Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Рецепторы гамма-аминомаслянной кислоты в центральной нервной системе LYMNAEA STAGNALIS(L): локализация, электрофизиологические и фармакологические характеристики

РГп ОД

1 1 и ин АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ

. . ,. , ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ

УДК 577.352.5:594.381:612.019:612.829

РУБАХИН Станислав Станиславович

РЕЦЕПТОРЫ ГАММА-АМИНОМАСЛЯННОЙ КИСЛОТЫ В ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЕ ЬУМИАЕА STAGNALIS(Ь): ЛОКАЛИЗАЦИЯ, ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

14.00.17 - Нормальная физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата . биологических наук

Минск-1996

Работа выполнена в Белорусском государственном университете и Балатонском лимнологнчесхом институте Академии наук Венгрии

Научный руководитель:

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Мороз Л. Л.

доктор медицинских наук, профессор, академик АН Беларуси • Гурин В. Н.

доктор биологических наук, профессор Калганов В. Н.

доктор биологических наук, профессор Пастухов Ю. Ф.

Оппонирующая организация: Институт биологии развития Российской

академии наук (Москва)

Защита состоится 21 июня 1996 года в 15 часов на заседании совета по защите диссертаций Д 01.36.01 при Институте физиологии АН Беларуси (220072, Минск, ул. Скорины, 28).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии АН Беларуси

Автореферат разослан 20 мая 1996 г.

Учёный секретарь

совета по защите диссертаций,

кандидат биологических наук?-5^ В. М. РУБАХОВА О Институт физиологии АН Беларуси, 1996

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Пресноподный легочный моллюск l.ymiuiea ¡¡ицгшИз (L) [Gastropoda, Pulmonata) • классически!) молельный объект сопременной нейрофизиологии. Его центральная нервная система (ЦНС) содержит относительно небольшое количество (около 15000) крупных нейронов, многие из которых достигают 200 микрометров в диаметре. Это позволило в относительно короткий период идентифицировать нейроны и иейрональные сети, регулирующие процессы дыхания (Moroz, 1991; Syed et al., 1991 J, питания [Elliott and Kemenes, 1992], размножения [Roubos et al., 1988] и локомоции [Syed et al., 1988). В целом, количество идентифицированных нейронов и синапсов у L stagnatis превышает несколько сотен [Winlow et al., 1992], что позволяет рассматривать этот вид как один из наиболее изученных в иейробиологическом отношении. Как показали эксперименты с модуляцией свободного поведения L stagnalis, do всех вышеуказанных процессах определенную роль могут играть функционально и фармакологически различные клеточные рецепторы гамма-аминомаслянной кислоты (ГАМК) [Moroz, 1991; Romanova, 1994]. Результаты иммуногистохимического анализа свидетельствуют о наличии ГАМК-ергических нейронов в периферическом осфрадиальном ганглии [Nezlin et al., 1994].

Недавно из нервной системы L staf>nalis были изолированы комплементарные дезоксирнбонуклеиховые кислоты (кДНК), кодирующие полипептиды, идентичные на 30-52% аир субъсдиннцам ГАМКл-рецепторио-канальных комплексов млекопитающих. Результатом экспрессии кДНК в ооцитах Xenopux laevb стало формирование ГАМКл.-подобных ионотропиых рецепторов. Существующие различия между структурными полипептидами ГАМКд-рецепторов позвоночных и L stagnalls позволили ввести в современную классификацию семь новых субъединичных подтипов [Darlison et al., 1994].

Несмотря на столь значительные успехи молекулярио-биологических исследований, практически ничего не известно о характеристиках рецепторов ГАМК в нативных нейрональных мембранах L stagnate [Бочарова, 1975]. Соответственно, остаётся не выясненной функциональная роль этих рецепторов, а также их значение для адаптации организма к естественным условиям и антропогенным изменениям среды обитания. Исследования показали, что у беспозвоночных основной мишенью воздействия токсических соединений во многих случаях являются именно ГАМК-рецепторы [Lunt, 1991]. Благодаря способности специфически реагировать на те или иные вещества, находящиеся в окружающем пространстве, L. stagnalis широко используется для контроля и оценки состояния водных экосистем [S-Rozsa et al., 1988].

Учитывая большое значение систем клеточной рецепции аминокислот для реализации механизмов химической чувствительности и пластичности нейрональных мембран как беспозвоночных, "так и позвоночных животных, весьма интересным и

важным является изучение локализации, электрофизнологическнх и фармакологических характеристик рецепторов ГАМ К А. мицпиИл.

Связь работы с крупными научными пршраммами -смамп. Настоящая работа является составной частью научно-исследовательских программ "Исследовать механизмы действия модифицированных полисахаридов для шмскания эффективных антиаритмиков, регуляторов функции миокарда и температурной устойчивости организма.", Г.Б. № 004-56 и "Нсйромслиаторнмс механизмы модуляции поведенческих программ у ¡.утпаеа.\tagnulis", ИХУМЗОО.

Цель и задачи исследования. Целыо настоящего исследования явилось экспериментальное обоснование гипотезы о присутствии в нейронах Ц11С пресноводного легочного моллюска 1.утпаеа .иа^пиИл нескольких типов рецепторов гамма-аминомаслянной кислоты.

О соответствии с згой целью решались следующие основные задачи:

1. Исследовать локализацию в ЦМС Л. .ич^паИх идентифицированных нейронов, чувствительных к игонисгам ГАМКл- и ГЛМКв-рецеитороп.

2. Провеет элекгрофнзиологичсский и фармакологический анализ эффектов вгоинаон и иитипчшегои ГАМКа- н ГЛМКв-рецспторов на указанные нейроны.

3. Выяснить возможную роль рецепторов ГАМК в механ.шах нейроналыюй пластичности путем:

3.1. оценки влияния эндогенных нейромодуляторов (серотонин, мет-знксфалин, интерлейкииы П.-1(1, 11.-2, 1Ь-4, И.-6) и некоторых физиологически активных экзогенных соединений (форбол 12, 13-дибутират, морфицептин, налоксон) на вызванные агонистами ГАМКл-рецептороп иейрональные ответы;

3.2. анализа воздействия шонистов ГАМКа- и ГАМКв-рецепторов на мембранные потенциал-зависимые ионные токи.

Научнаи новизна результатов. Судя по имеющимся литературным данным, в работе впервые о мире продемонстрировано наличие двух типов рецепюров ГАМК в идентифицированных нейронах ЦНС Л. .\iugnalis, которые по своим электрофизиологичсским и фармакологическим характеристикам близки к ГАМКа-рецепторно-канальным комплексам н ГАМКв-сопряжениым с О-белками рецепторам позвоночных.

