Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Нейрохимическое изучение участия метаботропных и AMPA-рецепторов глутамата в механизме формирования эффектов ноотропных средств

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В. В. Закусова» Российской академии медицинских наук

На правах рукописи

04201365800

ВАСИЛЬЕВА ЕКАТЕРИНА ВАЛЕРЬЕВНА

НЕЙРОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ УЧАСТИЯ МЕТАБОТРОПНЫХ И АМРА-РЕЦЕПТОРОВ ГЛУТAMATA В МЕХАНИЗМЕ ФОРМИРОВАНИЯ ЭФФЕКТОВ НООТРОПНЫХ СРЕДСТВ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -

доктор медицинских наук, профессор

Ковалёв Георгий Иванович

Москва 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

Список сокращений 5

ВВЕДЕНИЕ 6

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13

1Л. Фармакология ноотропных препаратов 13

1Л Л .Общая характеристика ноотропных средств 13

1.1.2. Фармакологические характеристики ноотропов 15

1.1.3. Механизмы действия ноотропных препаратов 16

1.1.4. Клиническое применение ноотропов 18

1.1.5. Классификация ноотропных средств 20

1.1.6.Фармакология и нейрохимия ряда ноотропов 23

1.1.6.1. Производные пирролидона 23

1.1.6.2. Нейропептиды и их аналоги 32

1.1.6.3. Производные и аналоги ГАМК 36

1.1.6.4. Глутаматергические препараты 38 1.2. Глутаматергическая система 40

1.2.1. Общая характеристика глутаматных рецепторов 40

1.2.2. АМРА-рецепторы 41

1.2.2.1. Структура и функции субъединиц 41

1.2.2.2. Роль АМРА-рецепторов в синаптической пластичности 50

1.2.3. Метаботропные глутаматные рецепторы 56 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 65

2.1. Материалы 6 5

2.1.1. Животные 65

2.1.2. Вещества 65

2.2. Методы 66

2.2.1. Тест исследовательского поведения в закрытом 66

крестообразном лабиринте

2.2.2. Радиолигандный анализ 68

2.2.2.1. Выделение плазматических мембран коры мозга 68

2.2.2.2. Выделение плазматических мембран гиппокампа 68

2.2.2.3. Радиолигандный анализ АМРА-рецепторов 69

2.2.2.4. Радиолигандный анализ mGlur-рецепторов 69

2.2.2.5. Определение концентрации белка методом Лоури 70

2.2.3. Статистическая обработка результатов 71 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 72

3.1. Изучение влияния ноотропных препаратов на глутаматные 72 рецепторы in vitro

О

3.1.1 Влияние ноотропных препаратов на связывание [ H]-Ro48-8587 73

с АМРА-рецепторами коры мозга грызунов in vitro

3.1.2. Влияние ноотропных препаратов на связывание 73

[ H]-LY-354740 с mGluR-рецепторами коры мышей in vitro

3.2. Изучение поведения мышей BALB/C и C57BL/6 в закрытом 76 крестообразном лабиринте

3.2.1. Эффекты субхронического введения ноотропных препаратов 76

на поведенческие характеристики мышей BALB/c и С57В1/6 в крестообразном лабиринте

3.2.1.1. Влияние субхронического введения ноотропных препаратов 78 на эффективность исследовательского поведения мышей

3.2.1.2. Эффекты субхронического введения ноотропных препаратов 81 на уровень тревожности и двигательной активности мышей в новой обстановке

3.3. Влияние субхронического введения ноотропных препаратов на 86 характеристики связывания селективных лигандов с глутаматными рецепторами мозга мышей BALB/c и С 57В1/6 ex vivo

3.3.1. Влияние субхронического введения ноотропных препаратов на 87 характеристики связывания [ H]-Ro48-8587 с АМРА-рецепторами

коры мозга мышей BALB/c и С57В1/6 ex vivo

3.3.2. Влияние субхронического введения ноотропных препаратов на 94 связывание [ H]-LY-354740 с mGluR-рецепторами коры мозга

мышей BALB/c и С57В1/6 ex vivo

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 101

ВЫВОДЫ 118

Практические рекомендации 118

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 119

Список сокращений

3KJ1 - тест «закрытый крестообразный лабиринт»

УРПИ - тест «условный рефлекс пассивного избегания»

