самок с ГФЛГ без и на фоне хронического введения эстрадиола в дозе 15 мкг/кг на перфузию ацетилхолином в возрастающих концентрациях (Ов/к, черная линия, и Ов/Е2-15, пунктирная линия). * - Ов/Е2-15 vs Ов/к при перфузии ацетилхолином в концентрации 10"5 М (р<0,05).

Перфузия возрастающими концентрациями эстрадиола легочной артерии 3-его порядка у группы Ов/Е2-15 вызывала достоверное уменьшение этой реакции при концентрации эстрадиола 3x10"6 по сравнению с Ов/к, которое составило 56% (- 20,6 ± 7,3 vs -46,6 ± 7,3, дельта0/», п=10 и п=7, р<0,05) (Рис.6).

При перфузии возрастающими концентрациями эстрадиола изолированного сегмента подколенной артерии наблюдали увеличение реакции при концентрации 10'5М у группы Ов/Е2-15 vs Ов/к (-78 ± 7,6 vs -49,5 ± 4,4 дельта %, п=10 и п=7, р<0,05) (Рис.7). Таким образом, хроническое применение эстрадиола на фоне двухнедельной гипоксии наряду с появлением легочной гипертонии у этих животных вызывает разнонаправленное изменение реактивности сосудов малого и большого круга кровообращения на эстрадиол, что наблюдается при перфузии изолированных сегментов сосудов. В легочных сосудах наблюдается уменьшение эндотелий-зависимого расширения на эстрадиол, а в сосудах большого круга кровообращения - потенциирование этой реакции, что может являться одной из причин разнонаправленного изменения системных реакций артериального давления.

0

1

I 84

о га

3 5

8 1

1

о

0 §

1 а

0,0

-20,0

-40,0

-60,0 -

-80,0

-6,0

"-Ь

-5,5

-5,0

-100,0

1_СЮ ([эстрадиол.М])

Рисунок № 6. Дозо-зависимая реакции легочных сосудов 3-его порядка на перфузию эстрадиолом в возрастающих концентрациях у овариэктомированных групп, без на фоне введения эстрадиола в дозе 15 мкг/кг и подвергавшихся гипоксии (Ов/Е2-15, пунктирная линия, и Ов/к, черная линия). *-Ов/ Е2-15 уэ Ов/к при перфузии эстрадиолом в концентрации 3x10"6 М (р<0,05).

-80,0

-100,0

0 ^ --^^ -7,0 -6,0

-

^ *>. Л

\ N.

\ \л

\

\

\

\

Ч

1 *

[-СЮ ([эстрадиол.М])

Рисунок №7. Дозо-зависимая реакция подколенной артерии на перфузию возрастающих концентраций эстрадиола у овариэктомированных гипоксических контрольных групп и животных, хронически получавших эстрадиол в дозе 15 мкг/кг (Ов/к, черная линия, и Ов/Е2-15, пунктирная линия). * - Ов/Е2-15 уб Ов/к при перфузии эстрадиолом в концентрации 10"5 М (р<0,05).

4. Сравнительный анализ влияния введения эстрадиола в разных дозах в сочетании с гипоксией и нормоксией на систолическое давление в правом желудочке и кислородтранспортную функцию крови. Систолическое давление в правом желудочке в группах Ов/Е2-15 и Ов/ Е2 - 60 увеличивается на 21,5 % (р<0,001) и на 19 % (р<0,01) в сравнении с самками крыс групп Ов/Е2-15 не Гип и Ов/ Е2 - 60 не Гип, а также в сравнении с группой Ов/к на 18% (р<0,01) и на 14 % (р<0,05). В условиях двухнедельной гипоксии наблюдалось увеличение гематокрита в контрольной группе на 16 % и гемоглобина 19 % по сравнению с нормоксическим контролем. В условиях нормального содержания кислорода эстрадиол, вводимый хронически в дозе 60 мкг/кг, понижает уровень гематокрита (на 9 %) и количество эритроцитов (на 15%) в исследуемой крови овариэктомированных самок крыс. При действии гипоксии эстрадиол в обеих дозах : 15 и 60 мкг/кг , уменьшает уровни гематокрита (на 10 % и 9 %) и гемоглобина (на 10 %) , а также только наибольшая доза эстрадиола уменьшает содержание эритроцитов (на 9 %) в крови овариэктомированных самок крыс.

Таблица 2. Сравнительный анализ влияния введения эстрадиола в разных дозах в сочетании с гипоксией и нормоксией на систолическое давление в правом желудочке

и гематологические показатели.