Установлено, что стимуляция ГАМКл-подобных рецепторов /. нацгшИз приводит к формированию входящего хлорного тока, вызывающего деполяризацию нейронов различных функциональных групп (интернейрон ЯРеОК расположенный на дортальной стороне правого педального ганглия, и некоторые могонейроны из А групп педальных и правого париетального ¡англиев).

Выявлено, что через ГАМКв-подобнме рецепторы реализуется несколько различных мембранных эффектов' увеличение проводимости нейроналыюй

мембраны для ионов калия н связанная с этим гиперполярнзацня клеток (интернейроны RPeDI, VD4 - дорзальная сторона висцерального ганглня); угнетение кальциевого и быстрого калиевого потенциал-зависимых токов, приводящее к уменьшению амплитуд потенциала действия и следовой гиперполяризации (RPeDI, LPeDI - дорзальная сторона левого педального ганглия, часть нейронов из L и М групп висцерального ганглия).

Впервые обнаружено, что ГАМКл- и ГАМКв-подобные рецепторы ЦНС L stagnalis могут участвовать в механизмах пластичности нейрональных мембран, о чем свидетельствуют:

а) модуляция потенцнал-активируемых токов агонистами ГАМКв-рецепторов;

б) изменения клеточных ответов, вызванных приложением агонистов ГАМКл-рецепторов серотонином, мет-энкефалином, морфнцептпном, форбол 12, 13-дибутиратом, IL-ip, IL-2, IL-6,1L-4.

Практическая значимость полученных результатов. Показано, что идентифицированные нейроны L stagnalis являются удобной нейробиологической моделью для исследования влияния физико-химических факторов на функциональные характеристики рецепторов ГАМК. Методическая простота и высокая информативность модели позволяют использовать её при решении научно-практических задач токсикологии и радиобиологии.

Научные положения и выводы диссертации нашли практическое применение при исследовании ллияния модифицированных полисахаридов на химическую чувствительность нейрональных мембран, проведённом в НИЛ терморегуляции БГУ.

Экономическая значь сгъ полученных результатов. На основе модифицированных методов внутриклеточного диализа [Kostyuk and Krishta", 1977] и "фиксации концентрации" (concentration clamp) [Akaike, 1986] была создана новая система для работы с изолированным перфузируемым нейроном, позволившая уменьшить в десять раз расход биологически активных веществ и в два-три раза увеличить длительность эксперимента, что привело к расширению области применения метода внутриклеточного диализа в нейробиологическйх исследованиях. После метрологической адаптации данная система может быть представлена в виде коммерческого продукта.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- в педальных, париетальных, правом плевральном и висцеральном ганглиях ЦНС L stagnalis присутствуют идентифицируемые нервные клетки, содержащие ГАМКл- и ГАМКв-подобные рецепторы;

- деполяризация нейронов RPaDl (правый париетальный ганглий, дорзальная сторона), RPeDI, LP&V2 (левый париетальный ганглий, вентральная сторона), VDc (два нейрона, расположенных в каудальной части висцерального ганглня, дорзальная

сторона), некоторых нейронов из LPeA, RPeA, RPID групп агонистами ГАМКл-рецепторов (мусцпмол и ГАМК) опосредована увеличением проводимости клеточной мембраны, главным образом, для ионов хлора. Гиперполяризация RPeDl и VD4 агонистами ГАМКв-рсцепторов (баклофен и ГАМ1\" связана с увеличением проводимости клеточной мембраны преимущественно для ионов калия;

- ГАМК-активнрованное увеличение проницаемости нейроналыюй мембраны для С1 угнетается пикротоксипом, кадмием и свинцом, потеициируется ртутью, а для К+-подавляется 4-аминопириднном, тетраэтиамонием и цезием;

• участие систем рецепции ГАМК в процессах нейроналыюй пластичности определяется, во-первых, модуляцией кальциевых и калиевых потенциал-актнвируемыхтокоо в RPcDI, LPeDI, VD4 и ряде нейронов L и М групп агонистами ГАМКц-рецепторов - баклофеном и ГАМК, через механизмы, líe включающие G-белки, чувствительные к коклюшному токсину; во-вторых, тем, что ГАМКл-агонист-индуцированиый входящий хлорный ток подвергается нейромодуляторному воздействию ряда физиологически активных соединений (серотонин, мет-энкефалнн, морфицептин, налоксон, форбол 12,13-дибутират, IL-lp, IL-2,IL-4, IL-6).

Личный вклад соискатели. Все экспериментальные данные, включенные о настоящую работу, получены непосредственно автором. В диссертации не были использованы результаты исследований соавторов совместных публикаций. В то же время все соавторы принимали участие в обсуждении публикуемых результатов. Научный руководитель и научный консультант участвовали в определении цели и задач исследования, а также в обсуждении полученных результатов.

Апробация работы. Результаты диссертаций доложены и обсуждены на семинарах кафедры человека и животных БГУ, конференции биологического факультета Белгосунивсрснтета (Минск, 1994), заседании Минского городского отделения физиологического общества Беларуси (Минск, 4 мая 1996) и на международных симпозиумах Heavy metal induced alterations in excitable membranes (Hungary, Tihany, 22-24 July 1993), региональной конференции Международного общества нейробиояогии беспозвоночных (ISIN) (Россия, Пущино, 26-28 мая 1994), Symposium on molluscan neurobiology (Netherlands, Amsterdam, 1-4 June 1994), н 8th Symposiun on invertebrate neurobiology (Hungary, Tihany, 27 June-2 July 1995).

Опублмкооашюсть результатов. Результаты диссертации изложены в I статье и 8 тезисах научных конференций, опубликованных в отечественных и зарубежных изданиях.

Объем н структура диссертации. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (I глава), описания методов исследования (2 глава), трех глав, содержащих описание и' обсуждение

результатов исследования (3-5 главы), выводов, библиографического указателя, включающего 2i0 источников, иллюстрирована 1 таблицей и 28 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Пресноводные брюхоногие моллюски L stagnalis были собраны в Острошицко-Городокском водохранилище (Минский район) и на озере Kiss Balaton (Венгрия) и в дальнейшем содержались в аквариумах при температуре 15-20 °С и искусственном освещении. Фактический материал был получен на 180 взрослых особях с длиной раковины более 25 мм.

Выделение ЦНС и снятие первой соединительнотканой оболочки проводили в нормальном физиологическом растворе для L stagnalis [Moroz et al., 1993]. Затем изолированную ЦНС обрабатывали проназои Е (0,2 %) (Protease, type IV, Sigma) в течение 10 минут для микроэлектродных исследований и 40 минут для работы с изолированными нейронами. После отмывки проназы интактный препарат ЦНС помещали в холодильник при +4 °С и извлекали на короткие промежутки времени (не более трех минут) для выделения нервной клетки. Нейроны изолировали двумя электрохимически заточенными вольфрамовыми иглами.