AMP А - а-амино-3-гидроксил-5-метил-4-изоксазол-пропионовая кислота

BDNF - мозговой ростовой фактор

F_PtrN - длина первого цикла патрулирования (количество заходов) F_ChTm - латентный период продолжительность первого визита в боковой отсек

F_GITm - продолжительность первого визита в боковой отсек PatrlN - число циклов патрулирования

T_ChTm - общее время пребывания животного в центральном отсеке лабиринта

T_GITm - общее время пребывания животного в боковых ^отсеках лабиринта

mGluR - метаботропные глутаматные рецепторы

NMDA - Ы-метил-О-аспарагиновая кислота

АКТГ - адрено-кортикотропный гормон

АТФ - аденозин трифосфат

ГАМК - у-аминомасляная кислота

ГЭБ - гематоэнцефалический барьер

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

НП - ноотропные препараты

ПНП - пирролидоновые ноотропные препараты

РНК - рибонуклеиновая кислота

ЦНС - центральная нервная система

nACh - никотиновые ацетилхолиновые рецепторы

CaMKII - кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа II

5 НТ - серотониновые рецепторы

МАО - моноаминоксидаза

D - дофаминовые рецепторы

БДЗ - бензодиазепиновые рецепторы

Trk - тирозинкиназа

ЭПС - эндоплазматическая сеть

TARP - трансмембранные регуляторные белки

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Фармакологическая коррекция сниженной когнитивной деятельности является одной из актуальных проблем здравоохранения, поэтому поиск и изучение механизмов специфического действия ноотропных средств остаётся важной задачей психофармакологии. Актуальным является поиск новых препаратов, которые обладали бы большей фармакологической активностью и оказывали бы избирательное действие на интегративные функции головного мозга, улучшая состояние пациентов, умственную активность и ориентацию в повседневной жизни. Создание новых эффективных и безопасных фармакологических средств повышения эффективности умственного труда в сложных условиях патологий ЦНС, включая нейродегенеративные заболевания, особенно актуально в современную эпоху, которая характеризуется повышением влияния стрессогенных факторов на организм человека (Середенин, Вальдман, 2003; Воронина, 2000; Островская и др., 2002; Ковалёв Г. И., 1993).

У ноотропных препаратов имеется особенность - их своеобразная амфотропность, отсутствие возможности оказывать влияние на высшую нервную деятельность и психику человека при его нормальном (здоровом) состоянии, улучшать течение этих процессов при имеющихся функциональных или морфологических нарушениях (Ковалев Г.В, 1990). Кроме того, ноотропы способны оказывать лечебное действие как стимуляторы процесса познавания после длительной курсовой терапии. В настоящее время группа ноотропных препаратов включает вещества из различных групп химических соединений с разными спектрами фармакологических эффектов и механизмами действия; мишени для действия веществ чрезвычайно разнообразны, многие препараты способны реализовывать свой эффект, воздействуя на несколько мишеней (Воронина, Середенин, 2007). Ноотропы объединены общностью терапевтического эффекта, но отличаются отсутствием общего молекулярного механизма действия. В нейропсихофармакологии всё ещё остаются актуальными следующие вопросы: через какие молекулярные мишени и

синаптические механизмы ноотропы осуществляют свое модулирующее влияние на когнитивные процессы; какие звенья в нейрохимическом механизме действия являются общими для всех ноотропов, а какие специфическими; существуют ли универсальные для всех ноотропов фармакологические мишени (Ковалёв Г.И., 1993; Ковалёв, Фирстова, 2010; Froestl et al.,2012, 2013 а, 2013 b).

Известно, что в реализации эффектов ноотропных препаратов значительную роль играет глутаматергическая нейромедиаторная система, которая активно вовлечена в процессы синаптической пластичности и долговременной потенциации. В работе, выполненной в Лаборатории радиоизотопных методов исследований к.б.н. Ю.Фирстовой с помощью комплексного поведенческо-нейрохимического подхода, было убедительно установлено, в частности, что канальный сайт NMDA-рецептора, никотиновые рецепторы, а также нейротрофин BDNF специфически участвуют в процессах нормализации пластической функции мозга животных с помощью ноотропных препаратов различного строения (Фирстова, 2008). Вместе с тем, роль других глутаматных рецепторов - АМРА-, метаботропных - в фармакологических эффектах ноотропов остается невыясненной.

