Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Анализ участия женского полового гормона эстрадиола в развитии гипоксической формы легочной гипертензии у самок крыс популяции Wistar

ДИССЕРТАЦИЯ
Анализ участия женского полового гормона эстрадиола в развитии гипоксической формы легочной гипертензии у самок крыс популяции Wistar - диссертация, тема по медицине
АВТОРЕФЕРАТ
Анализ участия женского полового гормона эстрадиола в развитии гипоксической формы легочной гипертензии у самок крыс популяции Wistar - тема автореферата по медицине
Ковалева, Юлия Олеговна Москва 2014 г.
Ученая степень
кандидата медицинских наук
ВАК РФ
14.03.06
 
 

Автореферат диссертации по медицине на тему Анализ участия женского полового гормона эстрадиола в развитии гипоксической формы легочной гипертензии у самок крыс популяции Wistar

На правах рукописи

КОВАЛЕВА Юлия Олеговна

Анализ участия женского полового гормона эстрадиола в развитии гипоксической формы легочной гипертензии у самок крыс популяции \Vistar

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология 03.03.01 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2014

Работа выполнена на факультете фундаментальной медицины ФГБОУ ВПО Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор заведующий лабораторией патологии и фармакологии гемостаза ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России

доктор медицинских наук, профессор заведующая лабораторией клинической и экспериментальной биофизики ФГБУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России Соодаева Светлана Келдибековна

Ведущая организация: ФГБУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» РАМН

Защита состоится 5 июня 2014 года в 13:00 на заседании диссертационного совета Д 001.024.01, созданного на базе ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН по адресу : 125315, Москва, ул. Балтийская, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ученой части ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, 8 и на сайте www.academpharm.ru

Автореферат разослан........................2014 г.

Медведев Олег Стефанович Медведева Наталия Александровна

Макаров Владимир Александрович

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Елена Артуровна Вальдман

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИСЛ Т. К А 20 14

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Легочная артериальная гипертензия (ЛГ) представляет собой заболевание, определяемое патологическим сострянием малого круга кровообращения и характеризующееся хроническим повышением давления в сосудистой системе легких и правом желудочке сердца, а также его гипертрофией (Мартынюк Т.В., Чазова И.Е., Наконечников С.Н., 2011; Forfia P.R., Trow Т.К., 2013). Гипоксическая форма ЛГ (ГФЛГ) возникает либо при хроническом уменьшении парциального давления во вдыхаемом воздухе (высокогорная болезнь), либо как гипоксическое состояние организма, возникающее в результате заболеваний легких и нарушения их функции, таких как обструктивная болезнь, воспалительный процесс разного генеза, апное (Penaloza D., Arias-Stella J., 2007; Sunderram J., Androulakis I.P.,2012; Nathan S.D., Hassoun P.M., 2013). В последних случаях ЛГ является осложнением легочных заболеваний, усугубляющим их течение. Патогенез ГФЛГ является сложным и зависит от вида заболевания дыхательной системы (Чучалин А.Г., 2008: Voelkel N.F., Mizuno S., Bogaard HJ., 2013). Однако, общим является развитие суживающей реакции сосудов малого круга кровообращения, возникающее при острой гипоксии, как адаптивная реакция, и приводящее к увеличению сосудистого тонуса и сосудистого сопротивления при действии хронической гипоксии (^aronson P.I. и др., 2006; Sylvester J.Т. и др., 2012). Вторым общим и важным фактором патогенеза ГФЛГ является изменение секреторного фенотипа эндотелия сосудов, выражающееся в увеличении синтеза сосудосуживающих и уменьшении сосудорасширительных факторов, что, в конечном итоге, также приводит к возрастанию сосудистого тонуса, и сопровождается активацией свертывающей системы крови и процесса воспаления (Hassoun P.M. и др:, 2009; Kling er J. R, Aman, S. H, Gladwin, M. T, 2013). Третьим важным фактором в развитии ГФЛГ в последнее время рассматривается зависимость проявления этого заболевания от пола человека и животного. Известно, что ГФЛГ встречается чаще среди женской популяции, нежели среди мужской (Safdar Z., 2013; Pugh М.Е., Hemnes A.R., 2010). Этот факт противоречит представлению, сложившемуся в последнее десятилетие, о протективной роли женского полового гормона эстрадиола в отношении сердечно-сосудистой системы (Chung М.Т. и др., 2010; Fukumoto Т. и др., 2013; Kypreos К.Е. и др., 2014). Было выявлено, что существуют не только

ядерные, но и мембранные рецепторы к эстрадиолу, которые обуславливают быструю реакцию на этот гормон (Kim К.Н., Young B.D., Bender J.R., 2014). Активация этих рецепторов на эндотелии сосудистой стенки приводит к активации синтеза расширительных факторов, таких как оксид азота или простациклин, что реализуется в уменьшении сосудистого сопротивления и, в конечном итоге, может приводить к уменьшению артериального давления (do Nascimento G.R. и др., 2009). Эти данные вошли в противоречие с высокой степенью заболеваемости ГФЛГ среди женского населения, развитием гипертензии у женщин при беременности или на фоне приема гормональных средств в разных возрастных группах и были объединены в группу явлений, так называемого "эстрадиолового парадокса". Таким образом, сформировался клинический запрос на экспериментальное изучение роли женского полового гормона в развитии гендерзависимых заболеваний и, в частности, ЛГ. Существует несколько экспериментальных моделей ЛГ (Tofovic S.P., 2010). Монокроталиновая и блеомициновая модели воспроизводят структурные изменения, характерные для идиопатической и токсической форм легочной гипертензии, соответственно. При изучении влияния эстрадиола на степень проявления ЛГ в этих моделях было показано протективное действие гормона как в экспериментах на самках, так и у самцов крыс разных линий (Tofovic S.P. и др., 2009; Nadadur R.D. и др., 2012). В отношении гипоксической формы ЛГ были получены противоречивые результаты. Самцы крыс с ГФЛГ, хронически получавшие эстрадиол, демонстрировали меньшую степень развития заболевания (Lahm Т. и др., 2012). Удаление яичников - основного органа, синтезирующего эстрадиол в организме самок, приводило к ухудшению состояния этих животных при моделировании ГФЛГ (Resta Т.С., Kanagy N.L., Walker B.R., 2001). Данные получены более 10 лет назад, а в последнее время подобных исследований проведено не было. Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования стало изучение влияния хронического применения эстрадиола на развитие гипоксической формы легочной гипертензии на самках крыс популяции Wistar. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1.Провести сравнение степени развития гипоксической формы легочной гипертонии у интактных и овариэктомированных самок крыс популяции Wistar.

2.0ценить влияние хронического введения эстрадиола в дозах 5, 15 и 60 мкг/кг на степень развития гипоксической формы легочной гипертонии у овариэктомированных самок крыс популяции Wistar .

3.Провести анализ механизма действия хронически вводимого эстрадиола в дозе 15 и 60 мкг/кг в день на развитие гипоксической формы ЛГ с помощью блокатора эстрадиоловых рецепторов типа а и Р ICI 182,780 у овариэктомированных самок крыс.

4.Изучить изменение реактивности изолированных сосудов малого и большого круга кровообращения у овариэктомированных самок крыс с ГФЛГ и хроническим введением разных доз эстрадиола.

5.Провести анализ изменений гематокрита, количества эритроцитов и гемоглобина в плазме крови нормотензивных и крыс с ГФЛГ при хроническом введением разных доз эстрадиола.