Нейроны идентифицировались визуально по их размеру, цвету, расположению в ганглии н электрс,физиологически по параметрам потенциала действия, паттернам импульсной активности, потенциал- и лнганд-актнвнруемым токам. В исследовании использовалась клеточная номенклатура, предложенная в [Winlow and Benjamin, 1981]. Поиск ГАМК-чувствите ,ных нейронов проводился во всех ганглиях ЦНС среди нейронов, координирующих локомоторное, оборонительное и дыхательное поведение L. stagnalis. Основные статистические данные получены на следующих идентифицированных нервных клетках: RPeDl, RPaDl, LPeDl, VD4, VDc.

Часть работы выполнялась с использованием внутриклеточных, заполненных 3 М KCl микроэлектродов с сопротивлением кончика 5-15 МОм, усилителя МС-01М (изготовлен к. б. н. Будько Д. Ю.), микроманипулятора "Brinkmann" и самописца "Gold", другая - с привлечением модифицированной нами техники внутриклеточного диализа на пластиковой пипетке [Kostyuk and Krishtal, 1977], пэтч-клэмп усилителя АХОPATCH-ID (Axon Instruments, Foster City, CA). Подача командных сигналов, регистрация числовых параметров тока, напряжения и обработка результатов осуществлялись на микрокомпьютере Philips CM9043/OOG и программном обеспечении, разработанном доктором А- Сютч (Dr. A. Szucs). В большинстве случаев поддерживающий потенциал был равен -50 мВ.

Аппликация веществ и смена рабочих, растворов проводилась в режиме "фиксации концентрации" (concentration clamp) [Akaike, 1986] с некоторыми модификациями.

б

Применяли следующие растворы (псе концентрации d мМ): 1) внеклеточные - а) нормальный физиологический раствор : NaCI - 44, KCI - 1,7, СаСЬ - 4, MgCI: - 1,5, HEPES - 10; б) сахарозный раствор : сахароза - 83,7, трнс-(окснмет1ш)-амшюмстан -20; в) раствор с низким содержанием С1- - нормальный физиологический раствор, в котором хлорид натрия заменялся ацетатом натрия; г) кальциевый раствор: СаСЬ • 28,35, глюконат кальция - 6,25, TpiicI-ICI - 7, HEPES - 13; д) бсскальциеиый раствор с замещением в кальциевом растворе Са2+ на Ваг+ в эквнмолярном соотношении; е) СаТЕА раствор: MgClj-10, СаС12 - б, ТЕАС1 - 33,7,4-АР - 0,5, глюкоза - 10, CsCh- 4, TpucHCl - 10; 2) внутриклеточные - а) нормальный внутриклеточный раствор: KCI • 20, КОН - 43,5, аспартат -10, EGTA - 5, HEPES - 25,7; б) не содержащий ионов хлора: КОН - 63,5, аспартат - 50, EGTA - 5, HEPES - 5, трис-(оксимсшл)-амнномстан - 2,5. рН для всех внеклеточных растворов был равен 7,4±0,02. рН внутриклеточных растворов равнялся 7,3±0,02 и 'корректировался с помощью трис-(окснмстнл)-аминомстана или HEPES. Конечная расчетная осмоляриость для внутриклеточных растворов была 124-126 мОст, для внеклеточных - 122-123 мОсш, за исключением сахарозного раствора, имевшего 117-120 мОсш.

Мусцимол, глюконат кальция, фуроссмид, пикротоксип, форбол 12, 13- . дпбутират, коклюшный токсин, меТ-энкефалнн, морфицептин, налоксон изготовлены фирмой SIGMA (Sigma, USA). Интерлейкины IL-lp, IL-2, IL-4,1L-6 и антитела к IL-4 любезно предоставлены доктором Хыоджес (Dr. Huhges, Department Biological Science, SUNY, USA). Все остальные вещества произведены компанией Reanal (Венгрия).

Экспериментальные результаты обрабатывали методами вариационной статистики [Роклцкий, 1973]. Статистические данные приведены в форме: среднее арифметическое ± среднее квадратическое отклонение.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Локалшации, элсктрофшиологнчсскис и фармакологические свойства ГАМКл-подобиых рсцетгороа L. stagnails. Агоннсгы ГАМКл-рецспторно-канальных комплексов ГАМК (5x105 М, п=37) и мусцимол (5х10-5 М, п=28) деполяризуют нейроны RPeDl, RPaDl, LPaV2, VDc, некоторые нейроны из групп: А правого париетального, F висцерального, D правого плеврального и А правого и левого педальных ганглиев (Рис. 1). При этом наблюдалось достоверное уменьшение мембранного сопротивления па 23,б±5,52% (ГАМК 5x10 5 М, п=9). Селективный агонпст ГАМКв-рецепторов баклофен не вызывал подобных эффектов (п=16). Деполяризация указанных нейронов связана с активацией входящего тока, характеризующегося потенциалом реверсии 20±4 мВ и линейной зависимостью от -60 до 0 мВ (п=22). В диапазоне -100 * -60 мВ происходило отклонение показаний от линейной зависимости в сторону их уменьшения, что подтверждает предположение о

существовании пулла открытых ГАМКл-подобных комплексов, не активируемых агоиистами [ОэгИбоп, 1992].

рецепторно-канальных

Мусщгмол

/

Ж 0,4 нА

Рис. 1. Агонисты ГАМКа- н ГАМКв-рецепторов вызывают различные клеточные ответы в идентифицированных нейронах ЦНС Ь. ¡Ш£па1Ь, А - в режиме фиксации потенциала мусцимол стимулирует входящий, ГАМК - бифаэичный, баклофен • выходящий ток. В - в режиме фиксации тока мусцимол только деполяризует нейрон, ГАМК вызывает бифазнчиый ответ, баклофен гиперполяризует клетку. Б - карта локализации ГАМК-чувствительных нейронов в ЦНС Ь. НацпаИз. ЬС/ЛС, ЬРеМРе, 1*Р1/ИР1, ЬРа/КРа - соответственно левый/правый церебральный, педальный, плевральный, париетальный п V - висцеральный ганглии, буккальные ганглии на схеме не обозначены. Т - начало аппликации агониста, в А и В регистрации потенциалов и токов в нейроне кх'еЛ!.