Доказано, что АМРА-рецепторы играют важную роль в формировании эффекта долговременной потенциации и что их концентрация в синаптической области при этом увеличивается (Malinow, 2003), а установление длительного синаптического подавления сопровождается уменьшением количества АМРА-рецепторов в постсинаптических участках дендритов. Позитивная модуляция АМРА-рецепторов может потенциально улучшить когнитивную деятельность, во-первых, возмещая потери глутаматергических синапсов, во-вторых, стимулируя синаптическую пластичность, и в-третьих, увеличивая продуцирование трофических факторов. АМРА-рецепторы стали базовой мишенью для разработки ряда «усилитилей когнитивной активности», т.н. «ампакинов» (Arai et al., 2000; Lynch, Gall, 2006), корректирующих память и обучаемость в фунциональной связке с нейротрофинами (Lynch, Gall, 2006; Lauterborn et al., 2009), также посредством других путей сигналинга (Milstein,

Nicoll, 2008; Kessels, Malinow, 2009). При многих неврологических заболеваниях структура синапса и функции АМРА-рецепторов меняются, что делает данный вид рецепторов потенциальной терапевтической мишенью для клинического вмешательства.

Метаботропные глутаматные рецепторы (mGluR) выполняют важные функции в центральной и периферической нервных системах: участвуют в процессах памяти, обучения, ощущении тревоги, восприятии боли. Эти рецепторы обнаружены на мембранах как пре-, так и постсинаптических нейронов гиппокампа, мозжечка и коры, а также в других областях мозга (Palucha, Pile, 2007). mGluR представляются объектом действия т.н. аллостерических модуляторов, некоторые из которых рассматриваются в качестве прообразов для новых психоактивных веществ (Kew, 2004), в особенности, в качестве лигандов mGluR 2-го типа (Sanger et al., 2012; O'Neill et al., Gregory et al., 2011).

В лаборатории радиоизотопных методов исследований ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В.Закусова» РАМН на протяжении ряда лет разрабатывается концепция о модулирующем влиянии ноотропов на эффективность синаптической передачи, осуществляемом по различным механизмам модуляции. Согласно данной гипотезе, ноотропы как нейромодуляторы не являются прямыми лигандами нейромедиаторных рецепторов, но способны изменять показатели активности рецепторов, что ведет к адекватному изменению эффективности синаптической нейропередачи (Ковалев Г.И, 1993).

В настоящее время в экспериментальной фармакологии широко используются инвазивные методы моделирования психопатологии (болевое раздражение, использование токсинов и блокаторов рецепторов), но появляется все больше работ, использующих неинвазивные модели состояния когнитивного дефицита, от которых можно ожидать большей степени адекватности в воспроизведении процессов, происходящих в мозге под воздействием психофармакологических препаратов (Thiel et al., 1999; Pawlak,

Schwarting, 2002; Gorisch, Schwarting, 2006; Antoniou et al., 2008). Метод типизации животных по врожденным когнитивным способностям наиболее способен отражать специфику нейрохимических механизмов действия ноотропных средств, проявляющих свои эффекты в условиях патологии. Учитывая сложность соотношения высших интегративных функций человека и животных, необходимо искать формы отражения в поведенческих экспериментах когнитивной недостаточности (Chamberlain et al., 2006). Одним из информативных критериев является реакция особи на новизну обстановки (исследовательское поведение), которая составляет часть высших интегративных процессов. Показательно, что индивидуальная реакция животного на новизну обстановки непосредственно связана с различным типом поведения и нейрохимическим профилем организма (Ковалев Г.И. и др., 2007; Antoniou et al., 2008).

Для изучения характера действия ноотропов на нейромедиаторные системы, играющих важную роль в процессах обучения и памяти, в работе был использован комплексный поведенческо-нейрохимический подход к изучению индивидуально-типологического рецепторного профиля препаратов с использованием оригинальной неинвазивной методики типирования животных по уровням эффективности исследовательского поведения в крестообразном лабиринте.

Цели и задачи исследования. Целью данного исследования явилось изучение участия AMP А- и метаботропных рецепторов глутамата в формировании общих и специфических эффектов ноотропных препаратов.

Для достижения указанной цели были сформулированы и поставлены следующие задачи:

1. Изучить с помощью метода радиолигандного связывания in vitro прямое влияние ноотропных препаратов (пирацетама, фенотропила, ноопепта, семакса, пантогама, нооглютила) на АМРА и метаботропные (mGluR II) глутаматные рецепторы коры мозга грызунов.