Научная новизна работы. Установлено, что эстрадиол не оказывает протективного действия, а способствует развитию гипоксической формы легочной гипертензии у самок крыс популяции Wistar. Выявленный эффект эстрадиола значительно снижается в условиях применения ICI 182,780 - блокатора аир рецепторов к эстрадиолу, что подтверждает реализацию эффекта эстрадиола через специфические рецепторы. Анализ реакций системного артериального давления (АД) выявил уменьшение его величины у самок с ГФЛГ при хроническом введении эстрадиола по сравнению с ГФЛГ самками без введения эстрадиола. Оценка ответов изолированных перфузируемых сегментов системных и легочных сосудов показала, что в основе различий в изменении артериального давления в малом и большом круге кровообращения лежат разнонаправленные изменения реактивности сосудов большого и малого круга кровообращения на сосудорасширительные и сосудосуживающие факторы. Хроническое введение эстрадиола овариэктомированным самкам крыс с ГФЛГ приводит к снижению кислородтранспортной функции крови - уменьшению гематокрита, содержания эритроцитов и гемоглобина, что свидетельствует о множественности механизмов отрицательного действия эстрадиола на развитие гипоксической формы ЛГ у самок крыс популяции Wistar.

Теоретическая и практическая значимость работы. Впервые показано отрицательное воздействие эстрадиола на развитие гипоксической формы легочной гипертензии, моделируемой посредством хронической прерывистой гипобарической гипоксии. На изолированных сосудах установлено снижение реактивности легочных сосудов к эстрадиолу, уменьшение эндотелий-зависимых реакций на этот гормон. Кроме того, хроническое введение эстрадиола овариэктомированным самкам с ГФЛГ вызывает снижение кислородтранспортной функции крови за счет уменьшения количества гемоглобина. Увеличение степени развития ГФЛГ сопровождается уменьшением величины системного артериального давления, что свидетельствует о проявлении протективного действия гормона на сосуды большого круга кровообращения, опосредуемого увеличением реактивности к сосудорасширительным факторам и уменьшением - к сосудосуживающим агентам. Полученные результаты необходимо учитывать в клинической практике при применении эстрадиола для коррекции гормонального статуса у женщин. Положения, выносимые на защиту:

1. Женский половой гормон эстрадиол способствует развитию гипоксической формы легочной гипертензии, моделируемой хронической прерывистой гипобарической гипоксией, у самок крыс популяции Wistar.

2. Эффект является специфическим, реализуясь через альфа и бета рецепторы к эстрадиолу.

3. Анализ отрицательного действия эстрадиола на развитие ГФЛГ у самок крыс популяции Wistar подтверждает участие данного полового гормона в развитии патологического процесса, что находит свое выражение в разнонаправленном изменении реактивности сосудов малого и большого круга кровообращения и уменьшении кислородтранспортной функции крови.

Апробация результатов исследования. Основные положения диссертации были представлены на 21-ом и 22-ом Европейских Конгрессах , посвященных изучению гипертензии (Милан 2011, Милан 2013); на XIX международной молодежной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов" (Москва, 2012); на VIII Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 220-летию со дня рождения академика K.M. Бэра, «Механизмы

функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2012); на XXII съезде Физиологического общества имени И.П. Павлова (Волгоград, 2013). Публикации. Диссертационные материалы опубликованы в -11 работах, из которых 3 статьи - в научных изданиях, рекомендуемых ВАК, и 8 тезисов - в сборниках материалов конференций России и за рубежом.

Личный вклад. Автор работы является основным исполнителем проведенного исследования на всех этапах: анализа данных литературы по теме диссертационной работы, проведения экспериментальной части исследования, обработки и анализа полученных данных, формулировании выводов и рекомендаций. При активном участии автора подготовлены публикации по материалам диссертации. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 121 странице и включает введение, обзор литературы, описание методов исследования, результаты, обсуждение, выводы, список цитируемой литературы (содержит 209 источников, в том числе 23 опубликовано в отечественных изданиях). Работа иллюстрирована 32 рисунками и содержит 7 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

At

Эксперименты проводили на самках белых крыс популяции Wistar, которых содержали в стандартных условиях согласно требованиям Council Directive 86/609/ЕЕС (Guiade for use the laboratory animals, 1996). Деление животных на экспериментальные группы и моделирование гипоксической формы легочной гипертензии. Моделирование гипоксической формы легочной гипертензии осуществляли путем посадки экспериментальных животных в барокамеру, внутри которой с помощью вакуумного насоса создавали разряжение воздуха, соответствующее высоте 5 ООО м над уровнем моря, что приводило к уменьшению содержания кислорода во вдыхаемом воздухе до 10 %, по 10 часов в день в светлое время суток в течение 14 дней (прерывистая гипоксия) (Абдулла А. и др., 1991). Ввиду большого количества экспериментальных групп, исследование разделили на несколько серий. Во время первой серии животных делили на две групп. Животные одной из них оставались интактными (n=17), а животным второй группы (п=17) в двухмесячном возрасте проводили билатеральную овариэктомию (удаление яичников с обеих сторон под анестезией тиапенталом натрия, 40 мг/кг, внутрибрюшинно). Через месяц все животные

делились на 4 группы : 1) контрольных крыс группы (К) содержали в обычных условиях вивария; 2) овариэктомированных крыс группы (К/ов) содержали в обычных условиях вивария; 3) контрольных крыс группы (Гип) подвергали воздействию гипобарической гипоксии; 4) овариэктомированных крыс группы (Гип/ов) подвергали воздействию гипобарической гипоксии. Во второй и третьей сериях экспериментов овариэктомия была проведена в 2-х месячном возрасте всем животным. Через 2 недели после операции самкам начинали вводить вещества по группам: 1) крысам группы (Ов/к) ежедневно вводили растворитель пропиленгликоль; 2) животным групп (Ов/Е2-15) ежедневно вводили Е2 в дозе 15 мкг/кг; 3) крысам группы (Ов/Е2-60) ежедневно вводили Е2 в 60 мкг/кг в день; 4) самкам группы (Ов/Е2-15+бл) совместно с Е2 в дозе 15 мкг/кг вводили блокатор эстрогеновых рецепторов ICI 182,780 в дозе 150 мкг/кг; 5) крысам группы (Ов/бл) вводили только блокатор ICI 182,780 в дозе 150 мкг/кг. Спустя две недели после начала введения веществ, животных всех групп подвергали воздействию хронической гипоксии, в ходе которой (2 недели) продолжали вводить соответствующие вещества, а группам с введением пропиленгликоля и эстрадиола в разных дозах соответствовали группы контроля, содержавшиеся в виварии Ов/к не Гип , Ов/Е2-15 не Гип и Ов/Е2-60 не Гип.

Гематологическое исследование: определение содержания эритроцитов и концентрации гемоглобина. Расчет уровня гематокрита. Исследования производили в крови исследуемых самок крыс, собранной за сутки до окончания воздействия гипоксии, в пробирки Microvette 500 с антикоагулянтом - КЗЭДТА (Starstetd, Germany). Прямое исследование содержания эритроцитов и концентрации гемоглобина производили на автоматическом гематологическом ветеринарном анализаторе "Гемалайт -1280вет" ("Диксион", Россия). Расчет уровня гематокрита (%) производили по формуле : RBC х MCV / 10, где RBC - эритроцит, MCV - это средний объем эритроцита, автоматически полученный при определении количества. Проведение острого физиологического эксперимента для регистрации гемодинамическнх параметров с использованием имплантируемых катетеров in vivo. Метод записи гемодинамическнх параметров с использованием имплантируемых катетеров in vivo включал в себя непрерывную регистрацию параметров сердечно-сосудистой системы, таких как системное артериальное

давление (САД), среднее правожелудочковое давление (СПЖД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС), у наркотизированых экспериментальных животных. Для чего под уретановым наркозом (1,2 г/кг, внутрибрюшинно) в бедренную артерию и правый желудочек через яремную вену вводили катетеры и регистрировали гемодинамические параметры посредством датчиков и АЦП (Statham, USA и L-Card, модель Е 14-140). Для регистрации и обработки данных использовалась модифицированная программа BioShell (Мурашев А. Н., Медведев О. С., Давыдова С. А., 1997) с частотой оцифровки сигнала 512 Гц.