По кинетическим параметрам ГАМК-вызванных ответов выделены две группы нейронов с малым (1,52±0,47 с, п=12) и большим (3,48±0,24 с, п=10) временем максимума клеточного ответа (ВМКО), что скорее всего связано с наличием нескольких пуллов рецепторов ГАМК, находящихся в высокоаффинном и низкоаффшшом состояниях [Хухо, 1990]. ВМКО в диапазоне от -10 до -90 мВ были потенциал-независимы. В то же время имела место линейная зависимость ВМКО от концентрации агониста в пределах 10 5 - Ю-3 М, где мусцимол- и ГАМК- вызванные токи имели не различающиеся достоверно величины ВМКО, но при низких концентрациях (106 - 10-' М) происходил 1,5-2 кратный рост времени максимума клеточного ответа для ГАМК по сравнению с ВМКО для мусцимола. Кинетика десенситизационных процессов входящего тока описывалась уравнением с двумя экспонентами и характеризовалась быстрой (0,7±0,15 с - ГАМК, п=9; 1,27+0,22 с -мусцимол, п=6) и медленной (3,6±0,4 с - ГАМК, п=9; 4,32±0,25 с - мусцимол, п=6) составляющими.

Б

g

Изменения концентраций внеклеточных катионов не вызывали смещения потенциала реверсии. В то же время снижение концентрации ионов хлора как внутри клетки с 20 мМ до 2,3 мМ, так и вне ее с 52,7 мМ до 20 мМ приводило к смещению потенциала реверсии тока с -20±4 мВ до -51 ±6,7 мВ (п="7) и до +38,718,1 мВ (п=12) соответственно. Эти факты свидетельствуют о формировании входящего тока d основном ионами хлора, что не противоречит результатам молекулярно-бнологических исследований [Öarlison et al., 1994J.

Пороговая концентрация для ГАМК- и мусцнмол-активированных ответов была 10'8 М. Графики "доза-эффект" для обоих веществ имели енгмоидную форму и характеризовались ECso (полумаксимальная эффективная концентрация), равной 104 М. Коэффициент Хнлла составлял для ГАМК 0,85, мусцимола - 1,72, что указывало на вероятность активации ГАМКл-подобного рецептора L. siagnaüs одной и двумя молекулами агониста соответственно. Причём, ГАМК оказалась эффективнее мусцимола в соотношении 1:0,7, что встречается крайне редко (Takeuclii, 1992].

Известно, что клеточная реакция на активацию классических ГАМКа-рецепторов выключается пикротоксином, кадмием и фуроссмндом, модулируется свинцом и ртутыо [Kiss and Osipenko; 1994, Olsen, 1991].

Исследования показали, что ГАМК-зависимыо входящие токи в нейронах L slagnalis угнетались антагонистом ГАМКд-рецептороп пикротоксином (10J М) на 69,06113,04% (Р<0,05; п=12) и полностью восстанавливались после его удаления из внеклеточной среды.

Фуросемнд (Ю-4 М) - блокатор транспорта попов хлора в различных системах [Gapon et al., 1988; Nicol, 1978], не менял амплитуды ГАМК-активиропанного входящего тока, lio модулировал его кинетические параметры. Как и пикротоксин, фуросемнд не вызывал смещения потенциала реверсии клеточного ответа.

Широкий спектр действия на ГАМКА-агонист-вызванный нейрональный ответ имели тяжелые металлы. Кадмий (Ю-4 М) обратимо подавлял его. Предполагается, что па ГАМКл-нонотропном рецепторе присутствует участок специфического связывания с ионом кадмия [Sieghart, 1992].

Свинец дозо-зависимо ослаблял ГАМК-активированный входящий ток. При концентрациях его 10-' М и 5x10-5 М ГАМК-вызванный клеточный ответ составлял соответственно 71,22121,73% (Р<0,05; п=9) и 46,47124,35% (Р<0,05; п=7) от контрольного уровня. Падение амплитуды активированного ГАМК входящего тока свинцом, было максимальным при потенциале поддержки равном -70 мВ и практически отсутствовало при -30 мВ.

Ртуть в высокой концентрации (10-4 М) угнетала ГАМК-вызванный ответ на 29,85115,95% (Р<0,05; п=4), а в низких (10* М, 10 7 М, 10* М) - потенциировала соответственно до 132,43122,8% (Р<0,05; п=!3), 162,7147,5% (Р<0,05; п=7), 146145,26% (Р<0,05; п=5) от контрольного уровня. При этом ВМКО дозо-зависимо уменьшалось во всем диапазоне концентраций - 10 8 М, Ю-7 М, ID 6 М соответственно до 82,5114,7% /р<0,1; п=13), 64,125122,24% (Р<0,05; п=7), 59113.9% (Р<0,05; п=5).

Потенцинрующнй эффект ртути возрастал при смещении потенциала поддержки с О мВ до -70 мВ. Эти данные хорошо согласуются с результатами, полученными на нейронах вегетативных ганглиев крысы [Arakawa et all, 1991], где также наблюдалась потенциация ртутыо ГАМК-активированного тока. В то же время пороговая концентрация Hg2+, вызывающая модуляторный эффект у L. stagnalis, была на порядок ниже, что предполагает более высокую чувствительность ГАМКл-подобных рецепторов моллюска к ионам ртути. После удаления ртути и свинца из внеклеточной среды отмечалось лишь частичное восстановление нейронального ответа. Тяжелые металлы не вызывали смещения потенциала реверсии входящего тока.

Таким образом, результаты электрофизиологического и фармакологического анализа подтверждают предположение о наличии ГАМКл-подобных рецепторов в нейронах L. stagnalis, в том числе и в промежуточных (RPeDI), и в двигательных (некоторые нервные клетки LPeA, RPeA и RPaA групп), участвующих в контроле за локомоцией [Syed et а!., 1988] и респирацией [Moroz, 1991; Syed et al., 1991]. Эти данные хорошо согласуются с результатами экспериментов по модуляции свободного поведения L. stagnalis агонистами ГАМКл-рецепторов [Moroz, 1991; Romanova, 1994].

Локализация, элсктрофнзпологичсскне и фармакологические свойства ГАМКв-подобпых рецепторов L. stagnalis it их участие в механизмах нейрональной пластичности. Основными клеточными эффектами, развивающимися при активации классических ГАМКв-рецепторов являются увеличение проводимости нейрональной мембраны для ионов чалия и модуляция потенциал-зависимых токов [Bowery et al., 1990].