Экспериментальные группы СПЖД (мм рт.ст.) Гематологические показатели

Гематокрит, % Гемоглобин, г/дЛ Эритроциты, 10л6/мкл

Ов/к не Гип (п = 7) 44,1±0,7 47,91 ±0,55 14,0 ±0,8 7,9 ± 0,24

Ов/Е2-15 не Гип (п = 8) 45,1 ± 1,1 48,4± 2,2 13,9 ±0,5 7,3 ± 0,25

Ов/Е2-60 не Гип (п = 8) 44,2 ± 1,6 43,66 ± 2 ; * 12,9 ± 0,71 6,7±0,42 ; *

Ов/к (п = 8) 46,3±1,4 55,5 ± 2,32; & 16,7 ± 0,56;& 8,2 ±0,44

Ов/Е2-15 (п = 9) 54,8> ± 1,2; ***; @ 50,04 ±1,47; @ 15,0 ± 0,48; ® 7,6 ±0,31

Ов/Е2-60 (п = 10) 52,8 ± 1,4; **, # 50,4 ± 0,73; **,# 15,1 ±0,41; # 7,5 ± 0,16 ;#

* - Ов/к не Гип уэ Ов/Е2-60 не Гип (р<0,05); &- Ов/к не Гип уб Ов/к (р<0,05); ***-Ов/Е2-15 не Гип уб Ов/Е2-15 (р<0,001); @- Ов/к уб Ов/Е2-15 (мм рт.ст., р<0,01), Ов/к уб Ов/Е2-15 (%, р<0,05), Ов/к уб Ов/Е2 - 15(г/дЛ, р<0,05) **- Ов/ Е2-60 не Гип уб Ов/Е2-60 (р<0,01); #- Ов/к уэ Ов/Е2-60 (р<0,05).

Таким образом, подводя итог всему вышеизложенному, можно заключить, что женский половой гормон эстрадиол в условиях хронического действия гипоксии, при котором содержание кислорода во вдыхаемом воздухе уменьшено в два раза, усиливает развитие гипоксической формы легочной гипертонии у овариэктомированных самок крыс популяции Wistar. Эффект имеет сложный механизм и связан, по-видимому, с изменением участия эстрадиола в регуляции висцеральных функций в гипоксических условиях. Согласно полученным данным, происходит разнонаправленное изменение реактивности сосудов малого и большого круга кровообращения и уменьшение кислородтранспортной функции крови, что потенциирует развитие изучаемой патологии. Обнаруженный эффект безусловно имеет не только фундаментальное, но и клиническое значение, так как эстрадиол часто используется для коррекции гормонального статуса в разных возрастных группах у женщин по физиологическим показаниям и при развитии патологических процессов.

ВЫВОДЫ

Швариэктомированные самки крыс популяции Wistar демонстрируют меньшую степень развития гипоксической формы легочной гипертонии по сравнению с гипертензивными животными с интактными яичниками.

2.Хроническое введение эстрадиола в дозах 5,15 и 60 мкг/кг овариэктомированным самкам крыс популяции Wistar с гипоксической формой легочной гипертонии статистически значимо увеличивает величину систолического давления в правом желудочке сердца и его гипертрофию, что свидетельствует об усилении степени развития легочной гипертензии.

3. Блокатор рецепторов к эстрадиолу типа а и р ICI 182,780 статистически значимо уменьшает эффект действия экзогенного эстрадиола, что свидетельствует о реализации эффекта эстрадиола через специфические рецеторы типа а и р к этому гормону.

4.Введение эстрадиола в дозе 15 мкг/кг в течение 4-х недель наряду с потенциацией ГФЛГ сопровождается уменьшением величины среднего артериального давления.

5.Изучение изменения реактивности сегментов изолированных сосудов малого и большого круга кровообращения овариэктомированных самок крыс с ГФЛГ на фоне хронического введения эстрадиола на сосудорасширительные и сосудосуживающие

агенты выявило их разнонаправленную динамику. В легочных сосудах наблюдали уменьшение реакции на эстрадиол, в то время, как в подколенной артерии реакция на эстрадиол и ацетилхолин увеличивалась, а на серотонин - уменьшалась. 6.На фоне хронического введения эстрадиола у овариэктомированных самок крыс популяции Wistar с гипоксической формой легочной гипертензии наблюдается уменьшение гематокрита, содёржания эритроцитов и гемоглобина, что свидетельствует об уменьшении кислородтранспортной функции крови.

Практические рекомендации. Результаты исследования целесообразно использовать при разработке схем применения гормональных средств, содержащих эстрадиол, в клинической практике у женщин разных возрастных групп с учетом состояния организма и возможности развития гипоксии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: Статьи:

1. Ковалева, Ю.О. Анализ участия эстрадиола в проявлении симптомов гипоксической формы легочной гипертензии у самок крыс линии Wistar [Текст] / Ю.О.Ковалева, М.М.Артемьева, М.Е. Илатовская, О.С.Медведев, H.A. Медведева. // Экспериментальная и клиническая фармакология. -2012. - Т. 75,-№ 12. - с. 19-21.

2. Ковалева, Ю.О. Развитие гипоксической формы легочной гипертензии у овариэктомированных самок крыс линии Wistar при хроническом введении эстрадиола [Текст] / Ю.О.Ковалева, М.М.Артемьева, О.С.Медведев, H.A. Медведева // Экспериментальная и клиническая фармакология,- 2013.- Т. 76, № 5. -С.7-9.