Исследования реактивности изолированных легочных и системных сосудов сосудов в ответ на перфузию различными веществами in vitro. По окончанию острого физиологического эксперимента после декапитации у самок крыс извлекали легочную артерию 3-го порядка и подколенную артерию. Для получения легочной артерии 3-го порядка производили эктомию правого легкого и располагали его в ванночке с физиологическим раствором. Отсепарированный сосуд с введенным для перфузии катетером помещали в термостатируемую ванночку обьемом 10 мл. Перфузию сосудов модифицированным физиологическим раствором Кребса-Хенсляйта проводили с постоянным расходом со скоростью 2 мл/мин (внутренний проток) и 4 мл/мин (внешний проток) на установке, состоящей из систем внешней и внутренней перфузии изолированного сосуда, компьютера, датчика давления (Statham. USA), АЦП (L-Card, модель Е 14-140), усилителя потенциалов, ванночки для выделенного сегмента сосуда. О реакции сосуда судили по изменению перфузионного давления, выражаемому в мм рт.ст. Регистрацию и обработку данных производили при помощи программы PowerGraph (Измайлов Д. Ю., 2007). Перфузию изолированных сосудов проводили растворами серотонина (3*10"8М- 10" 5М), ацетилхолина (10"9М - 10"5М) и эстрадиола (10'7М- 10"5М). Морфометрические исследования. Морфометрическое исследование сердца проводили сразу после декапитации животного. Относительный вес правого желудочка оценивали, как отношения ПЖ/вес животного, где ПЖ - вес правого желудочка (Itoh A., Tomita Н., Sano S., 2009). Матку после декапитации животного извлекали, помещали в физиологический раствор, далее подсушивали и взвешивали. Для оценки данного параметра не использовали индексов, так как сравнивали

собственную массу матки интактных крыс и массу матки овариэктомированных крыс с различными воздействиями.

Биохимические эксперименты. Определение уровня эстрадиола проводили в сыворотке крови, собранной по окончанию экспериментов, набором для иммуноферментного анализа DRG Эстрадиол ультрачувствительный (EIA-4399, USA). Образцы сыворотки хранили при -20 С.

Статистический анализ. Данные, собранные в ходе эксперимента, оформлены и представлены в виде среднее ± ошибка среднего. Статистический анализ данных проводили по критерию Манна-Уитни для независимых переменных из пакета программы Statistics 6.0 (Statistica Inc.,США). Как статистический значимый, рассматривали уровень доверительной вероятности р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Изучение влияния хронической гипоксии на овариэктомированных и интактных самок крыс.

1.1. Изучение влияния хронической гипоксии на систолическое давление в правом желудочке и на относительный вес правого желудочка сердца у самок, имевших интактные яичники, и овариэктомированных крыс.

После воздействия хронической гипоксии у животных группы Гип наблюдали увеличение систолического давления в правом желудочке на 53 % по сравнению с группой К (р<0,001). Сравнение двух гипоксических групп по величине СПЖД выявило достоверное снижение величины увеличения СПЖД у группы Гип/ов по сравнению с группой Гип на 17% (р<0,05) (Таб.1). Относительный вес правого желудочка после воздействия хронической гипоксии у крыс группы Гип достоверно увеличился на 15 % в сравнении с группой К (р<0,05) (Таб.1). Эти данные свидетельствуют о развитии гипоксической формы легочной гипертензии у группы животных Гип по СПЖД и индексу веса ПЖ. У самок из группы Гип/ов произошло уменьшение степени развития по СПЖД.

Таким образом, уменьшение уровня эндогенного эстрадиола вследствие проведенной заранее овариэктомии самкам крыс приводит к уменьшению у них степени развития гипоксической формы легочной гипертонии.

Таблица 1. Величины систолического давления в правом желудочке сердца и его относительного веса у всех экспериментальных групп.

Экспериментальные группы Регистрируемые параметры

Систолическое давление (мм рт.ст.) Относительный вес правого желудочка (ПЖ/вес животного* 10000)

К (п=8) 41,9 ± 1,6 6,2 ±0,1

Гип (п=9) 64,2 ±2,2 *** 7,0±0,2 ***

К/Ов (п=8) 46,8 ± 3,4 6,1±0,3

Гип/Ов (п=9) 53,0 ±3,8 * 6,4± 0,2

*** - К vs Гип, р<0,001 ; * - Гип vs Гип/Ов, р<0,05.

1.2. Влияние хронической гипоксии на уровень содержания эстраднола в плазме кровн самок крыс^ Результаты исследования указывают на то, что развитие гипоксической формы легочной гипертонии у животных группы Гип сопровождается двухкратным увеличением содержания эстрадиола в плазме крови этих животных в сравнении с самками К (36,88 ± 3,97 vs 18,86 ± 2,29 пмоль/л, п= 7 и п=6, р<0,05). Удаление яичников значительно понижало содержание эстрадиола в плазме крови (К/Ов и Гип/Ов , 0,69 ± 0,18 и 1,06 ± 0,27 пмоль/л, п=7 и п=8) и сопровождалось уменьшением степени развития легочной гипертонии, что выражалось в уменьшении величины СПЖД на 17 % (Таб.1). Таким образом, развитие легочной гипертонии сопровождается двухкратным увеличением содержания эстрадиола в плазме крови. При овариэктомии наблюдается уменьшение степени развития легочной гипертонии.

2. Изучение влияния хронического введения эстрадиола в дозах 15 и 60 мкг/кг и блокатора эстрадиоловых рецепторов типа аир ICI 182,780 в дозе 150 мкг/кг в сочетании с действием гипоксии на овариэктомированных самок крыс. 2.1. Влияние хронического введения эстрадиола в дозах 15 и 60 мкг/кг овариэктомированным гипертензивным самкам крыс на массу матки.

Было показано, что эстрадиол увеличивает массу маток крыс в группах, получавших его в дозах 15 мкг/кг в день и 60 мкг/кг в день, по сравнению с группой Ов/к (п=8 и п = 10 уб п=7, р<0,01 и р<0,001). Эффект носил дозо-зависимый характер (Ов/Е2 -15 уб Ов/Е2 -60, р<0,05). Блокатор эстрогеновых рецепторов, вводимый совместно с Е2 (группа Ов/Е2+бл, п = 10), статистически значимо снижает массу матки в сравнении с группами Ов/Е2 - 15 и Ов/Е2 - 60, соответственно, р<0,01 и р<0,001 (Рис.1).

Ов/ Е2- 15 + бл; 219

♦♦♦♦♦♦♦♦ ♦♦♦♦♦♦♦♦ ♦♦♦♦♦♦♦♦ ♦♦♦♦♦♦♦♦

Гипоксия

Рисунок № 1. Масса матки интактных самок, подвергавшихся хронической гипоксии, и овариэктомированных самок крыс популяции \Vistar, подвергавшихся воздействию хронической гипоксии и введению различных веществ. ** и *** - Ов/ Е2-15 ув Ов/к (р<0,01) и Ов/ Е2-60 уб Ов/к (р<0,001); **** - Ов/Е2-60 ув Ов/Е2-15 (р<0,05); # - Ов/Е-15+бл уб Ов/Е2-15 и Ов/Е2-60 (р<0,001); @ - Ов/бл уб Ов/к (р<0,001); & - Гип Ув с Ов/к (р<0,01 ); $ - Гип уэ Ов/бл и Ов/Е2-15+бл (р<0,001).