В наших исследованиях агонисты ГАМКв-рецепторов баклофен и ГАМК вызывали гиперполяризацию i пернейронов RPeDI и VD4, причем для ГАМК-вызванного ответа в нейроне RPeDI это была вторая фаза, следующая за быстрой деполяризационной фазой (Рис. 1). В основе гиперполяризации лежал выходящий ток с потенциалом реверсии -67,4±8,3 мВ (п-9), что, согласно расчетам по формуле для определения потенциала Нернста, позволяло предположить участие в этом процессе К+. Кинетические параметры тока характеризовались относительно небольшим ВМКО 2,35±0,24 с (п=9). Эффекты, баклофена и ГАМК были дозо-зависимы; пороговое разведение составляло Ю-7 М. Кривая, описывающая зависимость "доза-эффект" для баклофена, имела енгмоидную форму, при этом максимальная амплитуда тока (+0,94 нА) была зарегистрирована при концентрации препарата 5х10-5 М. Селективный агонист ГАМКл-рецепторов мусцимол не вызывал подобных эффектов.

Выходящий ГАМК-зависимый ток не блокировался пикротоксином (Ю-4 М), но при увеличении концентрации фермента и/или длительности обработки проназой ЦНС наблюдалось его угнетение, что косвенно подтверждает сведения [Proks and Ashcroft, 1993] о способности протеолнтических ферментов оказывать модулирующее воздействие на работу калиевых каналов. ГАМК- и баклофен-активируемые выходящие токи не регистрировались в присутствии блокаторов калиевой

проводимости тетраэтиламония (33,7x1o-3 М) и 4-аминопиридина (0,5хI0-1 М) во внеклеточном растворе и цезия (4x10o М) во внутриклеточном.

Таким образом, интернейроны RPeDI и VD4 гнперполяризуются атомистами ГАМКв-рецепторов, указывая на участие в этом процессе ГАМКв-подобных рецепторов L stagnalis.

Модуляция потепциал-управляемых токов, вовлеченных в генерацию потенциала действия различными нейротрансмиттерамн и нейромодуляторамн была описана для позвоночных и беспозвоночных животных [Canavier et al., 1991; Gritz et al., 1994]. Она играет, важную роль в механизмах, лежащих в основе нейроналыюй пластичности [Klein et al., 1980].

Как показали результаты экспериментов на изолированных клетках, аппликация баклофена (5хЮ5 М) вызывает в нейронах RPeDI, LPeDI, VD4 и нескольких клетках из L и М. групп висцерального ганглия (Рис. 1) редукцию амплитуд потенциала действия на 24,6±12,6% (р<0,05; п= 15) и следовой гиперполяризацин на 41,89±1б,2% (р<0,05; п=15). В то же время практически не изменялись пороговый потенциал' и относительная длительность потенциала действия, измеряемая на уровне полопним его амплитуды (р>0,05). Эти эффекты воспроизводились ГАМК.

Описанные явления В основном опосредованы уменьшением амплитуды входящих и выходящих потенциал-зависимых токов, соответственно на 34,62±9,04% (Р<0,05;п=9) и 28,1+1,55% (Р<0,05; п=9) (ГАМК 5x10-5 м).

Известна ключевая роль кальциевых потенциал-актипируемых токов (le«) в химической сннаптической передаче [Monck and Fernandez, 1994] и в формировании потенциалов действия у L stagnalis [Byerly et al., 1989].

В наших опытах с использованием фармакологической изоляции 1с. (СаТЕА раствор) было установлено, что ГАМК и баклофеи, но не мусцимол, модулируют как амплитудные, так и кинетические параметры 1с» (Рис, 2, А, Б). Амплитуда 1с» начинала снижаться уже при концентрации ГАМК, равной 10-* М, и продолжала уменьшаться с нарастанием вплоть до 10-4 М (Рис. 2, В). Баклофеи также пропорционально концентрации угнетал 1с»- Уменьшение амплитуды 1с. ГАМК м баклофеном являются потенциал-зависимыми процессами. Максимальная депрессия его амплитуды возникала при тестирующем потенциале, равном -10 мВ (Рис. 2, Г). В то же время не было выявлено смещения максимума вольт-амперных характеристик и порога активации 1с>- Эффективность ГАМК н баклофена была примерно одинакова (1:0,95),

Предварительная обработка нейронов коклюшным токсином (I мкг/мл) не вызывала достоверного снижения угнетающего действия агонистов ГАМКв-рецепторов в отношении потенциал-зависимых токов (р>0,05).

Общепрнэнана способность 1)а2* проходить через кальциевые каналы моллюсков [Коетюк, 1986]. Она широко используется в электрофизиологии для выявления процессов, запускаемых притоком внеклеточного Са2+ внутрь клетки

[Dolphin and Scott, 1986]. При замене Са2+ на Ва2+ в СаТЕА растворе мы констатировали сохранность модуляторного действия ГАМК на входящий потенциал-зависимый ток. Учитывая это, а также. наличие во внутриклеточном растворе высокой концентрации хелатора Са2+ ЭГТА (5 мМ), можно констатировать неучастие вне- и внутриклеточного кальция п процессах угнетения 1с» ГАМК в нервных клетках L. stagnalis.

Л

2 с; о о.

IX

о

о4

ю

о о

120 г ГАМК Б 120

100 -С .....-■■ §110

80 60 V _ ГАМК1-р-Ьг{-{ §■100 1 90

40 м ■ _ sp 80

20 10 мс о 70 Л

0 - --------------(-----------i - 60 и

в 50

£40 <3,

им

«

х

<и Й £ 10

30 20

50 Время (с)

100

Ю-8 3x108 10* ю-4 [ГАМК], М

восстановление ГАМК

) 50 100

Время (с)

Потенциал (мВ) 10 0 10 20

+ 0-4----f--1-f—f—I

ГАМК ^^

^s^j-^осстановление -45 I (нА)

Рис. 2. Влияние ГАМК на 1с>. А - нормированные к контрольным значениям изменения амплитуды 1с. при аппликации ГАМК (5х10-5 М); Б - нормированные к контрольным значениям изменения постоянной инактивации 1с», В - зависимость "доза-эффект" ГАМК-вызваннои модуляции 1с«; Г • вольт-амперная характеристика модуляторного воздействия ГАМК на 1с. для нейрона ЛРеО!. Для (Б) и (Г) ГАМК 5x10-5 М.

Следовательно, в отношении нейронов, контролирующих респираторное поведение ¿. !1а%па1и (ЯРеО!, несколько нейронов из Ь и М групп [Могог, 1991; Winlovv е1 а1., 1992]) ГАМК, вызывая депрессию кальциевых и калиевых потенциал-

зависимых токов, выступает в качестве нейромодулятора, что свидетельствует о возможности её участия в формировании механизмов нейрональной пластичности через активацию ГАМКв-подобных рецепторов £. ¡Ш^паИ.!.