2. Исследовать особенности поведения инбредных мышей линий BALB/c и С57/В1 в закрытом крестообразном лабиринте.

3. Оценить влияние ноотропных препаратов в режиме субхронического введения на параметры поведения линий мышей BALB/c и C57BL/6 в закрытом крестообразном лабиринте.

4. Изучить особенности АМРА- и метаботропного глутаматного рецепторного профиля коры мозга инбредных мышей линий BALB/c и C57BL/6.

5. Исследовать с помощью метода радиолигандного связывания ex vivo влияние субхронического введения ноотропных препаратов на характеристики АМРА- рецепторов в коре мозга мышей BALB/c и C57BL/6.

6. Исследовать с помощью метода радиолигандного связывания ex vivo влияние субхронического введения ноотропных препаратов на характеристики mGluR II- рецепторов в коре мозга мышей Balb/C и C57BL/6.

Научная новизна. На основе статистически репрезентативной серии экспериментов впервые методом радиолигандного связывания in vitro было обнаружено сродство отечественных ноотропных препаратов к выбранным рецепторам глутамата: нооглютила и ноопепта - к АМРА-рецепторам, семакса - к метаботропным глутаматным рецепторам II группы. При сравнении поведения и нейрохимических показателей инбредных мышей BALB/c и C57BL/6 описаны различия АМРА- и метаботропного глутаматного рецепторного профиля коры мозга и характеристик поведения двух линий. Показано, что эффекты субхронического введения всех исследованных ноотропных препаратов направлены на улучшение показателей исследовательской активности животных в закрытом крестообразном лабиринте, кроме того, для некоторых из них характерен анксиолитический компонент. Впервые показано неоднородное влияние субхронического введения ноотропных препаратов различных классификационных групп на

AMP А- и mGluR II рецепторы коры мозга мышей BALB/c и C57BL/6, проявляющееся в изменении плотности рецепторов Вшах без изменения их аффинности к селективным лигандам (Kd) в указанной структуре.

Научно-практическая значимость. Полученные результаты существенно расширяют имеющиеся представления о нейрохимическом и нейрорецепторном механизме действия различных ноотропных препаратов. Обнаруженные эффекты ноотропов на поведение и нейрохимические характеристики AMP А- и метаботропных глутаматных рецепторов позволяют выявить общие и специфические фармакологические мишени для препаратов, улучшающих когнитивные функции. Выявленные различия эффектов ноотропных препаратов могут способствовать оптимизации их клинического применения при направленной фармакотерапии различных психо- и неврологических расстройств.

Положения, выносимые на защиту

1. Ноотропные препараты проявляют фармакологически значимую конкуренцию за места связывания AMP А- и метаботропных рецепторов глутамата с их селективными лигандами.

2. В условиях теста закрытого крестообразного лабиринта инбредные мыши линий BALB/c и C57BL/6 отличаются по эффективности исследовательского поведения, тревожности и двигательной активности.

3. Инбредные мыши линий BALB/c и C57BL/6 отличаются по характеристикам AMP А- и метаботропных рецепторов глутамата.

4. Субхроническое введение ноотропных препаратов избирательно воздействует на поведенческие характеристики мышей линий BALB/c и C57BL/6 в условиях теста закрытого крестообразного лабиринта.

5. Субхроническое введение ноотропных препаратов изменяет характеристики АМРА-рецепторов коры мозга мышей линий BALB/c и C57BL/6.

6. Субхроническое введение ноотропных препаратов влияет на характеристики т01иЯ П-рецепторов коры мозга мышей линий ВАЬВ/с и С57ВЬ/6.

Апробация. Результаты работы представлены на 5-ой Международной конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам" (Москва, июнь 2010), Научно-практической конференции с международным участием «Нейрохимические подходы к исследованию функционирования мозга» (Ростов-на-Дону, сентябрь 2011), 4-м съезде фармакологов России (Казань, сентябрь 2012), 1У-м Всероссийском научно-практическом семинаре молодых ученых с международным участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекар-ственных средств» (Волгоград, октябрь 2012), П-ой Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, ноябрь, 2012), первой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Проблемы разработки новых лекарственных средств» (Москва, июнь 2013), межлабораторной конфер