Эстрадиол, вводимый овариэктомированным самкам крыс в дозах 15 и 60 мкг/кг в день в течение 28 дней, при действии гипоксии в последние 2 недели инъекций достоверно увеличивает массу матки, как основного органа-мишени воздействия женского полового гормона, в сравнении с Ов/к (р<0,01 и р<0,001). Также на основании отсутствия различий между группами Ов/Е2-15, Ов/Е2-60 и Гип можно говорить о том, что уровень женского полового гормона в крови крыс с удаленными яичниками после инъекций эстрадиола в течение 28 дней, согласно косвенному показателю - массе матки, соответствует весу матки интактных самок, и подобная схема введения эстрадиола подходит для воспроизведения физиологического уровня

эстрадиола в крови самок крыс с удаленными яичниками. Блокатор эстрадиоловых рецепторов ICI 182,780, вводимый совместно с эстрадиолом, достоверно снижает массу матки (р<0,001), что говорит о том, что действие блокатора на рецепторы к эстрадиолу эффективно.

2.2. Влияние введения экзогенного эстрадиола и блокатора эстрадиоловых рецепторов при совместном действии гипоксии на систолическое давление в правом желудочке. При сравнении СПЖД крыс групп Ов/Е2-15 и Ов/Е2-60 наблюдали увеличение параметра на 15% и 12,5 % по сравнению с группой Ов/к (п=8 и.п=10 vs п=7, р<0,01 и р<0,05). Введение только блокатора эстрадиоловых рецеторов типа аир ICI 182,780 (п=10, Ов/бл) или блокатора эстрадиоловых рецепторов совместно с эстрадиолом в дозе 15 мкг/кг (п=10, Ов/Е2-15+бл) не приводили к достоверным изменениям по СПЖД в сравнении с Ов/к (51,6±1,9 и 51,3±1,6 vs 48,0±1,5 мм.рт.ст.) (Рис.2).

s о ш

га

а с ш ф

s .

X 03 Ш X

с; z

m о

60,0

55,0

со 5 О. 50,0

4 с S

§ g х S

45,0

о s О

Ов/ Е2- 15 + бл; 5Ï

♦♦♦♦♦♦♦♦ ♦♦♦♦♦♦♦♦ ♦♦♦♦♦♦♦♦ ♦♦♦♦♦♦♦♦ ♦♦♦♦♦♦♦♦

Рисунок №2. Величина систолического артериального давления в правом желудочке сердца овариэктомированных самок крыс, подвергавшихся воздействию хронической гипоксии без и с введением разных доз эстрадиола и блокатора эстрадиоловых рецепторов 1С1182,780 отдельно и в сочетании с эстрадиолом. **-Ов/Е2-15 ув Ов/к (р<0,01);* - Ов/Е2-60 ув Ов/к (р<0,05).

Полученные данные свидетельствуют о том, что у овариэктомированных крыс введение эстрадиола в дозах 15 и 60 мкг/кг совместно с действием гипоксии способствует развитию гипоксической формы легочной гипертензии в сравнении с Ов/к. Этот эффект, по-видимому, опосредуется в основном через активацию специфических рецепторов к эстрадиолу, так как совместное введение блокатора рецепторов к эстрадиолу и самого гормона значимо уменьшает степень развития ГФЛГ у этих животных.

2.3. Реакция САД на хроническое введение эстрадиола и блокатор эстрадиоловых рецепторов при совместном действии гипоксии. При измерении САД прямым способом выявлено его снижение у крыс группы Ов/Е2-15 в сравнении с Ов/к на 10 % (п= 8 vs п=7, р<0,05) (Рис.3). Таким образом, при введении эстрадиола в течение 28 дней в большом круге крообращения наблюдается эффект, противоположный тому, что наблюдается в малом круге крообращения: в малом круге Е2 потенциирует развитие ГФЛГ у овариэктомированных крыс, в то время, как в большом круге кровообращения наблюдается проявление протективного действия женского полового гормона эстрадиола (Lahm Т. и др., 2012). У животных группы Ов/бл САД снизилось относительно самок крыс Ов/к на 13 % (п= 10 vs п=7, р<0,05) (Рис.3). Данный факт можно объяснить тем, что одним из проявлений действия блокатора специфических эстрадиоловых рецепторов а и ß является стимуляция третьего рецептора к эстрадиолу GPR30, расположенному на клеточной мембране. Он стимулирует выработку оксида азота и простациклина, которые вызывают расслабление гладкой мышцы и могут инициировать расслабление сосуда и уменьшение сосудистого сопротивления и артериального давления (Lahm Т. и др., 2012). Однако, при введении блокатора эстрадиоловых рецепторов в дозе 150 мкг/кг совместно с эстрадиолом в дозе 15 мкг/кг и воздействии гипоксии (Ов/Е2-15+бл) эффект уменьшения САД, наблюдаемый в группе Ов/бл, не наблюдался (п=10 , р<0,05) (Рис.3).

120,0

Гипоксия

Рисунок №3. Величина системного артериального давления овариэктомированных самок крыс, подвергавшихся воздействию хронической гипоксии без и с введением эстрадиола в разных дозах и блокатора эстрадиоловых рецепторов 1С1182,780 отдельно и в сочетании с эстрадиолом.

* и @ - 0в/Е2-15 и Ов/бл Ув Ов/к (р<0,05); # - Ов/Е2-15+бл уэ Ов/бл (р<0,05).

3. Изучение реактивности изолированных сосудов малого и большого круга кровообращения овариэктомированных самок крыс при хроническом введение эстрадиола в дозе 15 мкг/кг и действии гипоксии. При сравнении реакции изолированных легочных артерий 3-его порядка на перфузию серотонином между группами Ов/Е2-15 и Ов/к не выявили различий в реакциях. При исследовании сегмента подколенной артерии у групп крыс Ов/Е2-15 уб Ов/к было выявлено уменьшение вазоконстрикторной реакции на серотонин в концентрациях серотонина 10"7 на 84 % (1,6 ± 0,8 уэ 10,2 ± 3 мм рт.ст., п=11 и п=13, р<0,01); ЗхЮ"7 на 53 % (17,6 ± 6,5 уб 37,1 ± 6,8 мм рт.ст., п=11 и п=13,р<0,05) и 10'6 М на 48 % (30 ± 6,6 уб 57,8 ± 5,1 мм рт.ст., п=11 и п=13, р<0,01) (Рис.4).

Рисунок №4. Дозо-зависимая реакция изолированного перфузируемого сегмента подколенной артерии на возрастающие концентрации серотонина у самок крыс с гипоксической формой легочной гипертонии без и на фоне хронического введения эстрадиола в дозе 15 мкг/кг (Ов/к, черная линия, и Ов/Е2-15,пунктирная линия). ** -Ов/Е2-15 уэ Ов/к, [С] = 10"7 М (р<0,01). # - Ов/Е2-15 уз Ов/к при перфузии серотонином в концентрации 3x10"7 (р<0,05); @ - Ов/Е2-15 ув Ов/к при перфузии серотонином в концентрации 10"6 (р<0,01).

Сравнивая реакцию изолированных легочных артерий 3-его порядка на перфузию их ацетилхолином в возрастающих концентрациях (10"9; 1СГ8; 1СГ7; 10~6 ; 10"5М) у групп крыс Ов/Е2-15 и Ов/к, не выявили достоверных отличий между группами.

Проводя эксперименты по перфузии ацетилхолином в возрастающих концентрациях от 10"9 до 10"5 М изолированного сегмента подколенной артерии групп Ов/Е2-15 и Ов/к, отметили достоверное увеличение сосудорасширительной реакции на перфузию концентрацией ацетилхолина (10"5 М) в группе Ов/Е2-15 на 51 % Ув Ов/к°(-58,5 ± 5,1 уб - 88,2 ± 9 %, дельта , п=10 и п= 12, р<0,05) (Рис.5).