Участие ГАМКл-подобных рецепторов stagnalis в механизмах ненроналышП пластичности. Считается, что одним из основных механизмов пластичности нсйрональных . мембран является изменение их химической чувствительности веществами нейромодуляторами [Котляр, 1989), в том числе серотошшом, опиатными пептидами и интерлейкинами.

В наших экспериментах серотонин (5х10 3 М) вызывал разнонаправленные эффекты на ГАМКл-агоннст-вызванные ответы нейронов: в большинстве опытов (п=8, нейроны ЯРа01 и 11Ре01^ происходило увеличение их амплитуды на 50,17±22,9% (Р<0,05) (Рис. 3, А), но в ряде случаев (п=4, некоторые нейроны из ЬРсА и 11РеА групп) наблюдалось уменьшение амплитуды ответа на 68,2± 16,25% (Р<0,05)

1,8 1,6 1,4 1,2 1

0,8 0,6 0,4 0,2 0

ГАМК

ГАМК

ГАМК + 5-ОТ

ГАМК

ГАМК + 5-ОТ

1,6 1.4 1,2 1

0.8 0,6 0,4 0,2 0

ГАМК

5-ОТ

......................- - *-----

1

т

*

_______т______

...

ГАМК + 5-ОТ

ГАМК

ГАМК

0,5 нА [

Юс

Рис. 3. Серотонин (5-ОТ) модулирует ГАМК-активированный входящий ток. А - гистограмма, иллюстрирующая потенциирующий эффект серотонина. Ось ординат ' - нормированное к контролю значение 1глмк. Б - гистограмма, иллюстрирующая угнетающий эффект серотонина. Ось ординат • нормированное к контролю значение 1глмк. В - примеры регистраций лиганд-вызванных токов как при совместной, так и при раздельной аппликациях ГАМК и серотонина. Для А, Б, В -ГАМК 5x10-5 М, 5-ОТ 5x103 М. ♦ - Р<0,05.

(Рис. 3, Б). При этом не было выявлено смещения потенциала реверсии ГАМК-актипировапного входящего тока.

Агонисты ц-опиатных рецепторов мет-энкефялин (МЕ) Ю 6 М и морфицептнн (МО) 10'6 М, Ю"5 М уменьшали ГАМК-активнроваиный входящий ток соответственно до 81,1±5,08%(Р<0,05; п=9), 68,78±4,65% (Р<0,05; п=12), 3б,2±3,77% (Р<0,05; п=6) от контрольного уровня. При этом ннзкис концентрации опиатов незначительно изменяли кинетические параметры тока. В то же время 10-* МО вызывал уменьшение ВМКО до 88,15±2,78% (Р<0,05; п=10). Постоянная времени десенситизации более чувствительна к воздействию МО: так. Ю'7 М МО уменьшал постоянную времени десенситизации до 87,09+2,48% (Р<0,05; п=7), а 10 6 МО - до 82,7±2,68% (Р<0,05; п=12) от контрольного уровня.

Налоксон (10'' М) - антагонист опиатных рецепторов, достоверно предотвращал опиат-вызываемое уменьшение ВМКО и постоянной времени десенситизации ГАМК-активируемЫх клеточных ответов, по имел невысокую эффективность в отношении их амплитудных показателей. В то же время налоксон стимулировал депрессию амплитуды ГАМК-актипнропанного входящего тока до 78,94±6,46% (Р<0,05; п=9). В нейронах млекопитающих налоксон имеет высокое сродство к ГЛМКл.рецспторно-канальным комплексам и может уменьшат!, амплитуду ГАМКл-агоннст-вызываемых ответов р}!гщ!есПпе й а1., 1978, 5а\уток с! а!., 1976]. Во псех вышеуказанных случаях потенциал реверсии входящего тока не изменялся.

Аппликация пнтерлейкинов 1Ь-ф, 1Ь-2, 1Ь-6 дозо-зависнмо угнетала амплитуду ГАМК-вызванного входящего тока (Рис. 4, А).

Рис. 4. Интерлейкины в физиологических концентрациях изменяют амплитуду (А) и ВМКО (Б) ГАМК-активированного входящего тока в нейронах ЦНС Ь. иа^паИ^. 1) 1Ыр 30 Ед/мл, 2) 1Ь-2 10 Ед/мл, 3) 1Ь2 100 Ед/мл, 4) 1Ь6 200 Ед/мл, 5) 1Ы5 1000 Ед/мл, 6) 1Ь-6 2000 Ед/мл, 7) 1Ь-6 1000 Ед/мл теплом инактивированный 1Ь-6. * -Р<0,05. Первый столбец в группе из трех - контроль, второй - ГАМК + 1Ь, третий -1гамка(ц после удаления 1Ь.

IL-2 и IL-6 увеличивали DMICO 1глмкл (Рис. 4, Б). Инактивнрованный нагревом до 90 °С в течение 10 минут IL-6 не был эффективен (Рис. 4, Л).

IL-4 яозо-зависимо увеличивал амплитуду и уменьшал BMICO ГАМК-нндуцируемого входящего тока. Эти эффекты устранялись преинкубацней IL-4 с антителами. Интерлейкнны не вызывали смещения потенциала реверсии ГАМК-активнрованкого входящего тока. Аппликация большинства интерлейкинов вызывала незначительный (0,05 - 0,1 нА) выходящий ток. Только в случае высокой концентрации IL-4 можно было наблюдать увеличение этого тока до 0,4 нА.

Присутствие интерлейкинов в крови у представителей типа Mollusca показано нммуноцитохимическими методами [Stefano et al, 1994]. Различия в эффектах IL-Iß, IL-2, IL-б и IL-4 могут быть связаны с механизмами их реализации. Известно, что ключевое значение в IL-lß-, i IL-2-, IL-6-эависимом фосфорилировании внутриклеточных белков имеют тирозинкнназы [Kishimoto et al., 1994], тогда как для многих IL-4-акпшированных процессов участие тирозинкиназ не является обязательным условием [Кузнецов и др., 1994].

* -X- JC- X

-•

----

X

Мг- -

*

1

D:.ü_n

2 3 4 5 6

Рис. 5. Влияние 1штсрлейкнна-4 на ГАМК-активированный входящий ток. А - пример модуляции 1гамка(ц (20 Ед/мл), стрелками обозначен момент аппликации ГАМК (5x105 М), цифрами - время, прошедшее с начала аппликации 1Ь-4, ВО -восстановление 1гамкао-) после удаления 1Ь-4. Гистограммы изменения амплитуды (Б) и ВМКО (В) 1гамка(ц в присутствии 0,2 Ел/мл 11.-4 (2), 2 Ед/мл 1Ь-4 (3), 20 Ед/мл 1И (4), 100 Ед/мл 1Ь-4 (5), 100 Ед/мл 1Ь-4 после их преинкубацней с антителами в течение получаса (6). (1) - контроль взят за 100%.