3. Ковалева, Ю.О. Влияние хронического введения блокатора эстрадиоловых рецепторов на развитие гипоксической формы легочной гипертензии у овариэктомированных самок крыс линии Wistar [Текст] / Ю.О.Ковалева, М.М.Артемьева, О.С.Медведев, H.A. Медведева// Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2013. -Т.76, № 7. - С. 15-8.

Тезисы:

1. Medvedeva, N.A. Role of estrogen and endothelin-1 in gender differences in experimental hypoxic pulmonary hypertension in rats [Текст] / N.A.Medvedeva,

21

M.E.Ilatovskaya, M.M.Artemieva, Yu.O.Kovaleva, O.S. Medvedev / 21 st European Meeting on Hypertension and Cardiovascular Protection // J of Hypertension. - 2011. - P. e342 - e343.

2. Ковалева, Ю.О. Влияние блокатора эстрадиоловых рецепторов на потенциацию гипоксической формы легочной гипертензии, вызываемой хроническим введением эстрадиола [Текст] / Ю.О.Ковалева, М.М.Артемьева, О.С.Медведев // Тезисы докладов VIII Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 220-летию со дня рождения академика K.M. Бэра, «Механизмы функционирования висцеральных систем», Санкт-Петербург , 2012. - СПб., 2012. - С 105- 106.

3. Ковалева, Ю.О. Влияние эстрадиола на реактивность сосудов малого и большого кругов кровообращения у самок крыс линии Wistar при гипоксической форме легочной гипертензии [Текст] / Ю.О.Ковалева, М.М.Артемьева, О.С.Медведев // Тезисы докладов VIII Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 220-летию со дня рождения академика K.M. Бэра, «Механизмы функционирования висцеральных систем», - Санкт-Петербург , 2012. - СПб., 2012. -С 106-107.

4. Ковалева, Ю.О. Анализ участия женского полового гормона эстрадиола в развитии гипоксической формы легочной гипертензии в экспериментах на крысах [Текст] / Ю.О.Ковалева // Материалы XIX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ», Москва, 2012. - М., 2012. - 1 электрон, опт. диск (CD-ROM).

5. Артемьева, М.М. Влияние хронического введения эстрадиола на перфузионное давление сосудов малого и большого кругов кровообращения у самцов крыс линии Wistar [Текст] / М.М.Артемьева, Ю.О.Ковалева, М.Е.Илатовская, Е.Д.Юдахина, Д.Б.Лозинская, О.А.Маслова, О.С.Медведев, Н.А.Медведева // Тезисы докладов XXII Съезда физиологического общества имени И.П. Павлова, Волгоград, 2013. -Волгоград, 2013.-С. 37

6. Ковалева, Ю.О. Влияние хронического введения эстрадиола на проявление симптомов гипоксической формы легочной гипертензии у овариэктомированных самок крыс линии Wistar [Текст] / Ю.О.Ковалева, М.М.Артемьева, О.С.Медведев,

Н.А.Медведева // Тезисы докладов XXII Съезда физиологического общества имени И.П. Павлова., Волгоград, 2013. - Волгоград, 2013. - С. 228-229.

7. Медведева, Н.А. Анализ роли женского полового гормона эстрадиола в зависимом от пола проявлении гипоксической формы легочной .гипертонии [Текст] / Н.А.Медведева, Ю.О.Ковалева, М.М.Артемьева // Тезисы докладов XXII Съезда физиологического общества имени И.П. Павлова, Волгоград, 2013. - Волгоград, 2013.-С. 340-341.

8. Kovaleva, Y. Blocker of estrogen receptors ICI 182, 780 reduces degree of hypoxia-induced pulmonary hypertension caused by estrogen in female rats [Текст] / Y.Kovaleva / 23rd European Meeting on Hypertension and Cardiovascular Protection // J of Hypertension. - 2013. - P. e399.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ GPR30 - мембранный рецептор эстрадиола MCV - средний объем эритроцита RBC - эритроциты АД - артериальное давление АЦП - аналогово-цифровой преобразователь ГФЛГ - гипоксическая форма легочной гипертензии Е2 (Е2) - эстрадиол

КЗЭДТА - калий 3 этилендиаминтетрауксусная кислота

ЛАГ - легочная артериальная гипертензия

ЛГ - легочная гипертензия

ПЖ - правый желудочек сердца

САД - системное артериальное давление

СПЖД - систолическое давление в правом желудочке

ЧСС - частота сердечных сокращений

н - б Л 2

Заказ № 106-Р/04/2014 Подписано в печать 04.04.14 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,0

' ООО "Цифровичок",

ч.....у'/Адрес: г. Москва, Большой Чудов пер., д.5

тел. (495) 797-75-76, www.cfr.ru ; e-mail: zakpark@cfr.ru

2014067301