£

-120,0

LOG ([ацетилхолин.М])

Рисунок № 5. Дозо-зависимая реакция изолированного сегмента подколенной артерии овариэктомированных самок с ГФЛГ без и на фоне хронического введения эстрадиола в дозе 15 мкг/кг на перфузию ацетилхолином в возрастающих концентрациях (Ов/к, черная линия, и Ов/Е2-15, пунктирная линия). * - Ов/Е2-15 vs Ов/к при перфузии ацетилхолином в концентрации 10"5 М (р<0,05).

Перфузия возрастающими концентрациями эстрадиола легочной артерии 3-его порядка у группы Ов/Е2-15 вызывала достоверное уменьшение этой реакции при концентрации эстрадиола 3x10"6 по сравнению с Ов/к, которое составило 56% (- 20,6 ± 7,3 vs -46,6 ± 7,3, дельта0/», п=10 и п=7, р<0,05) (Рис.6).

При перфузии возрастающими концентрациями эстрадиола изолированного сегмента подколенной артерии наблюдали увеличение реакции при концентрации 10'5М у группы Ов/Е2-15 vs Ов/к (-78 ± 7,6 vs -49,5 ± 4,4 дельта %, п=10 и п=7, р<0,05) (Рис.7). Таким образом, хроническое применение эстрадиола на фоне двухнедельной гипоксии наряду с появлением легочной гипертонии у этих животных вызывает разнонаправленное изменение реактивности сосудов малого и большого круга кровообращения на эстрадиол, что наблюдается при перфузии изолированных сегментов сосудов. В легочных сосудах наблюдается уменьшение эндотелий-зависимого расширения на эстрадиол, а в сосудах большого круга кровообращения - потенциирование этой реакции, что может являться одной из причин разнонаправленного изменения системных реакций артериального давления.

0

1

I 84

о га

3 5

8 1

1

о

0 §

1 а

0,0

-20,0

-40,0

-60,0 -

-80,0

-6,0

"-Ь

-5,5

-5,0

-100,0

1_СЮ ([эстрадиол.М])

Рисунок № 6. Дозо-зависимая реакции легочных сосудов 3-его порядка на перфузию эстрадиолом в возрастающих концентрациях у овариэктомированных групп, без на фоне введения эстрадиола в дозе 15 мкг/кг и подвергавшихся гипоксии (Ов/Е2-15, пунктирная линия, и Ов/к, черная линия). *-Ов/ Е2-15 уэ Ов/к при перфузии эстрадиолом в концентрации 3x10"6 М (р<0,05).

-80,0

-100,0

0 ^ --^^ -7,0 -6,0

-

^ *>. Л

\ N.

\ \л

\

\

\

\

Ч

1 *

[-СЮ ([эстрадиол.М])

Рисунок №7. Дозо-зависимая реакция подколенной артерии на перфузию возрастающих концентраций эстрадиола у овариэктомированных гипоксических контрольных групп и животных, хронически получавших эстрадиол в дозе 15 мкг/кг (Ов/к, черная линия, и Ов/Е2-15, пунктирная линия). * - Ов/Е2-15 уб Ов/к при перфузии эстрадиолом в концентрации 10"5 М (р<0,05).

4. Сравнительный анализ влияния введения эстрадиола в разных дозах в сочетании с гипоксией и нормоксией на систолическое давление в правом желудочке и кислородтранспортную функцию крови. Систолическое давление в правом желудочке в группах Ов/Е2-15 и Ов/ Е2 - 60 увеличивается на 21,5 % (р<0,001) и на 19 % (р<0,01) в сравнении с самками крыс групп Ов/Е2-15 не Гип и Ов/ Е2 - 60 не Гип, а также в сравнении с группой Ов/к на 18% (р<0,01) и на 14 % (р<0,05). В условиях двухнедельной гипоксии наблюдалось увеличение гематокрита в контрольной группе на 16 % и гемоглобина 19 % по сравнению с нормоксическим контролем. В условиях нормального содержания кислорода эстрадиол, вводимый хронически в дозе 60 мкг/кг, понижает уровень гематокрита (на 9 %) и количество эритроцитов (на 15%) в исследуемой крови овариэктомированных самок крыс. При действии гипоксии эстрадиол в обеих дозах : 15 и 60 мкг/кг , уменьшает уровни гематокрита (на 10 % и 9 %) и гемоглобина (на 10 %) , а также только наибольшая доза эстрадиола уменьшает содержание эритроцитов (на 9 %) в крови овариэктомированных самок крыс.

Таблица 2. Сравнительный анализ влияния введения эстрадиола в разных дозах в сочетании с гипоксией и нормоксией на систолическое давление в правом желудочке

и гематологические показатели.

Экспериментальные группы СПЖД (мм рт.ст.) Гематологические показатели

Гематокрит, % Гемоглобин, г/дЛ Эритроциты, 10л6/мкл

Ов/к не Гип (п = 7) 44,1±0,7 47,91 ±0,55 14,0 ±0,8 7,9 ± 0,24

Ов/Е2-15 не Гип (п = 8) 45,1 ± 1,1 48,4± 2,2 13,9 ±0,5 7,3 ± 0,25

Ов/Е2-60 не Гип (п = 8) 44,2 ± 1,6 43,66 ± 2 ; * 12,9 ± 0,71 6,7±0,42 ; *

Ов/к (п = 8) 46,3±1,4 55,5 ± 2,32; & 16,7 ± 0,56;& 8,2 ±0,44

Ов/Е2-15 (п = 9) 54,8> ± 1,2; ***; @ 50,04 ±1,47; @ 15,0 ± 0,48; ® 7,6 ±0,31

Ов/Е2-60 (п = 10) 52,8 ± 1,4; **, # 50,4 ± 0,73; **,# 15,1 ±0,41; # 7,5 ± 0,16 ;#

* - Ов/к не Гип уэ Ов/Е2-60 не Гип (р<0,05); &- Ов/к не Гип уб Ов/к (р<0,05); ***-Ов/Е2-15 не Гип уб Ов/Е2-15 (р<0,001); @- Ов/к уб Ов/Е2-15 (мм рт.ст., р<0,01), Ов/к уб Ов/Е2-15 (%, р<0,05), Ов/к уб Ов/Е2 - 15(г/дЛ, р<0,05) **- Ов/ Е2-60 не Гип уб Ов/Е2-60 (р<0,01); #- Ов/к уэ Ов/Е2-60 (р<0,05).

Таким образом, подводя итог всему вышеизложенному, можно заключить, что женский половой гормон эстрадиол в условиях хронического действия гипоксии, при котором содержание кислорода во вдыхаемом воздухе уменьшено в два раза, усиливает развитие гипоксической формы легочной гипертонии у овариэктомированных самок крыс популяции Wistar. Эффект имеет сложный механизм и связан, по-видимому, с изменением участия эстрадиола в регуляции висцеральных функций в гипоксических условиях. Согласно полученным данным, происходит разнонаправленное изменение реактивности сосудов малого и большого круга кровообращения и уменьшение кислородтранспортной функции крови, что потенциирует развитие изучаемой патологии. Обнаруженный эффект безусловно имеет не только фундаментальное, но и клиническое значение, так как эстрадиол часто используется для коррекции гормонального статуса в разных возрастных группах у женщин по физиологическим показаниям и при развитии патологических процессов.

ВЫВОДЫ

Швариэктомированные самки крыс популяции Wistar демонстрируют меньшую степень развития гипоксической формы легочной гипертонии по сравнению с гипертензивными животными с интактными яичниками.