Угнетение ГАМК-ак гмвированного хлорного тока интерлейкиками, опиатами и серотонином скорее всего связано с фосфорилированием специфических участков Р-

субъединиц ГАМКд-подобных рецепторов L. stagnalis [Darlison, 1992]. Как известно, протеинкиназы А и С могут фосфорилировать ßi , у2. и уа субъединицы ГАМКа-рецептора [Kellenberger et al., 1993; Leidenhei'mer et al., 1992], а опиаты, серотонин и иптерлейкнны способны активировать эти ферменты [Mangoura and Dawson, 1993; Crow and Forrester, 1993; Henderson and Blake, 1992, Farrar and Anderson, 1985]. Возможность участия протеинкиназ в модуляции вызванного аппликацией ГАМК входящего тока подтверждается п результатами опытов с активатором протеинкиназы С форбол 12, 13-дибутиратом (105 М), который также уменьшал амплитуду ГАМК-завнсимого тока на 48±16,11%. (1'<0,05; п=7) и увеличивал его BMICO на 32,34± 18,96% (Р<0,05; п=7).

Таким образом, результаты настоящего исследования свидетельствуют об участии ГАМКд-подобных рецепторов L. stagnalis в формировании механизмов нейроналыюй пластичности.

ВЫВОДЫ:

1. В педальных, париетальных, правом плевральном и висцеральном ганглиях L. stagnalis локализованы чувствительные к ГАМК нейроны, содержащие ГАМКд- и ГАМКо-подобныс рецепторы.

2. Агоипсты ГАМКл-рецспторов мусцимол и ГАМК уменьшают сопротивление нсПрональной мембраны и дозо-зависимо активируют входящий хлорный ток, вызывающий деполяризацию нейронов RPcDl, RPaDI, LPaV2, VDc, некоторых нервных клеток из А группы правого париетального, F группы • висцерального, D группы правого плеврального и А групп правого и левого педальных ганглиев. Эти эффекты угнетаются пикротоксином, кадмием н свинцом, потенцннруются - ртутыо и не активируются баклофепом.

3. Нейроны RPeDI и VD4 Гнперполяризуются агонистамн ГАМКв-рецепторов баклофепом и ГАМК, что является следствием увеличения проводимости нейроналыюй мембраны дня ионов калия, формирующих выходящий ток. Эффект является пнкротоксин-незавнснмым и не воспроизводится при аппликации мусцпмола.

4. Участие рецепторов гамма-аминомасляной кислоты в механизмах нейроналыюй пластичности реализуется через: уменьшение агонистамн ГАМКв-рецепторов амплитуды потенциал-зависимых кальциевых и калиевых токов, что приводит к снижению максимумов потенциала действия и следовой гиперполяризации в нейронах RPeDI, LPeDl 11 в некоторых нейронах L п М групп через внутриклеточные механизмы, не связанные е участием чувствительных к коклюшному токсину G-белков; дозо-зависимую потенцпацию входящего ГАМК-активируемого тока 1L-4; угнетение входящего ГАМК-нндуцируемого тока агонистамн (мет-энхефалнн, морфнцептин) и антагонистом (палоксои) р-опиатиых рецепторов, активатором протеннкиназы С - форбол 12, 13-дибутиратом, IL-lß, IL-2,

il.

IL-6; уменьи ние амплитуды входящего ГАМК-активируемого тока серотошшом в некоторых нейронах А-групп педальных ганглиев и ее увеличение в нейронах RPeDl iiRPaDl.

5. Из всех протестированных клеток только для интернейрона RPeDl характерны все вышеуказанные эффекты гамма-аминомасляной кислоты, опосредованные стимуляцией ГАМКа- и ГАМКп-подобных рецепторов, что позволяет рассматривать гигантский дофаминергический нейрон RPeDl как наиболее удобную модель для изучения механизмов нейроналыюй пластичности, связанных с функциональным состоянием ГАМК-рецспторных систем.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

ч

1. Rubakhin S.S., Szucs A., S.-Rozsa К. Characterization of GABA-induced response on identified dialysed Lymnaea neurones II Regional meeting ISIN.- Pushchino. Russia, 26-28 May 1994.- P. 38.

2. Gyori J., Rubakhin S.S., Fejtl M., Carpenter D.O., Salartki J. Divergent effects of HgCh on acetilcholine and GABA activated currents of Aplysia and Lymnaea neurones II Regional meeting ISIN.- Pushchino. Russia, 26-28 May 1994,- P. 13.

3. Rubakhin S.S., Szucs A., S.-Rozsa K. Opiates modulates GABA-induced currents on the dialysed Lymnaea neurones // Symposium on molluscan neurobiology.- Amsterdam, Netherlands, 1-4 June 1994.- P. 35.

4. Romanova E.V., Rubakhin S.S., S.-Rozsa K. Modulation of the behaviour in the gastropod mollusc Lymnaea stagnalis induced by GABA and GABA receptors agonists. // Symposium on molluscan neurobiology.- Amsterdam, Netherlands. 1-4 June 1994,- P. 23.

5. Moroz L.L., Maslova G.T., Potapovich A.I., Rubakhin S.S., Romanova E.V., Petrashevskaya N.N., Budko D. Yu., Winlow W., and Kostyuk V.A. Molluscan central neurones are highly resistant to free radical damage due to their well developed anti-oxidant defence system.//Journal of Physiology.- 1994.-Vol. 477.-P. 92.

6. Rubakhin S. S., Szucs A., Gourine V. N, S.-Rozsa K. Inhibition of calcium spikes by gamma-aminobutyric acid in the neurons, of Lymnaea stagnalis II Abstracts of 8th Symposium on invertebrate neurobiology.- Tihany, Hungary, 27 June-2 July 1995.- P. 56.

7. Salanki J., Carpenter D.O., Gyori J., Rubakhin S.S. Toxic heavy metals potentiate ligand-gated currents in gastropoda neurons. // Abstracts of 8th Symposium on invertebrate neurobiology.- Tihany,"Hungary, 27 June-2 July 1995.- P. 58.

8. Szucs A., Rubakhin S.S., Stefano G.B., S.-Rozsa K. Interleukin-2 and interleukin-4 modulate ligand-, and voltage-gated ion currents on Lymnaea neurons. // Abstracts of 8th Symposium on invertebrate neurobiology.- Tihany, Hungary, 27 June-2 July 1995.- P. 62.

9. Kazakevich V.B., Rubakhin S.S. Low temperature induces reversible modulation of electrophysiological parameters in Lymnaea neurons. // Thermoregulation and temperature adaptations / ed. V.N. Gourine.- 1995,- Minsk.- P. 103-106.