2.Хроническое введение эстрадиола в дозах 5,15 и 60 мкг/кг овариэктомированным самкам крыс популяции Wistar с гипоксической формой легочной гипертонии статистически значимо увеличивает величину систолического давления в правом желудочке сердца и его гипертрофию, что свидетельствует об усилении степени развития легочной гипертензии.

3. Блокатор рецепторов к эстрадиолу типа а и р ICI 182,780 статистически значимо уменьшает эффект действия экзогенного эстрадиола, что свидетельствует о реализации эффекта эстрадиола через специфические рецеторы типа а и р к этому гормону.

4.Введение эстрадиола в дозе 15 мкг/кг в течение 4-х недель наряду с потенциацией ГФЛГ сопровождается уменьшением величины среднего артериального давления.

5.Изучение изменения реактивности сегментов изолированных сосудов малого и большого круга кровообращения овариэктомированных самок крыс с ГФЛГ на фоне хронического введения эстрадиола на сосудорасширительные и сосудосуживающие

агенты выявило их разнонаправленную динамику. В легочных сосудах наблюдали уменьшение реакции на эстрадиол, в то время, как в подколенной артерии реакция на эстрадиол и ацетилхолин увеличивалась, а на серотонин - уменьшалась. 6.На фоне хронического введения эстрадиола у овариэктомированных самок крыс популяции Wistar с гипоксической формой легочной гипертензии наблюдается уменьшение гематокрита, содёржания эритроцитов и гемоглобина, что свидетельствует об уменьшении кислородтранспортной функции крови.

Практические рекомендации. Результаты исследования целесообразно использовать при разработке схем применения гормональных средств, содержащих эстрадиол, в клинической практике у женщин разных возрастных групп с учетом состояния организма и возможности развития гипоксии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: Статьи:

1. Ковалева, Ю.О. Анализ участия эстрадиола в проявлении симптомов гипоксической формы легочной гипертензии у самок крыс линии Wistar [Текст] / Ю.О.Ковалева, М.М.Артемьева, М.Е. Илатовская, О.С.Медведев, H.A. Медведева. // Экспериментальная и клиническая фармакология. -2012. - Т. 75,-№ 12. - с. 19-21.

2. Ковалева, Ю.О. Развитие гипоксической формы легочной гипертензии у овариэктомированных самок крыс линии Wistar при хроническом введении эстрадиола [Текст] / Ю.О.Ковалева, М.М.Артемьева, О.С.Медведев, H.A. Медведева // Экспериментальная и клиническая фармакология,- 2013.- Т. 76, № 5. -С.7-9.

3. Ковалева, Ю.О. Влияние хронического введения блокатора эстрадиоловых рецепторов на развитие гипоксической формы легочной гипертензии у овариэктомированных самок крыс линии Wistar [Текст] / Ю.О.Ковалева, М.М.Артемьева, О.С.Медведев, H.A. Медведева// Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2013. -Т.76, № 7. - С. 15-8.

Тезисы:

1. Medvedeva, N.A. Role of estrogen and endothelin-1 in gender differences in experimental hypoxic pulmonary hypertension in rats [Текст] / N.A.Medvedeva,

21

M.E.Ilatovskaya, M.M.Artemieva, Yu.O.Kovaleva, O.S. Medvedev / 21 st European Meeting on Hypertension and Cardiovascular Protection // J of Hypertension. - 2011. - P. e342 - e343.

2. Ковалева, Ю.О. Влияние блокатора эстрадиоловых рецепторов на потенциацию гипоксической формы легочной гипертензии, вызываемой хроническим введением эстрадиола [Текст] / Ю.О.Ковалева, М.М.Артемьева, О.С.Медведев // Тезисы докладов VIII Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 220-летию со дня рождения академика K.M. Бэра, «Механизмы функционирования висцеральных систем», Санкт-Петербург , 2012. - СПб., 2012. - С 105- 106.

3. Ковалева, Ю.О. Влияние эстрадиола на реактивность сосудов малого и большого кругов кровообращения у самок крыс линии Wistar при гипоксической форме легочной гипертензии [Текст] / Ю.О.Ковалева, М.М.Артемьева, О.С.Медведев // Тезисы докладов VIII Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 220-летию со дня рождения академика K.M. Бэра, «Механизмы функционирования висцеральных систем», - Санкт-Петербург , 2012. - СПб., 2012. -С 106-107.

4. Ковалева, Ю.О. Анализ участия женского полового гормона эстрадиола в развитии гипоксической формы легочной гипертензии в экспериментах на крысах [Текст] / Ю.О.Ковалева // Материалы XIX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ», Москва, 2012. - М., 2012. - 1 электрон, опт. диск (CD-ROM).

5. Артемьева, М.М. Влияние хронического введения эстрадиола на перфузионное давление сосудов малого и большого кругов кровообращения у самцов крыс линии Wistar [Текст] / М.М.Артемьева, Ю.О.Ковалева, М.Е.Илатовская, Е.Д.Юдахина, Д.Б.Лозинская, О.А.Маслова, О.С.Медведев, Н.А.Медведева // Тезисы докладов XXII Съезда физиологического общества имени И.П. Павлова, Волгоград, 2013. -Волгоград, 2013.-С. 37

6. Ковалева, Ю.О. Влияние хронического введения эстрадиола на проявление симптомов гипоксической формы легочной гипертензии у овариэктомированных самок крыс линии Wistar [Текст] / Ю.О.Ковалева, М.М.Артемьева, О.С.Медведев,

Н.А.Медведева // Тезисы докладов XXII Съезда физиологического общества имени И.П. Павлова., Волгоград, 2013. - Волгоград, 2013. - С. 228-229.

7. Медведева, Н.А. Анализ роли женского полового гормона эстрадиола в зависимом от пола проявлении гипоксической формы легочной .гипертонии [Текст] / Н.А.Медведева, Ю.О.Ковалева, М.М.Артемьева // Тезисы докладов XXII Съезда физиологического общества имени И.П. Павлова, Волгоград, 2013. - Волгоград, 2013.-С. 340-341.

8. Kovaleva, Y. Blocker of estrogen receptors ICI 182, 780 reduces degree of hypoxia-induced pulmonary hypertension caused by estrogen in female rats [Текст] / Y.Kovaleva / 23rd European Meeting on Hypertension and Cardiovascular Protection // J of Hypertension. - 2013. - P. e399.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ GPR30 - мембранный рецептор эстрадиола MCV - средний объем эритроцита RBC - эритроциты АД - артериальное давление АЦП - аналогово-цифровой преобразователь ГФЛГ - гипоксическая форма легочной гипертензии Е2 (Е2) - эстрадиол

КЗЭДТА - калий 3 этилендиаминтетрауксусная кислота

ЛАГ - легочная артериальная гипертензия

ЛГ - легочная гипертензия

ПЖ - правый желудочек сердца

САД - системное артериальное давление

СПЖД - систолическое давление в правом желудочке

ЧСС - частота сердечных сокращений

н - б Л 2

Заказ № 106-Р/04/2014 Подписано в печать 04.04.14 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,0

' ООО "Цифровичок",

ч.....у'/Адрес: г. Москва, Большой Чудов пер., д.5

тел. (495) 797-75-76, www.cfr.ru ; e-mail: zakpark@cfr.ru

2014067301

 
 

Текст научной работы по медицине, диссертация 2014 года, Ковалева, Юлия Олеговна

Московский Государственный Университет им. М. В. Ломоносова Факультет фундаментальной медицины

М20Н57832

На правах рукописи

Ковалева Юлия Олеговна

АНАЛИЗ УЧАСТИЯ ЖЕНСКОГО ПОЛОВОГО ГОРМОНА ЭСТРАДИОЛА В РАЗВИТИИ ГИПОКСИЧЕСКОЙ ФОРМЫ ЛЕГОЧНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ У САМОК КРЫС ПОПУЛЯЦИИ

\VISTAR

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология 03.03.01 - физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители: Доктор медицинских наук, профессор О. С. Медведев Доктор биологических наук, профессор Н. А. Медведева

Москва - 2014

СОДЕРЖАНИЕ

1.ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................6

2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................10

2.1 Легочная гипертензия......................................................................................10

2.1.1.Классификация легочной гипертензии..............................................................11

2.1.2.Патогенез легочной гипертензии......................................................................12

2.1.3.Патогенез гипоксической формы легочной гипертензии.......................................15

2.1.3.1. Гипоксия......................................................................................................15

2.1.3.2. Виды гипоксий...........................................................................................15

2.1.3.3. Реакция организма на гипоксию...................................................................17

2.1.4.Гендерные различия в проявлениях легочной гипертензии..................................23

2.2.Эстрогены......................................................................................................24

2.2.1.Эстрадиол: синтез, метаболизм...........................................................................24

2.2.2.0сновные физиологические функции эстрадиола................................................29

2.2.3.Роль эстрадиола в регуляции сердечно-сосудистой системы...................................36

2.3. Влияние эстрадиола на выраженность легочной гипертензии на различных экспериментальных моделях...................................................................................40

2.3.1. Влияние эстрадиола на проявление монокроталиновой и блеомициновой моделей легочной гипертензии...................................................................................................40

2.3.2. Влияние эстрадиола на проявление гипоксической модели легочной гипертензии........................................................................................................41

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ......................................................43

3.1. Деление животных на экспериментальные группы и моделирование гипоксической формы легочной гипертензии..................................................................................43

3.2. Проведение билатеральной овариэктомии и введение разных доз эстрадиола и блокатора его ядерных и мембранных рецепторов типа альфа и бета....................................................................................................................44

3.3. Плетизмографическое измерение систолического артериального давления в хвостовой артерии животного................................................................................45

3.4. Гематологическое исследование крови: определение содержания эритроцитов и концентрации гемоглобина, расчет уровня гематокрита............................................46

3.5. Проведение острого физиологического эксперимента для регистрации гемодинамических параметров и их реакции на введение вазоактивных веществ с использованием имплантируемых катетеров in vivo...................................................46

3.6. Исследования реактивности изолированных легочных и системных сосудов в ответ на

перфузию вазоактивных веществ in vitro.................................................................49

3.7. Морфометрические исследования сердца и матки................................................50

3.8. Биохимические эксперименты..........................................................................51

3.9. Вещества, использовавшиеся в экспериментах.....................................................52

3.10. Статистический анализ..................................................................................52

4.РЕЗУЛЬТАТЫ...................................................................................................53

4.1.Изучение влияния хронической гипоксии на овариэктомированных и интактных самок крыс популяции \Vistar..................................................................................53

4.1.1. Изучение влияния хронической гипоксии на систолическое давление в правом желудочке и на вес правого желудочка сердца у интактных и овариэктомированных самок крыс популяции \Vistar................................................................................53

4.1.2. Влияние хронической гипоксии на уровень содержания эстрадиола в плазме крови самок крыс.........................................................................................................55

4.1.3. Качественная оценка овариэктомии по массе матки животного...........................56

4.2.Изучение влияния растворителя пропиленгликоля на регистрируемые параметры сердечно-сосудистой системы при гипоксической форме легочной артериальной гипертензии у овариэктомированных самок крыс популяции \Vistar...........................57

4.3.Сравнительный анализ изучения влияния хронического применения эстрадиола в дозах 15 и 60 мкг/кг на овариэктомированных самок крыс популяции \Vistar , подвергавшихся хронической гипоксии в течение 2 недель или содержавшихся в нормоксических условиях................................................................................................59

4.3.1. Влияние введения экзогенного эстрадиола

овариэктомированным самкам крыс при условиях гипоксии или нормоксии на систолическое давление в правом желудочке и на вес правого желудочка сердца.................................................................................................................59

4.3.2.Влияние хронического введения экзогенного эстрадиола

овариэктомированным самкам при условиях гипоксии и нормоксии на массу матки животных...........................................................................................................62

4.3.3. Влияние хронического введения экзогенного эстрадиола овариэктомированным самкам при условиях гипоксии и нормоксии на уровни гематокрита, количества эритроцитов и гемоглобина...................................................................................63

4.4. Изучение влияния введения экзогенного эстрадиола в дозах 5 и 15 мкг/кг в день в течение 21 дня и гипоксии в течение 2 недель на овариэктомированных самок крыс популяции \Vistar......................................................................................................67

4.4.1. Влияние введения экзогенного эстрадиола и гипоксии на систолическое давление в правом желудочке и на вес правого желудочка сердца...............................................68

4.4.2. Влияние хронического введения экзогенного эстрадиола и гипоксии на систолическое и среднее артериальное давление. Реакции регистрируемого артериального давления на введении вазоактивных веществ.........................................70

4.4.2.1. Изменение систолического артериального давления. Сравнение показателей, полученных прямым и непрямым методами регистрации...........................................71

4.4.2.2. Среднее (системное и систолическое) артериальное давление у овариэктомированных самок с хроническим введением эстрадиола при гипоксической форме легочной гипертонии...................................................................................72

4.4.2.3.Изменения системного среднего артериального давления при внутривенном болюсном введении вазоактивных веществ...............................................................73

4.4.3. Влияние хронического введения экзогенного эстрадиола в дозах 5 и 15 мкг/кг на массу матки.........................................................................................................74

4.5.Изучение влияния введения экзогенного эстрадиола в дозах 15 и 60 мкг/кг в день и блокатора эстрадиоловых рецепторов типа аир 1С1 182,780 в дозе 150 мкг/кг в день в течение 28 дней и гипоксии в течение 2 недель на овариэктомированных самок крыс популяции \Vistar.................................................................................................75

4.5.1. Влияние введения экзогенного эстрадиола, блокатора эстрадиоловых рецепторов и гипоксии на систолическое давление в правом желудочке и на вес правого желудочка сердца................................................................................................................76

4.5.2.Реакция среднего системного артериального давления на хроническое введение эстрадиола, блокатор эстрадиоловых рецепторов и гипоксию.....................................77

4.5.3.Изменения системного артериального давления при внутривенном введении вазоактивных веществ.........................................................................................79

4.5.4. Влияние хронического введения эстрадиола в дозах 15 и 60 мкг/кг овариэктомированным гипертензивным самкам крыс на массу матки.........................80

4.6. Изучение реактивности изолированных сосудов малого и большого круга кровообращения овариэктомированных самок крыс популяции \Vistar

при хроническом введение эстрадиола и действии гипоксии............................................................................................................82

4.6.1. Дозо-зависимая реакция изолированных легочных сосудов овариэктомированных крыс популяции \Vistar, получавших эстрадиол в дозе 15 мкг/кг, на серотонин после воздействия хронической гипоксии................................................................................83

4.6.2. Дозо-зависимая реакция изолированных перфузируемых сосудов овариэктомированных крыс популяции \Vistar, получавших эстрадиол в дозе 15 мкг/кг, на ацетилхолин после воздействия хронической гипоксии.....................................................................................................................................85

4.6.3. Дозо-зависимая реакция на эстрадиол сосудов овариэктомированных крыс популяции \Vistar, хронически получавших эстрадиол в дозе 15 мкг/кг в сочетании с

хронической гипоксией..........................................................................................87

5.0БСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ..........................................................................90

6.ВЫВОД Ы.........................................................................................................99

7.СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ.....................................100