РЕЗЮМЕ

РУБЛХИН СТАНИСЛАВ СТАНИСЛАВОВИЧ. РЕЦЕПТОРЫ ГАММА-АМИНОМАСЛЯННОЙ КИСЛОТЫ В ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЕ LYMNAEA STAGNALIS'. ЛОКАЛИЗАЦИЯ, ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА.

Ключевые слова: гамма-аминомасляпная кислота, идентифицированные нейроны, нейромедиатор, моллюск, Lymnaea stagnalis, лиганд-активнруемые ионные токи.

С использованием методов микроэлектродной регистрации п внутриклеточной перфузии изолированной клетки исследованы рецепторы гамма-аминомаслянной кислоты легочного моллюска Lymnaea stagnalis (L).

Обнаружено присутствие в ряде идентифицированных нейронов центральной нервной системы Lymnaea stagnalis клеточных рецепторов, по своим элсктрофизнологическим и фармакологическим характеристикам близких к ГАМКа-п ГАМКв-рсцспторам позвоночных. Активация ГАМКл-подобнЫх рецепторов Lymnaea stagnalis приводит к деполяризации нейрона, в основе которой лежит увеличение проводимости нейрональной мембраны для ионоа хлора. В то^е время ГАМКв-подобные рецепторы способны инициировать калиевый выходящий ток. Оба рецептора могут участвовать в механизмах нейрональной пластичности, о чем-свидетельствует: во-первых, модуляция кальциевых и калиевых потенциал-зависимых токов агоннстами ГАМКв-рецепторов через процессы, не включающие чувствительные к коклюшному токсину G-бслкн; во-вторых, изменение параметров ГАМКА-агоннст-актнвнрованного хлорного тока под • воздействием ряда физиологически-активных соединении (серотонни, мет-энкефалин, морфицептин, налоксон, форбол 12,13-дибутнрат, интерлейкнны - IL-lp, IL-2, IL-4, IL-б).

Эти факты позволяют рассматривать Lymnaea stagnalis как удобную нейробиологнческую модель для исследования функциональной роли рецепторов гамма-аминомаслянной кислоты у моллюсков.

РЭЗЮМЭ

РУБАХШ СГАШСЛА? СТАШСЛАВАВ1Ч. РЭЦЭПТАРЫ ГАММА-АМ1НАМАСЛЯНАЙ К1СЛАТЫ 9 ЦЭНТРАЛЬНАЙ НЯРВОВАЙ С1СТЭМЕ ЬУМИАЕА БТАвИАШ (Ь): ЛАКАЛ13АЦЫЯ, ЭЛЕКТРАФ131ЯЛАГ1ЧНЫЯ I ФАРМАКАЛАГ1ЧНЫЯ УЛАСЦ1ВАСЦ1.

Юпочавыя словы: гакша-аьнаамасляная мслата, идэнтыфжаваныя нейроны, нейратрансмтары, малюск, Ьутпаеа $1<чпаИз, Л1ганд-актыв1руемыя юнныя ток!.

3 выкарыстаннем метадау мкраэлектроднай рэпстрацьи 1 $нутрыклетачнаП перфузн.паляванага нейрона даследаианы рэцэптары гамма-амжамаслянай шсдаты лёгачнага малюска Ьутпаеа на£па!и.

Выявлена прысутнасць. у радзе ¡дэнтыфжаваных нейрона]? цэнтральнай нярвовай с1стэмы и stagnalis клетачных рэцэптарау, па свщх электрафЫялапчных I фармакалапчных характэрыстыках падобных да ГАМКа- I ГАМКв-рэцэптараУ пазваночных. Актыоацыя ГАМКл-падобных рэцэптарау Ь. stagnalis вядзе да дэпалярызацьп нейрона, у аснове якой ляжыць павялтнне праводнасщ нейроннай мембраны для юнау хлору. У той жа час ГАМКв-падобныя рэцэптары здольны ннщяваць кал1евы выходзячы ток. Абодва рздэптары могуць удзельмчаць у мехашзмах нейронная пластычнасц), аб чым сведчыць: па-першае, мадуляцыя кальциевых ■ кашевых патэнцыял-залежных тока? агашстам! ГАМКа-рэцэптараУ праз працэссы, не Уключаючыя адчувопьныя да коклюшнага таксшу О-бялкI; па-другое, змяненне параметра^ ГАМКа агашст-актывфаванага хлорнага току пад уздзеяннем рада фп^ялапчна активных злучэння^ (сератанш, мет-энкефалш, морфщэптын, налаксон, фарбол 12, 13-Д1бут1рат, штэрлежшы • 1Ь-ф, 11,-2, 1Ь-4, 1Ь-6).

Гэтыя факты дазваляюць разглядаць Ьутпаеа stagnalis як зручную нейраб^ялапчную мадэль для даслсдванняу функцыянальнай рол! рэцэптарау гамма-амшамасляннай мслаты У малюска^.

SUMMARY

RUBAKHIN STAN IS LAV STANISLAVOVICH. RECEPTORS OF GAMMA-AMINOBUTYRIC ACID IN THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM OF LYMNAEA STAGNALIS: LOCALIZATION, ELECTROPHYSIOLOGICAL AND PHARMACOLOGICAL PROPERTIES.

Key words: gamma-aminobutyric acid, identified neurons, neurotransmitters, molluscs, Lymnaea slagnalis, ligand-gated ionic currents.

Gamma-aminobutyric acid receptors in a pulmonate snail, Lymnaea slagnalis have been characterized using microelectrodc and intracellular perfusion techniques on isolated central nervous system neurons.

It was found that in a number of identified neurons of L. slagnalis there are cellular receptors pharmacologically and electrophysiological^ closed to GABAa and GABAb receptors of vertebrates. Activation of GABAx-Iike receptors of L. slagnalis results to depolarization of neurons due to an enhancement of chloride conductance. Activation of GABAB-like receptors is responsible for neuronal hyperpolarization and activation of potassium ionic conductance. Both types of receptors are suggested to be involved in the mechanisms of neuronal plasticity. The evidence are follows: firstly, modulation of calcium and potassium voltage-dependent ionic currents by GABAb receptor agonists through the process being not mediated by pertussis toxin sensitive G-proteins; secondly, alteration ol parameters of the GABAA-agonist-gated currents under action of number of physiologically active substances (serotonin, met-enkephalin, morphiceptine, naloxone, phorbol 12, 13-dibutirate, interleukins - IL-lp, IL-2, IL-4. IL-6).

These data suggest that Lymnaea slagnalis is a suitable neurobiological model tc study the functional role of gamma-aminobutyric acid receptors of molluscs.