8.СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................103

9.БЛАГОДАРНОСТ И..........................................................................................121

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Легочная артериальная гипертензия (ЛГ) представляет собой заболевание, определяемое патологическим состоянием малого круга кровообращения и характеризующееся хроническим повышением давления в сосудистой системе легких и правом желудочке сердца, а также его гипертрофией (Мартынюк Т.В., Чазова И.Е., Наконечников С.Н., 2011; Forfia P.R., Trow Т.К., 2013). Гипоксическая форма ЛГ (ГФЛГ) возникает либо при хроническом уменьшении парциального давления во вдыхаемом воздухе (высокогорная болезнь), либо как гипоксическое состояние организма, возникающее в результате заболеваний легких и нарушения их функции, таких как обструктивная болезнь, воспалительный процесс разного генеза, апное (Penaloza D., Arias-Stella J., 2007; Sunderram J., Androulakis I.P.,2012;Nathan S.D., Hassoun P.M., 2013). В последних случаях ЛГ является осложнением легочных заболеваний, усугубляющим их течение. Патогенез ГФЛГ является сложным и зависит от вида заболевания дыхательной системы (Чучалин А.Г., 2008: Voelkel N.F., Mizuno S., Bogaard H.J., 2013). Однако общим является развитие суживающей реакции сосудов малого круга кровообращения, возникающее при острой гипоксии, как адаптивная реакция, и приводящее к увеличению сосудистого тонуса и сосудистого сопротивления при действии хронической гипоксии (Aaronson P.I. и др., 2006; Sylvester J.T. и др., 2012). Вторым общим и важным фактором патогенеза ГФЛГ является изменение секреторного фенотипа эндотелия сосудов, выражающееся в увеличении синтеза сосудосуживающих и уменьшении сосудорасширительных факторов, что, в конечном итоге, также приводит к возрастанию сосудистого тонуса, но сопровождается активацией свертывающей системы крови и процесса воспаления (Hassoun P.M. и др., 2009; Klinger J. R., Abman, S. H., Gladwin, M. T., 2013). Третьим важным фактором в развитии ГФЛГ в последнее время рассматривается зависимость проявления этого заболевания от пола человека и животного. Известно, что ГФЛГ встречается чаще среди женской популяции, нежели среди мужской (Safdar Z., 2013; Pugh М.Е., Hemnes A.R., 2010). Этот факт противоречит представлению, сложившемуся в последнее десятилетие, о протективной роли женского полового гормона эстрадиола в отношении сердечно-сосудистой системы (Chung M.Т. и др., 2010; Fukumoto Т. и др., 2013; Kypreos К.Е. и др., 2014). Было выявлено, что существуют не только ядерные, но и мембранные рецепторы к эстрадиолу, которые обуславливают быструю реакцию на этот гормон (Kim К.Н., Young B.D., Bender J.R., 2014). Активация этих рецепторов на эндотелии сосудистой стенки приводит к активации синтеза расширительных факторов, таких как оксид азота или простациклин, что реализуется в уменьшении сосудистого сопротивления и, в конечном итоге, может приводить к уменьшению артериального давления (do Nascimento G.R. и др., 2009). Эти данные вошли в противоречие с высокой степенью заболеваемости ГФЛГ среди женского населения, развитием гипертензии у

женщин при беременности или на фоне приема гормональных средств в разных возрастных группах и были объединены в группу явлений, так называемого "эстрадиолового парадокса". Таким образом, сформировался клинический запрос на экспериментальное изучение роли женского полового гормона в развитии гендерзависимых заболеваний и, в частности, ЛГ. Существует несколько экспериментальных моделей ЛГ (Tofovic S.Р., 2010). Монокроталиновая и блеомициновая модели воспроизводят структурные изменения, характерные для идиопатической и токсической форм легочной гипертензии, соответственно. При изучении влияния эстрадиола на степень проявления ЛГ в этих моделях было показано протективное действие гормона как в экспериментах на самках, так и у самцов крыс разных линий (Tofovic S.P. и др., 2009; Nadadur R.D. и др., 2012). В отношении гипоксической формы ЛГ были получены противоречивые результаты. Самцы крыс с ГФЛГ, хронически получавшие эстрадиол, демонстрировали меньшую степень развития заболевания (Lahm Т. и др., 2012). Удаление яичников - основного органа, синтезирующего эстрадиол в организме самок, приводило к ухудшению состояния этих животных при моделировании ГФЛГ (Resta Т.С., Kanagy N.L., Walker B.R., 2001). Данные получены более 10 лет назад, а в последнее время подобных исследований проведено не было.

В связи с вышеизложенным, целью настоящего исследования стало изучение влияния хронического применения эстрадиола на развитие гипоксической формы легочной гипертензии на самках крыс популяции Wistar.

Задачи исследования. Для достижения цели настоящего исследования были поставлены следующие задачи:

it Провести сравнение степени развития гипоксической формы легочной гипертонии у

интактных и овариэктомированных самок крыс популяции Wistar. it Оценить влияние хронического введения эстрадиола в дозах 5, 15 и 60 мкг/кг на степень развития гипоксической формы легочной гипертонии у овариэктомированных самок крыс популяции Wistar. rit Провести анализ механизма действия хронически вводимого эстрадиола в дозе 15 и 60 мкг/кг в день на развитие гипоксической формы ЛГ с помощью блокатора эстрадиоловых рецепторов типа а и ß ICI 182,780 у овариэктомированных самок крыс, it Изучить изменение реактивности изолированных сосудов малого и большого круга кровообращения у овариэктомированных самок крыс с ГФЛГ и хроническим введением разных доз эстрадиола.

it Провести анализ изменения гематокрита, количества эритроцитов и гемоглобина в плазме крови нормотензивных и крыс с ГФЛГ при хроническом введением разных доз эстрадиола.

Научная новизна работы. Установлено, что самый активный из группы гормонов, синтезируемых в женском организме - эстрадиол, не оказывает протективного действия, а способствует развитию гипоксической формы легочной гипертензии у самок крыс популяции \Vistar. Эффект эстрадиола реализуется через специфические рецепторы, что подтверждается результатами опытов с блокатором аир рецепторов к эстрадиолу, в которых отмечалось снятие наблюдаемого увеличения степени развития заболевания. Анализ реакций артериального давления (АД) и реактивности сосудов малого и большого круга кровообращения на гипо- и гипертензивные факторы выявил разнонаправленное изменение артериального давления у самок с ГФЛГ при введении эстрадиола по сравнению с контролем. Увеличение степени развития ГФЛГ сопровождалось уменьшением величины системного АД. Оценка ответов изолированных сегментов системных и легочных сосудов показала, что в основе этих различий, по-видимому, лежит разнонаправленное изменение реактивности сосудов большого и малого круга кровообращения на сосудорасширительные и сосудосуживающие факторы. Изучение кислородтранспортной функции крови по изменению гематокрита, содержанию эритроцитов и гемоглобина показало уменьшение всех трех параметров при хроническом введении эстрадиола овариэктомированным самкам крыс с ГФЛГ, что свидетельствует о множественности механизмов отрицательного действия эстрадиола на развитие гипоксической формы ЛГ у самок крыс популяции

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты нашей работы впервые демонстрируют отрицательное воздействие женского полового гормона эстрадиола на развитие гипоксической формы легочной гипертензии, моделируемой посредством хронической гипобарической гипоксии, у самок крыс популяции \Vistar. Эксперименты на изолированных сосудах продемонстрировали уменьшение реактивности легочных сосудов к эстрадиолу, что находит свое выражение в уменьшении эндотелий-зависимых реакций на этот гормон, и снижение кислородтранспортной функции крови за счет уменьшения количества гемоглобина. Увеличение степени развития ГФЛГ сопровождается уменьшением величи